Nghiên cứu tạo kit tách chiết ADN và ARN từ các tiêu bản cố định mô ung thư

Tuy nhiên, trước khi lựa chọn được hạt phù họp, chúng tôi đã thực hiện tổng họp các loại hạt có tính chất khác nhau theo phương pháp đã mô tả ở trên, và dưới đây là kết quả phân tích của

BÁO CÁO TỎNG KÉT

K Ế T Q U Ả T H ự C H IỆ N Đ Ề T À I K H & C N

C Á P Đ Ạ I H Ọ C Q U Ố C G IA

từ các tiêu bản cố định mẫu mô ung thư

H à Nội , 2 0 1 7

1.3 Danh sách chủ trì, thành viên tham gia thực hiện đề tài

1 PGS.TS Nguyễn Thị Vân Anh Trường ĐHKHTN Chủ nhiệm đề tài

1.4 Đ ou vị chủ trì: T rư ờ n g Đại học K hoa học T ự nhiên• o # • • •

1.5 Thòi gian thực hiện:

1.5.1 Theo hợp đồng: từ tháng 1 năm 2016 đến tháng 12 năm 2017

1.5.2 Gia hạn (nếu có): Không

1.5.3 Thực hiện thực tế: từ tháng 1 năm 2014 đến tháng 12 năm 2017

1.6 Những thay đổi so với thuyết minh ban đầu (nếu có):

( v ề m ụ c t i ê u , n ộ i d u n g, p h ư ơ n g p h á p , k ế t q u ả n g h i ê n c ứ u v à t o c h ứ c t h ự c h i ệ n ; N g u y ê n n h â n ;

Ỷ kiến của Cơ quan quản lý)

1.7 Tổng kinh phí đưọ’c phê duyệt của đề tài: 665.000.000đ (sáu trăm sáu mươi lăm triệu đồng).

PHẦN II TỎNG QUAN KÉT QUẢ NGHIÊN c ứ u

1 Đ ặt vấn đề

Sử dụng nến và paraíin trong bảo quản lâu dài các mô ung thư là một phương pháp hiệu quả giúp cung cấp nguồn mẫu dự trữ dồi dào và có chất lượng ổn định cho nghiên cứu, cũng như các xét nghiệm thường quy trong bệnh viện và chẩn đoán dịch tễ học phân từ trên quy mô lớn Trong đótách chiết ADN và ARN từ các tiêu bản mô ung thư cố định bằng íòrmalin trong thể vùi paraíìn(formalin-fixed, paraffin-embedded tissue, gọi tắ t là mô ung th ư FFPE) là bước đi đầu tiên giúp phát hiện các dấu ấn phân từ liên quan đến ung thư sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử như: giải trình tự gen, Real time PCR nhàm xác định chính xác các đột biến gen hay định lượng mức độ biểu hiện của gen chỉ thị ung thư giúp các bác sỹ lâm sàng tiên lượng được bệnh, chân đoán chính xác hơn và chỉ định điều trị thuốc hướng đích hiệu quả (Ahmad-Neiad et al., 2015; Gilbert et al., 2007) Hiện nay việc tách chiết ADN và ARN từ các tiêu bản mô ung thư FFPE còn gặp nhiều khó khăn, hàm lượng ADN/ARN thấp và ADN/ARN bị đứt gãy sau khi tách chiết, gây trở ngại cho các

kỹ thuật chẩn đoán sinh học phân từ khi sử dụng ADN/ARN tách chiết làm khuôn của phản ứng (Masuda et al., 1999; Macabeo-Ong et al., 2002; Shi el al., 2004; McSherry et al., 2007) Dựa trên

System (Promega), Invisorb® Spin Tissue Mini Kit (Stratect) Tuy vậy, hạn chế của phương pháp này là thời gian thực nghiệm dài với số lượng mẫu lớn, không tự động hóa được quy trình tinh sạch nên có khả năng nhiễm chéo cao giữa các mẫu trên cùng 1 lần thao tác Để khắc phục nhược điểm này, các công ty sinh phẩm hóa chất phát triển các bộ kit sử dụng hạt oxit sắt từ tính bọc silica (Fe3 0 4/SiC>2) kích thước micromet Các phân tử nucleic acid sau khi liên kết với hạt micro từ bọc silica sẽ được giữ lại và tách riêng ra khỏi protein, các hợp chất khác nhờ nam châm Nucleic acid

sẽ thu được dưới dạng tinh sạch khi được tách ra khỏi hạt micro từ bọc silica bằng dung dịch đệm

có nồng độ muối thấp hoặc bằng nước cất (Stephane et al., 2004) Một số kit thương mại sử dụng hạt micro từ tính bọc silica như MagMAX FFPE DNA isolation kit (Thermo Scientiíic, Mỹ), Maxwell 16 FFPE Tissue LEV DNA Puriíication kit (Promega, Mỹ), SaMag™ FFPE DNA Extraction Kit (Sacace, Ý) với quy trình đơn giản và thời gian tách chiết rút ngắn còn khoảng 3 tiếng cho 24-96 mẫu tùy vào số giếng trên giá nam châm của hệ thống tách chiết tự động

Ở Việt Nam hiện nay chưa có công ty nào sản xuất bộ kit tách chiết ADN và ARN từ mô ung thư FFPE Vi vậy, các khoa xét nghiệm thuộc các bệnh viện tuyến Trung ương vẫn phải sử dụng các kit nhập ngoại với giá thành cao (100-150 nghìn đồng/phản ứng) cho các bệnh nhân tự nguyện chi trả xét nghiệm Do vậy, việc chủ động tạo ra các bộ kit này là rất cần thiết để chuyển giao công nghệ, sản xuất và ứng dụng các bộ kit có chất lượng tương đương với bộ kit ngoại nhập, giá thành cạnh tranh, phục vụ việc chẩn đoán tại các bệnh viện

2 Mục tiêu: nghiên cứu tạo bộ kit tách chiết ADN và ARN từ các tiêu bản cố định mẫu mô ung thư trong thể vùi paraíĩn (gọi tắt ]à ADN và ARN từ mô ung thư FFPE) bằng công nghệ hạt nano từ bọc silica với các ưu điểm: hiệu suất tách chiết cao, thời gian tách chiết ngắn, giá thành giảm khoảng 3 lần so với kit nhập ngoại

3 Phương pháp nghiên cứu

Tổng hợp hạt nano từ tỉnh FejŨ 4 @ SỈO 2 : Đầu tiên, lỗi hạt nano từ tính Fe3Ơ4 được tổng hợp bàng phương pháp đồng kết tủa bằng cách hòa tan FeCl2.4H2 0 với FeCỈ3 trong nước khử ion, khuấy đều trên máy khuấy từ (IKA RW 20 digital) ở nhiệt độ 60°c Sau đó, NH4OH 11% được tiếp tục thêm vào dung dịch phản ứng và khuấy trong 90 phút để tạo mầm tinh thể Sau khi đưa về nhiệt độ phòng, hỗn dịch chứa mầm tinh thể Fe3Ơ4 được rửa với cồn ethanol 6 lần và với nước khử ion 1 lần Trong bước tiếp theo tạo lớp bọc silica, hỗn dịch hạt nano từ Fe3 0 4 được đưa vào dung dịch gồm ethanol, nước khử ion, ammonia solution NH3 28% và TEOS với tỷ lệ khác nhau của TE0 S:Fe3 0 4 NPs là 1; 8,9 và 17,8 Hỗn họp được rung sóng siêu âm (Elmasonic S15H) với thời gian 5, 1 0, 15 30, 45, 60, 90 và 1 2 0 phút để tạo các hạt nano Fe3Ơ4@ S1O2 phân tán tốt trong nước-cồn và có độ dày của lóp silica khác nhau, c ấ u trúc của hạt được phân tích bàng phổ nhiễu

xạ tia X (X Bruker D5005 X-ray), kỹ thuật kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM JEM1010, JEOL), phổ hồng ngoại (FT/IR-6300, JASCO, và đo từ độ thông qua thông số đường cong từ trễ (VSM) để chọn lựa ra 3 loại hạt đại diện: có sự khác biệt về độ dày của lớp S1O2 và từ độ (Nguyen et al., 2014; Nguyen et al., 2017)

P ha c h ế cá c bộ đ ệm : Các bộ đệm được pha chế tham khảo từ nghiên cứu trước đây (N guyen et

al., 2014) và cải tiến, tối ưu cho phù họp cho việc tách chiết ADN/ARN từ mô ung thư FFPE Các muối, acid hữu cơ (Guanidin HC1, Guanidin SCN, Tris-HCl, EDTA, Natricitrat, acid citric, Kali

2

-ADN; BB1-02, BB2-02, BB3-02 cho ARN), đệm rửa mẫu (Washing Buffer 01-1 01-2, 02-1, 02-2 gọi tắt là WB01-1, WB01-2 cho ADN, WB02-1, WB02-2 cho ARN), đệm chiết đẩy (Elution Buffer

1, 2 gọi tắt là EB1 cho ADN, EB2 cho ARN) Trong đó, hai loại đệm quan trọng nhất là Lysis và Binding buffer được thử nghiệm, so sánh để chọn ra bộ đệm phù họp nhất cho bộ kit tách chiết ADN và ARN từ mô ung thư FFPE Các đệm vvashing và elution không có nhiều sự thay đổi so với các bộ đệm từ nghiên cứu trước nên thừa hường từ nghiên cứu trước của nhóm (Nguyen et al., 2014; Nguyen et al., 2017)

- Thu thập mẫu mô ung th ư FFPE: 10 mẫu mô FFPE nghi ung thư vòm mũi họng (UTVMH)

được cung cấp bởi Khoa Sinh lý bệnh,-Học viện Quân Y; 30 mẫu mô FFPE nghi ung thư đại trực tràng (ƯTĐTT) được cung cấp bởi Trung tâm nghiên cứu Gen và Protein - Đại học Y Hà Nội; 30 mẫu mô FFPE nghi ung thư tuyến giáp (UTTG) được cung cấp bời bệnh viện TWQĐ 108

- Tách chiết A D N và A R N từ mẫu mô ung thư FFPE sử dụng hạt nano từ bọc silỉca và hệ đệm

phù họp: việc tách chiết được tiến hành trên giá nam châm 12-giếng và 24-giếng (cũng là sản phẩm

được tạo ra trong đề tài này), gồm có 2 bước chuẩn bị và 1 quy trình tách mẫu, tóm tắt như sau: Chia mẫu: Mầu mô vùi paraíin được cắt thành từng lát mỏng có độ dày khoảng lmm, dài khoảng 20-50 mm Dùng cân tiểu ly cân các lát cắt mô khoảng 10 mg/phản ứng; Xử lý parâíìn: mẫu được

xử lý với dung dịch dầu khoáng để loại bỏ lóp paraíĩn Sau đó, sừ dụng cồn và nước để rửa sạch lượng dầu khoáng còn sót lại, chỉ giữ lại mô; Quy trình tách ADN và ARN từ mẫu mô vùi paraíìa: Đầu tiên, 20 |il proteinase K và 200 |il LB (là LB1-01, LB2-01, LB3-01 cho ADN; LB1-

02, LB2-02, LB3-02 cho ARN) được bổ sung vào 10 mg mẫu mô ung thư đã được loại bỏ paraíĩn bằng dầu khoáng Nếu tách chiết ADN , mẫu được ủ ở 60°c trong 1 giờ đế ly giải mô giải phóng ADN, và tiếp tục ủ ở 90°c trong 1 giờ để loại bỏ liên kết chéo Nếu tách chiết ARN, mẫu được ủ ờ 60°c trong 15 giờ để ly giải mô giải phóng ARN, và tiếp tục ủ ở 80°c trong 30 phút để loại bỏ liên

kết chéo 400 ụ\ BB (BB1-01, BB2-01, BB3-01 cho ADN; BB1-02, BB2-02, BB3-02 cho ARN),

200 ụ\ isopropanol và 50 Ịil hạt nano từ bọc silica (hạt MagSi nano) (M l, M2, M3) được bổ sung

vào mẫu để ADN hoặc ARN được gắn lên hạt MagSi nano Mầu được đặt lên giá nam châm để tập trung phức hệ hạt gắn ADN hoặc ARN và loại bỏ các tạp chất 500 |il WB1-1 và 500 |il WB2-1 lần lượt được bổ sung vào hạt để rửa bỏ các tạp chất còn sót lại trước khi chiết đẩy ADN ra khỏi hạt bằng 50 ụ.1 EB1 500 Ịil WBl-2 và 500 |il WB2-2 lần lượt được bổ sung vào hạt để rửa bỏ các tạp

chất còn sót lại trước khi chiết đẩy A R N ra khỏi hạt bằng 50 |il EB2 ADN/ARN được bảo quản ở -

20°c hoặc sử dụng ngay cho phản ứng PCR, real time PCR, real time RT-PCR tiếp theo Kit thương mại dùng để so sánh là MagMAX FFPE DNA isolation kit (Thermo Scientiíĩc, Mỹ), ReliaPrep™ FFPE DNA Miniprep System (Promega), Invisorb® Spin Tissue Mini Kit (Stratec) và ReliaPrep™ FFPE Total ARN Miniprep System (Promega)

Đánh giá nồng độ và độ tinh sạch ADN/ARN: được thực hiện bàng phương pháp đo độ hấp

thụ ờ bước sóng 260 nm và 280 nm trên máy quang phổ kế Nanodrop 2000 Đánh giá mức độ đứt gãy cùa ADN sau khi tách chiết được thực hiện bằng phương pháp điện di ADN tách chiết trên gel agarose 1,5-2% (Nguyen et al., 2014; Nguyen et al., 2017)

- Đánh giá chất lượng A D N sau khi tách ch iết có thể sử dụng cho các ứng dụng tiếp theo được

thực hiện bàng các phương pháp kiểm định (assay) sau:

bước: 95°c 30 giây, 58°c 30 giây, 72°c 30 giây ; 72°c 5 phút

• Giải trình tự gen của sản phẩm PCR để phát hiện một số đột biến trên các gen dấu chuẩn

BRAF Sản phẩm PCR nhân đoạn gen đặc hiệu BRAF được điện di trên gel agarose 1,5-2% để

kiểm tra độ sáng và vị trí của băng sau đó được tinh sạch bởi ANAPURE PCR & Gel Purifícation kit (ANABIO R&D), và gửi mẫu đi giải trình tự (IDT, Mỹ) Trình tự ADN được phân tích bởi phần mềm ApE (Đại học Uta, Mỹ) kết họp cơ sở dữ liệu tin sinh học NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/')

• Real time PCR Taqman probe để phát hiện các đột biến gen dấu chuẩn ung thư BRAF (V600E), KRAS-1, KRAS-2 (G12A/D/R/V/C/S; G13D), HRAS (G12V, G13R, G61R), NRAS

(Ọ61H/K/R/L) bàng bộ Thyroid Cancer Mutation Analysis Kit (Entrogen), phát hiện các virus gây bệnh ung thư như Epstein-Barr-EBV kết họp định lượng gen giữ nhà P-globin để đánh giá tính toàn vẹn của ADN tách chiết (Niesters et al., 2000) Trình tự mồi và probe phát hiện EBV gồm: EBV-Fw 5’- GGAACCTGGTCATCCTTGC- 3’, EBV-Rv 5’- ACGTGCATGGACCGGTTAAT - 3’, EBV-Probe 5,-(FAM)-********TCGTACTGCTCGCT-(TAMRA)-3, Chu trình nhiệt gồm 95°c 10 phút; 45 chu kỳ gồm các bước: 95°c 30 giây, 60°c 45 giây

• Nested real time SYBR kết họp với giải trình tự gen để phát hiện genotype của Human Papillomavirus-HPV (DeRoda Husman et al., 1995; Herraez-Henandez et al., 2013) Trình tự mồi và probe phát hiện HPV gồm: HPV- F w l, 5’- TTT AAT AAR CCA TAT TGG YTR CA -

3 ’, HPV- R vl, HPV-Fw2 5’- ATT CAT AGT ATG WAT ATA KGY CAT - 3’, HPV- Rv2 5’- GAA AAA TAA ACT GTA AAT CAT ATT c - 3 \

- Đ ánh giá chất lượng A R N sau k h i tách chiết: ARN được đánh giá sừ dụng làm khuôn cho các

ứng dụng tiếp theo thông qua phương pháp kiểm định tiêu chuẩn cơ sở (assay) định lượng mức

độ biểu hiện mARN của gen dấu chuẩn ung thư (TSHR) kết họp định lượng gen nội chuẩn GAPDH để đánh giá tính toàn vẹn của ARN tách chiết Các mồi và probe sử dụng trong nghiên cứu được tham khảo theo các nghiên cứu trước đây (Tanaka et al., 2000; Roddiger et aỉ., 2002; Barber et al., 2005) và cải tiến để đạt được độ nhạy tốt hơn, bao gồm: GAPDH- Fw 5’- TCATAATGCTTGCTCTGATAG- 3 ’, GAPDH- Rv 5’- CTTTCTAGTAACTCAGCAGC -3 % GAPDH- Probe 5’-HEX-TCCGACGCCTGCTTCACCACCTTCT-MGBNFQ-3', TSHR- Fw 5'- CCTTCACCTCACACGGGCT-3', TSHR- Rv 5'-TGCTCTCATTACACATCAAGGACTC-3', TSHR- Probe 5’-FAM- ********CACTGCTGTGCC-BHQ-3\ Chu trình nhiệt gồm 50°c 30 phút; 95°c 10 phút; 45 chu kỳ gồm các bước: 95°c 30 giây, 60°c 45 giây

4 Tổng kết kết quả nghiên cứu

4.1 Xây dựng quy trình chế tạo và sử dụng bộ kit tách chiết DNA từ các tiêu bản cố định mẫu

mô ung thư

4.1.1 Tổng họp và xác định cấu trúc, tính chất của hạt nano từ tính từ bọc silica FeỉƠ 4 @ SìOị

Quy trình chế tạo hạt phù họp nhất cho việc tách chiết ADN/ARN từ tiêu bản mô ung thưFFPE được mô tả chi tiết ở Phụ lục 1 Tuy nhiên, trước khi lựa chọn được hạt phù họp, chúng tôi

đã thực hiện tổng họp các loại hạt có tính chất khác nhau theo phương pháp đã mô tả ở trên, và dưới đây là kết quả phân tích của 03 loại hạt nano Fe3Ơ4@ S1O2 đại diện (ký hiệu là M l, M2, M3) được lựa chọn để sử dụng cho việc thử nghiệm tách chiết ADN/ARN

4

-(422), (511) và (440) Kết quả chỉ ra rằng hạt nano Fe Ơ NPs có cấu trúc “cubic spinel” đảo với hằng số mạng a = 8,36 Â khi so sánh với phổ chuẩn JCPDS Card No (79 - 0417) Vị trí đỉnh tại góc 20 khoảng 20°-30° của hạt nano Fe3 0 4@SiƠ2 được xác định là của lớp vô định hình silica Kích thước trung bình của tinh thể Fe304 được tính bằng công thức Debye-Sherrer có giá trị là 10,7

nm Hình 1B là phổ FTIR của SĨƠ2, hạt nano Fe3Ơ4 và Fe3Ơ4@Si0 2 được chế tạo với tỉ lệ TEOS:Fe3Ơ4 là 17,8 dưới điều kiện siêu âm trong thời gian 10 p h ú t, 30 phút and 60 phút Trong tất cả các phổ, vùng xung quanh 1600 and 3400 ciĩT1 là dao động của liên kết H-O-H hoặc hấp thụ của nước (TLTK) Trong phổ của hạt nano Fe3 0 4 và Fe3 0 4@SiC>2 có vùng hấp thụ tại 500 Cĩĩf1 là dao động của liên kết F e-0 Vùng tại 1060 cm~' là dao động của o trong liên kết Si-O-Si trong

S1O2 Két quả này chứng tỏ Fe3 0 4 NPs được bọc thành công bởi S1O2

Hình 1: Phổ nhiễu xạ tia X và phổ FTIR của các mẫu (A): Phổ nhiễu xạ tia X của hạt nano Fe30 4 tổng hợp (a), Fe3 0 4@ Si0 2 với tỷ lệ mol 17,8 và thời gian siêu âm 10 phút (b) và 60 phút (c), (B): phổ FTIR của S i0 2, hạt nano Fe30 4 và Fe30 4@ Si02 được chế tạo với tỷ lệ mol TE0S:Fe30 4 là 17,8 theo phương pháp siêu âm trong 10 phút, 30 phút và 60 phút.

Hìah 2 là ảnh TEM của hạt nano Fe3Ơ4 (a) và Fe3 0 4@Si0 2 với tỉ lệ mol TEOS:Fe3C>4 là 17,8 chế tạo với thời gian siêu âm là 10 phút, 30 phút and 60 phút Phân bố kích thước hạt được chỉ ra lần lượt trong Hình 2 (b), (h), (j) and (1) Kích thước trung bình của hạt nano Fe3 0 4 là 10,7 nm và của hạt lano Fe3 0 4@SiƠ2 dưới điều kiện siêu âm 10 phút là 23,4 nm và cả hai loại hạt cỏ dạng gần hình cầu Khi thời gian siêu âm tăng lên 30 và 60 phút, kích thước trung bình của hạt nano

nano hoặc tăng lượng silica bọc hạt Kết quả nhiễu xạ tia X chỉ ra rằng bề mặt hạt nano Fe3 0 4 đã được bcc thành công nhờ sử dụng sóng siêu âm Điều này có thể quan sát trong ảnh TEM của hạt nano Fe;C>4@Si0 2 với tỉ lệ mol TEOS:Fe3C>4 lần lượt là 1 (Hình 2c), 8,9 (Hình 2e) và 17.8 (Hình

2i) chế -ạo dưới điều kiện siêu âm 20 phút Phân bố kích thước được thể hiện tương ứng lần lượt

trong các trong hình 2d, 2 f và 2j Khi tỉ lệ mol TEOS:Fe3Ơ4 tăng từ 1 đến 8,9 và 17,8, kích thước hạt trung, bình Fe3 0 4@SiC>2 tăng lần lượt từ 14,5, 24,4 và 34,9 nm Có thể kết luận tăng thời gian siêu âm sẽ làm tăng kích thước hạt nano hoặc tàng lượng silica bọc hạt

1 lình 2: Hình ảnh TEM của NPN Fei04 (a) và Fe304 @ SÌO2 NP với tỷ lệ mol TEOS: Fe3Ơ4 lần lượt là 1 (c), 8,9 (e) và 17.8 (i) được chế tạo với thời gian siêu âm là 30 phút Sự phân bố kích thước của chúng được thể hiện tương ứng trong Hình 2 (b), (d), (í) và (j) Fe3Ơ4 @ SÌO2 NPs với tỷ lộ mo! TEOS: Fe304 NPs là 17,8 được che tạo với thời gian siêu âm 10 phút (g), 30 phút (i) và 60 phút (k) Sự phân bố kích thước của chúng được thê hiện lương ứng trong Hình 2 (b), (h), (j) và (1).

Hình 3A thế hiện đường cong từ hóa của của hạt nano Fe3Ơ4 và Fe3C>4@Si0 2 với ti lệ mol TEOS:Fe3 0 4 17,8 cùng thời gian siêu âm lần lượt là 10, 30 và 60 phút tại nhiệt độ 300 K Tất cả các đường cong cho thấy tính chất siêu thuận từ với lực kháng từ rất nhỏ Từ độ bão hòa của hạt nano

Fe 3 0 4 là 60,9 emu/g ở 11 kOe sau đó giảm xuống khi lớp silica được phủ lên bề mặt của hạt Lý do của sự giảm hấp thụ bão hòa được quan sát có thể được giải thích bàng sự có mặt của vỏ silica xung quanh hạt đã làm suy yếu tính chất từ của lõi hạt từ của từ bên trong Hình 3B cho thấy từ độ bão

100 nm

6

Time (min) (B) Hình 3: Các đường cong từ hóa và từ độ bão hòa cùa các hạt nano Fe30 4 và Fe30 4 @ SĨƠ2 , (A): Các đường cong từ hóa của hạt nano Fe30 4 và Fe30 4@ Si0 2 với tỷ lệ mol TE0S:Fe30 4 là 17,8 theo với thời gian siêu âm là 10, 30 và 60 phút ở 300 K Trong hình con của hình A cho thấy các đường từ hóa với từ trường trong khoảng từ -100 Oe đến 100 Oe (B) Từ độ bão hòa của hạt nano Fe30 4 và Fe30 4@Si0 2 với ti lệ mol TEOS:Fe3Ơ4 là 1, 8,9 và 17,8 với thời gian siêu âm 120 phút ở nhiệt độ 300 K.

Từ các kết quả này, chúng tôi chọn các hạt nano Fe3 0 4@Si0 2 (mẫu M l, M2 và M3) cho các ứng dụng như trong Bảng 1, ừong đó MI là Fe3Ơ4 @ S1O2 chế tạo với tỉ lệ mol TEOS: Fe3 0 4 NPs

là 1 với thời gian siêu 30 p h ú t; M2 là Fe304 @ S1O2 NPs chế tạo với tỷ lệ mol TEOS Fe3Ơ4NPs là 8,9 với thời gian siêu âm 30 phút; M3 là Fe3Ơ4 @ S1O2 NPs chế tạo với tỷ lệ mol TEOS: Fe3Ơ4 NPs

là 17,8 với thời gian siêu âm 30 phút

Bảng 1: Dặc điểm của 03 loại hạt nano từ Fc30 4@ Si0 2 bọc silica

1 Nồng độ (mg/ml) 25, 50, 75 25 25

2 Từ độ bão hòa của hạt nano lõi Fe30 4 (emu/g) 60.9 60.9 60.9

3 Từ độ bão hòa của hạt nano Fe30 4@Si02 (emu/g) 50.2 18.6 10.3

4 Đường kính trung bình của hạt nano lõi Fe30 4 (nm) 10,7 10,7 10,7

5 Đường kính trung bình của hạt nano Fe30 4@Si02 (nm) 14.5 24.4 34.9

4.1.2 Tối ưu đệm Lysis và Binding B uffer p h ù hợp với tách chiết A D N từ mô FFPE

Trong quá trình tối ưu kít tách chiết ADN từ mô ung thư FFPE, đầu tiên chúng tôi thực hiện tối

ưu đệm Lysis và Binding buffer vì đây là 2 đệm quan trọng nhất quyết định thành công của các bộ kit tách chiết Ba loại bộ đệm Lysis và Binding được pha chế, có thành phần được kí hiệu là LB1-01 + BB1-01 (bộ đệm 1-DNA), LB2-01 + BB2-01 (bộ đệm 2-DNA), LB3-01 + BB3-01 (bộ đệm 3-

M l Mỗi thí nghiệm đều sử dụng 10 mg lát cắt mô FFPE, lặp lại 3 lần Nồng độ ADN của 5 bệnhnhân khi tách chiết bởi ba bộ đệm được trinh bày trên Hình 4.

Bàng 2: Kết quả đo độ tinh sạch ADN của 5 bệnh nhân tách bời 3 bộ đệm khác nhau.

ADN tách chiết của 5 bệnh nhân này khi sử dụng bởi cả 3 bộ đệm sử dụng được để làm

khuôn cho phản ứng PCR nhân đoạn gen BRAF Kêt quả điện di sản phâm PCR (Hình 5) chỉ ra răng phản ứng PCR lấy khuôn là ADN tách chiết từ 3 bộ đệm đêu nhân thành công gen đặc hiệu BRAF,

có khích thước khoảng 252 bp, trong đó phản ứng PCR sử dụng khuôn là DNA tách bởi bộ đệm 2- DNA cho tín hiệu sáng rõ nét nhât ở 3 mâu đại diện Kêt quả này tương đông với kêt quả đo nông

độ ADN ở Hình 4, khẳng định thêm việc lựa chọn đệm 2-DNA là phù hợp nhất

252 bp

300

200

100

Hình 5 : Kết quả điện di PCR nhân đoạn gen Braf từ mẫu ADN của Bệnh nhân 2 tách bởi ba bộ đệm tương

ứng (Bộ đệm 1-DNA: LB1 + BB1: Bộ đệm 2-DNA: LB2 + BB2; Bộ đệm 3-DNA: LB3 + BB3); lkb: lkb ladder, lOObp: lOObp DNA ladder, đối chứng (-t): plasmid TOPO chứa đoạn gen đặc hiệu kích thước 252 bp

của gen Braf.

4.1.3 Lựa chọn hạt M agsi nano phù hợp với tách chiết A D N từ mô ung thư FFPE

Sau khi lựa chọn được bộ đệm 2-DNA (LB2-01 + BB2-01) là bộ đệm phù hợp nhất, chúng tôi dùng bộ đệm 2 này đế tiếp tục lựa chọn hạt Magsi nano từ 3 loại hạt Magsi nano ban đầu M 1, M2, M3 Vì lượng mô của mỗi bệnh nhân chỉ đủ sử dụng cho khoảng 9-10 lần lặp lại, thí nghiệm lựa chọn hạt nano phù hợp buộc phải tiến hành trên mẫu mô vùi paraíìn của 5 bệnh nhân tiếp theo

(ký hiệu BN 6-10) và mỗi bệnh nhân được lặp lại ba lần (n = 3) ADN của 5 bệnh nhân tách chiết

bởi ba loại hạt Magsi nano khác nhau được đem đi đo nồng độ và độ tinh sạch bàng phương pháp quang phố kể sử dụng máy Nano Drop ND-1000 Nồng độ ADN khi tách chiết bởi ba loại hạt được trình bày trên Hình 6

'<©

0.00

Hình 6: So sánh nồng độ ADN tách từ 10 mg mẫu mô ung thư FFPE của 5 bệnh nhân sử dụng ba loại hạt

Magsi nano Ml, M2, M3 khác nhau (n = 3).

Bảng 3: Kết quà áo độ tinh sạch ADN của 5 bệnh nhân tách hởi 3 loại hạt khác nhau

BN 6, BN7 là 16,5 ± 1,18 ngẠil, 30,6 ± 5,8 ngẠíỉ đối với BN 8, 41,6 ± 3,5 ngẠil BN9 và 12,2 ± 6,3 ng/(.u ở BN 10) và gấp 2 lần so với hạt M3 (16,6 ± 1,5 ng/ul ơ BN 6, BN7 là 40,5 ±4,17 ng/|il, 69,6

± 14,3 tig/ịil đối với BN 8, 94,8 ± 1,4 ng/|il BN9 và 32,4 ± 4,5 ng/|.il ở BN 10) Điều này có thể lý giải là ADN có nhiều nhỏm chức phosphate có khả năng bám tốt lên bề mặt silica nên chỉ cần lớp bọc silica mỏng cũng đủ giữ lại ADN trên bề mặt hạt Việc chọn hạt MI có lớp SÍƠ2 mỏng nhất nhưng bù lại có từ độ cao nhất sẽ giúp giữ được nhiều hạt nano gắn ADN lên giá nam châm và cho hiệu quả tách cao Độ tinh sạch của ADN tách chiết bởi ba loại hạt Magsi nano trình bày ở Bảng 3 cho thấy ADN tách chiết bởi cá ba loại hạt đều có độ tinh sạch tốt không lẫn nhiều protein hay ARN

vì giá trị A2 6 0/A2 8 0 năm trong khoảng 1,8 - 2,2

Tiếp tục sử dụng ADN tách chiết từ ba loại hạt để làm khuôn cho phản ứng PCR nhân đoạn

gen đặc hiệu BRAF, sau đó điện di kết quả PC'R trên gel agarose 1,5% (Hình 7) Kết quả điện di

cho thấy ADN tách chiết bởi ba loại hạt Magsi nano đều có khả năng sử dụng làm khuôn nhân thành

công đoạn gen đặc hiệu BRAF Trong đó sử dụng ADN tách bởi hạt MI cho kết quả PCR rõ nét

nhất, độ dày của băng lớn nhất, tín hiệu sáng nhất so với băng PCR nhân bản từ ADN tách bới hai loại hạt còn lại Kết quá này tương đồng với kết quá đo nồng độ ADN tổng số ớ trên Hình 7

plastnid TOPO chứa đoạn aen đặc hiệu kích thước 252 bp của gen BRAF.

Sau khi tách được ADN từ các mẫu mô FFPE của ba bệnh nhân và nhân thành công đoạn gen

đặc hiệu BRAF từ sản phẩm ADN tách chiết được, chúng tôi đã tiến hành gửi mẫu giải trình tự đoạn gen BRAF của hai bệnh nhân số 1 và số 2 và thu được tín hiệu các đính peak của trình tự rõ ràng

(kết quả không trình bày ở đây), chứng tỏ ADN tách chiết bởi bộ đệm 2 và hạt nano từ bọc silica

MI đã loại bở được hoàn toàn các liên kết chéo, sử dụng tốt cho các thí nghiệm PCR và giải trình tự sau đó Từ các kết quả trình bày trong Hình 6, 7 và Bảng 3, chúng tôi lựa chọn hạt nano từ bọc silica

MI vì hạt này cho phép tách được ADN với hàm lượng cao nhất, băng PCR có độ sáng rõ nét nhất

và có thè ứng dụng cho việc giải trình tự gen chỉ thị ung thư

♦

252 bp

-

10-sở đánh giá chất lượng bộ kit, hướng dẫn sử dụng bộ kit Toàn bộ thông tin được trình bày chi tiết ơ

Bảng 4: Các thành phần trong MAGPURE FFPE DNA nano kit (100 pứ)

Thành phần Mã hóa Lượng Proteinase K 20 mg/ml PK 1 ml MagSi nano 75 mg/ml MI 4 ống X 1,25 ml Lysis Buffer LB-01 20 ml

Binding Buffer BB-01 50 ml Washing Buffer 1 WB1-01 50 ml (đậm đặc) Washing Buffer 2 WB2-01 100 ml

Elution Buffer EB-01 20 ml

Với quy trình sản xuất này, chúng tôi phối hợp với công ty ANABIO R&D là đơn vị nhận chuyến giao công nghệ tạm tính giá thành thương mại của 01 bộ kit 100 pứ là 4 triệu đồng (chi phí hóa chất-nguyên vật liệu cho sản xuất, kiếm định: 2 triệu, chi phí nhân công-điện nước-hao phí máy móc-quản lý phí: 1 triệu; chi phí quảng cáo-bán hàng: 1 triệu) Giá thành bộ kit MagPure chỉ bằng khoảng 1/3 giá bán của các kit nhập ngoại, ví dụ như MagMAX FFPE DNA isolation kit (96 pứ) của Thermo Scientiíic là 12 triệu, ReliaPrep™ FFPE Total DNA Miniprep System (100 pứ) của Promega là 11 triệu; và Invisorb® Spin Tissue Mini Kit (50 pứ) của Stratect: 5,5 triệu Quy trình tách chiêt ADN của MagPure kit có thời gian tương đương (khoảng 3 giờ) với kit thương tnại MagMAX FFPE DNA isolation kit (Thermo Scientiííc, Mỹ) và ReliaPrep™ FFPE DNA Miniprep System

Hình 8: Hình ảnh MagPure FFPE DNA nano kit và giá nam châm

4.2 Xây dựng quy trình chế tạo và sử dụng bộ kỉt tách chiết ARN từ các tiêu bản cố định mẫu

mô ung thư

4.2.1 Lựa chọn hại M agsi nano phù hợp với tách chiết A R N từ mô ung thư FFPE

Với bộ kit tách ARN, trước hết chúng tôi tạm thời sử dụng bộ đệm LB02-01 + BB02-01 đã được tối ưu cho ADN và chỉ thay đổi 3 loại hạt MagSi Nano M l, M2, M3 đế thứ nghiệm tách chiết ARN với mục đích tìm ra loại hạt phù hợp nhất Các khối mô ung thư tuyến giáp dạng thể vùi

ARN và độ tinh sạch ARN cho kết quả dao động và không phản ánh chính xác chất lượng ARN sau tách chiết Vì vậy chúng tôi tham khảo những nghiên cứu trước đây (Masuda et al., 1999; Tanaka et al., 2000) và chọn phương pháp đánh giá chất lượng và hàm lượng ARN chủ đạo là Real time RT- PCR sử dụng primer được thiết kế vắt chéo qua 2 exon cho phép chỉ khuếch đại ARN của gen nội chuẩn GAPDH mà không khuếch đại ADN của GAPDH.

Hình 9: Biểu đồ so sánh giá trị C( của gen GAPDH được nhân lên trong phản ứng Real time RT-PCR (n = 3)

sử dụng khuôn ARN tách chiết bởi 3 loại hạt MagSi nano M l, M2 và M3 (A) và đường biểu diễn khuếch đại ARN của gen GAPDH được nhân lên trong phản ứng Real time RT-PCR sử dụng khuôn ARN tách chiết bởi 3 loại hạt MagSi Nano M l, M2, và M3 (B) trên mẫu bệnh số 1.

Với cách tiếp cận như vậy ARN tổng sổ tách chiết được từ 3 loại hạt khác nhau đã được

dùng là khuôn cho phản ứng Real time RT- PCR nhân bản đoạn gen nội chuẩn GAPDH Dựa trên

biểu đồ so sánh giá trị chu kỳ ngưỡng (Thresold cycle; Ct) và tín hiệu huỳnh quang nhân lên của phản ứng Real time RT- PCR sử dụng ARN tách chiết từ 3 loại hạt MagSi nano được trình bày ở Hình 9, chúng tôi thấy ARN tách chiết bởi ba loại hạt MagSi nano đều có khả năng sử dụng làm

khuôn nhân thành công đoạn gen GAPDH với giá trị Ct có sự khác biệt, nhưng không quá lớn

Trong đó, ARN tách bởi hạt M3 cho giá trị chu kỳ ngưỡng thấp nhất (Ct = 24) với tín hiệu huỳnh quang cao nhất (RFU = 400), còn hạt MI và M2 cho giá trị chu kỳ ngưỡng tương ứng là 25 và 26 với tín hiệu huỳnh quang tương ứng RFU khoảng 210 và 110 Điều này có thể lý giải là do ARN có kích thước phân tử nhỏ và số nhóm chức phosphate ít hơn so với ADN nên lực tương tác với silica yếu hơn ADN và cần hạt nano từ có lớp silica dày hơn để bám lên Từ các kết quả trên chúng tôi chọn lựa hạt M3

4.2.2 Tổi ưu đệm Lysis và Bindíng Buffer p h ù hợp với tách chiết A R N từ mô FFPE

Sau khi đã chọn lựa được hạt M3 phù hợp nhất, áp dụng quy trình đánh giá chất lượng ARN sau tách chiết như trên chúng tôi giữ lại đệm LB02-1 của bộ đệm tách chiết ADN và thử nghiệm thay đổi đệm Binding bằng cách tiến hành pha chế 3 bộ đệm Binding Buíĩer (BB1-02, BB2-02, BB3-02) với thành phần hóa học, nồng độ các chất (GuHCL, Tris HCL ) cũng như pH khác nhau Thí nghiệm được tiến hành trên mẫu mô ung thư FFPE số 2 và lặp lại 3 lần để tìm ra đệm BB cho hiệu quả tách chiết ARN tốt nhất

Hình 10: Biểu đồ so sánh giá trị c t của gen GAPDH được nhân lên trong phản ứng Real time RT-PCR (n -

3) sù dụng khuônARN tách chiết bởi 3 loại đệm BB1-02, BB2-02, và BB3-02 (A) và đường biểu diễn khuếch đại ARN của gen GAPDH trong phản ứng Real time RT-PCR sử dụng khuôn ARN tách chiết bởi 3

loại đệm BB1, BB2, và BB3 (B) trên mẫu bệnh số 2.

Dựa trên biểu đồ so sánh giá trị chu kỳ ngưỡng (Thresold cycle; Ct) và tín hiệu huỳnh quang nhân lên của phản ứng Real time RT- PCR sử dụng RNA tách chiết từ 3 loại hạt MagSi nano được trình bày ở Hình 10, chúng tôi thấy ARN tách chiết bởi ba loại đệm đều có khả năng sử dụng làm

khuôn nhân thành công đoạn gen GAPDH với giá trị Ct có sự khác biệt khá đáng kể Trong đó,

ARN tách bởi đệm BB3-02 cho giá trị chu kỳ ngưỡng thấp nhất (Ct = 23) với tín hiệu huỳnh quang

cao nhất (R FU = 1400), còn đệm BB1 và BB2 cho giá trị chu kỳ ngưỡng tương ứng là 25,5 và 27 với tín hiệu huỳnh quang tương ứng RFU khoảng 800 và 700.

Như vậy chúng tôi đã chọn được hạt M3 và đệm BB3-02 phù hợp cho tách chiết ARN Tương

tự, chúng tôi tiếp tục thay đổi đệm Lysis buíĩer bằng cách pha chế 3 bộ đệm LB1-02, LB2-02, LB3-02 với thành phần hóa học, nồng độ các chất (SDS, Tris HCL ) khác nhau Thí nghiệm được tiến hành trên mẫu mô ung thư FFPE số 3 và lặp lại 3 lần Lượng mô ung thư FFPE sử dụng cho 1 phản ứng tách chiết là 10 mg để tìm ra đệm LB cho hiệu quả tách chiết ARN tốt nhất

Hình 11: Biểu đồ so sánh giá trị c t của gen GAPDH được nhân lên trong phản ứng Real time RT-PCR (n =

3) sử dụng khuôn ARN tách chiết bởi 3 loại đệm LB1-02, LB2-02, và LB3-02 (A) và đường biểu diễn khuếch đại ARN của gen GAPDH trong phản ứng Real time RT-PCR sử dụng khuôn ARN tách chiết bởi 3 loại đệm B B 1, BB2, và BB3 (B) trên mẫu bệnh số 3.

4.2.3 Xây dựng quy trình chế tạo và sử dụng bộ kít tách chiết A R N từ các tiêu bản cố định m ẫu

mô ung th ư và sản xuất 10 bộ kit

Tổng hợp các dữ liệu về hạt M3, bộ đệm LB1-02, BB3-02, WBl-02, WB2-02, chúng tôi đã xây dựng được quy trình chế tạo bộ kit bao gồm quy trình sản xuất, phương pháp kiểm định và tiêu chuẩn cơ sở

đánh giá chất lượng bộ kit Thông tin được trình bày chi tiết ở Phụ lục 2 Dưới đây là công thức

(Bảng 5) và hình ảnh bộ kit bên cạnh giá nam châm (Hình 13) được sản xuất trong đề tài

Bảng 5: Các thành phần trong MAGPURE FFPE RNA nano kit (100 pứ)

Proteinase K 20 m g/m l PK 1 m l MagSi nano 50 mg/ml M3 4 ống X 1,25 m l

Washing Buffer 1 W B l-0 2 50 m l (đậm đặc)

Với quy trình sản xuất này, chúng tôi phối hợp với công ty ANABIO R&D là đom vị nhận chuyển giao công nghệ tạm tính giá thành thương mại của 01 bộ kit 100 pứ là 5 triệu đồng (chi phí hóa chất-nguyên vật liệu cho sản xuất, kiểm định: 2,5 ừiệu, chi phí nhân công-điện nước-hao phí

máy móc-quản lý phí: 1,25 triệu; chi phí quảng cáo-bán hàng: 1,25 triệu) Giá thành bộ kit

MagPure chỉ bằng khoảng 1/3-1/4 giá bán của các kit nhập ngoại, ví dụ như MagMAX FFPE RNA isolation kit (96 pứ) của Thermo Scientiííc là 24 triệu, ReliaPrep™ FFPE Total RNA Miniprep System (100 pứ) của Promega là 18 triệu) Quy trình tách chiết ARN của MagPure kit cỏ thời gian tương đương (khoảng 2 giờ) với kit thương mại ReliaPrep™ FFPE RNA Miniprep System

Hình 12: Hình ảnh MagPure FFPE RNA nano kit và giá nam châm

4.3 Đánh giá chất lượng của các bộ kỉt tách chiết ADN và ARN từ các tiêu bản cổ định mẫu

mô ung thư

Các bộ kit được chúng tôi thực hiện nội kiểm định chất lượng trên các mẫu ung thư vòm mũi họng FFPE cung cấp bởi Bộ môn sinh lý bệnh, Học viện Quân Y trước khi gửi đi đánh giá chất lượng tại

02 đơn vị y tế là Trường ĐH Y Hà Nội và Bệnh viện QĐTW108

1 4

-trên 10 mẫu bệnh phẩm và so sánh với kit MagMAX của hãng Thermo Scientiíic Kit thử nghiệm được bảo quản trong vòng 12 tháng kể từ ngày sản xuất đến lúc thừ nghiệm Ket quả trên Hình 13 cho thấy cả hai bộ kit đều đã tách thành công ADN từ mẫu mô FFPE với độ tinh sạch cao trong khoảng 1,8-2,1 Hàm lượng ADN tinh sạch bởi kit MAGPURE thậm chí cao hơn kit MagMAX từ 2 cho tới 5 lần, đạt nồng độ khoảng 20-220 ng/|al và hàm lượng ADN tổng khoảng 2-200 Ịig.

Hình 13: Hàm lượng ADN cùa 10 mẫu bệnh phẩm tách bằng kit MagPure và MagMAX

Bảng 6: Kết quả real-time PCR phát hiện EBV và real-time nested PCR phát hiện HPV sử dụng ADN

khuôn tác từ 2 bộ kit MagPure và MagMAX trên 10 bệnh nhân

và hàm lượng ADN tách bằng kit MagPure tốt hơn hẳn so với MagMAX Tương tự với HPV, kết quả chỉ ra 2 kit MagPure và MagMAX tương đồng 100%, khi cùng phát hiện được 4/10 mẫu dương tính 9 (chiếm 40%) Từ các kết quả trình bày ở trên, có thể kết luận cả 2 bộ kit MagPure và

sừ dụng cho nhiều ứng dụng khác nhau như phát hiện đột biến gen chỉ thị ung thư cũng như virus gây bệnh.

4.3.2 Thử nghiệm kit tách MagPure FFPE A D N và A R N nano kit tại bệnh viện Q Đ TƯ 108

Nhóm nghiên cứu của TS Hoàng Quốc Trường tại bệnh viện QĐTƯ 108 đã tiến hành thử nghiệm, đánh giá hiệu quả tách chiết và chất lượng ADN khi tách bằng bộ kit MagPure với Invisorb® Spin Tissue Mini Kit, đạt tiêu chuẩn CE-IVD của Châu Âu, của hãng Stratec (Đức) trên cùng đối tượng 20 mẫu mô ung thư biểu mô tuyến giáp Kit thử nghiệm được bảo quản trong vòng

8 tháng kể từ ngày sản xuất đến lúc thử nghiệm ADN tinh sạch sau khi tách bằng 2 bộ kit được dùng làm khuôn cho phản úng real time PCR để phân tích một số đột biến trên gen chỉ thị ung thư

như BRAF (V600E), KRAS-1, KRAS-2 (G12A/D/R7V/C/S; G13D), HRAS (G12V, G13R, G61R),

NRAS (Q61H/K/R/L) hiện đang bắt đầu đưa vào sử dụng cho việc chẩn đoán sớm ung thư biểu mô

tuyến giáp thể nhú tại Khoa Sinh học phân từ bệnh viên QĐTƯ 108 MagPure FFPE DNA nano kit

sử dụng hạt nano từ tính cho hiệu quả tách chiết ADN cao hơn Invisorb® Spin Tissue Mini Kit, thể hiện bời nồng độ ADN cao gấp 1,5-15 lần, tuy nhiên độ tinh sạch thấp hơn kit thương mại (giá trị

A2 6 0/A2 8 0 trong khoảng 1,2-1,6 (do thao tác tách chiết của kỹ thuật viên không hút sạch hoàn toàn vvashing buffer) Nồng độ ADN tách bằng MagPure kit đạt khoảng 20-100 ng/ịil và hàm lượng

ADN tổng khoảng 2-100 jag, và ADN cho phép phát hiện đột biến trên gen BRAF ở mô ung thư

tuyến giáp với độ nhạy cao hơn (18/20 mẫu dương tính) so với Invisorb® spin Tissue Mini Kit

(13/20 mẫu dương tính), và cho kết quả tương đồng 90-100% ở 4 gen còn lại KRAS-1, KRAS-2,

NRAS và HRẨS Kết quả chi tiết xem tại Phụ lục 3.

Hiệu quả tách chiết và chất lượng ADN khi tách bằng bộ kit MagPure FFPE RNA nano kit được so sánh với ReliaPrep™ FFPE Total ARN Miniprep System của hãng Promega Việc so sánh được tiến hành trên cùng đối tượng 10 mẫu mô ung thư biểu mô tuyến giáp và 10 mẫu mô lành tính ARN tinh sạch sau khi tách bằng 2 bộ kit sẽ được dùng làm khuôn cho phản ứng real time RT- PCR

để phân tích mức độ biểu hiện marker gen Thyroid Stimulating Hormone Receptor (TSHR) và gen nội chuẩn Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) Hai loại MagPure FFPE RNA nano kit sử dụng hạt nano từ tính cho hiệu suất thu hồi ARN tổng số kém hơn từ 2-3 lần so với kit ReliaPrep™ FFPE Total RNA Miniprep System của hãng Promega, tuy nhiên cho độ tinh sạch và chất lượng của ARN tách bằng 2 bộ kit là tương đương Nồng độ ARN tách bằng MagPure kit đạt khoảng 22-100 ng/|J và hàm lượng ARN tổng khoảng 2,2-100 |j.g, giá trị A2 6 0/A2 8 0 trong khoảng1,9-2.1, và ARN đảm bảo chất lượng làm khuôn cho phản ứng real time RT-PCR phân tích mức độ biểu hiện gen TSHR ở các bệnh nhân nghi ung thư biểu mô tuyến giáp với độ sai lệch kết quả dưới 10% so với Promega kit Ket quả chi tiết xem tại Phụ lục 4

4.3.3 Thử nghiệm kit tách MagPure FFPE DNA nano kit tại Trucmg Đ H Y Hà Nội

MagPure FFPE DNA nano kit được đánh giá tiếp tục bởi nhóm nghiên cứu của PGS Trần Vân Khánh thuộc Trung tâm nghiên cứu Gen và Protein thuộc Trường ĐH Y Hà Nội, so sánh với kit MagMAX FFPE DNA Isolation kit (Thermo Scientiĩic) trên cùng đối tượng 20 mẫu mô ung thư đại trực tràng Kit thử nghiệm được bảo quản trong vòng 6 tháng kể từ ngày sản xuất đến lúc thử

~ - - —.- .— - - 1 6 - -

Gen- Protein, Đại học Y Hà Nội Hai loại kit sử dụng hạt từ bọc silica MagPure FFPE DNA nano kit và MagMAX FFPE DNA Isolation kit (Thermo Scientiíic) cho hiệu quả tách chiết ADN từ mẫu

mô đúc paraíin, khả năng khuếch đại gen bằng phản ứng PCR và giải trình tự là tương đương nhau Một số mẫu tách chiết bằng MagPure FFPE DNA nano kit cho nồng độ và độ tinh sạch cao hơn hai loại kit nhập ngoại Nồng độ ADN tách bàng MagPure kit đạt khoảng 50-400 ng/(_tl và hàm lượng ADN tổng khoảng 5-40 |ag, giá trị A2 6 0/A2 8 0 trong khoảng 1,8-2,0 ADN tách chiết bởi MagPure FFPE DNA nano kit hoàn toàn có thể áp dụng trong tách chiết ADN từ mẫu mô đúc parafíìn để phục vụ chẩn đoán phát hiện đột biến gen ung thư đại trực tràng bằng phương pháp PCR kết họp giải trình tự gen vì tín hiệu giải trinh tự thu được đều rõ nét và chính xác Kết quả chi tiết xem tại

Phụ lục 5.

5 Đánh giá về các kết quả đạt được và kết luận

Đe tài đã đạt được 2 mục tiêu đề ra là (i) tạo được các bộ kit tách chiết ADN và ARM từ các tiêu bản cố định bằng parafin/formalin các mẫu mô ung thư, và (ii) đánh giá chất lượng của các bộ kít tách chiết ADN and và ARN từ các tiêu bản cổ định mẫu mô ung thư Các kết quả đạt được bám sát theo đăng ký trong thuyết minh và họp đồng của đề tài v ề cơ bản, có 04 kết quả chính như sau:

- Đã xây dựng được quy trình sản xuất bộ kit tách chiết ADN từ mô ung thư FFPE với tên thương mại là MagPure FFPE DNA nano kit dựa trên các thành phần chính được tối ưu: Hạt Fe3Ơ4@

S1O2 Magsi nano MI (10,7 nm lõi từ Fe3Ơ4, 14,7 nm Fe3 0 4@Si0 2, từ độ bão hòa 50,2 emu/g),

bộ đệm ly giải và gắn DNA lên hạt ký hiệu LB2-01 + BB2-01 với giá thành khoảng 4 triệu đồng/100 pứ, bằng 1/3 so với kit thương mại nhập ngoại

- Đã xây dựng được quy trình sản xuất bộ kit tách chiết ARN từ mô ung thư FFPE với tên thươngmại là MagPure FFPE RNA nano kit dựa trên các thành phần chính được tối ưu: Hạt Fe3C>4@

S1O2 Magsi nano MI (10,7 nm lõi từ Fe3 0 4, 34,9 nm Fe3 0 4@SiC>2, từ độ bão hòa 10,3 emu/g),

bộ đệm ly giải và gắn ARN lên hạt ký hiệu LB1-02 + BB3-02, với giá thành khoảng 5 triệuđồng/100 pứ, bằng 1/3-1/4 so với kit thương mại nhập ngoại

- Bộ kit MagPure FFPE DNA nano kit được kiểm nghiệm nội bộ và thử nghiệm tại 02 đơn vị y tế

và kết quả đánh giá cho thấy ADN tách bởi bộ kit có hiệu quả và thời gian tách chiết tương đương với kit nhập ngoại có uy tín, và thậm chí lượng ADN tách chiết còn cao hơn khoảng 2-15 lần trên một số mẫu thử nghiệm Hàm lượng ADN tách từ 10 mg mô ung thư FFPE đạt khoảng 2-40 ịig, với nồng độ ADN trong khoảng 20-400 ng/ml tùy mẫu mô ung thư FFPE, và giá trị

- Bộ kit MagPure FFPE RNA nano kit được thử nghiệm tại 01 đơn vị y tế và kết quả đánh giá cho thấy ARN tách bởi bộ kit có hiệu suất thu hồi kém 2-3 lần so với kit Promega, tuy nhiên độ tinh sạch, chất lượng và thời gian tách chiết là tương đương Hàm lượng ARN tách từ 10 mg mô ung thư FFPE 2-10 (_ig, với nồng độ ARN trong khoảng 20-100 ng/ml tùy mẫu mô ung thư FFPE, và giá trị A2 6 0/A2 8 0 phản ánh độ tinh sạch của ARN nằm trong khoảng 1,9-2,1

cứu này, chúng tôi chế tạo các bộ kit tách chiết ADN và ARN từ mô ung thư FFPE sử dụng hạt nano từ tính bọc silica và các bộ đệm phù hợp và đánh giá chât lượng các bộ kit tạo thành Cụ thê, chúng tôi đã xây dựng được quy trình sản xuất bộ kit tách chiết ADN và ARN từ mô ung thư FFPE với tên thương mại là MagPure FFPE DNA nano kit và MagPure FFPE RNA nano kit dựa trên các thành phần chính được tối ưu: (i) Hạt Fe3Ơ4@ SiO? Magsi nano ký hiệu MI (14,7 nm Fe3Ơ4@Si02,

từ độ bão hòa 50,2 emu/g) để tách chiết ADN và ký hiệu M3 (34,9 nm Fe3 0 4@Si0 2 , từ độ bão hòa 10,3 emu/g ) để tách chiết ARN; (ii) bộ đệm ly giải và gắn ADN lên hạt ký hiệu LB2-01 + BB2-01

và bộ đệm ly giải và gắn ARN lên hạt ký hiệu LB1-02 + BB3-02 MagPure FFPE DNA nano kit được đánh giá có hiệu quả và thời gian tách chiết tương đương vói kit nhập ngoại có uy tín, và thậm chí lượng ADN tách chiết cao hơn 2-15 lần trên một số mẫu thử nghiệm Trong đó hàm lượng ADN đạt 2-40 p.g/10 mg mô, nồng độ ADN 20-400 ng/p.1, độ tinh sạch 1,8-2,2 MagPure FFPE RNA nano kit được đánh giá có hiệu suất thu hồi ARN kém 2-3 lần so với kit Promega, tuy nhiên độ tinh sạch, chất lượng và thời gian tách chiết là tương đương Hàm lượng ARN tách từ 10 mg mô ung thư FFPE là 2-10 Ịig, nồng độ ARN 20-100 ng/p.1, độ tinh sạch 1,9-2,1 ADN/ARN tách chiết bởi các

bộ kit MagPure đã được thử nghiệm tại 02 đơn vị y tế và đã được chứng minh có khả năng sử dụng làm khuôn cho các phản ứng PCR kết hợp giải trình tự gen, real time PCR trong phát hiện các đột biến gen chỉ thị ung thư và các virus gây bệnh liên quan tới ung thư đại tràng, mũi họng, và tuyến giáp Kết quả thừ nghiệm cũng cho thấy sự tương đồng cao với các bộ kit đã thương mại 02

bộ MagPure kit có giá thành thấp hợp 1/3-1/4 lần so với kit thương mại, và đã được chuyển giao công nghệ cho công ty ANABIO R&D để sản xuất và thương mại hóa trong thời gian tới

Tiếng A nh

Extraction of DNA and RNA from íòrmalin íixed paraffm embedded (FFPE) cancer tissue is critical important for down-stream molecular reactions to detect pathogens and biomarker’s mutations relating to cancer diseases In this study, we developed DNA and RNA extraction kit from FFPE cancer tissues using silica-coated magnetic nano particles and suitable buffers We built

up protocol to produce FFPE tissue DNA and RNA extraction kit and produced MagPure FFPE DNA nano kit and MagPure FFPE RNA nano kit based on the major components: (i) Fe3Ơ4@ SĨƠ2

Magsi nano MI (14.7 nn diameter, 50.2 emu/g) for DNA extraction, and MagSi nano M3 (34.9 nm diameter, 10.3 emu/g ), (ii) lysis and binding buffer for DNA including LB2-01 and BB2-01, lysis and binding for RNA including LB1-02 and BB3-02 The MagPure FFPE DNA nano kit was quality controlled in comparison to commercial kits and the data shows that DNA recovery of MagPure kit was equal, and even 2-15 fold higher than the commercical ones on several tested samples The DNA recovery was 2-80 |ig/10 mg tissue, DNA concentrations were 20-400 ng/|al, and the value A2 6 0/A2 8 0 were within 1,8-2,2 The MagPure FFPE RNA nano kit was quality controlled in comparison to commercial kits and the data shovvs that RNA recovery of MagPure kit was about 2-3 fold less than the commercical One on several tested samples The RNA recovery was 2-20 í^g/10 mg tissue, RNA concentrations were 20-100 ng/|al, and the value A2 6 0/A2 8 0 were within1,9-2,1 As quality control data períbrmed at two hospital laboratories, DNA and RNA extracted by the MagPure kits could be used as templates for PCR-DNA sequencing and real time PCR in detection of biomarker gene mutations and pathogenic viruses relating to naphasolyn, colon, and thyroid cancers The data shows high similarities between the MagPure kít and commercial kits Both DNA/RNA MagPure kits had competitive prices compared to commercial available kits, and the technology of producing these two kits has been tranfered to ANABIO R&D for production and commercialization in near future

1 8

-banks Clinl Chem Lab Med, 53, 1972-1934.

2 Barber R.D., D w Harmer , R A Coleman , B J Clark (2005) GAPDH as a

housekeeping gene: analysis of GAPDH mRNA expression in a panel of 72 human tissues Physỉoì

Genomics, 21, 389-395.

3 Boom R, J A Sol, M M M Salimans, c L Jansen, p M E Wertheim (1990) Rapid and

simple method for purifícation of acid nucleics J Clìn Microbiol, 28, 495-503.

4 De Roda Husman, A.M., Walboomers, J.M., Van den Brul, A.J., Meijer, C.J., Snijders, C.J (1995) The use of general primers GP5 and GP6 elongated at their 3' ends with adjacent highly

conserved sequences improves human papillomavirus detection by PCR J, Gen, Viroỉ, 76, 1057-

1062

5 De Roock w , B Claes, D, Bemasconi, (2010) Effects of KRAS, BRAF, NRAS, and PIK3CA mutations on the effícacy of cetuximab plus chemotherapy in chemotherapy-refractory

metastatic colorectal cancer: a retrospective consortium analysis Lancet Oncoỉ, 11, 753-762.

6 Gilbert M T p, T Haselkom, M Bunce, J J Sanchez, s B Lucas, L D Jewell, E Van Marck, M Worobey (2007) The isolation of acid nucleics from íixed, paraffin-embedded tissues-

whicli methods are useful when?, PLoS ONE, 2, e537.

7 Henle G., Henle w , AND Horowitz c A (1997) Epstein-Barr Virus Spesiíic diagnosis:

Test in Infectious Mononucleosis, HumPathol, 5,551-558.

8 Herraez-Hemandez E., Preda o , Alonso s., Pardo R s., Olmo A (2013) Detection and Genotyping o f Human Papillomavirus DNA in Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Specimens

with the HPV Direct Flow CHIP System, Open Virol J, 7, 91-95.

9 Macabeo-Ong M., D G Ginzinger , N Dekker , A McMillan , J A Regezi , D T Wong , R c Jordan (2002) Effect of duration of fixation on quantitative reverse transcription polymerase

chain reaction analyses, Modernpathology, 15, 979-987.

10 Masuda N., T.Ohnishi, s Kawamoto, M Monden & K Okubo (1999) Analysis of chemical modification of RNA from formalin-fíxed samples and optimization o f molecular biology

applications for such samples”, N/AResearch, 27, 4436-4443.

11 McSherry E A., McGoldrick A., Kay E w , Hopkins A M., Gallagher w M., Dervan p

A (2007) Formalin-Fixed Paran-Embedded Clinical Tissues Show Spurious Copy Number

Changes in Array-CGH Proles Cỉin Genet, 72, 441-447.

12 Niesters HG, Van Esser J., Fries E., Wolthers KC., Comelissen J., Osterhaus AD (2000)

Development of a real-time quantitative assay for detection of Epstein-Baư virus J, Mỉcrobỉol,, 38,

712-715

13 Nguyen T H., V Q Dao, H N Nguyen, H L Nguyen, T V K Tran, T V A Nguyen (2014) Efficient puriíĩcation of DNA from blood cells using silica- coated magnetic nanoparticles

and suitable buffers VNU Journaỉ o f Science: Natural Sciences and Technology, 30 (3S), 158-166.

14 Nguyen MH, Nguyen HN, Nguyen TH, Nguyen TVA, Phan TN, Nguyen BK, Nguyen LT, Ngirven HL (2017) Synthesis of Si02-Coated Fe3Ơ4 Nanoparticles Using Ultrasound and Its Application in DNA Extraction from Formalin-Fixed, Parafin-Embedded Human Cancer Tissues

Jouraal o f Elec Materỉal, doi: 10.1007/sl 1664-017-5282-6.

Molecular Endocrinology, 29, 287-295.

16 Shi s R., Datar R„ Liu c „ Wu L„ Zhang z , Cote R J„ Taylor c R (2004) DNAextraction from archival formalin-fĩxed, paraffm-embedded tissues: heat induced retrieval in

alkaline solution Histochem Cell Bioỉ, 122, 211- 218.

17 Stéphane M., V Sébastien, G Fabie and D Etienne (2004) Magnetic nanoparticle design for

medical diagnosis and therapy", Journal ofMaterial Chemistry, 14, 2161-2175.

18 Tanaka K., H Sonoo, Y Yamamoto, et al (2000) Changes of expression level of the differentiation markers in papillary thyroid carcinoma under thyrotropin suppression therapy in vivo immunohistochemical detection of thyroglobulin, thyroid peroxidase, and thyrotropin receptor

Journal ofSurgical Oncoỉogy, 75, 108-116.

PHẢN III SẢN PHẨM, CÔNG BỐ VÀ KẾT QUẢ ĐÀO TẠO CỦA ĐÈ TÀI

kit tách chiết DNA từ các

tiêu bản cố định mẫu mô

ung thư

Quy trình đạt yêu cầu về mặt khoa học và kỹ thuật, được nghiệm thu bởi hội đồng cấp

cơ sởHướng dẫn sử dụng rõ ràng,

dễ thực hiện

Quy trình đạt yêu cầu về mặt khoa học và kỹ thuật, được nghiệm thu bởi hội đồng cấp cơ sờ và cấp ĐHQGHN

Hưởng dẫn sử dụng rõ ràng, dễ thực hiện

2 01 Quy trình chế tạo và

01 hướng dẫn sử dụng bộ

kit tách chiết ARN từ các

tiêu bản cố định mẫu mô

ung thư

Quy trình đạt yêu cầu về mặt khoa học và kỹ thuật, được nghiệm thu bởi hội đồng cấp

cơ sởHướng dẫn sử dụng rõ ràng,

dễ thực hiện

Quy trình đạt yêu cầu về mặt khoa học và kỹ thuật, được nghiệm thu bởi hội đồng cấp cơ sở và cấp ĐHQGHN

Hướng dẫn sừ dụng rõ ràng, dễ thực hiện

Độ tinh sạch: A2 6 0/A2 8 0 trong khoảng 1,7-2,4

DNA tinh sạch sử dụng được để nhân bản đoạn gen đặc hiệu bằng kỹ thuật PCR

Bộ kit được sản xuất theo các tiêu chuân cơ sở

Vượt yêu cầu về sổ lượng: tổng cộng 15 bộ, trong đó 05 bộ thử được sử dụng cho thử nghiệm và trưng bày triển lãm; 10 bộ lưu mẫu

Lượng ADN tách từ 10 mg mô đúc trong khối nến đạt 2-40 ịig; nồng độ ADN đạt 20-400 ng/|_il;

Độ tinh sạch: A2 6 0/A2 8 0 trong khoảng 1,8-2,2

Bộ kit đạt yêu cầu về chất lượng theo tiêu chuẩn cơ sở thiết lập

2 0

-dụng cho thử nghiệm và

5 bộ lưu mẫu

Nồng độ ARN > 5 ng/ịil;

Độ tinh sạch: A2 6C)/A2 8 0> 1,8 ARN tinh sạch sử dụng được để nhân bản đoạn gen đặc hiệu bằng kỹ thuật RT- PCR;

Bộ kit được sản xuất theo các tiêu chuẩn cơ sở

trưng bày triển lãm; 05 bộ lưu mẫu

Lượng ARN tách từ 10 mg mô đúc trong khối nến đạt 2-20 Jj.g; nồng

độ ARN đạt 20-100 ng/|al; Độ tinh sạch: A2 6 0/A2 8 0 trong khoảng 1,9- 2,0

Bộ kit đạt yêu cầu về chất lượng theo tiêu chuẩn cơ sở thiết lập

5 Báo cáo kết quả đánh giá

thừ nghiệm 02 loại bộ kit

• Báo cáo kết quả đánh giá kit MagPure DNA nano kit tương đương và có phần vượt trội về hàm lượng DNA so với kit thương mại của hãng Thermo Scientiíic và Promega trên 20-30 mẫu/bệnh viện tại Trường ĐH Y Hà Nội và Bệnh viện QĐTƯ108

• Báo cáo kết quả đánh giá MagPure RNA nano kit gần tương đương với kit thương mại của hãng Promega trên 20 mẫu/bệnh viện tại bệnh viện QĐTU 108

01 đơn đăng ký giải pháp

hữu ích quy trình sản

xuất kit

Đăng ký giải pháp hữu ích được chấp nhận đơn hợp lệ tại Cục Sở hữu trí tuệ, Bộ KHCN

Giải pháp hữu ích được chấp nhận đơn hợp lệ ngày 23/10/2017, số đơn 2017-2-00303

01 hợp đồng chuyển giao

công nghệ

Hợp đồng chuyển giao công nghệ được ký kết với mức kinh phí chuyển giao công nghệ tối thiểu ban đầu là 30-

50 triệu đồng kèm theo 1-2%

doanh số bán sản phẩm hàng năm

• 01 họp đồng chuyển giao công nghệ cho công ty ANABIO R&D trị giá 50 triệu

• 01 họp đồng dịch vụ kiểm định chất lượng sản phẩm với trị giá

1 -2% doanh số bán sản phẩm hàng năm

TT Sản phâm đơn/ đã được chấp nhận đơn

hợp lệ/ đã được cấp giấy xác nhận SHTT/ xúc nhận

sử dụng sản phẩm)

sự tài trọ' của ĐHQGHN đúng quy định

(Đạt, không đạt)

1 Công trình công bô trên tạp chí khoa 1ỌC quôc tê theo hệ thông ISI/Scopus

1.1 Nguyên MH, Nguyen HN, Nguyen

TH, Nguyen TVA, Phan TN,

\lguyen BK, Nguyen LT, Nguyen

-IL (2017) Synthesis of S1O2-

Ultrasound and Its Application in

DNA Extraction from Formalin-

Fixed, Parafin-Embedded Human

Cancer Tissues Journal o f Elec

2 Sách chuyên khảo được xuât bản hoặc ký hợp đông xuât bản

3 Đăng ký sờ hữu trí tuệ

3.1 Kit tách chiêt DNA và/hoặc RNA từ

tiêu bản mô cố định bang íòrmalin

vùi trong paraíin và quy trình sản

xuất kit này

Đã được châp nhận đơn hợp lệ ngày 23/10/2017,

sổ đơn 2017-2-00303

Không có mục ghi cảm ơn

Đạt yêu cầu

4 Bài báo quôc tê không thuộc hệ thông ISI/Scopus

5 Bài báo trên các tạp chí khoa học của ĐHQGHN, tạp chí khoa học chuyên ngành

quốc gia hoặc báo cáo khoa học đăng trong kỷ yếu hội nghị quốc tế

5.1 Nguy en Thi Huy en, Le Duc Linh,

Pham Thi Thu Huong, Nguyen Minh

Hieu, Nguyen Hoang Nam, Tran Thi

My, Nguyen Hoa Anh, Phan Tuan

Nghia, Nguyen Thi Van Anh (2016'

Development of DNA Extraction Kit

Based on Silica-Coated Magnetic

Nanoparticles for Formalin-Fixec

and Paraĩin-Embedded Cancei

Tissues VNU Journal o f Science

Naíuraỉ Sciences and Technology,

32,277-285

cảm ơn đúng quy định

Đạt yêu cầu

2 2

-13 Oct 2016, Korea Invited talk.

6.2 Nguyen Thi Van Anh et al (2017) Magnetic silica-coated nanoparticles for DNA

extraction from FFPE cancer tissues: application in detection of viruses and

biomarker gene mutations Korean_Vietnam Joint-seminar on Tropical Diseases

and Zoonosis, 15 Dec 2017, Hanoi Invited talk

7 Kêt quả dự kiên được ứng dụng tại các cơ quan hoạch định chính sách hoặc cơ sở

ứng dụng KH&CN

02 bộ kit ứng dụng công nghệ hạt nano từ bọc silica là sản phâm chính của đê tài đã

được chuyển giao công nghệ cho công ty ANABIO R&D Bên cạnh đó, nhóm tác giả

cũng phối hợp với công ty tạo ra 02 bộ kit theo nguyên lý tương tự nhưng sử dụng

công nghệ màng cột silica của công ty (sản phẩm phụ, không đưa vào báo cáo số

liệu) Tổng cộng có 04 bộ kit được chuyển giao đưa vào sản xuất và thương mại hóa

với tên thương mại

• MagPure FFPE DNA nano kit

• MagPure FFPE RNA nano kit

• AnaPure FFPE DNA nano kit

• AnaPure FFPE RNA nano kit

Vượt yêu cầu

3.3 Kết quả đào tạo

phí tham gia đề tài tương đương với 5 tháng

01 luận văn thạc sĩ, 01 bài báo quốc tế, 01 bài báo chuyên ngành, 01 giải pháp hữu ích được chấp nhận đon họp lệ

Bảo vệ ngày18/12/2017, đang chờ nhận bằng

Cử nhân và hướng dân nghiên cứu khoa học

1 CN Lê Đức Linh 6 tháng, không có kinh

phí tham gia

01 báo cáo khoa học giải

ba poster cấp Trường, khoá luận tốt nghiệp/01 bài báo khoa học

06/2016

2 CN Chu Văn Sơn 12 tháng, không có

kinh phí tham gia

01 báo cáo sinh viên nghiên cứu khoa học đạt giải 3 poster cấp Khoa, khoá luận tốt nghiệp, 01 giải pháp hữu ích được chấp nhận đơn hợp lệ

06/2017

2 Sách chuyên khảo được xuât bản hoặc ký hợp đông xuât bản 0 0

4 Bài báo quôc tê không thuộc hệ thông ISI/Scopus

5 Sô lượng bài báo trên các tạp chí khoa học của ĐHQGHN, tạp

chí khoa học chuyên ngành quốc gia hoặc báo cáo khoa học

đăng trong kỷ yếu hội nghị quốc tế

6 Báo cáo khoa học kiên nghị, tư vân chính sách theo đặt hàng

của đơn vị sử dụng

7 Kêt quả dự kiên được ứng dụng tại các cơ quan hoạch định chính

sách hoặc cơ sở ứng dụng KH&CN

01 hợp đồng CGCN

01 hợp đông CGCN và 01 thỏa thuận họp tác

8 Đào tạo/hỗ trợ đào tạo NCS

bảo vệ ngày 18/12/2017

(triệu đồng)

Kinh phí thưc hiện

(triệu đồng)

Ghi chú

A Chi phỉ trực tiêp

3 Thiêt bị, dụng cụ

4 Công tác phí

6 Hội nghị, Hội thảo, kiêm tra tiên độ, nghiệm thu 25,5 26,275

7 In ân, Văn phòng phâm

8 Chi phí khác (xây dựng đê cương, viêt tông

quan tư liệu)

B Chi ph í gián tìêp

-• 01 Quy trình chế tạo và 01 hướng dẫn sử dụng bộ kit tách chiết ADN từ các tiêu bản cố định mẫu mô ung thư được hội đồng thẩm định phê duyệt (có kèm theo hình ảnh bộ kit) (Phụ lục 1).

• 01 Quy trình chế tạo và 01 hướng dẫn sử dụng bộ kit tách chiết ARN từ các tiêu bản cố định mẫu mô ung thư được hội đồng thẩm định phê duyệt (có kèm theo hình ảnh bộ kit) (Phụ lục 2)

• 03 Báo cáo kết quả đánh giá thử nghiệm 02 loại bộ kit so sánh với các bộ kit nhập ngoại tại và Khoa Sinh học phân tử-Bệnh viện QĐTUÌ08 và Trung tâm Công nghệ Gen và Protein-Trường

ĐH Y Hà Nội được hội đồng thẩm định phê duyệt (Phụ lục 3-5)

- Phụ lục 6: Sản phâm khoa học:

• 01 bài báo quốc tế (trong danh mục ISI),

• 01 bài báo chuyên ngành,

• 01 đăng ký giải pháp hữu ích được chấp nhận đơn hợp lệ,

• 01 hợp đồng chuyển giao công nghệ với công ty ANABIO R&D,

• 01 thỏa thuận họp tác kiểm định chất lượng sản phẩm

ỉtv

- Phụ lục 7: Sản phâm đào tạo: 01 học viên cao học, 02 cử nhân

Hà Nội, n g à y Ị) tháng năm 2 0 ỉ $

BIÊN BẢN HỌP TỎ THẢM ĐỊNH KÉT QUẢ NGHIÊN c ứ u

CỦA ĐÈ TÀI

BÁO CÁO HOÀN THIỆN ĐÈ TÀI

QUYẾT ĐỊNH

cấp Đại học Quốc gia Hà Nội, mã số QG.16.22

HIỆU TRƯỞNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC T ự NHIÊN• • • • •

Căn cứ Quy định về Tổ chức và hoạt động của các đơn vị thành viên và đơn vị trực thuộc Đại học Quốc gia Hà Nội ban hành kèm theo Quyết định số 3568/QĐ-ĐHQGHN ngày 08/10/2014 của Giám đốc Đại học Quốc gia Hà Nội;

Căn cứ Quy định về quản lý nhiệm vụ Khoa học và Công nghệ cấp Đại học Quốc gia

Hà Nội (ĐHQGHN) được ban hành kèm theo Quyết định số 3839/QĐ-ĐHQGHN ngày 24/10/2014 của Giám đốc ĐHQGHN;

Căn cứ Quyết định số 5282/QĐ-ĐHQGHN ngày 30/12/2015 của Giám đốc Đại học Quốc gia Hà Nội (ĐHQGHN) về việc phê duyệt đề tài và chủ nhiệm đề tài cấp ĐHQGHN năm 2016, mã số QG 16.22;

Xét đề nghị của Giám đốc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein và Trưởng phòng Khoa học - Công nghệ,

QUYẾT ĐỊNH:

Đ iều 1 Thành lập Tổ thẩm định kết quả của đề tài cấp Đại học Quốc gia

H à Nội năm 2016: “Nghiên cứu tạo kit tách chiêt A D N và A R N từ các tiêu bản

cổ định mẫu mô ung th ư ”, m ã số QG 16.22 do PGS.TS N guyễn Thị Vân Anh làm I

chủ nhiệm Tổ thẩm định gồm 03 thành viên (có danh sách kèm theo)

Đ iều 2 Tổ thẩm định có nhiệm vụ kiểm tra số lượng và thẩm định chất lượng

sản phẩm của đề tài và tự giải thể sau khi hoàn thành nhiệm vụ

Điều 3 Trưởng phòng Khoa học - Công nghệ, Giám đốc Phòng thí nghiệm

Trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein, Thủ trưởng các đơn vị có liên quan, các thành viên Tổ thẩm định và Chủ nhiệm đề tài chịu trách nhiệm thi hành

D A N H S Á C H Thành viên Tổ thẩm định kết quả của đề tài cấp Đại học Quốc gia Hà Nội, mã số QG.16.22

(Kèm theo Quyết định số ỉ /Q Đ -Đ H K H TN , ngày Ầ l tháng 12 năm 2017)

Tổ thẩm định

1 PGS.TS Trịnh Hồng Thái Khoa Sinh học, Trường

Đại học Khoa học Tự nhiên Tô trường

2 TS Nguyễn Thị Hồng Loan

Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên

u v Thư ký

3 TS Tô Thanh Thúy Khoa Sinh học, Trường

Đại học Khoa học Tự nhiên u v Phản biện

(An định danh sách gôm 03 thành viên)

B ĩ Ể ^ B Ậ g g ỏ l ^ O THẨM ĐỊNH KÉT QUẢ NGHIÊN c ứ u

1 T h ô n g tin chung:

T ên đề tài: N ghiên cứu tạo kit tách chiết A DN và ARN từ các tiêu bản

cố định m ẫu mô ung thư

M ã số: Q G 16.22

C h ủ nhiệm đề tài: PGS.TS N guyễn Thị Vân Anh

Tổ chức ch ủ trì: Trường Đại học K hoa học Tự nhiên

2 Quyết định thành lập Tổ thẩm định số 4423/Q Đ -Đ H K H TN ngày 22/12/2017

của Hiệu trưởng Trường ĐHKHTN

3 N gày họp Tổ th ẩm đ ịn h : 28/12/2017 tại Trường Đại học K hoa học Tự nhiên

1 PGS.TS Trịnh Hồng Thái Khoa Sinh học, Trường

Đại học Khoa học Tự nhiên Tổ trường

2 TS Nguyễn Thị Hồng Loan

Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên

u v Thư ký 1

3 TS Tô Thanh Thúy Khoa Sinh học, Trường

Đại học Khoa học Tự nhiên u v Phản biện

Đ án h giá về sản p h ẩm nghiên cứ u (ghi rõ đ ạ t/ không đạt)'.

- về số lượng sản phẩm: số lưọng sản phẩm đầy đủ gồm:

+ 01 quv trình chế tạo và 01 hướne dẫn sử dụng bộ kit tách chiết DNA từ các tiêu

bản cố định mẫu mô ung thư

+ 01 quv trình chế tạo và 01 hướng dẫn sử dụng bộ kit tách chiết RNA từ các tiêu

bản cố định mẫu mô ung thư

+ 15 bộ kit tách chiết DNA (100 phản ứng/bộ), vượt so với số lượng đăng ký 05

bộ

+ 10 bộ kit tách chiết RN A (100 phản ứng/bộ)

+ Báo cáo kết quả đánh giá bộ kit tách chiết D N A và RNA là tương đương với kit

thưong m ại của hãng Therm o Scientiíic và Prom ega tại Trường ĐH Y Hà Nội và

+ 01 hợp đồng chuyển giao công nghệ cho Công ty ANABIO RD.

+ 0 1 thạc sĩ đã bảo vệ thành công ngày 18/12/2017

+ Vượt 01 công bố trên tạp chí ISI với IF= 1,29 và 01 báo cáo tại Hội nghị quốc

- Những vấn đề cần sửa chữa, hoàn thiện:

+ Trong quy trình thống nhất về sử dụng thuật ngữ, ký hiệu để thuận lợi cho người sử dụng

+ Các hình ảnh nên được in màu

+ Bổ sung và sửa chữa nhưng sai sót trong báo cáo về in ấn, lỗi chính tả

- v ề tình hình sử dụng và quyết toán kinh phí:

B Á O C Á O V Ề V IỆ C H O À N T H IỆ N

SẢ N PH Ẩ M Đ È T À I

I N hữ ng thông tin chung

1 Tên đề tài: N ghiên cứu tạo kit tách chiết A D N và A RN từ các tiêu bản cố định mẫu

mô ung thư

M ã số: QG16.22

2 Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS N guyễn Thị V ân Anh

3 Cơ quan chủ trì đề tài: Trường Đại học K hoa học T ự nhiên

4 Chủ tịch hội đồng đánh giá (ghi rõ họ tên, học vị, học hàm, cơ quan công tác):

PGS TS Trịnh Hồng Thái, Trường ĐHKH Tự Nhiên

5 Thời gian đánh giá: 28/12/2017

6 N ội dung đánh giá:

T T T ên sản p h ẩ m Y êu cầu k h o a học h o ặc/v à chỉ tiêu k in h tế - kỹ

th u â t cần đ a t • •

1 01 Quy trình chế tạo và 01

hướng dẫn sử dụng bộ kit tách

chiết ADN từ các tiêu bản cố

định mẫu mô ung thư

Quy trình đạt yêu cầu về mặt khoa học và kỹ thuật, được nghiệm thu bởi hội đồng cấp cơ sở

Hướng dẫn sử dụng rõ ràng, dễ thực hiện

2 01 Quy trình chế tạo và 01

hướng dẫn sử dụng bộ kit

tách chiết ARN từ các tiêu

bản cố định mẫu mô ung thư

Quy trình đạt yêu cầu về mặt khoa học và kỹ thuật, được nghiệm thu bởi hội đồng cấp cơ sở

ADN tinh sạch sử dụng được để nhân bản đoạn gen đặc hiệu bằng kỹ thuật PCR;

Bộ kit được sản xuất theo các tiêu chuẩn cơ sở và được nghiệm thu bởi hội đồng cấp cơ sở Trường ĐHKH Tự Nhiên

bệnh viện.

6 01 đơn đăng ký giải pháp hữu

ích quy trình sản xuất kit

Đăng ký giải pháp hữu ích được châp nhận đơn hợp lệ tại Cục Sở hữu trí tuệ, Bộ KHCN

7 01 hợp đône chuyên giao công

nghệ

Hợp đông chuyên giao công nghệ được ký kêt với mức kinh phí chuyển giao công nghệ tối thiểu ban đầu là 30-50 triệu đồng kèm theo 1-2% doanh số bán sản phẩm hàng năm

8 Báo cáo tông kêt đê tài Báo cáo đạt yêu câu vê mặt khoa học

II Nội dung đã chỉnh sửa, hoàn thiện theo kết luận của hội đồng:

- Đã chỉnh sửa các thiếu sót trong quy trình sản xuất 02 loại kit tách chiết DNA và RNA từ tiêu bản mô ung thư theo góp ý của hội đồng: bổ sung thông tin về hóa chất sử dụng, thống nhất cách viết tên hóa chất và tên các loại đệm, các lỗi íòrm at

- Đã bổ sung tình hình quyết toán tài chính trong báo cáo tổng kết

Xác nhận của Tổ trưởng tổ thẩm định Chủ nhiệm đề tài

PGS.TS Trịnh H ồng Thái PGS.TS N guyễn Thị Vân Anh

Xác nhận của Phòng KHCN

2

PHỤ LỤC 1

Q uy trình chế tạo và hướng dẫn sử dụng bộ kit tách chiết A D N từ các tiêu bản

cổ định mẫu mô ung thư.

PHỤ LỤC 2

Quy trình chế tạo và hướng dẫn sử dụng bộ kit tách chiết A D N từ các tiêu bản

cố định mẫu mô ung thư.

PHỤ LỤC 3

Thử nghiệm , đánh giá hiệu quả tách chiết A D N của bộ kit trên các mẫu m ô ung thư biểu mô tuyến giáp, so sánh với kit thương mại tại bệnh viện Trung Ư ơng Quân đội 108.

PHỤ LỤC 4

Thử nghiệm , đánh giá hiệu quả tách chiết A R N của bộ kit trên các mẫu m ô ung thư biểu mô tuyến giáp, so sánh với kit thương mại tại bệnh viện Trung Ư ơng Quân đội 108.

PHỤ LỤC 5

Thử nghiệm , đánh giá hiệu quả tách chiết A D N của bộ kit trên các mẫu m ô ung thư đại trực tràng, so sánh với kit thương mại tại Trung tâm nghiên cứu gen và protein, Đ ại học Y Hà N ội.

Q U Y T R ÌN H C H É T Ạ O VÀ H Ư Ớ N G D Ẫ N s ử D Ụ N G BỘ K IT T Á C H

C H IẾ T ADN T Ừ T IÊ U BẢ N CÓ Đ ỊN H M ẲƯ M Ô U N G T H Ư (FFPE)

I Q uy trình chế tạo bộ kit tách ch iết A D N từ tiêu bản cố định mẫu

mô ung th ư (FFPE)

1.1 Nguyên liệu cho sản xuất kit

- Iron (II) chloride (FeCl2.4H20 , M = 199, M erck)

- Iron (III) chloride (FeC l3.6H20 , M = 270,5, M erck)

- Guanidine hydrochloride (GuHCl, M = 95,5, Biobasic)

- Natri chloride (NaCl, M = 58,5, M erck)

- Calcium chloride (CaCl2.4H20 , M = 183,04, M erck)

- Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA, M = 292,24, Merck)

- Trisam inom ethane base (Tris base, M = 121.5, Scharlau)

- Natri dodecyl sulfate (SDS, M = 288,37, M erck)

- Kali acetate (CH 3CO O K , M = 98,14, M erck)

- Am onium hydroxide (N H4OH, M = 35, M erck)

- Tetraethyl orthosilicat (TeOS, M = 208, M erck)

- Dầu khoáng đạt tiêu chuẩn dùng cho sinh học phân tử (0.84 g/mL at 25 ° c , Merck)

- Ethanol tuyệt đối (96-100°) loại cho phân tích (Merck)

- Proteinase K (20 mg/ml, Enzynom ics)

1.2 Nguyên liệu cho kiểm định kit

- M ầu mô vùi paraffm

- Cặp mồi (prim ers) và đầu dò huỳnh quana; Taqm an (Taqman probe) nhân bản trình tự đặc hiệu của gen nội chuẩn beta-globin bằng kỹ thuật real tim e PCR Taqman probe đặt của hãng IDT (Bảng 1)

- M aster m ix cho real tim e PC R Taq man TO Preal™ qPCR 2X

PreMIX (Enzynom ics)

1

Bảng 1: Primer và Probe sử dụng đê kiêm định MagPure FFPE DNA nano kit

beta -globin-Fw 5’- TTCTXXXXXXXXTGTGTTcACTAGC- 3’

beta -globin-P 5 ’-(HEX)-CTCXXXXXXXXXAGTC-(MGB)-3 ’

khác chưa nghiệm thu.

Cân điện tử 4 số lẻ (Satorius- TE214S, Thụy Sỹ)

M áy đo pH (Orion 3, N hật Bản)

M áy khuấy từ (IKA-RW 20 digital, Đức)

Khuấy từ gia nhiệt (IKA-RH basic, Đức)

- N ồi khử trùng (TOM Y- CL32L, N hật Bản)

Bể siêu âm (Branson-3510E-M TH , Đức)

Nam châm (Trung Quốc)

■ Cho kiểm định kit

M áy cắt mô (Mỹ)

Bể ổn nhiệt (Julabo-ED 5, M ỹ)

- Tủ thổi khí sạch (NU 425-600E, Mỹ)

M áy trộn Vortex (IK A -M S 1, Đức)

Giá nam châm 12 hoặc 24 giếng (siá từ, sản phẩm của đề tài QG 16.22)

Máy quans phổ kế (Thermo Scientiíĩc-N anodrop, Mỹ)

Máy real time PCR 96 (Roche-Lightcycler, Diagnostics)

2 Các bưóc chế tạo

Các bước chế tạo được viết chune cho việc pha chế nhiều bộ kit Dựa vào số lượng kit cần pha mà tính toán và cân, đong lượns hóa chất cho phù hợp

2.1 Tạo hạt MagSi M I nano bọc silica

B ước 1: Tạo hạt nano oxit sắt từ bằne cách hòa tan lần lượt FeCỈ2.4H2 0 và

F eC l3.6H20 với nước đạt nồng độ từ 0,4 đến 4% và khuấy đều trong khoảng từ 20 đến

30 phút, sau đó phối trộn hai dung dịch này theo tỷ lệ trọne lượng

F eC l2.4 H2 0/FeCl3.6H2 0 từ 1/2 đến 1/3 (w/w) và 2,ia nhiệt đến nhiệt độ khoảng 50 đến

70°c, sau đó bổ sung dung dịch N H4OH nồng độ khoảng từ 5 đến 15% đã được gia nhiệt đến nhiệt độ khoảng từ 50 đến 70°c theo tỷ lệ thể tích từ 1/3 đến 1/4 (w/w), sau khi khuấy trộn đều trong khoảng từ 30 đến 40 phút để phản ứng tạo m ầm hạt nano xảy

ra thu được dung dịch chứa hạt nano oxit sắt;

B ước 2: Thu hạt nano oxit sắt từ bằng cách sử dụng nam châm tác dụng từ trường lên dung dịch chứa hạt nano sắt từ F e30 4 trong thời gian từ 5 đến 15 phút để hạt nano tụ xuống, sau đó loại bỏ phần dịch, bỏ nam châm để ngắt từ trường và bổ sung nước cất để rửa, tiếp đó đưa nam châm tác dụng từ trường từ 5 đến 15 phút để tụ hạt nano và loại bỏ nước, lặp lại từ 5 đến 10 lần, thu được hạt nano oxit sắt từ;

B ước 3: Thu hạt M agSi nano M I bọc silica bằng cách rửa hạt nano oxit sắt từ

F e3Ơ4 thu được ở Bước 2 bằng ethanol, sau đó pha với dung dịch ethanol theo tỷ lệ

từ 1 đến 2% (g/m l) và bổ sung khoảng từ 5 đến 20% dung dịch bao gồm N H4OH 25% đã pha với tetraethyl orthosilicat (TEO S) theo tỷ lệ 50/50 (w/w), sau đó bổ sung khoảng 10 đến 30% nước cất và để hỗn dịch này trong bể siêu âm với tần số từ

30 đến 40 kH z trong thời gian từ 1 giờ đến lg iờ 30 phút thu được hạt nano sắt từ được bọc lớp silica (Fe3 0 4 @ Si0 2) dày khoảng từ 2 đến 5 nm, sau đó lọc rửa bàne nước cất thu được hạt M aeSi nano M I bọc silica kích thước từ 10-20 nm có độ từ hóa từ 50 em u/g đến 60 emu/g

3

2.2 Tạo 6 dung dịch đệm

Bước 1: Tạo dung dịch chứa hạt M aeSi nano bọc silica M I (M aeSi M l) bằng cách chuẩn hóa hạt M agSi nano bọc silica thu được ở M ục 2.1 và pha với dung dịch Tris-H Cl từ 5 mM đến 10 mM, pH trona khoảne từ 5,0 đến 8,0, nồne độ Fe3 0 4 @ Si0 2

tro n e khoảng từ 50 m g/m l đến 75 mg/ml, sau khi trộn đều thu được dung dịch đệm chứa hạt MagSi nano M I bọc silica có độ từ hóa từ 50 em u/g đến 60 emu/g dung dịch đệm MagSi này được dùng để liên kết đặc hiệu với ADN và ARN;

Bước 2: Tạo dung dịch đệm phân giải (Lysis Buffer; LB-01) bằng cách bổ sung lần lượt natri dodecyl sulphat (SDS) nồng độ từ 0,2 đến 2%, canxi clorua nồng độ từ 1

m M đến 5 mM vào dung dịch đệm Tris-HCl nồng độ từ 20 raM đến 80 mM, pH từ 7,0 đến 9,0 trộn đều, dung dịch đệm LB này được dùng để phá vỡ khối mô, giải phóng

A RN và ADN;

Bước 3: Tạo dung dịch đệm liên kết (Binding Buffer; BB-01) bằng cách bổ sung guanidin hydrochlorit (G u-H Cl) nồng độ từ 2 M đến 4 M, kali acetat nồng độ từ 0,2 M đến 0,8 M, EDTA nồng độ từ 2 mM đến 10 m M vào dung dịch đệm Tris-HCl nồng độ

từ 20 ìnM đén 80 mM, pH từ 6,5 đến 7,5 trộn đều, dung dịch đệm BB-01 này được dùng để liên kết m ột cách chọn lọc A D N lên cột;

Bước 4: Tạo dung dịch đệm rửa thứ nhất (W ashing Buffer 1; W B1-01) bằne cách bổ sung guanidin thiocyanat hoặc guanidin hydrochlorit nồng độ từ 1 M đến 3 M, natri chloride (NaCl) nồng độ từ 0,5 M đến 3 M vào dung dịch đệm Tris-HCl nồng độ

từ 20 mM đến 50 raM, pH từ 6,0 đến 7,0 và trộn đều, sau đó bổ sung ethanol đến khi nồng độ đạt từ 40% đến 60%, dung dịch đệm WB1-01 này được dùng để rửa phức hệ

Bước 6: Tạo dung dịch đệm chiết đẩy (EB-01) bằng cách hòa tan ED TA nồng độ

từ 1 mM đến 2 mM với dung dịch đệm Tris-HCl nồne độ từ 25 mM đến 35 mM, pH

từ 7,0 đến 9,0, dung dịch đệm EB1 này được dùna, để đẩy ADN ra khỏi hạt M agSi nano M I

Bước 7: Khử trùng các đệm ngoại trừ đệm chứa hạt M aeSi nano trong nồi khử trùng ở điều kiện 120°c 20 phút

2.3 Đóng gói kit và bảo quản

- Chuẩn bị các lọ nhựa đã được khử trùng, hộp carton, nhãn

- Chia nhỏ lượng đệm đã pha và đóng vào các lọ nhựa lượng phù họp cho 01 kit 100 phản ứne Lọ cần chia bao gồm lọ đệm đựng hạt M agSi nano M I và 05 lọ đựng các dung dịch đệm được chế tạo ở mục 2.2, cùng với Proteinase K là hóa chất m ua sẵn của hãng Enzynomics Thành phần và định lượng cho 01 kit 100 phản ứng được mô tả

ở B ảng 2 như dưới đây:

Bảng 2: Thành phần của 01 bộ MagPure FFPE DNA nano kit (100 pứ)

(ml/lọ)

Số lượng(lọ)

1 Dung dịch đệm chứa hạt MagSi

SO ĐỒ QUY TRÌNH SẢN XUẤT