Khảo sát và xây dựng cơ sở dữ liệu tần suất các alen của 15 locus gen hệ identifiler từ quần thể người dân tộc khmer ứng dụng trong giám định ADN

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌCVÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LÊ THANH CỪ KHẢO SÁT VÀ XÂY DỰNG CƠ SỞ DỮ LIỆU TẦN SUẤT CÁC ALEN Ở 15 LOCUS GEN HỆ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

LÊ THANH CỪ

KHẢO SÁT VÀ XÂY DỰNG CƠ SỞ DỮ LIỆU TẦN SUẤT CÁC ALEN Ở 15 LOCUS GEN HỆ IDENTIFILER TỪ QUẦN THỂ NGƯỜI DÂN TỘC KHMER ỨNG DỤNG

TRONG GIÁM ĐỊNH ADN

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

Đề tài :

KHẢO SÁT VÀ XÂY DỰNG CƠ SỞ DỮ LIỆU TẦN SUẤT CÁC ALEN Ở 15 LOCUS GEN HỆ IDENTIFILER TỪ QUẦN THỂ NGƯỜI DÂN TỘC KHMER ỨNG DỤNG

TRONG GIÁM ĐỊNH ADN

Học viên: Lê Thanh Cừ

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60 42 01 14

Người hướng dẫn: PGS TS Nguyễn Văn Hà

NĂM 2014

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành được luận văn cao học này tôi xin được bày tỏ lời cảm

ơn đến:

- PGS.TS Nguyễn Văn Hà - Phó giám đốc trung tâm giám định Sinh học

pháp lý, Viện Khoa học hình sự, đã chỉ bảo đã cho tôi nhiều kinh nghiệm trongthời gian thực hiện luận văn cũng như trong quá trình công tác

- Tập thể Lãnh đạo Viện Khoa học hình sự, Lãnh đạo và cán bộ trong

Trung tâm giám định Sinh học Pháp lý - Viện Khoa học hình sự đã tạo điều kiệnthuận lợi cho tôi trong quá trình đi học và làm nghiên cứu đề tài

- Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn đến tất cả thầy, cô đã giảng dạy tại

Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật Việt Nam - Viện Hàn lâm Khoa học vàCông nghệ Việt Nam những người đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quí giá

về lĩnh vực Công nghệ Sinh học làm cơ sở cho tôi thực hiện tốt luận văn này

Sau cùng tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến gia đình đã luôn tạo điều kiệntốt nhất cho tôi trong suốt quá trình học cũng như thực hiện luận văn

Hà Nội, tháng 12 năm 2014

Lê Thanh Cừ

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT 3

DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ BẢNG BIỂU……….……… …4

MỞ ĐẦU 5

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 9

1.1 Giám định gen (ADN): 9

1.1.1 Sự ra đời của sinh học phân tử: 9

1.1.2 Cơ sở khoa học và sự ra đời của giám định gen: 13

1.1.3 Khái niệm về locus và alen 19

1.1.4 Các tiêu chuẩn cho locus STR dùng trong giám định ADN 19

1.1.5 Ý nghĩa của cơ sở dữ liệu tần suất alen của các locus STR 20

1.2 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về khảo sát tần suất các alen của các locus gen sử dụng trong giám định ADN

21 1.2.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 21

1.2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước: 23

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1 Nội dung nghiên cứu: 26

2.2 Phương pháp nghiên cứu: 26

2.2.1 Thu mẫu: 26

2.2.2 Phân tích mẫu: 27

2.2.2.1 Quy trình phân tích ADN……….27

2.2.2.2 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ: 28

a Hóa chất và thiết bị cho tách chiết ADN 28

b Hóa chất và thiết bị cho định lượng ADN 28

c Hóa chất và thiết bị cho nhân bội và điện di 28

2.2.3 Xử lý thống kê số liệu và tính tần suất các locus gen 29

2.2.3.1 Cơ sơ ly thuyết 29

2.2.3.2 Phương phap xư ly thống kê 29

2.2.3.3 Các bước tính toán thống kê và kiểm định: 30

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 31

3.1 Kết quả thu, bảo quản mẫu và tách chiết AND 31

3.2 Kết quả thực hiện phản ứng PCR, điện di và phân tích kiểu gen 31

3.3 Kết quả xử lý số liệu thống kê 32

3.3.1 Kết quả tính toán tần suất các alen 32

3.3.2 Kết quả quan sát kiểu gen từng locus và tính toán chỉ số kiểm định Khi bình phương……….……….35

3.4 Một số ví dụ về ứng dụng kết quả của đề tài trong công tác giám định ADN tại Viện Khoa học hình sự - Bộ Công an 54

KẾT LUẬN……… ……….56

KIẾN NGHỊ 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

VNTR - Variable Number of Tandem Repeat - Các trình tự lặp ngắn

STR - Short Tandem Repeat - Các trình tự lặp ngắn

ID - Identifiler/Identify definition

hình sự

bp - Base pair

DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ BẢNG BIỂU

Hình ảnh kiểu gen dạng peak từ mẫu ký hiệu KM100

Bảng 1.1 Các locus gen hệ Identifiler

Bảng 3.1 Kết quả định lượng ADN bằng phương pháp Realtime PCR Bảng 3.2 Tần suất xuất hiện của các alen trên 15 locus gen hệ Identifiler.Bảng 3.3 đến 3.17 Xử lý số liệu thống kê ở 15 locus gen hệ Identifiler

t l

Bảng 3.19 So sánh tần xuất alen với một số quần thể

MỞ ĐẦU

Viện Khoa học hình sự là một đơn vị đầu ngành của lực lượng kỹ thuậthình sự, một trung tâm khoa học của ngành Công an Việt Nam Một trongnhững nhiệm vụ quan trọng của Viện Khoa học hình sự là công tác giám địnhphục vụ tố tụng hình sự, tố tụng dân sự và các yêu cầu cá nhân, trong đó nổi bật

là lĩnh vực giám định ADN

Từ tháng 4 năm 1999, Viện Khoa học hình sự đã triển khai lĩnh vực giámđịnh ADN với toàn bộ quy trình được chuyển giao từ Viện Khoa học hình sựbang Victoria - Úc, sử dụng hệ NinePlex II (gồm 09 locus)

Năm 2006 Viện Khoa học hình sự đã đưa vào ứng dụng hệ Identifiler(gồm 15 locus) trong giám định ADN Với bộ kit này, công tác giám định đạthiệu quả cao hơn so với bộ kit 9 locus NinePlex II

Trong giám định ADN hình sự đòi hỏi bắt buộc phải tính xác suất mộtngười ngẫu nhiên trong quần thể có cấu trúc di truyền trùng lặp với ADN củacác mẫu vật giám định Để tính toán được xác suất này thì phải có dữ liệu tầnsuất của từng alen [7]

Theo lý thuyết di truyền học, mỗi quần thể người (dân tộc) khác nhau cónhững đặc điểm di truyền đặc trưng, thể hiện bằng sự phân bố tần suất alentrong mỗi quần thể là khác nhau và không thể áp dụng cơ sở dữ liệu của quầnthể này cho một quần thể khác Do đó, bắt buộc phải tiến hành khảo sát tần suấtcác alen của các locus dùng trong giám định ADN hình sự đối với mỗi dân tộc

để đảm bảo tính khoa học, chính xác và khách quan trong kết luận giám định.Việc khảo sát tần suất các alen của các locus đang sử dụng trong giám địnhADN đối với các dân tộc trên toàn lãnh thổ Việt Nam là một việc làm mang tínhcấp bách

Việt Nam có 54 dân tộc, trong đó dân tộc Kinh chiếm tỉ lệ lớn nhất (gần90%) [1] và đã có đề tài khoa học cấp Bộ khảo sát tần suất alen gen người

(Kinh) theo hệ Identifiler [12] Còn lại là các dân tộc thiểu số, do điều kiện về cơ

sở vật chất cũng như con người chưa đáp ứng được nên chưa thể tiến hành khảosát tần suất alen cho tất cả các dân tộc

Trong nhóm các dân tộc thiểu số đông dân nhất (T à y , h á i , T ư ờ n g , MK

h m er, H o a, ùnN g , H m ôn g , n g ư ời D a o , G i ara i , Ê đê , C h ă m , Sán D ì u , ng ư ờ i Ra

g l a y ) có một số dân tộc cư trú chủ yếu tại các tỉnh biên giới, là các điểm nóng

về An ninh và Trật tự an toàn xã hội

Theo T ổ n g đ i ề u t ra d ân s ố v à n h à ở n ăm 20 0 9 , người Khmer ở Việt Nam

có dân số 1.260.640 người, có mặt ở tất cả các t ỉn h , t h à n h p h ố Người Khmer cưtrú tập trung tại các tỉnh: S ó c T ră n g ( 397.014 người, chiếm 30,7 % dân số toàn

chiếm 31,6 % dân số toàn tỉnh và 25,2 % tổng số người Khmer tại Việt Nam),

lễ này có đua thuyền Ngo giữa các phum - sóc

Lịch sử: Người Khơ Me từ Tây Khương xuống Trung Lào vào khoảng giữathiên kỷ 1 trước Tây lịch, cùng lúc với người Việt tộc từ Giang Nam di cưxuống Bắc bộ (2), từ Tây Khương (hay Tây Khang) đi Trung Lào không xa lắm,chỉ vượt qua Vân Nam là đến, lại có sẵn một “đường” rất tiện là con sông Cửu

Long Đến trước thế kỉ XII người Khơ Me và văn hoá của họ giữ vai trò chủ thể

ở vùng đồng bằng sông Cửu Long

Văn hóa: Người Khơ Me đã có những cống hiến to lớn vào kho tàng văn hóa

chung của các dân tộc ở Việt Nam Về văn học dân gian, người Khơ Me là chủnhân di sản của một nền văn hóa phong phú gồm nhiều thể loại: dân ca, truyển

cổ, những câu châm ngôn, tục ngữ thường như một lời khuyên răn, một kinhnghiệm sống Gắn liền với những sinh hoạt khác nhau, dân ca Khơ Me cũng cónhiều loại: hát ru con, hát trong lao động… những bài hát không chỉ phản ánhkhông kinh nghiệm nông nghiệp mà còn phản ánh đời sống xã hội nhiều tìnhcảm của người Khơ Me

Hoạt động sản xuất: Bên cạnh việc trồng lúa nước là ngành sản xuất chủ yếu,

nông dân Khơ Me còn trồng hoa mầu trên đất rẫy Có hai loại đất rẫy: rẫychuyên dùng và rẫy vốn là ruộng ven làng Giữa hai vụ mùa lớn, người dân Khơ

Me canh tác thêm một vụ hoa màu phụ ngắn ngày Trên đất rẫy, phổ biến cácloại đậu, khoai, ngô, rau, mía, hành, ngò… Có nhiều địa phương chuyên trồngcác đặc sản như dưa hấu, hành đỏ, nhãn, trầu vàng, xoài… Ngoài công việc chănnuôi, người Khơ Me ở vùng ven sông rạch hay biển cũng sử dụng các kỹ thuậtđánh bắt cá nước ngọc và nước mặn Rất ít người Khơ Me sống chuyên bằngchài lưới trên biển, tuy cũng có một số gia đình chung vốn vào việc mua thuyền,mua lưới đánh cá ven biển

Như vậy, người Khmer tuy là dân tộc thiểu số nhưng phân bố rộng rãikhắp các tỉnh thành và tập trung chủ yếu theo tuyến biên giới phía Tây Nam Bộ[1] Đây là những khu vực có thời tiết khí hậu khắc nghiệt, giao thông đi lại khókhăn và lại là địa bàn nhạy cảm, thường xuyên phải đấu tranh với những âmmưu thủ đoạn, hoạt động chống phá của các thế lực thù địch, các loại tội phạm(tội phạm xâm phạm an ninh quốc gia, tội phạm ma túy, buôn lậu, buôn bán phụ

nữ trẻ em, giết người, hiếp dâm, vận chuyển, buôn bán tiền giả, chất nổ, chấtcháy ) Giám định ADN là một công cụ đắc lực phục vụ cho công tác điều tra,xét xử nói chung và góp phần bảo vệ chủ quyền an ninh biên giới, giữ vững an

ninh trật tự xó hội khu vực phớa Tõy Nam Bộ núi riờng Hàng năm sốlượng các vụ án hình sự nghiêm trọng liên quan đến ng-ười dân tộc Khmer và được trưng cầu giám định ADN tạiViện Khoa học hình sự có xu hướng gia tăng Cụ thể năm

2004 có 10 vụ, năm 2005 có 11 vụ, năm 2006 có 7 vụ,năm 2007 có 9 vụ, năm 2008 có 16 vụ, năm 2009 có 21

vụ và năm 2010 có 18 vụ

Tuy nhiên, ở Việt Nam cho đến nay chưa có mộtnghiên cứu hoàn chỉnh nào được công bố về khảo sát sựphân bố các alen của 15 locus gen hệ Identifiler đốivới quần thể người dân tộc Khmer Vỡ vậy, việc tiến hành triển

khai đề tài nghiờn cứu: “Khảo sỏt và xõy dựng cơ sở dữ liệu tần suất cỏc alen

đánh giá và kết luận giám định đối với những vụ ánliên quan đến người thuộc dân tộc Khmer

Mục tiờu của đề tài

Khảo sỏt và xõy dựng cơ sở dữ liệu tần suất cỏc alen của 15 locus gen(ADN) hệ Identifiler từ dõn tộc Khmer phục vụ cho cụng tỏc giỏm định ADN ởcỏc vụ ỏn liờn quan đến người dõn tộc Khmer Trờn cơ sở đú, tớnh tần suất xuấthiện của mỗi alen trong từng locus của dõn tộc Khmer, làm cơ sở khoa học đểphõn tớch, đỏnh giỏ và rỳt ra kết luận giỏm định truy nguyờn huyết thống hoặctruy nguyờn cỏ thể Đồng thời đúng gúp vào nhiệm vụ giỏm định ADN cho cỏc

lực lượng thực thi pháp luật trên toàn cầu, nhất là trong bối cảnh toàn cầu hóagiữa cảnh sát các nước thông qua Interpol.

1.1.1 Sự ra đời của sinh học phân tử

Theo F Jacob thì sinh học hiện đại có mục đích là giải thích các đặc tínhcủa cơ thể sống thông qua nghiên cứu cấu trúc và chức năng của các phân tử vậtchất thành phần

Sinh học phân tử là một ngành sinh học hiện đại quan tâm đến việc giảithích những hiện tượng và quy luật sinh học ở mức phân tử Các nhà sinh họcphân tử thường sử dụng những kỹ thuật hóa sinh để nghiên cứu những vấn đề ditruyền Lịch sử ra đời và phát triển của sinh học phân tử chính là sự hội tụ vàphát triển của nhiều ngành khoa học khác nhau như: Sinh học tế bào, Di truyềnhọc, Hóa sinh học và Vi sinh vật học

Ngành di truyền học ra đời vào thế kỷ thứ XX: Đầu tiên những công

di truyền do nhiễm sắc thể ra đời

Vào đầu thế kỷ XX người ta khám phá ra ADN như một chất sinh hóamang thông tin di truyền và làm sáng tỏ cấu trúc ADN.

Những năm 70 ngành sinh hóa phân tử bùng nổ

Sự xuất hiện ngành di truyền học: Ngành di truyền học hiện đại này có từcác công trình của Mendel, người đầu tiên thực hiện các lý thuyết về di truyền.Ông in ra các kết quả năm 1866, nhưng lúc bấy giờ ít được chú ý Cho đến năm

1900 thì người ta mới nghiên cúu và khám phá trở lại

Sự phát triển của thuyết nhiễm sắc thể về tính di truyền Các gene nằmtrong nhiễm sắc thể và theo Sturtevant thì các gene có thể có một trật tự trongnhiễm sắc thể, và thành lập bản đồ gene đầu tiên Cũng trong phòng thí nghiệmcủa Morgan mà các thủ tục về thí nghiệm biến đổi được Muller phát triển

Sự hội tụ của ngành sinh hóa và di truyền: Lúc bấy giờ người ta biết sựhiện diện các gene trong nhiễm sắc thể nhưng chưa biết tính chất sinh hóa cácgene hay cách hành động của chúng

Garrod thiết lập sự liên hệ đầu tiên giữa gene và enzym từ sự quan sátcăn bệnh di truyền

Beadle và Tatum đào sâu liên hệ này nhờ một hệ thống dẫn tới thựcnghiệm: nấm Neurospora crassa

Tổng hợp các công trình này đưa đến một kết luận là các gene kiểm soát

sự tổng hợp các enzym, và mỗi protein được mã hóa (code) bởi một loại generiêng biệt

ADN chất sinh hóa mang thông tin di truyền: Năm 1928 hiện tượng đầutiên cho phép phát triển về sự nhận diện chất di truyền là sự biến đổi vi khuẩn doGriffith, người Anh tìm ra

Hiện tượng này lúc bấy giờ được xem là một thử nghiệm về hoạt độngsinh học mà nhờ đó người ta có thể xác định được bản chất của chất di truyềnThử nghiệm này lại được Avery dùng để làm sáng tỏ bản chất sinh hóa đó làADN Tuy nhiên sự khám phá này cũng được đón chào bởi nhiều người hoài

nghi Phải đợi có nhiều công trình khác kế tiếp mà thực tế này mới được chấpnhận: Đặc biệt là công trình của Chargaff hay Hershey Sự chấp nhận toàn toàn

và vĩnh viễn có được khi Watson và Crick làm sáng tỏ của cấu trúc ADN

Ảnh hưởng của các nhà vật lý học: Ảnh huởng các nhà vật lý học sẽđánh dấu ngành sinh học phân tử Có những người, như Schrödinger đóng vaitrò như một nhà quan sát Những người khác cống hiến tất cả sự nghiệp của họcho ngành này vì họ nhận biết rằng khoa học này là một biên giới (lãnh vực)mới của sự hiểu biết khoa học

Pauling và Delbrück đóng một vai trò xác định sự tiến triển của khoa học này

Delbrück đặc biệt là người sáng lập ra nhóm phage với Luria vàHershey

Cấu trúc ADN: Cuối cùng, đó là nhờ sự sáng tỏ của cấu trúc ADN màngành sinh hóa phân tử biết thành công rực rỡ Sự thành công này không những

là công trình của Watson và Crick; mà cũng là của các nhà nghiên cứu Franklin

và Wilkins

Mô hình của W a t s o n v à C r i ck v à tổng quan về cấu trúc ADN

Trong quá trình nghiên cứu của mình W a ts o n v à C r i c k đ ã bắt đầu suynghĩ về mô hình xoắn kép, nhưng vẫn thiếu thông tin về bước xoắn và khoảngcách ngang giữa 2 mạch Khi đó, R o s a l i n d Fra n k l i n g ửi một số phát hiện của bà

trong các đường dẫn của M a x Pe r u t z' s Công trình của Franklin xác nhận về câutrúc xoắn kép và còn ghi nhận về tính đối xứng của phân tử, đặc biệt là cho rằng

2 mạch chạy theo hướng ngược nhau dạng đối song

Giữa tháng 3 năm 1953, Watson và Crick đã suy luận ra cấu trúc xoắn kép

Fra

n k li n v Mà a u r i ce W ilk in s , (điều này từng gây tranh cãi vì hai ông xem cácmẫu nhiễu xạ tia X quan trọng của Franklin mà chưa được sự đồng ý của bà (bàthậm chí không biết đến).) Sau khi xem kết quả của Franklin, Watson có đề nghị

Franklin hợp tác để thắng nhóm của Pauling trong cuộc chạy đua tìm ra cấu trúcnhưng bà từ chối Ngay sau đó, Maurice Wilkins cho Watson xem bức ảnh nổitiếng - Bức ảnh 51 Từ bức ảnh này, Watson và Crick nhanh chóng nhận ra rằngkhông chỉ khoảng cách giữa 2 mạch không đổi mà còn có thể đo đạc chính xáccon số là 2 nanomet, và cũng từ đây, họ xác định được bước sóng 3,4 nm mỗi10bp của cấu trúc xoắn kép.

Cuối cùng, Watson và Crick cho rằng việc bắt cặp bổ sung của các base(Nucleobase) giải thích cho phát hiện của Chargaff Tuy nhiên, khi ấy các sáchgiáo khoa đã tiên đoán sai rằng các Nu c l e o b a s e t ồn tại dạng e no l ( thực chấtchúng tồn tại dạng k e t o ) Khi J erry D on o h u e c hỉ ra lỗi sai này cho Watson, ông

sẽ tạo ra các cấu trúc như những bậc thang giữa 2 mạch Hai ông nhanh chónghoàn thành mô hình và công bố trước khi Franklin xuất bản bất kỳ công trìnhnào của bà Ngày 2 5 th á n g 6 n ăm 1953 , W a ts o n v r i c k đ à C ã đăng nghiên cứucủa các ông trong bài báo trên t ạ p c h í kh o a h ọ c N a t u re v ới tiêu đề: A structurefor deoxyribose nucleic acids (Cấu trúc của Axit Deoxyribo Nucleic (ADN)

Phân tử ADN được coi là "cơ sở vật chất của tính di truyền ở cấp độ phântử" (molecule of heredity) Tuy nhiên, thực chất về mặt cấu tạo, các ADN khôngphải một phân tử đơn thuần mà nó được tạo thành từ hai chuỗi p ol y n u c l e o t i d e ,

chúng liên kết với nhau và uốn quanh 1 trục tương tự 1 chiếc thang dây xoắn.Cấu trúc này được gọi là cấu trúc xoắn kép

Mỗi chuỗi polynucleotide chính là do các phân tử n u c l e o t i d e l iên kết vớinhau thông qua l i ên k ết ph o sp h od i e s t e giữa gố đ ư ờ n g c c ủa nucleotide này vớigốc p h os ph a t e c ủa nucleotide tiếp theo Tóm lại, ADN là các đại phân tử(polymer) mà các đơn phân (monomer) là các nucleotide

nucleotide và những loại này khác nhau ở thành phần nucleobase Do đó tên gọicủa các loại

nucleotide xuất phát từ gốc nucleobase mà nó mang: a d e nin e ( A), t h y m in e (T), C y tosin e ( C), và gu a n in e ( G) Trong đó, Avà G l à các pu r in e ( có kíchthước lớn) còn T v à C ( tiếng Việt gọi là X ), có kích thước nhỏ hơn (p y r i m idi n e )

Trong môi trường dịch thể, 2 chuỗi polynucleotide của 1 phân tử ADNliên kết với nhau bằng l i ên k ế t h i đ r ô Liên kết này được tạo ra giữa 2 gốcnucleobase của 2 nucleotide đối diện nhau trên 2 chuỗi, tương tự như những bậcthang trên 1 chiếc thang dây

Do cấu tạo hoá học của các nucleobase mà liên kết hydro chỉ hình thànhgiữa 2 loại nucleobase nhất định là A v ới T ( qua 2 liên kết hydro)

và C v ới G ( bằng 3 liên kết hydro) Đó thực chất là liên kết giữa một purine và 1pyrimidine nên khoảng cách tương đối giữa 2 chuỗi polynucleotide được giữvững Nguyên tắc hình thành liên kết trên được gọi làn gu y ên t ắc b ổ s un g v à nóphổ biến trên mọi loài s i n h v ậ t

Trong tế bào, dưới tác dụng của một số protein đặc hiệu, 2 chuỗi của phân

tử ADN có thể tách nhau ra (còn gọi là b i ế n t ín h AD N) do các liên kết hydro bịcắt đứt Khi đó, các nucleotide trên mỗi chuỗi có thể tạo thành liên kết với cácnucleotide tự do trong môi trường nội bào Kết quả của q u á t r ì n h n ày l à tạothành 2 phân tử ADN giống hệt nhau từ 1 phân tử ADN ban đầu Đây cũng

thực hiện quá trình tự nhân đôi này t r o n g ố n g n g h i ệm g ọi là kỹ thuật PCR Nếu

sự bắt cặp giữa nucleotide chuỗi gốc với nucleotide không tuân theo nguyên tắc

bổ sung thì sẽ tạo thành đ ộ t bi ế n l à nguồn gốc của hiện tượng b i ến d ị

1.1.2 Cơ sở khoa học và sự ra đời của giám định gen

Năm 1956 Joe Hin Tjio và Albert Levan đã xác định chính xác ở người,trong nhân tế bào thể (tế bào lưỡng bội) có 46 nhiễm sắc thể (NST) được xếpthành 23 cặp đồng dạng: 22 cặp nhiễm sắc thể thường và một cặp nhiễm sắc thểgiới tính Riêng tế bào trứng và tinh trùng chỉ có 23 nhiễm sắc thể (tế bào đơn

bội) Thế hệ con cái nhận từ mẹ 23 nhiễm sắc thể thông qua tế bào trứng và 23nhiễm sắc thể từ cha thông qua tế bào tinh trùng Sự kết hợp giữa trứng và tinhtrùng đã duy trì được số lượng nhiễm sắc thể trong tế bào thường là 46 Bộnhiễm sắc thể được bảo tồn và truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác và mangtính đặc trưng cho người [26, 28]

Có nhiều phương pháp được sử dụng để xác định cá thể người: nhận biếtqua vân tay, tiếng nói, nhận biết các yếu tố di truyền như: xác định các nhómkháng nguyên hồng cầu (nhóm máu), xác định một số yếu tố protein trong huyếtthanh, xác định một số enzym, nhưng khả năng phân biệt còn thấp Phải đếnnhững năm cuối thế kỷ 20, đặc biệt là thập kỷ 80, 90 các nhà khoa học hình sựmới ứng dụng công nghệ gen (DNA- Technology) vào trong xác định tội phạm.Năm 1984 Alec Jeffreys và các cộng sự ở trường đại học Leicester (Anh) khinghiên cứu các đoạn ADN mã hoá cho myoglobin trong máu người đã phát hiện

ra trình tự của các bazơnitơ được lặp lại một số lần với chiều dài đoạn lặp từ

10-15 bp (base pair), các đoạn lặp này được gọi là tiểu vệ tinh (minisattelite) Ôngcũng phân lập được hai đoạn và nhân bội chúng, sử dụng làm mẫu dò (probe) đểphát hiện những vùng mà Jeffreys gọi là vùng siêu biến (hypervariable region) ởcác vật liệu di truyền khác nhau [26] Đây được coi là bước ngoặt lớn trong lịch

sử phát triển của Khoa học hình sự thế giới nói chung và Sinh học pháp lý nóiriêng Các tiểu vệ tinh được phát hiện thấy trong mọi tế bào và ở những vị tríkhác nhau trong hệ gen người Điều đáng chú ý là số lần lặp lại các đoạn lặp này

ở các cá thể khác nhau thì khác nhau Alec Jeffreys coi đây là đặc điểm rất quan

trọng để phân biệt sự khác nhau giữa các cá thể (truy nguyên cá thể) Giám định gen cho mục đích tư pháp ra đời từ đây Giám định gen ra đời không chỉ khắc

phục được những hạn chế của các phương pháp huyết thanh học mà còn giảiquyết được những vụ án bế tắc trước đây- những vụ án mà ADN là bằng chứngduy nhất Tính ưu việt của giám định gen là truy nguyên được cá thể người, xácđịnh quan hệ huyết thống cha con, xác định hài cốt Ban đầu, giám định gen

được gọi là giám định vân tay di truyền (DNA-"fingerprinting"), về sau để tránh

sự hiểu lầm giữa giám định đường vân và giám định gen, Uỷ ban nghiên cứuquốc gia Mỹ (NRC) đề nghị đổi là truy nguyên ADN (DNA-profiling) [16, 28]

Tháng 10 năm 1990, tại Mỹ, Dự án hệ gen người (Human GenomeProject-HGP) chính thức được bắt đầu Đến ngày 12 tháng 02 năm 2001, HGP

và Celera đã công bố trình tự đầy đủ của hệ gen người - một sự kiện trọng đạitrong sự phát triển của sinh học phân tử nói chung và trong việc nghiên cứu genngười nói riêng Theo công bố này, số lượng gen trong bộ gen người có khoảng

35 000 gen, trong đó có hàng chục gen được nghiên cứu ứng dụng để xác địnhhuyết thống và truy nguyên cá thể [26]

Cũng như ADN ở sinh vật nhân chuẩn khác, ADN nhân ở người gồmnhững trình tự mã hoá (các exon) xen kẽ với những trình tự không mã hoá (cácintron) [14, 15] Leder, năm 1977 đã phát hiện ra hiện tượng này Tuỳ mức độhiện diện của chúng trong nhân, các trình tự ADN được chia làm 3 loại:

- Các trình tự duy nhất: là các gen mã hoá cho các protein có trình tự đặctrưng cho từng gen

- Các trình tự có số lần lặp lại trung bình: chiếm khoảng 25- 40% bộ genngười, chúng có kích thước từ 100-1000 kb, đa dạng hơn các trình tự lặp lạinhiều lần Các trình tự này không tập trung mà phân tán trên toàn bộ hệ gen.Chúng có thể là những trình tự không mã hoá với chức năng chưa rõ hoặc cũng

có thể là những trình tự mã hoá (các gen mã hoá cho ARN riboxom, ARN vậnchuyển )

- Các trình tự lặp lại nhiều lần: Chiếm 10-15% bộ gen Đó là những trình

tự ADN ngắn (10-200 kb), không mã hoá, thường tập trung ở những vùngchuyên biệt trên nhiễm sắc thể (vùng tâm động, vùng đầu nhiễm sắc thể)

Các gen được sử dụng trong giám định hình sự là các gen nằm ở vùng

gen, người ta áp dụng các kỹ thuật phân tích các gen có đoạn lặp trung bình

(Variable Number of TADNem Repeat-VNTR hay Minisatellite) Nhưng những

kỹ thuật này chỉ áp dụng được với từng gen riêng lẻ (single locus) và phụ thuộcvào thao tác kỹ thuật của người giám định nên dễ xảy ra sai sót Từ năm 1990tới nay các nhà Khoa học hình sự sử dụng các kỹ thuật phân tích các gen cótrình tự lặp ngắn (Short TADNem Repeat-STR hay Microsatellite) vì chúng khábền vững, có khả năng phân tích đồng thời nhiều gen, ít phụ thuộc vào thao tác

kỹ thuật của người giám định Các cấu trúc VNTR hay STR đều mang tính bảothủ cao, được di truyền qua các thế hệ và mang tính đặc trưng cho cá thể Đó lànền tảng khoa học cho giám định gen Các gen này thường có tính đa hình cao,

ít đột biến, tương đối bền vững và cho phép đồng thời thực hiện được phản ứngnhân gen của nhiều gen khác nhau [24]

Tính đa hình của các gen này được thể hiện ở hai dạng: đa hình về trình tựcác nucleotid và đa hình về chiều dài

- Đa hình về trình tự: các gốc nucleotid ngẫu nhiên trong đoạn ADNkhông theo một trình tự nào Ví dụ: tại locus A,

Ở cá thể thứ nhất có trình tự: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

-

- Như vậy tại vị trí số 3 và vị trí số 8 của dãy thứ nhất đã được thay thế Abằng C và T bằng G

AGCCTGCGAG Đa hình về chiều dài: Một số gốc nucleotid được lặp đi lặp lại nhiều lầntrên chiều dài của đoạn ADN

Ví dụ: tại locus D7S820,

thể thứ hai: GAT A GAT A GA T A G A T A 12 đoạn lặp GAT A Xuất phát từ thực tế của giám định ADN và cùng với sự tiến bộ của kỹ

thuật, ngày nay các nhà khoa học hình sự đang áp dụng kỹ thuật phân tích các

gen có trình tự siêu ngắn Mini STR (Mini Short TADNem Repeat) Về thựcchất của Mini STR vẫn là những đoạn STR nhưng khi phân tích, mồi (primer)được thiết kế với mục đích sao chép đoạn STR ngắn hơn những đoạn STR thôngthường nhằm thu được sản phẩm từ những đoạn STR của mẫu ít nhiều đã bị biếntính hoặc phân huỷ phần nào, tức những mẫu có hàm lượng ADN ít Đây là sựcải tiến của các nhà khoa học, bởi lẽ dấu vết hình sự nói chung, đặc biệt là dấuvết sinh học nói riêng không phải lúc nào cũng tồn tại ở dạng nguyên vẹn chonên cần phải có những biện pháp kỹ thuật hợp lý để hạn chế sự biến tính của dấuvết đồng thời khai thác triệt để khả năng của dấu vết [21, 26].

Để phân tích Mini STR các hãng sản xuất trên thế giới cũng chế tạo ranhững bộ kit tương tự như những bộ kit phân tích thông thường khác, chẳng hạnnhư bộ kit Minifiler

Các tập đoàn nghiên cứu khoa học trên thế giới đã sản xuất các bộ kít phântích tổ hợp các gen có trình tự lặp lại ngắn: kít 2 gen (như TPOX/CSF1PO), kít 3gen (như THO1/F13A1/FES), kít 9 gen (D3S1358/FGA/vWA/ ) [21, 29]

Ngày nay các nhà Sinh học phân tử và Khoa học hình sự trên thế giới đãcho ra đời và ứng dụng những bộ kít phân tích tới 16, 24 hoặc 27 gen Việc phântích ít hay nhiều gen phụ thuộc vào đặc điểm quần thể, dân số của mỗi quốc gia.Nếu chỉ phân tích từ 2 đến 3 gen thì độ tin cậy khoảng 85 % - 90% Số lượnggen được phân tích càng nhiều thì độ tin cậy càng cao Theo tập đoàn Perkin-Elmer (Mỹ) khi phân tích tổ hợp 9 gen hệ Profiler Plus thì khả năng trùng hợp

về một kiểu gen là vô cùng nhỏ, vì tần suất xuất hiện của một kiểu gen làkhoảng 1/72 tỉ [40] Hiện nay, Viện Khoa học hình sự - Bộ Công an Việt Nam

sử sụng hẹ Identifiler để xây dựng cơ sở dữ liệu tần xuất các gen (database) củangười Việt (Kinh); truy nguyên cá thể và xác định huyết thống cha con Quagiám định cho thấy khả năng trùng hợp của một kiểu gen trong quần thể ngườiViệt cũng vô cùng nhỏ Ví dụ: Trong vụ án hiếp, giết và cướp tài sản xảy rangày 12/01/2005 tại xã Long Thành Bắc, huyện Hoà Thành, tỉnh Tây Ninh,

giám định gen theo hệ Profiler Plus cho thấy kiểu gen của tinh trùng có trênquần lót nạn nhân trùng hoàn toàn với kiểu gen của đối tượng và tần xuất củakiểu gen này trong quần thể người Việt là 1/60 tỉ (trong khi đó dân số Việt namhiện nay chỉ khoảng 82 triệu); do vậy đã truy nguyên được đối tượng gây án.Trong một vụ án giết người xảy ra ngày 09/12/2004 tại xã Hàm Thạnh, huyệnHàm Thuận Nam, tỉnh Bình Thuận, phân tích gen đã khẳng định được máu trêncon dao chính là máu của nạn nhân vì kiểu gen phân tích từ dấu vết máu trêndao trùng với kiểu gen của nạn nhân với tần xuất trong quần thể người Việt là1/638404 tỉ.

Theo các nhà khoa học hình sự khi phân tích bằng bộ kit Identifiler thì độ

người thì mới có một người ngẫu nhiên nào đó trùng với kiểu gen trên [17, 28]

Bộ kit ProfilerPlus có 10 locus, độ tin cậy trung bình là khoảng1/ 1,48 x

D3S1385 D5S818 D7S820 D8S1179 D13S317

truy tìm tội phạm, xét xử đúng người, đúng tội và minh oan cho người vô tội.Giá trị chứng cứ của ADN ngày càng được coi trọng trong hệ thống pháp luật,đặc biệt ở các nước phát triển Ở Mỹ hiện có hơn 100 phòng giám định gen hình

sự của nhà nước và hàng chục phòng thí nghiệm của tư nhân Hàng năm họ đãgiám định hàng trăm ngàn mẫu ADN Ở hầu hết các nước châu Âu và châu Áđều có giám định ADN ở các mức độ phát triển khác nhau Riêng ở Trung Quốcngành công an đã triển khai giám định ADN xuống tận cấp quận, huyện Trênthế giới số lượng phòng giám định ADN ngày càng tăng [7, 14, 15] Ở ViệtNam, tại Viện Khoa học hình sự, phòng thí nghiệm giám định ADN đã đượctriển khai từ năm 1999 với trang thiết bị hiện đại và đội ngũ giám định viên đư-

ợc đào tạo chuyên sâu Trong qua trình phát triển trình độ năng lực cán bộ ngàycàng được nâng cao, trang thiết bị được bổ sung và nâng cấp, đã đáp ứng vàphục vụ hữu hiệu cho công tác đấu tranh phòng chống tội phạm của lực lượngCông an và công tác xét xử của ngành Tư pháp

1.1.3 Khái niệm về locus và alen

Locus là một đoạn ADN trên nhiễm sắc thể, dành cho một gen nhất định.Trong giám định ADN thì locus còn có thể là những đoạn ADN không mã hóa[26]

Alen là các trạng thái khác nhau của cùng một locus Mỗi cá thể đều cóhai alen cho mỗi một locus, trong đó một alen di truyền từ bố, một alen di truyền

từ mẹ Nếu hai alen của một locus hoàn toàn giống nhau thì được gọi là đồnghợp tử, còn khác nhau được gọi là dị hợp tử [16, 26]

1.1.4 Các tiêu chuẩn cho locus STR dùng trong giám định ADN

Giám định ADN hiện nay sử dụng các locus STR là chủ yếu Phươngpháp giám định gen có độ tin cậy rất cao bởi các locus STR có tính đa alen (tính

đa hình) rất cao, mỗi alen chỉ xuất hiện trong quần thể với tần số rất thấp [16,32] Locus STR ngắn nên có thể đồng thời phân tích được ba hoặc nhiều STR

hơn trong cùng một thời điểm Việc phân tích đa hệ rất có giá trị vì chúng có kếtquả phân biệt lớn và thành công ngay cả một số trường hợp mẫu lẫn hoặc đã bịphân hủy phần nào [14, 15].

Một locus STR được sử dụng cho mục đích nhận dạng và xác định cá thểphải đảm bảo các thông số sau:

- Có tính bền vững cao (tần suất đột biến thấp)

- Locus STR phải có tính đa hình và mức độ dị hợp tử cao Điều này giúpcác nhà phân tích chỉ sử dụng một số locus tối thiểu đã đạt được sự phân biệt cáthể một cách tốt nhất

- Các locus STR có độ dài ngắn, trung bình từ 100 - 400 bp so với cácđoạn đa hình ngẫu nhiên khác Các đoạn ADN ngắn có độ bền vững cao, ít bị đứtgãy dưới tác động của điều kiện ngoại cảnh Do vậy, khi tiến hành PCR thựchiện sẽ thu được hiệu quả tốt hơn các đoạn ADN dài

- Các locus chứa đoạn STR phải đảm bảo yếu tố di truyền độc lập, do vậynên lựa chọn tổ hợp các locus nằm trên các nhiễm sắc thể khác nhau là rất quantrọng Các STR thông thường có rất nhiều alen, độ dài của các alen thôngthường khác nhau số đoạn lặp Do vậy, việc sử dụng các STR có chiều dài dưới

400 base để dễ dàng phân tích là một yêu cầu cần thiết trong quá trình lựa chọn

Nhiều đoạn đa hình có trình tự lặp lại chứa các đơn vị lặp lại từ 4nucleotide đã được nghiên cứu và đáp ứng được yêu cầu của quy trình phân tích

cá thể người Các đoạn này có đặc tính như sau:

- Có tính đa hình và mức độ dị hợp tử cao (>70%)

- Dễ dàng phối hợp thành bộ phức khi thực hiện PCR

- Sản phẩm PCR ổn định, ít xảy ra trường hợp khi PCR đoạn lặp bị thiếu

1.1.5 Ý nghĩa của cơ sở dữ liệu tần suất alen của các locus STR

Mỗi cá thể người có cấu trúc di truyền riêng không ai giống ai, trừnhững trường hợp sinh ra cùng một trứng [7] Nếu xét rộng trong cả một quần

thể thì một số đặc điểm di truyền (ADN) ở các cá thể khác nhau vẫn có thểgiống nhau (trùng lặp) Mặt khác mỗi một quần thể người (tộc người) khác nhaucũng có những đặc điểm di truyền đặc trưng thể hiện bằng sự phân bố tần suấtalen trong mỗi quần thể [30, 40] Do vậy, trong giám định ADN các nhà khoahọc hình sự ngoài lựa chọn, nghiên cứu những locus (vị trí trên nhiễm sắc thể)

có tính đa alen (đa hình) cao thì cần khảo sát tần suất phân bố các alen trongquần thể của từng locus để sử dụng Quần thể được nghiên cứu khảo sát phảiđạt được các yêu cầu trong thống kê, di truyền như: các mẫu dùng trong nghiêncứu phải đảm bảo tính ngẫu nhiên, không có quan hệ huyết thống trong 3 đời[19, 36]

Để có được tần suất của mỗi alen, trước hết phải tìm được số lần xuất hiệncủa mỗi alen trong quần thể nghiên cứu sau đó tính tần suất lý thuyết của alen đótheo luật di truyền quần thể [40] Khi có được tần suất thực tế và tần suất lýthuyết của mỗi alen, chúng ta tiến hành kiểm định xem tần suất alen có đượcchấp nhận với mức xác suất đã chọn

Giám định gen (ADN) đòi hỏi cơ sở khoa học vững chắc để tính toán xácsuất một người ngẫu nhiên trong quần thể là người có cấu trúc di truyền đặctrưng trùng lặp với ADN trong các mẫu vật (thu thập trong quá trình điều tra,phá án) Nếu không có tần suất alen thì không tính toán được tần suất xuất hiệncủa một kiểu gen nào đó trong một quần thể nhất định [12, 29, 32]

Trong trường hợp cần xác định huyết thống, để kết luận một người cóphải là cha đẻ hoặc mẹ đẻ của người con không, phải dựa vào khả năng chonhận của các alen và phải căn cứ vào tần suất alen để tính ra chỉ số quan hệhuyết thống (Paternity Index - PI) Từ đó tính độ tin cậy đạt được Mặt khác, đócũng là cơ sở khoa học để so sánh độ tin cậy trong trường hợp phân tích đượcnhiều locus gen hoặc ít locus gen hơn [31]

1.2 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về khảo sát tần suất các alen của các locus gen sử dụng trong giám định ADN

1.2.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Từ những năm 1990, các nhà Khoa học hình sự trên thế giới sử dụng các

kỹ thuật phân tích các gen có trình tự lặp ngắn (Short Tandem Repeat-STR hayMicrosatellite) cho mục đích giám định ADN hình sự [21, 29]

Ứng dụng các thành tựu của Công nghệ sinh học nói chung và kết quả của Dự

án hệ gen người (Human Genome Project-HGP) nói riêng, Các tập đoàn nghiêncứu khoa học trên thế giới đã sản xuất các bộ kit phân tích tổ hợp các locus cótrình tự lặp lại ngắn: kit 2 locus (TPOX/CSF1PO), kit 3 locus (THO1/F13A1/FES), kit 9 locus (hệ Profiler Plus của hãng Perkin-Elmer, Mỹ), kit 15 locus (hệIdentifiler của hãng AB, hệ Power Plex 16 của hãng Promega) [11]

Tổ chức Cảnh sát hình sự quốc tế (Interpol) có hiệp hội giám định ADN vàrất nhiều quốc gia đã có phòng thí nghiệm giám định ADN hình sự

Mỗi phòng thí nghiệm giám định gen (ADN) đều phải đạt những chỉ tiêuchất lượng trang thiết bị máy móc cũng như con người và đều phải có cácnghiên cứu, khảo sát và công bố kết quả của mình về tần suất các alen trong hệlocus gen của từng quần thể người để ứng dụng trong giám định truy nguyên cáthể hay xác định quan hệ huyết thống Để đảm bảo tính chính xác, các phòng thínghiệm giám định gen thường dùng hệ thống phân tích 15 locus gen như hệIdentifiler hoặc hệ Power Plex 16

Tại Mỹ, cảnh sát liên bang Mỹ đã khảo sát và sử dụng tần suất dữ liệuADN theo hệ Identifiler của nhiều chủng tộc người khác nhau: 191 người gốc

Mỹ, 290 người Mỹ gốc Tây Ban Nha và Bồ Đào Nha, 349 người Mỹ da trắng và

357 người Mỹ gốc Phi [17, 20]

Với chủng tộc người lai Âu - Á (Eurasia), tại mỗi quốc gia khác nhau lại cónhững khảo sát khác nhau về tần suất các alen theo hệ Identifiler của cộng đồngngười Eurasia tại quốc gia đó: 384 người tại Nga, 300 người tại Hy Lạp, 139

người tại Rumani [38, 39]

Tại Singapore, Cảnh sát Singapore sử dụng tần suất các alen theo hệIdentifiler của dân tộc người Hoa, dân tộc người Mã Lai, dân tộc người Ấn Độ

để phục vụ công tác giám định [7]

1.2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam, giám định gen được triển khai từ tháng 4 năm 1999, tại ViệnKhoa học hình sự - Bộ Công an Toàn bộ quy trình giám định gen được chuyểngiao từ Viện Khoa học hình sự bang Victoria - Úc cùng đội ngũ giám định viênđược đào tạo cơ bản tại Úc

Năm 2000, đề tài cấp Bộ "Nghiên cứu, khảo sát và xây dựng tần suất các alen của các gen trong hệ NinePlex II (9 locus gen) trên đối tượng người Kinh"

được triển khai và năm 2002 được nghiệm thu, kết quả là bảng tần suất các alencủa người Kinh được sử dụng hiệu quả trong các bản kết luận giám định truynguyên cá thể, xác định quan hệ huyết thống giúp các cơ quan tố tụng giải quyết

có hiệu quả rất nhiều vụ việc [7]

Năm 2004, Việt Nam đã thông báo bảng tần suất các alen của các locus gen

hệ Nineplex II trên đối tượng người Kinh cho Interpol, đây là một cột mốc đánhdấu sự phối hợp toàn cầu trong đấu tranh phòng chống tội phạm dựa vào lĩnhvực giám định ADN

Trường Đại học Y Hà Nội phối hợp với Viện Kỹ thuật hóa sinh và tài liệu

nghiệp vụ đã tiến hành “Khảo sát tần suất của 3 locus D5S818, D7S820

và D13S317 trên đối tượng người Mường” bằng các bộ kit phân tích ADN theo

công nghệ điện di nhuộm bạc

Năm 2006, Viện Khoa học hình sự đưa vào triển khai hệ Identifiler (15locus gen: D8S1179, D21S11, D7S820, CSF1PO, D3S1358, THO1, D13S317,D16S539, D2S1338, D19S433, vWA, TPOX, D18S51, D5S818 và FGA) tronggiám định ADN Với bộ kit mới này, công tác giám định đạt hiệu quả cao hơn so

với bộ kit 9 locus gen Nineplex II Cũng như các phòng thí nghiệm giám địnhADN khác trên thế giới, để có cơ sở pháp lý cho việc ứng dụng hệ Identifiler tạiViệt Nam thì phải khảo sát để có tần suất các alen của các dân tộc khác nhau.

Bảng 1.1 Các locus gen hệ Identifiler [17]

Tên locus Vị trí trên NST Trình tự đoạn lặp Các alen

Như vây chinh cac đăc trưng trong cấu tạo của phân tử DNA (trong cấutrúc phân tử, tính đa hinh về trât tự sắp xếp va tinh đa hinh về chiều dai) cungvới sự phân ly đôc lâp trong quá trinh hinh thanh giao tư va tô hơp tư do trongqua trinh thụ tinh hình thành hơp tư của cac nhiêm sắc thê trong nhân tế bao ơngười là cơ sở khoa học cho giam đinh DNA Co nhiều phương phap giam đinhDNA khác nhau tuy theo viêc sư dung đối tượng trong qua trinh phân tich là gi.Thực tế hiện nay phương pháp giam đinh DNA dưa trên việc phân tich trinh tưcác locus gen STR hê Identifiler đươc sư dụng hiêu qua va phô biến nhất.

Hiện nay đa co một số công trinh nghiên cưu tần suất các alen hêIdentifiler cua quần thê ngươi thuôc môt số dân tôc tai Viêt Nam song chưa cocông trình nào nghiên cứu tần suất cac alen hê Identifiler của quần thê ngươi dântộc Tày, nên việc lựa chon đề tai nghiên cưu tần suất cac alen hê Identifiler cuaquần thể ngươi dân tôc Tày la rất cần thiết va có y nghia cao ca về khoa hoc vathưc tiên

CHƯƠNG II

NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nội dung nghiên cứu

- Thu 120 mẫu máu của 120 cá thể người Khmer

- Phân tích mẫu bao gồm các bước tách chiết ADN, định lượng ADN,nhân bội ADN, điện di trên máy điện di mao dẫn, kết quả lập được bảng kiểugen của các mẫu nghiên cứu

- Xử lý số liệu thống kê, kiểm định tần suất kiểu gen giữa kết quả thực tế

và tính toán lý thuyết với độ tin cậy p = 0,05 Tính toán và đưa ra bảng tần suấtcác alen của các locus gen hệ Identifiler cho 120 cá thể người Khmer

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Luận văn sử dụng các phương pháp nghiên cứu sau

- Phương pháp lấy ý kiến chuyên gia

- Phương pháp điều tra khảo sát thực tế, thu đại diện ngẫu nhiên mẫu, đảmbảo các điều kiện theo định luật Hardy - Weinberg

- Phương pháp thực nghiệm khoa học: phân tích kiểu gen 120 cá thể theoquy trình giám định ADN của Viện Khoa học hình sự

- Phương pháp thống kê số liệu sinh học để tính tần suất các alen trong hệIdentifiler của dân tộc Khmer

Luận văn sử dụng các kỹ thuật sau

- Thu mẫu máu: dùng kim chích đầu ngón tay và thấm lên giấy FTA

- Kỹ thuật tách chiết ADN dùng chelex 100

- Kỹ thuật PCR và định lượng ADN bằng hệ thống Realtime PCR

- Kỹ thuật điện di mao quản

2.2.1 Thu mẫu

Thu mẫu máu của 120 cá thể người Khmer theo nguyên tắc ngẫu nhiên,không có quan hệ họ hàng huyết thống:

- Thu mẫu ngẫu nhiên ở nhiều địa phương khác nhau

- Quan sát hình thái học (người dân tộc Khmer có các đặc điểm nhânchủng học đặc trưng)

- Kiểm tra giấy tờ tùy thân (chứng minh thư nhân dân, giấy khai sinh )

- Hỏi trực tiếp người được thu mẫu

- Dùng kim chích đầu ngón tay và thấm trực tiếp vào giấy FTA

- Mẫu thu phải đảm bảo chất lượng, không bị lẫn, nhiễm, phơi khô tựnhiên, đóng gói riêng rẽ, ghi ký hiệu cho mẫu từ KM1 đến KM122 (hai mẫu bịhỏng)

2.2.2 Phân tích mẫu

2.2.2.1 Quy trình phân tích ADN

Chúng tôi tiến hành phân tích theo quy trình giám định ADN của ViệnKhoa học hình sự đã được chuẩn hóa theo quy định tại Điều 42, khoản 2, mục bcủa Luật Giám định tư pháp 2012, gồm các bước sau:

Tách chiết ADN(phương pháp vô cơ)

Định lượng ADN (phương pháp Real-time PCR)

Nhân bôi ADN (PCR)(bộ Kit Identifiler)

Điện di mao quản(Máy AB3130)

(Phần mềm GenmapperID v3.2)

2.2.2.2 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ

a Hóa chất và thiết bị cho tách chiết ADN

b Hóa chất và thiết bị cho định lượng ADN

Biosystems)

c Hóa chất và thiết bị cho nhân bội và điện di

10 Septa

2.2.3 Xử lý thống kê số liệu và tính tần suất các locus gen

2.2.3.1 Cơ sơ ly thuyêt

Đê số liêu nghiên cưu về cac locus gen sư dung đươc cho nhưng ưng dung

cu thê, điều cần thiết đầu tiên la cần đánh gia xem mâu nghiên cưu vơi locus genđươc phân tích có đam bảo rằng cấu truc di truyền cua mâu (tần số tương đốicủa các alen và tần số cac kiêu gen) la ổn đinh hay không qua cac thế hê, nghia

la mâu có tuân theo định luât Hardy - Weinberg hay không [9, 13, 40]?

Do đo cần kiêm tra sư phu hơp giưa mâu vơi quần thê cân bằng ly thuyếtthông qua đánh giá chênh lệch giữa tần số quan sat thực tế vơi phân bố ly thuyếtcủa các kiểu gen của môi locus gen đươc nghiên cưu co sai khac nhau haykhông? [3, 40]

2.2.3.2 Phương phap xư ly thông kê

Kiêm đinh sư phu hơp phân bố tần số kiêu gen giưa mâu khảo sát va quần

Đánh giá sư phù hợp giữa số liệu thưc nghiệm và giả thuyết lý thuyết theo

Trong đó : * k là số lơp của dãy số liệu thưc nghiệm

(2.1)

k(k-1)/2 (2.3)

Quy tắc kiểm định 2 là trong một locus gen số lượng kiểu gen quan sátdưới 5, thì phải kết hợp các alen bên cạnh để tăng số lượng quan sát cao hơn 5

để tính toán

2.2.3.3 Các bước tính toán thống kê và kiểm định

- 120 kiÓu gen cña 120 c¸ thÓ ng•êi Khmer ®•îcthèng kª tÇn sè kiÓu gen, tÇn sè alen

- Tinh tần suất cac alen cua mỗi locus theo số liêu thu đươc trong nghiên

- Xac đinh số kiêu gen thưc tế cua mâu khảo sát (số lượng kiểu gen AiAjcho từng locus )

locus được giả thiết tuân theo định luật Hardy - Weinberg)

bảng)

- So sanh gia tri khi binh phương tinh được với khi bình phương tiêu

phù hơp vơi phân phối lý thuyết, nghia la mâu phu hơp vơi quần thê ly thuyết [2,

3, 4, 13, 10]

Trong chương này chúng tôi đã trình bày các bước thu thập và bảo quảnmẫu đúng với qui trình tiên tiến tại các phòng thí nghiệm giám định ADN củacác nước trên thế giới Cùng với đó là qui trình giám định ADN của Viện Khoahọc hình sự đã được chuẩn hóa theo quy định tại Điều 42, khoản 2, mục b LuậtGiám định tư pháp 2012

Sử dụng phương pháp thống kê phổ biến trong nghiên cứu Sinh học, do

CHƯƠNG 3

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN

3.1 Kết quả thu, bảo quản mẫu và tách chiết ADN

- Thu ngẫu nhiên được 120 mẫu máu của 120 người Khmer trên thẻ thu

mẫu FTA và bảo quản theo quy định tại phòng thí nghiệm ADN của Viện Khoahọc hình sự (có danh sách ở phần phụ lục)

- Chúng tôi cũng đã tiến hành tách chiết ADN từ các mẫu máu trên theo

phương pháp vô cơ, định lượng ADN theo phương pháp Realtime PCR Do điềukiện thu mẫu tương đối tương đồng về các mặt khách quan như cán bộ thu mẫu,vật liệu thu mẫu và thời gian thu - bảo quản mẫu và sử dụng máy đục lỗ(Punching) để lấy mẫu với kích thước giống nhau nên chúng tôi chỉ tiến hànhđịnh lượng trên 10 mẫu ngẫu nhiên từ 120 mẫu máu thu trên thẻ FTA và cho kếtquả như sau:

Bảng 3.1: Kết quả định lượng ADN bằng phương pháp Realtime PCR