Nghiên cứu sinh khả dụng invivo của curcumin giải phóng từ màng bacterial cellulose nạp thuốc dùng qua da

Rất nhiều phương pháp đã được ứng dụng để làm tăng sinh khả dụng của curcumin thông qua làmtăng độ tan, độ ổn định và tính thấm qua màng tế bào bằng các kỹ thuậthoá học, kỹ thuật bào chế

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

NGUYỄN THỊ THÚY

NGHIÊN CỨU SINH KHẢ DỤNG IN VIVO CỦA

CURCUMIN GIẢI PHÓNG TỪ MÀNG BACTERIAL

CELLULOSE NẠP THUỐC DÙNG QUA DA

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌCNgười hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Phúc Hưng

HÀ NỘI, 2017

LỜI CẢM ƠN

Với lòng trân trọng và biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn thầygiáo TS Nguyễn Phúc Hưng, người thầy đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ emtrong suốt quá trình thực hiện luận văn này

Em cũng xin bày tỏ lời cảm ơn tới TS Nguyễn Xuân Thành cùng cácthầy cô giáo trong khoa Sinh – KTNN, các thầy cô tại Viện Nghiên cứu khoahọc và Ứng dụng, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, đã tạo mọi điều kiệnthuận lợi giúp đỡ em hoàn thành luận văn này

Một lần nữa em xin cảm ơn sự giúp đỡ của các thầy cô, cảm ơn gia đìnhcùng toàn thể các bạn, những người thân, đã luôn ở bên động viên, giúp đỡ

và khích lệ em hoàn thành luận văn này

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 15 tháng 11 năm 2017

Học viên

Nguyễn Thị Thúy

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận văn này là của chính tôi thực hiện dưới sự hướngdẫn của TS Nguyễn Phúc Hưng Kết quả nghiên cứu không sao chép vàkhông trùng với bất kỳ luận văn nào Những trích dẫn, kết quả nghiên cứu cótrong luận văn lấy từ các công bố chính thức và có ghi chú rõ ràng Nếu sai tôixin chịu hoàn toàn trách nhiệm trước hội đồng bảo vệ

Hà Nội, ngày 15 tháng 11 năm 2017

Học viên

Nguyễn Thị Thúy

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục đích nghiên cứu 4

3 Nhiệm vụ nghiên cứu 4

4.Vật liệu và phạm vi nghiên cứu 4

5.Phương pháp nghiên cứu

5 6 Dự kiến đóng góp mới của đề tài

5 NỘI DUNG 6

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 6

1.1 Bacterial Cellulose (bc) 6

1.1.1 Vi khuẩn Acetobacter xylinum 6

1.1.2 Cấu trúc của BC 7

1.1.3 Tính chất của BC 9

1.1.4 Các ứng dụng của BC trong Y học 9

1.1.5 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng màng BC làm vật liệu hấp thu và giải phóng thuốc qua da 10

1.2 Thuốc Curcumin 13

1.2.1 Công thức 13

1.2.2 Một số tính chất hóa lý của curcumin 14

1.2.3 Hoạt tính sinh học của curcumin 15

1.2.4 Tính khả dụng sinh học của curcumin 16

1.2.5 Dược động học của curcumin 17

1.2.6 Tình hình nghiên cứu cur trên thế giới và Việt Nam 19

1.3 Phương pháp HPLC 21

1.4.1 Khái niệm 21

1.4.2 Đánh giá sinh khả dụng và tương đương sinh học in vivo 22

1.4.3 Thẩm định phương pháp phân tích trong dịch sinh học 22

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 Vật liệu nghiên cứu 25

2.1.1 Nguyên liệu và hóa chất 25

2.1.2 Thiết bị và dụng cụ 25

2.1.3 Thỏ 25

2.2 Phương pháp nghiên cứu

26 2.2.1 Thiết kế thí nghiệm 26

2.2.2 Phương pháp lấy mẫu và xử lý mẫu 27

2.2.3 Các điều kiện phân tích 28

2.2.4 Thẩm định phương pháp phân tích

28 CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 34

3.1 Xây dựng quy trình phân tích curcumin trong huyết tương thỏ

34 3.1.1 Chuẩn bị mẫu phân tích 34

3.1.2 Xử lý mẫu phân tích 34

3.2 Thẩm định quy trình phân tích curcumin trong huyết tương thỏ

35 3.2.3 Xác định khoảng tuyến tính của phương pháp định lượng

37 3.2.4 Xác định độ lặp lại của phương pháp 41

3.2.5 Xác định độ đúng của phương pháp xây dựng 42

3.2.7 Quy trình phân tíchcurcumin trong huyết tương thỏ

44 3.3 Áp dụng quy trình phân tích lượng curcumin trong huyết tương thỏ

44 3.3.1 Định lượng Curcumin trong huyết tương thỏ sau khi dán BC nạp thuốc và bôi dung dịch cur 44

3.3.2 Các thông số dược động học của cur 46

KẾT LUẬN 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO 49 PHỤ LỤC 55

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

Acetobacter xylinum A xylinum

AUC Diện tch dưới đường cong nồng độ- thời gian

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Các thông số hoá lý của các thành phần curcuminoid 15Bảng 3.1 Kết quả khảo sát độ thích hợp của hệ thống 38Bảng 3.2 Tương quan giữa nồng độ và diện tích píc chuẩn Curcumin 40Bảng 3.3 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ và diện tch pícchuẩn Curcumin 41Bảng 3.4 Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp 42Bảng 3.5 Nồng độ Curcumin trong huyết tương thỏ sau khi dán BC nạp thuốc 44

Bảng 3.6 Nồng độ Curcumin trong huyết tương thỏ sau khi bôi dung dịch cur 45

Bảng 3.7 Các thông số dược động học trên thỏ sau khi đắp BC – cur và bôi cur 47

Bảng 3.8 Các thông số dược động học sau khi đắp BC – cur và bôi cur 47

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1.Cellulose vi khuẩn(x 20 000 lần) 8

Hình 1.2 Cellulose thực vật(x 200 lần) 8

Hình 1.3 Ứng dụng BC bọc vết thương cho vùng da bị bỏng 11

Hình 1.4 Cấu trúc của các thành phần curcuminoid [10] 14

Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ và diện tích píc chuẩn Curcumin 40

Hình 3.2 Đường cong nồng độ thuốc theo thời gian trong huyết tương thỏ sau khi đắp BC Cur và bôi Cur 46

1

1 Lý do chọn đề tài

MỞ ĐẦU

Curcumin - một hợp chất thiên nhiên, có nhiều trong rễ củ câyNghệ Các nghiên cứu in vitro, in vivo và trên lâm sàng đã chứng minh cácđặc điểm dược động học, tính an toàn và khả năng cho hiệuquả điều trịvớinhiều loại bệnh của curcumin Một số khả năng tác dụng khác cũng đượcnghiên cứu nhiều như: chống viêm, kháng khuẩn, chống bệnh sốt rét, chốngung thư, bảo vệ gan, thận, chống huyết khối, bảo vệ thành tim, chống thấpkhớp [3] Trên in vitro, curcumin có hiệu quả ức chế tăng sinh của các tế bàoung thư buồng trứng, vú, cổ, tuyến tền liệt, kết tràng, gan, tuyến tuỵ vàxương Về ứng dụng trong thực tiễn, curcumin đã được sử dụng nhiều để hỗtrợ điều trị các bệnh khác nhau như: đục thủy tnh thể, vết thương khó liền,sỏi mật, dị ứng, viêm tụy, viêm loét dạ dày, viêm ruột, sốt, hội chứng suygiảm miễn dịch mắc phải, bệnh vẩy nến, bệnh Alzheimer, xơ cứng bì, suygiáp, xơ nang, xơ vữa động mạch, nhồi máu cơ tim, loãng xương, bệnh phổi,sốt rét, viêm khớp, bệnh Leishmania, đái tháo đường, bệnh đa xơ cứng,bệnh động kinh, bệnh Parkinson và bệnh ung thư [11],[46]

Hạn chế của curcumin: hấp thu kém, chuyển hoá và thải trừ khỏi cơ thểnhanh nên sinh khả dụng rất thấp [7] Curcumin là một hợp chất kỵ nước, độhoà tan ở pH sinh lý rất thấp (khoảng 11 ng/mL) Curcumin có tốc độ chuyểnhoá và thải trừ nhanh, bị thuỷ phân trong môi trường kiềm và phân huỷkhi gặp ánh sáng, nhiệt độ cao và điều kiện oxi hoá Rất nhiều phương pháp

đã được ứng dụng để làm tăng sinh khả dụng của curcumin thông qua làmtăng độ tan, độ ổn định và tính thấm qua màng tế bào bằng các kỹ thuậthoá học, kỹ thuật bào chế phân tử Tuy nhiên, cho tới nay, vẫn chưa pháttriển thành công được một loại thuốc nào từ curcumin có tác dụng nhưmong đợi trong điều trị lâm sàng [11]

Trong những năm gần đây đã có sự chú ý đặc biệt về việc sử dụng cácvật liệu sinh học trong các sản phẩm chăm sóc sức khỏe vì khả năng tái tạo,tương thích sinh học và phân hủy sinh học của chúng Một trong nhữngvật liệu sinh học có những đặc tính trên được chú ý là cellulose Vật liệu nàyvượt trội so với các polyme tự nhiên và tổng hợp khác Trong đó, BacterialCellulose (BC) là đối tượng của nhiều nghiên cứu ứng dụng của các nhà khoahọc trong nước cũng như nước ngoài Đây là một loại vật liệu mới, được ứngdụng trong nhiều lĩnh vực như thực phẩm, y học, mỹ phẩm, Theo kết quảnghiên cứu cho thấy màng BC được tạo nên từ các nguyên liệu rẻ tiền, dễkiếm, có thể sản xuất trên quy mô công nghiệp Về mặt tính chất, BC có độtinh sạch lớn hơn rất nhiều so với các loại cellulose khác, có thể phân hủysinh học, tái chế hay phục hồi hoàn toàn Ngoài ra, BC còn có độ bền tinh thểcao, sức căng lớn, trọng lượng thấp, ổn định về kích thước BC còn là mộtmạng polyme sinh học có khả năng giữ nước rất lớn, giải phóng nước kéo dài.Đồng thời BC còn có tính xốp, độ ẩm cao, có lực bền cơ học cao Vì vậy, BC

có tiềm năng cao cho các ứng dụng trong các hệ thống giải phóng thuốc qua

da, qua đường miệng và mô - kỹ thuật, và một số ứng dụng y sinh học khác[8],[16],[20],[21],[22],[24],…

Xét về tiềm năng làm hệ thống giải phóng thuốc qua da, ngoài nhữngđặc điểm lợi thế trên, màng BC còn là hàng rào cản oxi và các sinh vật khác,ngăn cản sự phân hủy các cơ chất ở trong tế bào và sự tác động của UV.Đồng thời BC cũng là vật liệu không gây kích ứng da (do có bản chất làsaccarit), an toàn cho da [24]

Gần đây, một số nghiên cứu trên thế giới về việc ứng dụng màng BC làmvật liệu hấp thu và giải phóng thuốc qua da với một số loại thuốc có hiệu quả

rõ rệt, khắc phục được nhược điểm của thuốc ở dạng thông thường Việc sửdụng màng BC cho việc thẩm thấu qua da của nhiều thuốc, cụ thể làlidocaine

[48], cafeine [44], diclofenac [45], amoxicillin [42], benzalconium chloride[20] và sulfadiazine bạc [35] cho kết quả tch cực Các kết quả nghiên cứunày đã chứng minh rằng các tính chất cơ học của BC có độ bền và trương nởtương tự như da người; hỗ trợ sự phát triển, di chuyển của tế bào da của conngười [16],[19],[20].

Lợi thế lớn nhất từ việc sử dụng màng BC nạp thuốc là khả năng chữalành vết thương, đặc tính bảo vệ, không dị ứng với da và khả năng hấpthu dịch tiết với việc giải phóng các loại thuốc trị liệu có liên quan Hầu hếtcác chế phẩm đắp qua da được sản xuất bởi các vật liệu khác nhau Do đó,một hệ thống nạp thuốc có khả năng giải phóng thuốc kéo dài có ít lớp, hoặcthậm chí một lớp duy nhất có thể đơn giản hóa quy trình sản xuất và giảmchi phí [8],[48]

Trong điều trị nhiễm khuẩn trên da không có triệu chứng toàn thânđược khuyến cáo tránh sử dụng các chế phẩm kháng sinh thường đượcdùng rộng rãi toàn thân như penicilin, sulfonamid, streptomycin,gentamicin, do có khả năng gây mẫn cảm và tạo thuận lợi cho phát triển vikhuẩn kháng thuốc Để giảm thiểu phát triển vi khuẩn kháng thuốc, chỉ dùngcác chế phẩm chứa các loại kháng sinh bôi trên da

Rào cản lớn khiến thuốc curcumin chưa được ứng dụng rộng rãi là docurcumin không tan trong nước (độ tan 0,001%), sinh khả dụng thấp [18] Vìvậy, khi dùng theo đường uống, curcumin hòa tan một phần rất nhỏ vào cácdịch thể của ống têu hóa, chỉ 7- 10 % curcumin được hấp thu vào máu, lại bịchuyển hóa nhanh qua gan, làm cho sinh khả dụng thực tế của curcumin chỉđạt

2-3 % [16] Màng BC có khả năng thay đổi khả năng giải phóng, hơn nữa chưa

có đề tài nghiên cứu về hệ BC nạp curcumin nên chúng tôi đã chọn đề tài:

“Nghiên cứu sinh khả dụng invivo của curcumin giải phóng từ màng Bacterial cellulose nạp thuốc dùng qua da”

2 Mục đích nghiên cứu

Nghiên cứu sinh khả dụng invivo của curcumin giải phóng từ màng

Bacterial cellulose nạp thuốc dùng qua da

3 Nhiệm vụ nghiên cứu

- Làm thí nghiệm in vivo trên động vật nghiên cứu là thỏ

+ Xác định nồng độ thuốc ngưỡng và nồng độ thuốc trong mẫu BC - curcumin

+ Sử dụng hệ BC - curcumin cho động vật nghiên cứu : Đắp BC - curcumin và bôi dung dịch curcumin nguyên chất

+ Thu thập mẫu máu thỏ theo thời gian cố định trong 24h sau khi đắp

BC – curcumin và bôi dung dịch curcumin

-Phân tích mẫu máu bằng máy HPLC để xác định sinh khả dụng của thuốc và các thông số dược động học

4.Vật liệu và phạm vi nghiên cứu

Vật liệu nghiên cứu

Địa điểm nghiên cứu

Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng, trường Đại học Sư phạm HàNội 2

Viện kiểm nghiệm thuốc trung ương cơ sở 2, Tựu Liệt, Tam Hiệp, ThanhTrì, Hà Nội

5.Phương pháp nghiên cứu

6 Đóng góp mới của đề tài

Đây là đề tài đầu tiên nghiên cứu sinh khả dụng curcumin giải phóng từ

hệ BC nạp thuốc curcumin Kết quả nghiên cứu có thể định hướng sửdụng bào chế các loại thuốc dùng qua da

NỘI DUNG

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Bacterial Cellulose

1.1.1 Vi khuẩn Acetobacter xylinum

Một số loài vi khuẩn thuộc các chi khác nhau có khả năng tổng hợp

cellulose (gọi là bacterial cellulose) như Acetobacter, Achromobacter,

Aerobacter, Rhizobium[15] Trong các loài trên, Acetobacter xylinum là vi

khuẩn tạo cellulose hữu hiệu nhất A xylinum được Brown mô tả lần đầu tiên

vào năm 1886 với khả năng tạo ra lớp màng giống gelatin trên bề mặt môitrường lên men có thành phần hóa học giống cellulose Sau đó các khảosát tếp theo bằng kính hiển vi cho thấy vi khuẩn được phân bố trong toàn bộlớp mạng lưới cellulose này Hiện nay vi khuẩn A xylinum là chủng vi khuẩn cólợi trong lĩnh vực sản xuất cellulose bằng con đường sinh tổng hợp A xylinumthuộc nhóm vi khuẩn Acetc, chi Acetobacter, họ Pseudomonadaceae Gầnđây nó đã được xếp vào chi mới Gluconacetobacter Vi khuẩn hiếu khí, cóchu mao và sản xuất cellulose ngoại bào Theo khóa phân loại Bergey, A.xylinum thuộc lớp Schizomycetes, bộ Pseudomonadales, bộ phụ

Pseudomonadieae, họ Pseudomonadaceace Vi khuẩn A xylinum hình que,

thẳng hay hơi cong, dài khoảng 2-3 µm, bề ngang khoảng 0,6-0,8 µm, khôngsinh bào tử, có thể di động hoặc không, thường sắp xếp riêng lẻ, đôi khi

thành chuỗi A xylinum là vi khuẩn gram âm, nhưng trong những trường

hợp đặc biệt như khi vi khuẩn già hay do ảnh hưởng của môi trường nuôicấy lâu ngày hình dạng và gram của vi khuẩn có thể thay đổi, tế bào dài hơn,phình to ra, phân nhánh hoặc không phân nhánh, trong trường hợp này

giống bị thoái hoá dần, chất lượng cellulose kém A xylinum có thể phát

triển trong phạm vi pH từ 3-8, nhiệt độ

phát triển từ 12-30oC Ở 37oC vi khuẩn này bị thoái hóa hoàn toàn Nhiệt độthích hợp nhất là 25oC, pH tối ưu để tạo cellulose là 5,5

Trong môi trường nuôi cấy lỏng, ở trạng thái tĩnh, vi khuẩn sử dụng chấtdinh dưỡng chuyển hoá thành cellulose tạo váng dày trên bề mặt của cơchất Ở trạng thái động, cellulose tạo thành sẽ có hình elip hoặc dạng sợinhỏ Khi tạo cellulose, vi khuẩn đồng thời tích lũy khoảng hơn 4 % acidacetic, điều này sẽ làm pH môi trường giảm đi từ 1-2 so với pH môi trường

ban đầu Tuy nhiên, A.xylinum có khả năng chịu được pH thấp Ứng dụng ưu

điểm này, khi nuôi cấy người ta thường cho thêm acid acetic để tránhnhiễm các loại vi khuẩn lạ [12]

Đặc điểm sinh hoá của A xylinum: vi khuẩn có khả năng oxy hóa

ethanol thành acid acetic, phản ứng catalase dương tính, không tăng trưởngtrong môi trường Hoyer, không tạo sắc tố nâu, có khả năng tổng hợpcellulose, chuyển hóa glucose thành acid acetic, chuyển glycerol thànhdihydroxy aceton Khi nuôi trên môi trường rắn, lúc tế bào còn non, khuẩnlạc mọc riêng rẽ, nhầy, trong suốt, xuất hiện sau 3-5 ngày Khi già, tế bàomọc dính nhau thành từng cụm, khuẩn lạc mọc dính nhau thành lớp màng.

1.1.2 Cấu trúc của BC

Màng cellulose vi khuẩn (BC) cấu tạo bởi những chuỗi polymer 1,4glucopyranose mạch thẳng được tổng hợp từ một số loài vi khuẩn, chủ yếu là

Acetobacter xylinum(A xylinum) Màng BC do A xylinum tạo ra có cấu trúc

hóa học đồng nhất với cellulose thực vật nhưng lại có một số tính chất hóa línhư: độ bền cơ học và khả năng thấm hút nước cao, đường kính sợi nhỏ, độtinh khiết cao, khả năng polymer hóa lớn Hiện nay màng BC được xem lànguồn nguyên liệu mới có tiềm năng ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực khácnhau như công nghiệp thực phẩm, công nghệ giấy, công nghệ sản xuất pin ,Trong lĩnh vực y học, màng BC đã được một số nước trên thế giới nghiên cứuứng dụng làm màng trị bỏng, mặt nạ dưỡng da, mạch máu nhân tạo Báo

cáo này tập trung nghiên cứu vi khuẩn A xylinum tạo màng BC được phân lập

từ một số nguồn nguyên liệu ở Việt Nam ứng dụng trong điều trị bỏng.[9]Cấu trúc Kỹ thuật nhiễu xạ ta X phân biệt các dạng cấu trúc và kíchthước của cellulose vi khuẩn Các kỹ thuật phân tích phổ hồng ngoại và phổcộng hưởng từ hạt nhân giúp xác định dạng kết tinh của cellulose vi khuẩn

Hình 1.1.Cellulose vi khuẩn

(x 20 000 lần)

Hình 1.2 Cellulose thực vật

(x 200 lần)

Nguồn: Brown R.M (1999), Pure Appl Chem 71 [43]

Cellulose vi khuẩn có cấu trúc siêu mịn, đường kính sợi bằng 1/100đường kính của sợi cellulose thực vật So sánh đường kính của sợi cellulose vikhuẩn với đường kính của các sợi nhân tạo cho thấy kích thước của sợicellulose vi khuẩn còn nhỏ hơn cả kích thước của sợi tổng hợp hóa học nhỏnhất Cellulose là một polymer không phân nhánh bao gồm những gốcglucosepyranose nối với nhau bởi nối β -1,4 glucan Các nghiên cứu cơ bản

về BC cho thấy BC có cấu trúc giống cellulose thực vật Tuy nhiên cấu trúccao phân tử và các đặc tính của BC khác với cellulose thực vật Các sợi mớisinh ra của BC kết lại với nhau đểhình thành các sợi sơ cấp (subfibril) Các visợi nằm trong các bó (bundle) và cuối cùng hình thành các dải (ribbon) Cácdải có chiều dày 3- 4 nm, chiều rộng, 4,1- 117 nm [12] Trong khi chiều rộngcủa các sợi cellulose được tạo ra từ gỗ thông là 30 000 – 75 000 nm hay gỗbạch dương (betula) là 14 000 – 40 000 nm Những dải vi sợi cellulose mịn cóchiều dài thay đổi từ 1 – 9 µm hình thành nên cấu trúc lưới dày đặc, đượcliên kết bởi những liên kết hydro BC khác với cellulose thực vật bởi chỉ sốkết

chặt, về mức độ polymer hóa, thường BC có mức độ polymer hóa từ 2000đến

6000

1.1.3 Tính chất của BC

Tính chất cellulose vi khuẩn BC có độ bền cơ học, hóa học cao và cókhả năng cản vi khuẩn [37].Với tính chất này màng BC đã được chế tạo làmmàng lọc cản khuẩn Khả năng hút nước của BC lớn hơn rất nhiều so vớicellulose thực vật (so sánh với sợi bông, cao hơn gần 200 lần) Khả năng nàycòn tùy thuộc vào trạng thái của cellulose Cellulose ở trạng thái ẩm ướt

có khả năng hút nước cao hơn ở trạng thái khô (khoảng 10 lần) Nhưng nếulàm khô BC bằng phương pháp đông khô thì khả năng giữ ẩm sẽ tốt hơn BClàm khô tự nhiên[8]

Cellulose vi khuẩn là cellulose sinh học duy nhất được tổng hợp màkhông gắn lignin, có thể bị phân hủy bởi một số : CBH I và EG II là hỗn hợp

2 enzym cellulase được tinh chế từ Tricoderma viride với tên thương mại làMeicelase (Meiji Seika, Tokyo, Japan) có khả năng thủy phân BC Có thểkiểm soát được kích thước, cấu trúc (dạng A - BC hay S - BC) và chất lượngcủa cellulose (kiểm soát cellulose kết tinh) trong quá trình nuôi cấy tạocellulose

1.1.4 Các ứng dụng của BC trong Y học

Sử dụng BC chế tạo màng sinh học điều trị vết thương mất da:màng BCthu được sau khi nuôi cấy tnh được nghiên cứu sử dụng làm da nhân tạonhờ có một số tính chất đặc biệt như khả năng hút dịch, khả năng cản khuẩn,được sử dụng trong những trường hợp bị bỏng nặng[8],[12].Hơn nữa, người

ta thấy dường như BC còn có khả năng làm cho các tế bào da phát triển.Với những ưu điểm này, màng BC được sản xuất và bán ra thị trường vàđược sử dụng trong điều trị các loại vết thương mất da (chế phẩm BioFill®,Gengiflex®, Bioprocess ®) Người ta đã nghiên cứu tẩm nano bạc vào màng

BC nhằm tạo

cho màng có hoạt tính kháng khuẩn Trong nghiên cứu này NaBH4 đượcthêm vào để làm giảm sự hấp thu ion Ag+ vào màng, chỉ cho dạng nano Agothấm vào màng Màng BC có tẩm nano bạc có hoạt tính kháng khuẩn đối vớiEscherichia coli và Staphylococcus aureus [12].Sử dụng làm tá dược: dựa vàođặc tính trương nở, bột BC đã được sử dụng làm tá dược rã, tá dược ổn địnhcác nhũ tương Nhiều nghiên cứu cho thấy BC có cấu trúc tương tự nhưcellulose thực vật nên BC được thủy phân để tạo thành dạng bột và đượcứng dụng làm tá dược rã trong bào chế, trong sản xuất viên nén, làm chấtnhũ hóa, chất phân tán, chất ổn định trong nhũ tương, nhũ dịch.Sử dụnglàm vật liệu cấy ghép: BC có khả năng dung hợp, không gây biến chứng vàduy trì sự liên kết chặt chẽ, có tính tương hợp sinh học, độ bền cơ họccao, không thấm rỉ các thành phần của máu nên đã được sử dụng làm vỏbọc bảo vệ cho đường nối dây thần kinh.

Ứng dụng làm mạch máu nhân tạo: một nghiên cứu mới ở Mỹ cho thấy

BC còn được ứng dụng làm mạch máu nhân tạo - chế phẩm BASYC ® hỗ trợcho vi phẫu thuật[12]

Sử dụng trong nha khoa: các sản phẩm từ BC hiện nay đang được ápdụng rộng rãi trong việc cấy ghép phẫu thuật và nha khoa như làm phục hồicác mô quanh răng để phân cách các tế bào biểu mô miệng và nướu răngkhỏi bề mặt chân răng cần chữa trị

1.1.5 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng màng BC làm vật liệu hấp thu và giải phóng thuốc qua da

1.1.5.1 Trên thế giới

Với những đặc tính độc đáo trên, BC là vật liệu hấp dẫn cho các nhàkhoa học nghiên cứu ứng dụng trong nhiều lĩnh vực trong đó có lĩnh vựcdùng BC làm vật liệu hấp thụ và giải phóng thuốc qua da

Một số nghiên cứu trên thế giới về khả năng hấp thụ và giải phóngthuốc của màng BC định hướng sử dụng qua da với một số loại thuốc đãcho thấy có hiệu quả rõ rệt, khắc phục được một số nhược điểm củathuốc ở dạng thông thường.

Một trong những ứng dụng y sinh học nổi tiếng nhất của BC là như làmột màng cản khuẩn cho những vết thương hở nghiêm trọng Nghiên cứucủaCzaja và cộng sự (2007) [24] đã chỉ ra BC có khả năng băng kín vếtthương, duy trì dịch tiết, làm giảmđau vết thương, tăng tốc tái tạo tế bào,làm giảm tỷ lệ nhiễm trùng vết thương, giảm sẹo và dễ dàng tháo gỡ,kiểm tra Bên cạnh đó, với vết thương mất da, nhiễm trùng trên da, BC đápứng được nhu cầu giữ ẩm cho da, tránh da bị khô (hình 1.7)

Hình 1.3 Ứng dụng BC bọc vết thương cho vùng da bị bỏng

Nguồn: Czaja WK, Young DJ, Kawecki M, Browm RM (2007) [24].

Để tăng khả năng giữ ẩm cho da của BC, một số tác giả nghiên cứu vềlidocaine [48], cafeine [31], diclofenac [45], amoxicillin [42], benzalconiumchloride [20] và sulfadiazine bạc [35] cho thấy việc bổ sung glycerol vàomàng BC giúp màng linh động hơn và tạo điều kiện giữ ẩm cho bề mặt da

Tất cả các loại thuốc trên đã được thử nghiệm in vitro cho thẩm thấu qua

da và so sánh với cách thức thông thường Kết quả cho thấylidocaine hydrochloride (là chất tan trong nước tương tự như neomycin)giải phóng từ BC qua màng da nhân tạo chậm hơn ibuprofen (một chất ưu

lipit) Kết quả

này cho thấy màng BC có cấu trúc mạng không gian ba chiều phức tạp đã làmcho sự khuếch tán của thuốc được kéo dài và làm giảm tỷ lệ giải phóng thuốckhi so sánh với các cách thức thông thường, đây là một lợi thế cho việcđiều trị dài hạn của thuốc mà không gây tình trạng quá mẫn Bên cạnh đó,Luan J và cộng sự (2012) [35] đã nghiên cứu màng BC cho băng vết thươngnạp sulfadiazine bạc, một loại thuốc phổ biến được sử dụng trong điều trị vếtthương nhiễm khuẩn do bỏng Nó đã được chứng minh rằng sau khi sử

dụng màng BC ngâm tẩm bạc sulfadiazine, hoạt động kháng khuẩn đối với P.

aeruginosa,E coli và S aureus đạt hiệu quả tốt hơn dạng kem bôi hay dung

dịch thông thường

Nghiên cứu của Wei B và cộng sự (2011) [49] cho thấy màng khô BCthu được sau khi ngâm trong benzalkonium chloride (một tác nhân khángkhuẩn) có khả năng giải phóng thuốc trên mỗi đơn vị diện tích bề mặt đãđược tìm thấy là 0,116 kg/cm2, và tác dụng của thuốc kéo dài ít nhất 24h

chống lại hoạt động của S aureus và B subtilis Sợi BC với các hạt nano

bạc đã sản xuất thành công lên đến 99,99% hoạt tính kháng khuẩn chống lại

E coli và S Aureus Đồng thời trong các thí nghiệm trên vết thương hở bị

nhiễm khuẩn, BC cũng có vai trò như màng cản khuẩn, giảm sự xâm nhậpcủa vi khuẩn mới, giúp vết thương nhanh hồi phục [20] Nghiên cứu kháccho thấy việc sử dụng nanocomposites bạc với BC đã cho hiệu quả khángkhuẩn cao [41] Các S-enantiomer của propranolol, một loại thuốc chốngcao huyết áp, có được

giải phóng từ một lớp composite của BC với methacrylate, và đã thử

nghiệm in vivo cho kết quả tốt [17], [22] Một miếng dán có thể giải phóng

thuốc enantomeric đã được chứng minh bằng cách sử dụng một bể chứa gel

và polyme in dấu phân tử (MIP) màng Nghiên cứu về gel miếng dán gồm củachitosan và poloxamer chứng minh rằng sau 8h, Cmax của S-propranolol đã

đạt được (8,0 ± 1,0 ng/ml) từ một hồ chứa 1,5 mg propranolol racemic [39].Tiềm

năng vận tải và phân phối thuốc của màng BC qua da đã được nghiêncứu bằng cách tải tetracycline trong chùm electron mẫu chiếu xạ và khôngđược chiếu xạ BC không chiếu xạ cho phép giải phóng thuốc nhanh hơn sovới ảnh hưởng của BC chiếu xạ Kết quả nghiên cứu này cho thấy màng BCkhông chỉ có khả năng vận tải mà còn đề xuất một mô hình cho giải phóngthuốc qua màng [16].

1.1.5.2 Tại Việt Nam

Nguyễn Văn Thanh và cộng sự (2006) [12] đã tiến hành nuôi cấy, tnh

chế và thu màng BC từ A Xylium đạt hiệu quả cao Đồng thời nhóm nghiên cứu trên cũng đã tiến hành thử nghiệm in vivo trong ứng dụng màng BC điều

trị bỏng da với 2 loại màng BC gồm cho thêm hoạt chất tái sinh mô và hoạtchất kháng khuẩn Kết quả cho thấy tác dụng của màng có thêm hoạt chất táisinh mô tốt hơn hẳn dạng màng thông thường

Nhóm tác giả Nguyễn Thị Kim Ngoan, Đinh Thị Kim Nhung [9] nghiêncứu ở quy mô phòng thí nghiệm chế tạo màng BC làm mặt nạ dưỡng da

Từ những kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học trên đã chứng minh

BC có khả năng tuyệt vời trong việc hấp thụ và giải phóng một số loại thuốcqua da

1.2 Thuốc Curcumin

1.2.1 Công thức

Cây Nghệ vàng có tên khoa học là Curcuma longa L thuộc họ gừng(Zingiberaceae) Trên thế giới, Nghệ vàng phân bố ở các vùng nhiệt đới, cậnnhiệt đới và được trồng chủ yếu ở các nước châu Á như Ấn Độ, Trung Quốc,Pakistan, Bangladesh, Indonesia và Việt Nam Thành phần hóa học chínhquan trọng nhất của thân rễ Nghệ vàng là curcuminoid (~ 2-8 %), thành phầntạo màu vàng cho củ Nghệ Hỗn hợp curcuminoid bao gồm 3 thành phầnchính: curcumin (Cur), demethoxycurcumin (DMC)và

bisdemethoxycurcumin(BDMC) (hình 1.1) chiếm lần lượt khoảng 77 %, 17

%, 3 % [7]

Cấu trúc của curumin

Cấu trúc của demethoxycurcumin

Cấu trúc của bisdemethoxycurcumin

Hình 1.4.Cấu trúc của các thành phần curcuminoid[6]

Curcumin, danh pháp quốc tế hepta-1,6diene-3,5-dione, chiếm hàm lượng cao nhất trong 3 thành phần vàcũng được chứng minh có nhiều hoạt tnh sinh học mạnh và đa dạng hơn

1,7-bis-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-so với 2 thành phần còn lại.[6]

1.2.2 Một số tính chất hóa lý của curcumin

Curcumin là chất rắn kết tinh màu vàng cam, tan trong chất béo,ethanol, methanol, dichloromethane, acetone, acetc acid băng và hầu nhưkhông tan trong nước ở môi trừờng acid hay trung tính (độ tan < 10µg/ml ở25oC) Trong môi trừờng kiềm, curcumin tạo dung dịch màu đỏ[7] Dung dịch

curcumin trong dung môi hữu cơ có độ hấp thu cực đại ở bứớc sóng từ

Bảng 1.1 Các thông số hoá lý của các thành phần curcuminoid [7]

1.2.3 Hoạt tính sinh học của curcumin

Từ lâu Nghệ vàng đã được sử dụng rộng rãi ở nhiều quốc gia châu Á vớivai trò làm gia vị, chất tạo màu trong thực phẩm, chất bảo quản và cũng

là một phương thuốc dân gian hiệu quả chữa trị nhiều loại bệnh khác nhaunhư rối loạn tiêu hóa, viêm loét dạ dày, rối loạn chức năng gan mật, thấpkhớp, viêm xoang, hỗ trợ điều trị viêm nhiễm, giúp mau lành vết thương,mau liền da và làm đẹp da Chính vì vậy, trong nhiều thập kỷ qua, curcumin

đã trở thành đối tượng thu hút hàng nghìn các nghiên cứu khác nhau và đãđược chứng minh có nhiều hoạt tnh sinh học mạnh và đa dạng, đóng vai tròquan trọng đem lại hoạt tnh cao của củ Nghệ vàng Hàng loạt công trìnhnghiên cứu in vitro, in vivo và nhiều nghiên cứu lâm sàng đã cho thấycurcumin có tác dụng hỗ trợ và điều trị rất nhiều loại bệnh lí khác nhau.Curcumin giúp làm giảm cholesterol máu, ức chế sự oxy hóa LDL (lipoprotein

tỷ trọng thấp), ức chế sự kết tụ tiểu cầu, ngăn ngừa chứng nghẽn mạch,bệnh nhồi máu cơ tm, ngăn chặn các triệu chứng liên quan đến tiểu đườngtuyp 2, hỗ trợ ngăn ngừa các loại bệnh như viêm thấp khớp, các bệnh đa xơcứng, bệnh suy giảm trí nhớ (Alzheimer), ức chế sự nhân bản của virus HIV,

hỗ trợ làm lành vết thương, hỗ trợ bảo vệ gan, tăng sự đào thải, hỗ trợtrong việc bảo vệ cơ thể

khỏi các bệnh đục thủy tnh thể, các bệnh về phổi, xơ hóa phổi, bệnh xơ vữađộng mạch… Trong số đó, kháng oxy hóa và kháng ung thư là những hoạttính quan trọng của curcumin và là đối tượng của rất nhiều công trình nghiêncứu[10], [13], [36], [46], [47].

1.2.4 Tính khả dụng sinh học của curcumin

Mặc dù có hoạt tnh sinh học cao, các nghiên cứu về dược động học đãchứng minh curcumin có tính khả dụng sinh học (bioavaiability) khá thấp.Nghiên cứu trên chuột cho thấy, sau khi uống, phần lớn curcumin được hấpthu, chuyển hóa và đào thải rất nhanh qua ruột, chỉ lượng nhỏcurcumin chuyển vào máu và các mô khác trong cơ thể Ở liều uống 1 g/kgcurcumin,

75 % lượng curcumin bị đào thải qua phân và lượng rất nhỏ trong nướctiểu Ở các liều thấp hơn 400, 80, 10 mg và 500 mg/kg, gần 40 % curcuminkhông bị biến đổi tìm thấy ở phân sau 24 giờ [49].Sau khi uống, tại ốngtiêu hóa, phần lớn curcumin bị chuyển hóa thông qua các phản ứng khử,glucuronoside hóa và sulfate hóa trước khi đi vào vòng tuần hoàn máu Sảnphẩm chuyển hóa curcumin trong huyết thanh chuột được xác định gồmcurcumin glucuronoside, curcumin sulfate, lượng nhỏ hexahydrocurcumin,hexahydrocurcuminol, hexahydrocurcumin glucuronoside [30, 23] và sảnphẩm kết hợp đồng thời glucuronoside/sulfate curcumin [14] Curcumin bịkhử bởi hệ khử nội sinh (endogenous reductase system) và tham gia cácphản ứng kết hợp được xúc tác bởi các enzyme tạo phản ứng glucuronosidehóa và sulfate hóa ở gan, thận và niêm mạc ruột [14] Khi tiêm curcuminbằng đường bụng (i.p.), sản phẩm chuyển hóa chính trong huyết thanh,ngoài curcumin glucuronoside còn có các sản phẩm khử khác, gồmdihydrocurcumin glucuronoside, tetrahydrocurcumin (THC) glucuronoside,hexahydrocurcumin glucuronoside và THC Sinh chuyển hóa curcumin và các

sản phẩm chuyển hóa theo đường i.p được đề nghị trong hình 1.10 [38] Ởngười, nghiên cứu in vitro cho thấy,

curcumin bị chuyển hóa nhanh ở ruột thông qua các phản ứng khử hóa,glucuronoside hóa và sulfate hóa, phản ứng xảy ra nhanh hơn so với ở chuột.Tại gan, các phản ứng kết hợp tiếp tục xảy ra, tuy nhiên mức độ thấp hơn ởchuột [26] Các phản ứng chuyển hóa xảy ra nhanh Ở chuột, nồng độcao nhất các sản phẩm chuyển hóa của curcumin trong huyết thanh đạt đượcchỉ 1 giờ sau khi uống [14] Nhiều nghiên cứu trên chuột chứng chứng minh,thời gian bán hủy của curcumin trong cơ thể khá thấp Ở các liều uống 2g/kg, 1 g/kg và 500 mg/kg curcumin, thời gian bán hủy đạt được lần lượt là1,7 giờ,

1,45 giờ và 44,5 phút [33],[34] Ở liều tiêm tnh mạch (i.v.) 40 mg/kg, chỉ sau

1 giờ đã không phát hiện curcumin trong huyết thanh [23] Chính vì các yếu

tố trên, sinh khả dụng của curcumin trong cơ thể khá kém Nồng độ curcumin

đo được trong huyết thanh ở các liều uống khác nhau trên cả chuột và ngườiđều rất thấp [33],[34] Ở người với liều uống 2 g, không phát hiện curcumintrong huyết thanh hoặc nồng độ curcumin cực kỳ thấp 0,006 µg/ml sau 1 giờ[31].Ở nồng độ 500 mg/kg, sinh khả dụng của curcumin theo đường uống chỉkhoảng 1 % [34] Nghiên cứu trên các bệnh nhân tiền ung thư hoặc có nguy

cơ ung thư cao với các liều uống cao hơn 4 g, 6 g, 8 g curcumin/ngày trong 3tháng, cho thấy nồng độ curcumin trong huyết thanh thường đạt đỉnh 1 giờđến

2 giờ sau khi uống và giảm dần trong vòng 12 giờ Ở liều 8 g curcumin/ngày,hàm lượng cao nhất đạt được chỉ khoảng 1,325 µg/ml và không phát hiệnđộc tnh do phản ứng thuốc Tuy nhiên khi vượt qua ngưỡng 8 g, lượngcurcumin quá lớn đối với khả năng tiếp nhận của cơ thể người bệnh [7]

1.2.5 Dược động học của curcumin

Tính chất dược động học và dược lực học của curcumin có ảnh hưởngrất lớn đến hiệu quả điều trị Curcumin có những đặc điểm dược động họckhông thuận lợi như: hấp thu kém, chuyển hoá và thải trừ khỏi cơ thể nhanh

nên sinh khả dụng rất thấp [11],[47] Curcumin là một hợp chất kỵ nước, độhoà tan ở

pH sinh lý rất thấp (khoảng 11 ng/mL) Curcumin có tốc độ chuyển hoá vàthải trừ nhanh, bị thuỷ phân trong môi trường kiềm và phân huỷ khi gặp ánhsáng, nhiệt độ cao và điều kiện oxi hoá Khả năng hấp thu curcumin kém ởruột có thể do độ tan thấp, ngoài ra còn bị phân huỷ ở pH trung tnhhoặc kiềm và bị ảnh hưởng chuyển hóa của các enzym Nghiên cứuđánh dấu phóng xạ đã cho thấy hầu hết liều uống được bài tiết trong phân

và một phần ba curcumin vẫn không thay đổi cấu trúc Rất nhiều phươngpháp đã được ứng dụng để làm tăng sinh khả dụng của curcumin thông qualàm tăng độ tan, độ ổn định và tính thấm qua màng tế bào bằng các kỹ thuậthoá học, kỹ thuật bào chế phân tử [9] Một số kỹ thuật bào chế chính làmtăng sinh khả dụng của curcumin như: tạo phức hợp dạng lồng phân tửcurcumin-cyclodextrin; bào chế dưới dạng liposome, tạo micell với các chấtdiện hoạt; bào chế phức hợp phytosome; tạo tiểu phân nano curcumin vớicác chất mang polymer Sử dụng kết hợp cùng với các chất tăng sinh khảdụng cũng đã được ứng dụng (kết hợp với piperine để ức chế glucuronidhoá) Một số nghiên cứu còn tổng hợp các cấu trúc tương tự curcumin nhằmtạo ra các chất có nhiều ưu điểm hơn Tuy nhiên, cho tới nay, vẫn chưa pháttriển thành công được một loại thuốc nào từ curcumin có tác dụng nhưmong đợi trong điều trị lâm sàng Các nghiên cứu gần đây chú ý nhiều tớiviệc tạo dẫn chất PEG hóa curcumin Theo hướng này, có nhiều hứa hẹn đểtăng tnh ứng dụng của curcumin trong thực tễn điều trị[11]

Curcumin chữa lành vết thương, được cho là do sự hiện diện củamyofibroblast, và tăng cường biểu hiện fibronectn và collagen [1] Việc điềutrị vết thương bằng curcumin đã được báo cáo là làm tăng sự hình thành môhạt, bao gồm nội dung tế bào lớn hơn; Neo-vascularisation; Và nhanhchóng tái tạo biểu hiện vết thương [2] Những phát hiện này cho thấy chấtcurcumin có thể cải thiện sự chậm trễ sửa chữa vết thương do phóng

xạ gây ra

Curcumin cũng được báo cáo là có khả năng chống oxy hóa, kháng viêm, khảnăng chống vi trùng, khả năng chống ung thư[10] Các mô hình động vật khácnhau hoặc các nghiên cứu của con người cũng cho thấy chất curcumin cực kỳ

an toàn ngay cả khi ở liều 12g / ngày[8] Tuy nhiên, tất cả các đặc tnh trêncủa chất curcumin vẫn chưa được thực hiện đầy đủ do độ hòa tan trongnước thấp và sinh khả dụng kém Việc sử dụng curcumin ở liều 2 gkg / 1 đốivới chuột nhắt chỉ dẫn đến nồng độ huyết thanh tối đa là 1,35 (0,23 µgmLsau khi khoảng 1 giờ, trong khi ở người cùng một liều curcumin dẫn đếnkết quả không rõ hoặc cực kỳ thấp 0,005 µg / l trong vòng 1 giờ) nồng độchất curcumin trong micelle polyme, các hạt nano lipid và hydrogel để cảithiện khả năng hòa tan, độ ổn định và tính khả dụng sinh học[7]

1.2.6 Tình hình nghiên cứu cur trên thế giới và Việt Nam

1.2.6.1 Trên thế giới

Curcumin là thành phần hoạt tính của các loài Curcuma bao gồm C.longa (nghệ) Phân tử này nổi tiếng với tác dụng chống viêm, có vẻ như mạnhhơn hydrocortisone Các loài Curcuma đã được sử dụng trong y học cổtruyền châu Á như thuốc chống viêm Curcumin có khả dụng sinh khả dụngđường uống kém và ứng dụng tại chỗ của nó có thể là sự lựa chọn, đặc biệtđối với các hiệu ứng địa phương Tuy nhiên, sự hấp thụ qua da và tăngcường của nó, là đối tượng của cuộc điều tra hiện tại, chưa được nghiêncứu kỹ Sự thẩm thấu của chất curcumin qua da chuột đã được cắt bỏ đượcnghiên cứu ở 25°C sử dụng các tế bào khuếch tán tĩnh.Những kết quả nàycho thấy ethanol và có thể là các lớp tăng cường khác có thể tăng đáng

kể sự thâm nhập của curcumin Các phòng thí nghiệm của chúng tôi đangtiến hành các nghiên cứu sâu hơn bao gồm các ảnh hưởng của các chất tăngcường khác và các phương tện hấp thu chất curcumin và chiết xuất Curcumaqua da[32]

1.2.6.2 Tại Việt Nam

Ngày nay, bệnh viêm và dị ứng da có chiều hướng gia tăng với mức độtái phát cao nên phải điều trị kéo dài Phương pháp điều trị bệnh này thườngkết hợp thuốc uống và thuốc bôi ngoài da Các thuốc bôi ngoài da có nguồngốc thiên nhiên ngày càng được nghiên cứu và sử dụng nhiều do hiệu quảtrị liệu tốt và ít tác dụng phụ Trên thị trường hiện nay, các chế phẩm ngoạinhập có nguồn gốc từ dương cam cúc đang được ưa chuộng Dương cam cúcđược dùng ở dạng trà thảo mộc, các thuốc dược liệu có tác dụng kháng viêm,giảm đau, an thần, trợ têu hoá, đặc biệt hiệu quả trong điều trị vết thươngngoài da bị viêm và dị ứng Các chế phẩm này hiệu quả và an toàn nhưng giáthành cao.

Vì vậynghiên cứu bào chế kem thuốc điều trị bị viêm da và dị ứng từdương cam cúc trồng tại Việt Nam kết hợp thêm dầu nghệ, với mục têu chếphẩm ổn định về lý, hóa học, phóng thích hoạt chất nhanh, có tác dụng tốttrong điều trị, hướng tới thay thế hàng ngoại nhập[13]

Curcumin rất ít tan trong nước, chuyển hoá nhiều qua gan, thời gian bánthải ngắn nên sinh khả dụng (SKD) qua đường uống hoặc qua da không cao

Có nhiều biện pháp đã áp dụng để cải thiện độ tan của curcumin như chếtạo hệ phân tán rắn, dùng chất diện hoạt, giảm kích thước tiểu phân (micro,nano)… Mỗi biện pháp đều mang lại lợi ích nhất định nhưng đều có hạn chếnhư tính an toàn của các tá dược hay chất mang, công nghệ khó triển khai…

Phytosome là phức hợp giữa hoạt chất có nguồn gốc thực vật/dược liệu và phospholipid (PL) Phytosome mang lại nhiều lợi ích, trong đó có

ưu điểm nổi bật là tăng sinh khả dụng do thay đổi phân bố vào cả phanước và pha dầu, tá dược là phospholipid an toàn và tương đồng với màngsinh học Nghiên cứu này tập trung vào bào chế phức hợp (phytosome)curcumin - phosphatydin cholin đậu nành hydrogen hoá và đánh giá một sốđặc tnh về hoá lý của phytosome tạo ra[6]

1.3 Phương pháp HPLC

Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) ra đời năm 1967-1968trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc kí cột cổ điển.HPLC làmột phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứatrong cột chất rắn là đã được phân chia dưới dạng tểu phân hoặc một chấtlỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến bằng liênkết hóa học cới các nhóm chức hữu cơ Phương pháp này ngày càng được sửdụng rộng rãi và phổ biến vì nhiều lý do: có độ nhạy cao, khả năng địnhlượng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủynhiệt[5]

Cmax; tốc độ hấp thu được xác định bằng Tmax [2]

Đối với sản phẩm thuốc mà dược chất không được hấp thu (như thuốc

mỡ dùng ngoài, thuốc nhỏ mắt…), SKD được quyết định bằng phép đo dựavào tốc độ và mức độ hoạt chất hoặc gốc hoạt tnh giải phóng và đưa tới

bề mặt tác dụng [18]

Số liệu về SKD cung cấp sự đánh giá về lượng thuốc được hấp thu, cũngnhư sự phân bố và thải trừ về sau SKD cho thấy số phận của thuốc trong cơthể và được xác định trong suốt quá trình thử nghiệm lâm sàng ở cácgiai đoạn của nghiên cứu ứng dụng thuốc mới SKD phục vụ như chuẩn chocác nghiên cứu TĐSH về sau [20]

1.4.2 Đánh giá sinh khả dụng và tương đương sinh học in vivo

SKD in vivo được biểu thị dưới 2 khái niệm: SKD tuyệt đối và SKD tươngđối, trong đó SKD tương đối thường được dùng nhiều hơn trong nghiên cứuphát triển các sản phẩm thuốc generic

Đánh giá sinh khả dụng in vivo là phương pháp so sánh một số các thông

số dược động học hay hiệu quả sinh học trên cơ thể sống Đánh giá đượctiến hành trên con người hay động vật thí nghiệm Các thông số dượcđộng học như AUC, Cmax, Tmax được so sánh giữa thuốc thử và thuốc đốichứng [1]

1.4.3 Thẩm định phương pháp phân tích trong dịch sinh học

Phân tích hàm lượng dược chất trong dịch sinh học là phương phápđánh giá SKD trực tiếp và chính xác nhất Vì mẫu sinh học thường chứa nhiềutạp chất, lượng mẫu phân tích ít và nồng độ chất phân tích trong dịchsinh học thấp nên trước khi sử dụng phương pháp để định lượng ta phảithẩm định Các thông số cơ bản của việc thẩm định phương pháp phân tchsinh học là: độ đúng, độ chính xác, độ chọn lọc, độ nhạy, tái lặp và độ ổn định[1], [19]

a.Tính chọn lọc – đặc hiệu

Tính chọn lọc- đặc hiệu là khả năng của phương pháp có thể phân biệt

và định lượng được chất phân tích khi có mặt các thành phần khác trongdịch sinh học Chất gây trở ngại tiềm tang trong một dịch sinh học bao gồmthành phần nội sinh, chất chuyển hóa, sản phẩm phân hủy, dược phẩm đikèm và sản phẩm ngoại sinh

Do vậy, trên sắc đồ thu được từ mẫu trắng, mẫu thử và mẫu chuẩn phatrong mẫu trắng thì chất phân tích cần tách hoàn toàn với pic tạp

b.Xây dựng đường chuẩn và xác định khoảng tuyến tính

Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa dấp ứng của pic (Diện tích haychiều cao) và nồng độ thuốc trong dịch sinh học Mối quan hệ này phảiđược

đánh giá bằng phương trình hồi quy Đường chuẩn phải có ít nhất 5 nồng độ

mẫu chuẩn pha trong cùng một mẫu dịch sinh học

Khoảng tuyến tính là khoảng nồng độ từ thấp đến cao trong một đườngchuẩn có đáp ứng tuyến tính Khoảng tuyến tính bao gồm toàn bộkhoảng nồng độ mẫu cần phân tích Trong nồng độ khảo sát, đường chuẩntuyến tính với hệ số R2> 0,98 với điều kiện:

+ Độ lệch so với giá trị thực của các nồng độ ≤ 15%, riêng điểm gầnLLOQ chấp nhận ≤ 20%

+ Ít nhất 4/6 điểm đạt tiêu chuẩn bao gồm cả giới hạn định lượng dưới

(LLOQ) và nồng độ cao nhất

c Giới hạn định lượng dưới (LLOQ)

Mẫu chuẩn có nồng độ thấp nhất trên khoảng tuyến tính được chấpnhận là giới hạn định lượng dưới nếu thỏa mãn điều kiện sau:

+ Đáp ứng ở nồng độ này ít nhất phải bằng 5 lần đáp ứng của mẫu trắng+ Pic của chất phân tích có thể nhận biết, tách biệt và tái lặp với độchính xác nằm trong khoảng giới hạn ±20% và độ đúng từ 80 – 120%

d Độ đúng – độ chính xác

+ Độ đúng của một phương pháp phân tch thể hiện sự gần sát củacác kết quả kiểm nghiệm trung bình thu được từ phương pháp với giá trịthực của mẫu phân tích Độ đúng được xác định bởi phân tích tái lặp của cácmẫu chứa số lượng đã biết của chất phân tích

Độ đúng nên được xác định bằng việc định lượng tối thiểu 5 lần trênmột nồng độ, tối thiểu 3 nồng độ trong dãy nồng độ mong muốn Giá trịtrung bình nằm lệch trong khoảng ± 15% so với giá trị thật trừ LLOQ khôngnên lệch hơn 20%

+ Độ chính xác của một phương pháp phân tch thể hiện sự gần sát củacác lần đo riêng biệt của chất phân tích khi quy trình được lặp lại nhiều lầntrên cùng một mẫu thử đồng nhất.

Độ chính xác nên được xác định bằng việc định lượng tối thiểu 5 lần trênmột nồng độ, tối thiểu 3 nồng độ trong dãy nồng độ mong muốn Độchính xác đo ở mỗi nồng độ không nên vượt quá 15 % của RSD trừ LLOQkhông nên vượt quá 20 %

e Hiệu suất chiết

Hiệu suất chiết xác định tỉ lệ thu hồi mẫu bằng cách tiến hành địnhlượng song song mẫu chuẩn trong pha động và mẫu kiểm chứng

f Độ ổn định

Qúa trình đánh giá SKD thường kéo dài nên đánh giá độ ổn định củahoạt chất trong dịch sinh học là cần thiết Quy trình thử độ ổn định nên đượcđánh giá trong suốt thời gian thu thập và sử dụng mẫu Điều kiện sửdụng trong nghien cứu độ ổn định nên phản ánh những điều kiện nhưtrong quá trình sử dụng và phân tch mẫu Quy trình này nên bao gồm cảđánh giá độ ổn định của chất phân tch trong dung dịch chuẩn gốc độ ổn địnhcủa mẫu huyết tương

Độ ổn định của mẫu trong huyết tương bao gồm:

+ Độ ổn định sau 3 chu kì đông- rã đông

+ Độ ổn định thời gian ngắng ở nhiệt độ phòng đối với dung dịch thứasau khi đã sử lý

+ Độ ổn định thời gian dài để đông lạnh của mẫu thử trong khoảng thờigian dự định

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu và hóa chất

Nguyên liệu: Màng BC đã hấp thu Curcumin có khả năng giải phóng kéo

dài tốt nhất đã thử nghiệm trong invitro.

Hóa chất: Thuốc Curcumin dạng tinh khiết (Ấn Độ), các hóa chất đặcbiệt (pepton, cao nấm men của hãng MERD), các hóa chất thông thường cónguồn gốc Trung Quốc và Việt Nam, và một số hóa chất khác ở dạng tiêuchuẩn phân tích Thuốc chống đông máu EDTA (hoặc thuốc có tác dụngtương tự)

2.1.2 Thiết bị và dụng cụ

Chuồng nuôi thỏ thí nghiệm

Cân phân tích CPA 224S