Phân lập và tuyển chọn chủng pseudomonas sp sinh hoạt chất kháng vibrio sp gây bệnh ở tôm nuôi

số kháng sinh mới được đưa vào sử dụng để khắc phục vấn đề lại rất giới hạn.Hiện tượng đa kháng thuốc kháng sinh đang là mối lo không chỉ của ngườinuôi mà còn của cả các nhà quản lý sức

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

-NGUYỄN HUYỀN TRANG

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG

PSEUDOMONAS SP SINH HOẠT CHẤT KHÁNG

VIBRIO SP GÂY BỆNH Ở TÔM NUÔI

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Hà Nội – 2014

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN

SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

-PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG PSEUDOMONAS

SP SINH HOẠT CHẤT KHÁNG VIBRIO SP GÂY BỆNH Ở

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS Nguyễn Chí Thuận Trưởng phòng Công nghệ Phôi - Viện Công nghệ Sinh học đã tận tnh hướng dẫn

-và dìu dắt tôi trong quá trình nghiên cứu -và hoàn thành luận án

Tôi xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Hoàng Uyên, người đã giúp đỡ và tậntnh chỉ bảo tôi trong quá trình thực hiện luận án của mình

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới phòng Đào tạo - Viện Sinh thái vàTài nguyên sinh vật, trường Đại học Thái Nguyên và lãnh đạo Viện Công nghệSinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều kiện cho tôihoàn thành luận văn này

Bên cạnh đó, tôi xin cảm ơn những người thân trong gia đình và bạn bè đãtạo điều kiện, động viên, giúp đỡ tôi cả về vật chất và tnh thần để tôi có thểhoàn thành bản luận văn này

Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 15 tháng 12 năm 2014

Học viên

Nguyễn Huyền Trang

APW Alkaline Pepton Water

bp Base pair

CFU Colony-Forming Unit

DNA Deoxyribonucleic acid

PCR Polymerase Chain Reaction

RNA Ribonucleic acid

rRNA Ribosomal ribonucleic acid

SAM S-adenosylmethionine

TCA Trichloroacetic acid

X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indodyl-β galactosidase

sỹ Trang

1

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 4Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 61.1 Tổng quan về vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa

61.1.1 Phân loại

61.1.2 Đặc điểm

71.1.3 Cấu trúc gen

91.1.4 Phương pháp xác định vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa

101.1.4.1.Phương pháp phân lập vi sinh truyền thống

101.1.4.2 Phương pháp sinh học phân tử phân loại vi khuẩn

101.1.5 Ứng dụng của vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa

111.2 Hoạt chất pyocyanin

121.2.1.Cấu trúc pyocyanin và sự tham gia của các gen

121.2.2.Hoạt tính kháng khuẩn của pyocyanin

131.2.3 Ứng dụng của hoạt chất pyocyanin

141.3.Tổng quan về Vibrio sp gây bệnh ở tôm nuôi 15

sỹ Trang

2

1.3.1.Đặc điểm phân loại chủng Vibrio sp gây bệnh trên tôm nuôi

151.3.2 Bệnh do vi khuẩn Vibrio sp gây ra trên tôm 151.3.2.1 Lịch sử phát triển bệnh:

151.1.2.2 Đặc điểm dịch tễ

171.3.3 Các phương pháp phòng ngừa và điều trị

181.3.2.1 Biện pháp phòng bệnh tổng hợp

181.3.2.2 Điều trị

19Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 212.1 Vật liệu nghiên cứu

21

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

212.1.2 Thiết bị

212.1.3 Hóa chất

222.1.3.1 Hóa chất sử dụng cho vi sinh:

222.1.3.2 Hóa chất sử dụng trong sinh học phân tử:

242.2 Phương pháp nghiên cứu

252.2.1 Phương pháp vi sinh

252.2.1.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn trên môi trường King A 252.2.1.2 Phương pháp nhuộm tế bào quan sát hình thái của vi khuẩn

262.2.1.3 Phương pháp xác định hoạt tnh enzyme của vi khuẩn

262.2.1.4 Phương pháp lập kháng sinh đồ

272.2.1.5 Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn:

272.2.1.6 Phương pháp tách chiết và xác định sắc tố pyocyanin - PCN [32] 282.2.1.7 Phương pháp xác định ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sinh

khối và nồng độ hoạt chất của vi khuẩn 282.2.1.8 Phương pháp xác định khả năng kháng Vibrio sp: 28

sỹ2.2.2 Phương pháp sinh học phân tử Trang

292.2.2.1 Phương pháp tách chiết DNA tổng số

292.2.2.2 Phương pháp PRC khuếch đại gen

302.2.2.3 Phương pháp điện di

322.2.2.4 Phương pháp làm sạch sản phẩm PCR

332.2.2.5 Phương pháp tách dòng gen tái tổ hợp (Cloning)

342.2.2.6 Phương pháp giải trình tự gen

36Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 383.1 Kết quả phân lập và xác định P aeruginosa bằng phương pháp vi sinh vật

383.1.1 Kết quả phân lập vi khuẩn P aeruginosa trên môi trường King A 38

3.1.2 Kết quả nhuộm Gram

393.1.3 Kết quả nghiên cứu hoạt tnh enzyme

403.1.4 Kết quả thử hoạt tính kháng kháng sinh

413.2 Kết quả xác định P aeruginosa bằng phương pháp sinh học phân tử

423.2.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số

423.2.2 Kết quả PCR gen đặc hiệu P aeruginosa (PA): 433.2.3 Kết quả PCR gen 16s rRNA 443.2.4 Kết quả tách dòng tái tổ hợp mang đoạn gen 16s rRNA

453.2.5 Kết quả giải trình tự gen 16s rRNA và định tên vi khuẩn 473.3 Kết quả nghiên cứu khả năng sinh hoạt chất kháng Vibrio sp củaP.aeruginosa PS39

513.3.1 Kết quả xác định ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sinh khối vi khuẩn

và nồng độ hoạt chất

513.3.2 Kết quả xác định khả năng kháng Vibrio của dịch nuôi vi khuẩn và hoạtchất PCN

543.3.3.Xác định nồng độ hoạt chất PCN ức chế Vibrio sp 563.3.4 Kết quả xác định ảnh hưởng nồng độ hoạt chất PCN ức chế Vibrio in vitro

58

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 61TÀI LIỆU THAM KHẢO 62Phụ lục 1

74Phụ lục 2

75

số kháng sinh mới được đưa vào sử dụng để khắc phục vấn đề lại rất giới hạn.Hiện tượng đa kháng thuốc kháng sinh đang là mối lo không chỉ của ngườinuôi mà còn của cả các nhà quản lý sức khỏe cộng đồng bởi nó không chỉ làmgiảm hiệu quả điều trị mà còn tiềm ẩn nhiều nguy cơ đối với sức khỏe con người.Mặt khác, vì các quan ngại và hạn chế của việc sử dụng kháng sinh trong nuôithủy sản nên các nghiên cứu đang hướng sự quan tâm đến các chất thay thế cónguồn gốc thiên nhiên, do các chất này không gây đề kháng khuẩn và tồn dưtrong vật nuôi cũng như ảnh hưởng tới môi trường.

Pseudomonas sp là vi khuẩn phổ biến được tìm thấy trong đất, nước, hệ

vi sinh vật trên da và các môi trường nhân tạo trên khắp thế giới Chúng là mộttrong những vi sinh vật có giá trị thương mại và công nghệ sinh học Trongcác chế phẩm sinh học, Pseudomonas được sử dụng như probiotc kiểm soát sinhhọc đối với nấm gây bệnh và vi khuẩn trong nông nghiệp, phẩy khuẩn trongnuôi trồng thủy sản Các vi khuẩn Pseudomonas sp có khả năng tiết nhiều loạisắc tố là các hợp chất có tnh kháng khuẩn Trong đó, các hợp chất phenazine doPseudomonas sp tiết ra môi trường là những hợp chất có phổ kháng khuẩn rộng.Phenazine là nhóm sắc tố do Pseudomonas sp tiết ra bao gồm: pyocyaninPCN (5-N-methyl-1-hydroxyphenazine), phenazine-1-carboxylic (PCA) vàphenazine-

1-carboxamide Sắc tố pyocyanin từ Pseudomonas aeruginosa, được chiết bằngchloroform, là phenazine có sắc tố màu xanh Nghiên cứu tách chiết, tính chất và

ứng dụng của pyocyanin đã được tiến hành ở nhiều phòng thí nghiệm trên thếgiới:

Mĩ (Scot Angell-2006); Đức (Kasozi-2012); Iran (Jamileh Nowroozi-2012); Ấn Độ(Preetha -2010); Thái Lan (Pattamarat Rattanachuay-2010) Sắc tố đã được xácđịnh là có phổ kháng khuẩn rộng [75], chống nấm [55], các Vibrio sp gây bệnhtrong nuôi trồng thủy sản [66] Phân lập và điều tra cho thấy pyocyanin có tínhkháng mạnh với vi khuẩn Vibrio sp như V parahaemolytcus , V vulnificus , V.alginolyticus , V fluvialis , V Proteolyticus, V harveyi và do đó nó có thể đượcứng dụng cho các chế phẩm sinh học trong nuôi trồng thủy sản

Đề tài nghiên cứu: “Phân lập và tuyển chọn chủng Pseudomonas spsinh hoạt chất kháng Vibrio sp gây bệnh ở tôm nuôi” được thực hiện nhằmmục đích phân lập được chủng Pseudomonas sp có khả năng sinh hoạt chất khángVibrio gây bệnh trên tôm nuôi, góp phần điều trị bệnh và giúp tăng năng suất tômnuôi ở Việt Nam

Nhiệm vụ đặt ra cho đề tài là:

1.Phân lập và tuyển chọn chủng Pseudomonas sp có khả năng kháng lại vikhuẩn gây bệnh trên tôm nuôi

2 Sàng lọc chủng Pseudomonas sp sinh hoạt chất kháng khuẩn

3.Giải trình tự gen 16s rRNA, định danh vi khuẩn

1 0

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas là một chi vi khuẩn xuất hiện ở mọi nơi trong môi trường Sựbiến dưỡng dễ thay đổi và linh động của chúng làm cho chúng có thể sống

ở nhiều môi trường khác nhau như nước, đất, trên cây và trong các động vật Vikhuẩn không chỉ phát triển trong môi trường không khí bình thường, mà còn

có thể sống trong môi trường có ít khí oxy, và do đó có thể cư trú trong nhiều môitrường tự nhiên và nhân tạo Vi khuẩn này dinh dưỡng bằng rất nhiều cáchợp chất hữu cơ ở động vật Trong số những loài Pseudomonas này, cónhững loài tiêu biểu có thể được sử dụng trong công nghệ sinh học Một trong số

đó là loài Pseudomonas aeruginosa

Hình 1.1: Khuẩn lạc P aeruginosa trên môi trường King A

1.1.1 Phân loại

Giới (regnum) Bacteria

Ngành (phylum) Proteobacteria

1 1

Lớp (class) Gamma Proteobacteria

Bộ (ordo) Pseudomonadales

Họ (familia) Pseudomonadaceae

Chi (genus) Pseudomonas

Loài (species) Pseudomonas aeruginosa

1.1.2 Đặc điểm

Đặc điểm hình thái học chung cho Pseudomonas là Gram âm, tế bàohình que, di động nhờ roi ở đầu và không có bào tử Các đặc điểm sinh lí là dịdưỡng, không lên men, linh hoạt về dinh dưỡng, không quang hợp hoặc cố địnhnitrogen

P aeruginosa là loài điển hình thuộc giống Pseudomonas (Migula) [13] Tếbào của chúng có dạng hình que, dài 1-1,5µm, rộng 0,5-1µm P aeruginosa

sử dụng hô hấp hiếu khí (oxy) làm sự trao đổi chất tối ưu mặc dù chúng cũng cóthể hô hấp kị khí trên nitrat hoặc nhận điện tử khác thay thế P aeruginosa cóthể chuyển hóa một loạt các phân tử hữu cơ, bao gồm các hợp chất hữu cơ nhưbenzoate, điều này đã giúp P aeruginosa trở thành một vi sinh vật rất phổ biến

vì nó có thể được tìm thấy trong môi trường như đất, nước, con người, động vật,thực vật, nước thải và các bệnh viện [59] Trong tất cả các hệ sinh thái thủy vực cóchứa hàm lượng oxy hòa tan cao nhưng chất dinh dưỡng thực vật thấp, P.aeruginosa là sinh vật chiếm ưu thế và điều này biến nó trở thành loài sinh vậtphong phú nhất trên trái đất

Pseudomonas sp có khả năng tiết ra nhiều loại sắc

tố:

1 2

sỹ - Pyocyanin: là sắc tố phenazine, có màu xanh da trời, tan trong nước và tanTrang

trong chloroform, 96% số chủng P aeruginosa có khả năng sinh sắc tố này.Pyocyanin sinh ra thuận lợi trong môi trường tếp xúc nhiều với không khí, dễdàng phát hiện khi nuôi vi khuẩn trên môi trường canh thang, thạch thườnghoặc

1 3

- Pyorubin: sắc tố màu hồng nhạt, chỉ 1% số chủng P aeruginosa sinh ra sắc

P aeruginosa thường được xác định sơ bộ bởi vẻ ngoài óng ánh như hạttrai và có mùi giống như nho hoặc bánh tortlla khi được nuôi cấy in vitro Cácdấu hiệu nhận biết sự có mặt của P aeruginosa trong lâm sàng thường baogồm khả năng sinh cả hai sắc tố pyocyanin và fluorescein, cũng như khả năng pháttriển tại nhiệt độ 42°C P aeruginosa có khả năng sinh trưởng trong diesel vànhiên liệu máy bay, nơi mà vi khuẩn này được coi là vi sinh vật sử dụnghydrocarbon, và gây ra sự ăn mòn vi thể.[14]

Mặc dù được phân loại là một vi sinh vật hiếu khí, P aeruginosa cònđược xem như là vi sinh vật kị khí tùy nghi, vì vi khuẩn này có thể tăng sinh trongmôi trường thiếu một phần hay toàn phần khí oxy Nó có thể tăng sinh yếm khí

1 4

bằng cách sử dụng nitrat như là chất nhận điện tử cuối cùng, và thậm chí khithiếu nitrat

1 5

họ đảo gen pKLC102/PAGI-2 vào các gen tRNALys hay tRNAGly Các đảo gen riêng

lẻ khác nhau về thứ tự các gen trao đổi chất, nhưng giống nhau về các gen tương

kề truyền lại trực tiếp cho các chủng và các loài [25, 93]

Hình1.2: Gen P aeruginosa PA01 [77]

1 6

sỹ P aeruginosa có một nhiễm sắc thể dạng vòng duy nhất và siêu xoắn trong Trang

tế bào chất [33] Nó cũng mang rất nhiều plasmid nhiễm sắc thể huy động, điều này

rất quan trọng đối với tập tính sống của sinh vật Ví dụ như các plasmid, TEM,OXA, và PSE được mã hóa để sản xuất betalactamase, chất cần thiết cho sức đềkháng của vi khuẩn với thuốc kháng sinh [28]

1.1.4 Phương pháp xác định vi khuẩn Pseudomonas

aeruginosa

1

1 4 1 P hươ n g pháp phân l ập v i s inh t r u y ền t hố n g

Đây là phương pháp thông dụng được các nhà nghiên cứu sử dụng đểxác định các vi khuẩn nói chung Trong phương pháp vi sinh vật học, người tanghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa của các loài vi khuẩn.Đặc điểm hình thái của một loài vi khuẩn bao gồm cả các đặc điểm về tế bào(hình dạng, nội bào tử, tiêm mao, nhuộm Gram) và các đặc điểm về khuẩn lạc(màu sắc, đường kính, hình dáng) Các đặc điểm về sinh lý và sinh hóa như sựphát triển của các vi sinh vật ở các nhiệt độ, giá trị pH, nồng độ muối, nguồn nănglượng, hay các điều kiện môi trường khác Tiếp đó là sự phát triển của chúng trêncác kháng sinh khác nhau, hoạt động của các loại enzyme, và quá trình trao đổichất…

1

1 4 2 P hươ n g p h á p s i nh h ọ c p h â n tử p h â n l o ạ i v i k huẩn

Phân loại bằng sinh học phân tử là phương pháp mới nhưng có độ chuẩn xáccao Phương pháp này có thể phát hiện mô tả và giải thích tính đa dạng sinh học ởmức phân tử, quan hệ giữa các loài và trong phạm vi loài [1]

Ngày nay phương pháp phân loại vi khuẩn bằng phương pháp xác định và sosánh trình tự gen mã hóa 16S rRNA đang được áp dụng phổ biến Việc nghiên cứuphân tử rRNA là phương pháp hữu hiệu nhất để xác định mối quan hệ, tiến hóacủa các vi sinh vật vì rRNA có mặt ở tất cả các loài vi sinh vật, có khả năng xácđịnh, có tnh bảo thủ cao, chúng chỉ khác nhau rất ít giữa các nhóm vi sinh

vật Tuy nhiên, dựa vào sự khác nhau này, người ta có thể đánh giá được mốiquan hệ phát sinh chủng loại và phân loại vi sinh vật

Trong ba gen mã hóa rRNA của vi khuẩn có 5S rRNA, 16S rRNA và 23S rRNAthì gen 16s rRNA là phù hợp nhất cho việc nghiên cứu phân loại hiện nay Gen mãhóa 5S rRNA có kích thước khoảng 120 nucleotde, do có kích thước nhỏ nênthông tn chứa đựng ít, do đó khó phân biệt được chính xác sự khác nhau giữa chi,giữa loài và trong loài của vi sinh vật cũng như vị trí phân loại của chúng Gen mãhóa 23S rRNA có kích thước khoảng 2900 bp quá lớn cho nên không thuận lợi chotách dòng, xác định trình tự và phân loại vi khuẩn Gen mã hóa 16S rRNA có kíchthước khoảng 1500 nucleotde vừa đủ để phân loại chi tiết giữa các chủng vi sinhvật không gây khó khăn trong các bước xác định trình tự gen và được ưu tiên chọnlựa trong phân loại vi khuẩn

Cấu trúc của gen mã hóa 16S rRNA đã được các nhà khoa học nghiên cứu kỹ

và đã thiết kế rất nhiều các cặp mồi chung dùng cho nhiều nhóm vi khuẩncũng như các cặp mồi đặc hiệu riêng cho các chi và loài Đây là một thuận lợi lớncho nghiên cứu phân loại vi khuẩn và xạ khuẩn dựa trên gen mã hóa 16S rRNA[50]

1.1.5 Ứng dụng của vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa

Vi khuẩn Pseudomonas sp có khả năng làm suy giảm các hydrocacbon thơmnhư methylbenzene - những sản phẩm của ngành công nghiệp dầu khí và thườngđược sử dụng làm dung môi cho sơn men và sơn cũng như trong sản xuất thuốc

và hóa chất Methylbenzene được coi là chất gây ô nhiễm môi trường đang hiệndiện trong không khí, đất và trên bề mặt nước [70] P aeruginosa có thể phá vỡtoluene, hình thức đơn giản nhất của methylbenzene P aeruginosa thoái hóatoluene thông qua quá trình oxy hóa của các nhóm methyl cho aldehyde, rượu

và một acid, sau đó được chuyển đổi sang catechol (1,2-dihydroxybenzene) Do

đó, P aeruginosa có thể được sử dụng trong kiểm soát ô nhiễm [51]

sỹ P aeruginosa cũng được ứng dụng trong sản xuất chế phẩm sinh họcTrang

kiểm soát dịch bệnh trong nuôi trồng thủy sản Vi khuẩn P aeruginosa giúp giatăng sức

lệ sống của điệp N subnodosus[97].

1.2 Hoạt chất pyocyanin

1.2.1.Cấu trúc pyocyanin và sự tham gia của các gen

Hợp chất phenazine gồm 6,000 loại là các hợp chất thứ cấp của quá trìnhnuôi cấy chủng Pseudomonas sp như: pyocyanin - sắc tố xanh, pyorubrin - sắc tốnâu, Phenazine-1-carboxylic acid - sắc tố nâu đỏ, những hợp chất này đều có khảnăng kháng khuẩn Phenazine là một hợp chất dị vòng được sản xuất một cách tựnhiên như màu đỏ 5-methly-7-amino-1-carboxyphenazium betaine, sau đó đượcchuyển đổi thành các phenazine-1carboxylic acid (PCA) màu vàng chanh , và cuốicùng đến 1-hydroxy-5-methyl phenazine màu xanh (pyocyanin) [37] Việc sinhtổng hợp phenazine đã được nghiên cứu rộng rãi ở vi khuẩn Pseudomonas [42,

43, 45, 46] Shikimic acid được phát hiện là con đường chuyển hóa chính thànhphenazine Shikimic acid là tiền thân cho tổng hợp phenazine, cung cấp một điểmphân nhánh cho chorismic acid để tổng hợp phenazine [43, 45, 62]

Pyocyanin là một hoạt chất thứ cấp có màu xanh lá cây, tan trong nước vàchloroform, khuếch tán ra môi trường làm môi trường có màu xanh Các sắc tốpyocyanin gồm 2 tiểu đơn vị của Nmethyl -1- hydroxyphenazine Pyocyanin đượckết tnh ở dạng tinh khiết và được phân loại như một phenazine Trong quá trìnhtổng hợp pyocyanin, bảy gen của P aeruginosa đã được xác định, cụ thể là phzC,

D, E , F, G , M và S Locus sinh tổng hợp phenazine đã được tm thấy trong tất cảloài, phzM và phzS là các gen chịu trách nhiệm chính để chuyển đổi phenazine -1-

carboxylic acid thành pyocyanin Có hai bước được cho là tham gia vào quá trìnhtổng hợp pyocyanin từ PCA Bước đầu tiên được xúc tác bởi các enzyme phzM, S-Adenosylmethionine (SAM) methyltransferase, trong đó PCA được chuyển thành5-methyl phenazine-1-carboxylic acid betaine bằng cách chuyển một nhómmethyl vào các nguyên tử nitơ của phenazine vòng phân nửa Bước thứ haiđược xúc tác bởi các enzyme phzS, FAD-monooxygenase tham gia vào phản ứngkhử carboxyl hydroxylatve 5-methylphenazine-1-carboxylic acid betaine để tạothành pyocyanin [67]

1.2.2.Hoạt tính kháng khuẩn của pyocyanin

Pyocyanin là một chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tnh kháng khuẩn.Hoạt tnh kháng vi khuẩn của pyocyanin đã được báo cáo kể từ năm 1940 [92].Các sắc tố ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn Escherichia coli và được đặt tên làColicin Các phần protein được giải phóng khi chiết dịch của các vi khuẩn có tínhchất của pyocyanin [96] Hình thức tnh khiết của pyocyanin cho thấy tùy thuộcvào nồng độ của pyocyanin mà chúng cho tác dụng diệt khuẩn khác nhau [18]

Cơ chế ức chế vi khuẩn phát triển của pyocyanin đã được nghiên cứu và kết luậnrằng pyocyanin tương tác với chuỗi hô hấp màng tế bào dẫn đến ức chế việc thựchiện hoạt động trao đổi chất của các tế bào vi khuẩn [19] Đối với E coli,pyocyanin là nguyên nhân gây cạn kiệt nguồn cung cấp oxy cho các tế bào, sảnxuất H2O2 và cũng chuyển hướng dòng chảy điện tử, gây ra độc tính đối với tế bào

E Coli [38] Pyocyanin ảnh hưởng tiêu cực đến cơ chế vận chuyển tích cực củamột số sinh vật [19] P aeruginosa có trong đờm của bệnh nhân xơ nang (CF) ứcchế sự phát triển của Staphylococcus aureus

Tính kháng sinh của pyocyanin từ P aeruginosa phân lập từ môi trường biển

đã được nghiên cứu bởi Angell và cộng sự [12] P aeruginosa đã được phân lập

từ trầm tích đại dương thu thập từ quần đảo Hawaii và sàng lọc hoạt tnhkháng

khuẩn Gần 90-95% khả năng ức chế vi khuẩn của các chủng P aeruginosa là dopyocyanin Nó cho thấy khả năng kháng lại các loài vi khuẩn gây bệnh nhưSalmonella paratyphi, E coli và Klebsiella gây bệnh viêm phổi [81] Pyocyaninphân lập từ P aeruginosa 4B cho thấy khả năng kháng sinh chống lại tác nhân gâybệnh khác nhau và vi khuẩn gây hư hỏng thực phẩm như Bacillus cereus

Các sinh vật sản xuất các chất chuyển hóa pyocyanin trong môi trường

đã được chọn lọc và chứng minh tác dụng kháng khuẩn trên các sinh vậtnhư S aureus, Staphylococcus lớp biểu bì, Bacillus subtlis, Micrococcus luteus vàSaccharomyces cerevisiae Các sắc tố được sản xuất cho thấy khả năng chống lạicác sinh vật như vi khuẩn E coli, Acinetobacter , S aureus và Streptococcus gâybệnh viêm phổi rất hiệu quả (Thụy Điển năm 2010)

1.2.3 Ứng dụng của hoạt chất pyocyanin

Nghiên cứu tách chiết, tnh chất và ứng dụng của pyocyanin được tến hành

ở nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới: Mĩ (Scot Angell-2006); Đức 2012); Iran (Jamileh Nowroozi-2012); Ấn Độ (Preetha -2010); Thái Lan (PattamaratRattanachuay-2010) Sắc tố đã được xác định là có phổ kháng khuẩn rộng [75],chống nấm [55] và các Vibrio sp gây bệnh trong nuôi trồng thủy sản [66] Tác giảPrabhakaran Priyaja [74] đã thông báo khi khảo sát tnh kháng của PCN vớiVibrio sp cho thấy khả năng ức chế 7 loại Vibrio: V harveyi, V parahaemolytcus,

(Kasozi-V vulnifcus, (Kasozi-V alginolytcus, (Kasozi-V.fluvialis, (Kasozi-V mediterrani và (Kasozi-V nereis với vòngkháng khuẩn từ 13,5 đến 31,0mm Khi dùng dịch nuôi của P aeruginosa có hàmlượng PCN là 30mg/l cho vòng ức chế đạt 17,50 – 38,06mm Nồng độ ức chế tốithiểu của pyocyanin chống lại các vi khuẩn và nấm dao động ở 20-120 µg /ml PCN[15, 31, 39, 40, 63] Khả năng kháng E ictalluri kém hơn Mức dộ ảnh hưởng đối

với một số chủng không gây bệnh như LA5, B clausii tương tự như khi sử dụngkháng sinh TE

1.3.Tổng quan về Vibrio sp gây bệnh ở tôm nuôi

1.3.1.Đặc điểm phân loại chủng Vibrio sp gây bệnh trên tôm nuôi

Giống Vibrio thuộc họ Vibrionaceae, là những loài vi khuẩn Gram (-), hìnhque thẳng hoặc hơi uốn cong, kích thước 0,3 – 0,5 x 1,4 – 2,6 µm Chúng khôngsinh bào tử và chuyển động nhờ một hay nhiều tiên mao mảnh nằm ở một đầu vikhuẩn

Tất cả những loài vi khuẩn thuộc giống Vibrio đều là vi khuẩn kỵ khí tùy tiện,

vi khuẩn không phát triển trong môi trường không muối (NaCl) và không sinh H2S.Chúng mẫn cảm với thuốc thử Vibriostat 0/129

Về cơ bản, các loài vi khuẩn này đều có mặt trong môi trường nước, đặcbiệt là nước biển và cửa sông, Na+ kích thích sự phát triển của tất cả các loàiVibrio và là nhu cầu tuyệt đối với nhiều loài Hầu hết các mẫu phân lập từ bệnh vỏ

và viêm ruột của tôm trưởng thành đều gặp loài V alginolytcus, V.parahaemolyticus, V anguillarum

Hình 1.3: Khuẩn lạc của V alginolyticus và V parahaemolytcus

1.3.2 Bệnh do vi khuẩn Vibrio sp gây ra trên tôm

1.3

2.1 L ị c h sử phát t ri ể n b ện h:

Bệnh do vi khuẩn Vibrio đã được phát hiện rất sớm từ năm 1970 bởi Tukiashkhi bệnh xảy ra và gây chết với tỷ lệ >50% trên đối tượng nuôi thủy sản là cua

xanh (Callinectes sapidus) Đến năm 1977, Fisher đã thông báo các loài tôm hùmchâu Mỹ như: Homarus americarus, H gammarus… hay tôm hùm châu Á(Panulirus homarus, P ornatus ) đều có thể bị nhiễm bệnh do vi khuẩnVibrio Kết quả này cũng được thông báo bởi Roald và Bowser, 1981

Ngoài ra, Lioo và các ctv của ông đã thông báo hiện tượng tôm sú bị bệnh đỏthân có liên quan đến thức ăn thối rữa Nhưng có một số quan điểm khi nghiêncứu và hiện bệnh đỏ thân trong các ao nuôi tôm Sú ở Philippines với thức ăn tổnghợp (công nghiệp) cho rằng: bệnh đỏ thân xảy ra có liên quan đến khí độctrong ao Năm 1990, ông Hassawai cho rằng tác nhân gây ra bệnh đỏ thân ở TháiLan là do tôm ăn Artemia và tảo giả Tuy nhiên theo nghiên cứu của viện nuôitrồng thủy sản

3 thì bệnh đỏ thân do một giống vi khuẩn Vibrio alginolytcus gây ra trên tôm sú.Cho đến nay bệnh này được phát hiện ở nhiều nước trên thế giới cũng như ở ViệtNam Nghiên cứu của Newman và Feng, 1982 cho biết loài cua đá (Callinectesirroratus) cũng có thể bị chết do cảm nhiễm Vibrio ở 20oC sau 24h [3]

Ở Việt Nam, ngay từ những năm 1989 – 1990, các nhà nghiên cứu đã pháthiện rằng bệnh Vibriosis, đặc biệt là bệnh phát sáng rất phổ biến trong cá trạisản xuất tôm sú giống và trong ao nuôi thương phẩm [2] Những năm gần đây khi

mà nghề nuôi các động vật thân mềm nước mặn phát triển thì bệnh Vibriosis đãtrở thành bệnh thường gặp và gây nhiều tác hại cho nghề nuôi thủy sản

Vi khuẩn thuộc giống Vibrio sống ký sinh trên cơ thể động vật thủy sản đềugây ra một số dấu hiện bệnh lý nhất định Cho đến nay, một số tác giả cho rằngVibrio là tác nhân đầu tên gây ra các bệnh cho tôm Ngược lại một số tác giả lạicho rằng: Vibrio là tác nhân thứ hai Bệnh này xảy ra như là kết quả của các điềukiện khác: tôm bị bệnh truyền nhiễm hay các bệnh về dinh dưỡng, tôm bị thương

hoặc điều kiện môi trường khắc nghiệt Trong nghiên cứu bệnh động vật thủy sảnphân lập Vibrio từ mẫu bệnh không khó nhưng xác định vai trò của chúng trong

L de Lapena đã phân lập được 2 loài V harveyi và V splendidus Trong khi đó ởThái Lan, người ta lại cho rằng tác nhân là V parahaemolytcus Ở Việt Nam,một số cán bộ của trường Đại học Thủy sản đã phân lập từ tôm bệnh đượchai loài vi khuẩn V alginolyticus và V parahaemolyticus.

- Ký chủ : Hầu như các loài động vật thủy sản nuôi nước lợ, mặn đều có thể bịnhiễm và chịu tác hại của bệnh Vibriosis như : các loài tôm he (Penaeus spp) vàtôm thẻ (Metapenaeus spp), các loài tôm hùm châu Mỹ (Homarus spp) và tômhùm châu Á (Panulirus spp), các loài cua biển như cua xanh, cua đá…

- Giai đoạn phát triển : bệnh có thể xảy ra ở các giai đoạn ấu trùng, hậu

ấu trùng, ấu niên, cơ thể trưởng thành, ở đàn bố mẹ của các loài tôm, cua… Tuyvậy, tùy theo từng loại bệnh mà vi khuẩn Vibrio có thể gây nặng ở giai đoạn này vànhẹ hơn ở giai đoạn kia Ví dụ : Bệnh phát sáng do Vibrio harveyi có thể xảy ra ởnhiều giai đoạn khác nhau, nhưng tác hại nặng nhất là giai đoạn ấu trùng Zoae vàMysis

- Con đường lan truyền : Trong hệ thống nuôi thủy sản, vi khuẩn Vibrio xâmnhập vào ao theo một số con đường: nguồn nước, dụng cụ dùng, tôm mẹ hoặc

tôm giống, thức ăn, đặc biệt là thức ăn tươi sống Artemia và chúng có thể nằmsẵn ở thành bể hay dưới đáy ao

b, Mùa vụ xuất hiện bệnh

Mùa vụ xuất hiện bệnh do vi khuẩn Vibrio tùy thuộc theo loài và địa điểmnuôi Theo nghiên cứu của một số tác giả nước ngoài và Việt Nam, Vibrio sp, tìmthấy phổ biến trong nước biển và vùng ven bờ, trong bể ương ấu trùng, bể ươngtảo và bể ương Artemia

Nhìn chung, vi khuẩn Vibrio phân chia cơ thể rất nhanh ở độ mặn 10 –40ppt (phát triển tốt nhất ở độ mặn 20 – 30ppt), lây lan nhanh ở nhiệt độ cao(mùa nóng), phát triển nhanh ở nơi có nhiều chất hữu cơ, oxy thấp và pH 7-9.Trong bể ương lượng vi khuẩn Vibrio tăng theo thời gian nuôi, tầng đáy caohơn tầng mặt Mật độ vi khuẩn Vibrio tăng nhanh rõ rệt khi thời tiết thay đổi,vào các thời điểm biến động do bão, gió mùa hay áp thấp nhiệt đới hoặc theo connước của thủy triều (nước cường, nước ròng) [2]

a,Cải tạo và vệ sinh môi trường nuôi

Cải tạo ao trước khi ương nuôi: tháo cạn, vét bùn (rửa đáy ao), phơi khô(hoặc rửa chua) và khử trùng ao nuôi với mục đích là:

- Diệt địch hại và sinh vật là vật nuôi trung gian sinh vật canh tranh thức ăncủa tôm như các loài cá dữ, cá tạp, giáp xác, côn trùng, nòng nọc, sinh vật đáy…

- Diệt sinh vật gây bệnh cho tôm như các giống loài vi sinh vật: Vi khuẩn,nấm và các loài ký sinh trùng

- Cải tạo chất đáy làm tăng các muối dinh dưỡng, giảm chất độc tích tụ ở đáy

ao

b, Tiêu diệt nguồn gốc gây bệnh

- Khử trùng cơ thể con giống trước khi thả nuôi

- Khử trùng thức ăn

- Làm sạch nơi tôm đến ăn có thể dùng thuốc nào hay số lượng nhiều ítcòn tùy thuộc vào chất nước, độ sâu, nhiệt độ nước, diện tích nơi cho ăn và tnhhình phát sinh bệnh

- Khử trùng dụng cụ

c, Tăng sức đề kháng bệnh

Nguyên nhân gây bệnh xâm nhập vào những cơ thể có phát sinh ra bệnh haykhông còn tùy thuộc vào yếu tố môi trường và bản thân cơ thể vật nuôi Nếu vậtnuôi có sức đề kháng tốt có khả năng chống đỡ lại yếu tố gây bệnh thì sẽkhông mặc bệnh hoặc bệnh nhẹ, còn ngược lại thì khả năng chống đỡ yếu, dễdàng nhiễm bệnh Do đó một trong những khâu quan trọng để phòng bệnh chovật nuôi là phải tăng cường sức đề kháng cho vật nuôi bằng cách cho ăn theophương pháp “4 định”: định chất lượng, số lượng thức ăn, vị trí và thời gian choăn

sỹ Tuy nhiên, hiện nay vi khuẩn gây bệnh cho tôm đã có tính đa kháng thuốcTrang

cao, việc sử dụng kháng sinh kém hiệu quả và hạn chế Trong một nghiên cứu khả

năng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn Vibrio phát sáng phân lập từ hậu ấutrùng tôm sú (Penaeus monodon) ở đồng bằng sông Cửu Long cho thấy 100%chủng thử nghiệm kháng với ampicilin, và có khoảng từ (hoặc ít hơn) 15% khángvới trimethoprim/sulfamethoxazole, tetracillin, chloramphenicol, nitrofurantoin

và norfloxacin Phần lớn (77%) các chủng chỉ kháng với một loại kháng sinh

Số chủng kháng với 2 loại kháng sinh là 15% Có một chủng kháng 4 loại vàmột chủng kháng với cả 6 loại kháng sinh thử nghiệm [6] Chính vì vậy, giải pháptìm kiếm các chất thay thế có nguồn gốc thiên nhiên là vô cùng quan trọng và cầnthiết