Sàng lọc và nghiên cứu enzym phytase có khả năng thủy phân hoàn toàn 6 gốc photphat từ nấm men nhằm ứng dụng trong chăn nuôi

cứu phytase như: 1 phân lập các chủna, vi sinh vật sinh phytase có hoạt lực cao và có tính năng mới, 2 tìm kiếm phytase có tính năn2, giải phóng nhiều photphat dễ tiêu hóa trong đường r

MÁU 14/KHCN

ị Ban hành kèm theo Oưyết định s ổ 3 8 3 9 /Q Đ -Đ 1 ỉQCÌHN ngùy 2 4 tháng 10 nám 2 0Ì 4

cu a (ìiả m d ố c Đ ạ i h ọ c Q uốc giư I ỉà Nội) _

« Ạ Ỉ HỌ C Q Ư Ó C GIA HÀ NỘI

BÁO CÁO TONG KÉT

K Ế T QUÀ T H Ự C HIỆN ĐẺ TÀI KH&CN

M ẨU 14/K H C N

(Ban hành kèm theo Quyết định số 3839 /QĐ-ĐHQCiHN ngày 24 th á n g io năm 2014

của Giám đôc Đ ại học Q uốc gia H à Nội)

PHẢN I THÔNG TIN CHUNG

1.1 Tên đề tài: Sàng lọc và nghiên cứu enzym phytase có khả năng thủy phân hoàn toàn 6 gốc photphat từ nấm men nhằm ứng dụng trong chăn nuôi

1.2 Mã số: QG 12.23

1.3 Danh sách chủ trì, thành viên tham gia thực hiện đề tài

TT Chức danh, học vị, họ và tên Đo n vị công tác Vai trò thuc hiên đề tài

1 NCS Trần Thị Lệ Quyên Viện Vi sinh vật và

Thành viên tham gia

CNSH

Thành viên tham gia

1.4 Đon vị chủ trì: Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học, Đại học Quốc Gia Hà Nội 1.5 Thòi gian thực hiện:

1.5.1 Theo họp đồng: từ tháng 10 năm 2012 đến tháng 10 năm 2014

1.5.2 Gia hạn (nếu có): Không

1.5.3 Thực hiện thực tế: từ tháng 10 năm 2012 đến tháng 11 năm 2014

1.6 Những thay đối so vói thuyết minh ban đầu (nếu có): không

(Ve mục tiêu, nội dung, phương pháp, kết quả nghiên cứu và tô chức thực hiện; Nguyên nhân; Ỷ kiến của C ơ quan quản lý)

1.7 Tổng kinh phí được phê duyệt của đề tài: 180 triệu đồng.

PHẦN II TỔNG QUAN KÉT QUẢ NGHIÊN c ứ u

1 Đ ặt vấn đề

Phytases là enzyme xúc tác cho phản ử n s thủy phân axit phytic (Ins p 6) thành photphat

vô cơ tự do (Pi), tạo thành các este myo-inositol photphat bậc thấp hơn (Ins p5 đến Ins P]),

và trone, m ột sổ trường hợp tạo thành myo-inositol Hầu hết các phytase được biết thủy phân axit phytic giải phóne ra 5 Pi và tạo thành /wjỡ-inositol 2 ’-m onophotphat là sản phẩm cuối cùng Hiện nay mới chỉ có ba nhóm tác eiả côns bổ phytase có khả năng thủy phân cả 6 gôc photphat và tạo thành myo-inositol từ axit phytic (Segueilha và cs., 1992; Raaon và cs., 2008; Asano và cs., 2009) Việc tìm kiếm phytase có khả năns cất cả 6 aốc photphat hết sức

có ý nghĩa, chúne 2 Óp phần giải quyết được hai yêu cầu của ứ n s dụng công nghệ sinh học vào cuộc sống: (1) hiệu quả sử dụns enzvme đạt tối đa và (2 ) tạo sản phẩm cuối cùnơ là m^o-inositol có nhiều ứng dụns trone y học (R ason và cs 2008) Việc sử dụns phytase neày càns nhiều trona các ứ ns dụn2 côna nehệ sinh học đã thúc đay nhiều hướng nghiên

cứu phytase như: (1) phân lập các chủna, vi sinh vật sinh phytase có hoạt lực cao và có tính năng mới, (2 ) tìm kiếm phytase có tính năn2, giải phóng nhiều photphat dễ tiêu hóa trong đường ruột, và (3) chọn lọc được các phytase có thê duy trì được hoạt tính trons quá trình chế biến và bảo quản, với giá thành sản phẩm thấp nhất (Raẹon và cs., 2008).

Tuy phytase được sản sinh bởi rất nhiều loài sinh vật như thực vật, động vật và đặc biệt

ở nấm sợi như chi Aspergillus (Gibson, 1987; Dvorakova, 1997; Fujita, 2003; Gareova, 2006) vi khuẩn như chi Baciiỉus (Gulati, 2007; Kim 1998), chi Pseudomonas (Cho, 2003)

và m ột sô nâm men như Schwanniomyces castelii (Segueiha, 1992), Saccharomyces cerevisiae (Zyla 1994, Turk 2000), Arxula adeninivorans (Sano, 1999), Pichia spartinae

và p rhodanensis (Nakamura, 2000), Candida krusei (Quan, 2001) Nhưnơ 2 trone số 3

nhóm tác eiả phát hiện phytase mang đặc tính quý thủy phân hoàn toàn 6 gốc photphat trên

đối tượna, nấm men: Debaryomyces castellii CBS 2923 (RaRơn và cs., 2008) và Schwanniom yces castelii CBS 2863 (Seeueiha và cs., 1992).

Ở V iệt Nam, chưa có một báo cáo nào nehiên cứu sản xuất phytase từ nấm men và cũne chưa có báo cáo về phytase man^ đặc tính thủy phân hoàn toàn 6 gốc photphat, mặc dù có một số tác eiả đã nghiên cứu sản xuất phytase từ vi sinh vật nhằm phần nào đáp ứng nhu cầu trong nước, thay thế dần sản phẩm nhập ngoại, như PGS.TS Vũ Nguyên Thành (Viện Cône nghiệp Thực phẩm, 2009) đã nghiên cứu và sản xuất phytase tái tổ họp từ nấm sợi

Aspergillus niger Trần Thị Thủy (Đại học Sư phạm Hà nội, 2010) nghiên cứu nhân dòng và

biếu hiện gen phytase chịu nhiệt của Bacilỉus sp.MD2 trên E cơ// Tuy nhiên phytase của

các tác ai ả này m ới chỉ thủy phân được <5 gốc photphat

N hư vậy, với neuồn een nấm men lớn (1000 chủng) được lưu giữ tại Bảo tàne RĨổns chuẩn Vi sinh vật (VTCC), cùne với sự đa dạns lớn về nấm men của Việt nam ở các vùng sinh thái khác nhau, thì việc tìm kiếm được neuồn phytase mới và quý từ chúng rất khả quan N aoài ra, nấm men được xem là loài vi sinh vật hầu như không sây bệnh và được coi

là an toàn (G RA S) (M ishra và cs., 2009), sinh khối nấm men đane được sử đụne làm ns;uồn protein đơn bào cho neười và độns vật, do vậv, việc bố sune nấm men sinh phytase vào thức ăn chăn nuôi có thể làm được đồne thời hai nhiệm vụ cung cấp photphat vô cơ và bổ sung protein cho vật nuôi

Vì vậy việc "Sàne lọc và nghiên cứu enzym phytase quý có khả năng thủy phân hoàn toàn 6 2ốc photphat từ nấm men được lưu eiữ tại Bảo tàng siố n s chuẩn Vi sinh vật, Viện Vi sinh vật và cônạ nshệ Sinh học nhằm ứ ns dụns trong sản xuất thức ăn chăn nuôi” là rất cần thiết

hoan toàn 6 sốc Ịíhotphat

- Tinh sạch và nghiên cứu các đặc điểm sinh hóa của phytase ngoại bào sinh ra từ các chủng nấm men lựa chọn

3 Phuong pháp nghiên cứu

- Phươns pháp hoạt hóa vi sinh vật từ môi trường lạnh sâu

- Kỹ thuật nuôi cấy vi sinh

- Phươna pháp sàne lọc nâm men phytase trên môi trường đĩa thạch (theo Bae và cs., 1999)

- Phương pháp sàns, lọc nấm men sinh phytase trên môi trườnơ xốp và dịch thể (theo Gulati

và cs., 2007; ĩorquera và cs.,2010)

- Phươne pháp định lượna phytase (theo Shimizu 1992)

- Phươna pháp xác định sản phẩm thủy phân cuối cùne của phytase nghiên cứu trên cơ chất đặc hiệu bằna, sẳc ký lỏne cao áp (HPLC) (theo Kerovuo và cs., 2000; Sạịidan và cs., 2004;Raeon và cs., 2008; Hellstrom, 2012; Chen, 2003; Skoglund, 1998)

- Quan sát hình thái khuấn lạc và tế bào nấm men ( theo phương pháp của Yarrow, 1998)

- Phươns pháp tách chiết ADN (Manitis, 1982), PCR đoạn gen D1/D2 (Kurtzman và

Robnnet, 1998), phân tích trình tự đoạn D1/D2 (Kurtman và Robnett, 1997), và xây dựng cây phát sinh chủng loại của các chủng nấm men sinh phytase (Kimura, 1980)

= Phương pháp tinh sạch phytasc bằne sắc ký trao đổi ion và sắc ký lọc gcl và xác định kích

thước phytase bằng điện di SDS-PAGE (theo Lix và cs., 2007; Raeon và cs., 2008;

H artinssveldt và cs., 1993)

- Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởne nhiệt độ, pH, ion kim loại đến hoạt độns của

phytase(theo Gulati và cs., 2007)

- Phươna pháp lên men xốp và lên men dịch thế

- Phương pháp tách chiết enzyme từ môi trườns sau lên men

- Phươns pháp nghiên cứu tính bền của phytase dưới các điều kiện nhiệt độ, pH,(theo Gulati vàc.s.,2007)

- Phươnơ pháp nghiên cứu invitro ảnh hưởne của các enzyme đường tiêu hóa độne vật đên hoạt động của phytase (Kim và cs., 2003; Zhu và cs., 2010)

- Phương pháp lên men xốp và lên men dịch thể nấm men sinh phytase(Kam m oun và cs.,

- Phưưns pháp thu hồi phytase từ sản phẩm lên men bằne các duns dịch thích hợp (theo Quan và cs., 2001)

4 T ông kết kết quả nghiên cứu

4.1 H oạt hóa nấm men

Có 415 tro n s tổng sô 418 chủng nâm men phân lập từ 6 nguồn khác nhau lưu giữ tại VTCC

đư ợc hoạt hóa thành công từ lạnh sâu

4.2 Sàng lọc khả năng sinh pliytase của các chủng nam men lưu g iữ tại VTCC

S à n g lọc trên đĩa thạch: 127 chủng nấm men sinh phytase trên dĩa thạch, trong đó 32 chủng

có hoạt tính phytase mạnh (D-d>10 mm), 63 chủna có hoạt tính trune bình (5 mm<D- d<lO m m ) và 32 chủnơ có hoạt tính yếu (D-d<5 mm), với D-d là đườna kính VÒI1 2 trons

p h àn giải cơ chất

S à n g lọc trên m ôi trường dịch thể: 32 chủns nấm men có vòng trone phân siải cơ chất

phytate lớn trên môi trườne đĩa thạch được nuôi cấy trên môi trườna dịch thể Tsana có 7 chủng cho hoạt tính phytase cao (Ư/ml>0 ,l), 15 chủne có hoạt tính phytase trune bình (0,*05< ư /m l <0.1) và 10 có hoạt tính phytase thấp (U/ml<0,05)

S à n g lọc trên môi trường xốp: với 32 chủng nấm men được nghiên cứu trons thí nghiệm

nàv, chỉ có 5 chủne sinh phytase cao (U /m l> l), 16 chủne có hoạt tính phytase trune bình (0,5< u /m l <1) và 11 chủng sinh phytase yếu (U/ml<0,5)

4.3 Phân loại các chủng nấm men

P hân tích cây phát sinh chủng loại cho thấy: chủng 180 nằm cùng vị trí với loài Candida blainkii (trình tự rDNA 26S đoạn D1/D2 tương đồng 100%; 570/570 bp); chủng 102 và 81 nằm cùng vị trí với loài Saccharomycopsis jĩbuligera (tương đồng 100%, 594/594 bp);

ch ù n g LM 17 nằm cùne nhánh với loài Wickerhamomyces anomalus (tươiie đồna 100%, 585/585 bp); chủng BS9 nằm cùng vị trí với loài Candida tropicalis (tương đồng 100%,

589/589 bp) Kết họp đặc điểm hình thái và so sánh trình tự đoạn D1/D2 rDNA 26S, có thể

kh ẳn g định chủne 180 LM17, BS9 lần lượt thuộc loài Candida bỉankii, Wickerhamomyces anomaỉus, Candida tropicalis; hai chủna 102 và 81 cùne thuộc loài Saccharomycopsis fìbĩuligera.

4.4 Tìm kiếm chủng nấm men có phytase có khả năng thủy phân 6 gốc photphat

Có ba chủng nấm men sinh enzyme phytase thủy phân hoàn toàn 6 2 0C phosphate có ký hiệ!uL M 17,B S 9 và 180

4.51 Khả năng sình trưởng của các chủng nấm men lựa chọn trong điều kiệìt đường tiêu hóta

- K h ả năng tăng sinh của các chùng nấm men: Hai chùn? LM17 và 180 sinh trưởne tốt nhất

trê n 5 loại môi trườna với lượns sinh khối đạt cao nhất theo thứ tự là 7.5 và 8 s sinh khối khõ/1 môi trường Hansen Thí nehiệm này còn cho thấy môi trườns T sans vừa thích họp

- Khù năng chịu muôi mật của các chủng nàin men: 2 chủng LM 17 và 180 khôns bị ảnh

hưỏn? nhiều bởi muối mật Với nồng độ muối mật từ 1 - 9 % chủne LM 17 và 180 vẫn đạtđến 101 0 CFU/ ml, tuy nhiên đến nồng độ 7-9% cả hai chủne này đều có khuẩn lạc nhỏ hơn

3 lần so với khuẩn lạc ở nồng độ 0-5%

- K hả năng chịu emyrne và p H đường tiêu tóứ chủng 180 có khả năng chịu axit và kiềm,

sau thời gian ủ 1 giờ vẫn đạt 5 x l0 U) CFƯ/ml đổi với dung dịch pepsin và 7 x l01 0 CFU/ ml đối với trypsin Chủng LM 17 khả năng chịu kém hơn, đối với mẫu ủ trong pepsin thì số lượng tế bào chỉ đạt 107 CFU/ml, còn mẫu ủ với trypsin thì số lượng tế bào là 3x1 o9

4.6 N ghiên cứ u đặc điếm sinh hóa của phytase lựa chọn

- Tinh sạch phytase: bằng phươns pháp sắc ký trao đổi ion, sắc ký lọc sel, điện di SDS-

PA G E bước đầu kết luận kích thước protein phytase của chủns 180 và LM17 có kích thước lần lượt khoảna 61 kDa và 75 kDa

- N h iệt độ hoạt động tối ưu: trons dải nhiệt nahiên cứu 30-70°C phytase của 2 chủne LM 17

và 180 hoạt động tốt trons khoảng 45-50°C

- p H hoạt động toi ưu: phytase của cả 2 chủns LM 17 và 180 hoạt động tối ưu trons khoảnạ

pH từ 4-5,5 và từ pH 6 phytase dần giảm hoạt tính

-Tính bển nhiệt của enzyme: phytase của chủne LM17 bền nhiệt ở 5 0 °c sau 30 phút xử lý,

hoại tính vẫn giữ được trên 60% Ở 60, 70 và 8 0 °c hoạt tính gần như mất hoàn toàn sau 30 phủi Phytase của chủng 180 bền nhiệt ở 6 0 ° c sau 30 phút xử lý, hoạt tính vẫn giữ được trên

90% Ở nhiệt độ 70 và 80°c hoạt tính chỉ còn dưới 20% sau 30 phút

- K hả năng bền p H : sau 30 phút xử lý ở pH 3 và 4, phytase chủng LM17 còn trên 90% hoạt

tínlh; với chủna 180 sau 10 phút xử lý ở 2 pH này thì còn hơn 60%, nhưne khi tăng thời eian

xử lý lên 30 phút thì hoạt tính eiảm mạnh xuốne dưới 40% Tại pH 8 cả 2 chủng LM 17 và

180 có hoạt tính phytase giảm nhanh sau 5 phút xử lý, sau 30 phút phytase chủng 180 còn 20®/o hoạt tính, phytase chủng LM 17 gần như mất hoàn toàn hoạt tính Tại pH 9 phytase chũng 180 bền sau 30 phút xử lý, hoạt tính còn 70%, chủng LM 17 sau 30 phút chỉ còn 30% hoạt tính Sự khác nhau khi xử lý ở hai pH 8 và 9 có thể do dùna các loại đệm khác nhau

- A n h hưởng của ion kim loại: sự có m ặt của ion Na+ và EDTA làm tăng nhẹ hoạt tính

phytase ở cả 2 chủng LM17 và 180 Hiện tượna EDTA không nhữnR khôna làm giảm hoạt tínlh phytase mà còn làm tăng nhẹ có thể do EDTA làm kết tủa một số tác nhân ức chế hoạt động của enzyme Sự có mặt của SDS làm mất hoàn toàn hoạt tính của enzyme phytase ở cả

2 c;hủng LM17 và 180 Sự có mặt của các ion K+, Ca2+, Cu2+,Zn2+, M g 2+, M n 2+, B a 2+ làm eiảim một phần hoạt tính phytase của 2 chủnạ LM 17 và 180

- A'nh hưởng của em ym e và p H đường tiêu hỏa: phytase chủna LM17 chỉ còn dưới 20%

hoạt tính sau 30 phút ủ với 2 enzyme tiêu hóa pepsin (0.2 mg/ml) pH 2 và trypsin (0.2 mgĩ/ml) pH 8 trona khi đó phytase chủna 180 khi ủ với pepsin và trvpsin cùna nồng độ trên vẫm giữ nsuyên được hoạt tính Thực hiện thí nehiệm tiếp với phytase chủna 180 ở nồna độ

pepsin và trypsin cao hơn, với pepsin 1 mg/ml sau 30 phút ủ phytase vẫn siừ được trên 70% hoạt tính, với trypsin 1 mg/ml trong 30 phút ủ hoạt tính chỉ còn dưới 20%.

4 7 Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sinh pltytase của các chủng nấm men lựa chọn và điều kiện thu hồi phylase từ sản phẩm lên men

Điều kiện nhân giong thích hợp Với 5 môi trường nhàn eiốne đuợc sử dụII2 trons nghiên cứu, chủng 180 sinh trưởng tốt nhất trên môi trường Hansen, sau 24 giờ nuôi lắc số lượng tế bào đạt 4 ,5 x l09 CFU/ml Trên môi trườne Tsane và PDA, chủna 180 cho sinh khối tốt nhất vào giờ lên men 36 với sổ lượna đạt lần lượt 22x1 o8 và 8,7x108CFƯ/ml Như vậy, để nhân giống cho các nshiên cứu tiếp theo, chủng 180 được nuôi lắc 140 vòne/phút, trons 24 giờ trên 20 ml môi trườna Hansen ở nhiệt độ 2 8 °c

Lựa chọn cơ chât thích hợp cho khả năng sinh trưởng và sinh phytase của chùng nám men

Hoạt tính phytase của chủng 180 đạt cao nhất trên 3 môi trường gạo lứt+cám; malt+trấu và ngô vỡ (lần lượt là 4.4; 4,1 và 3,8 Ư/2, cơ chất khô), tuy nhiên trone quá trình chiết enzyme, hai môi trường gạo lứt+cám; malt+trấu cho rất nhiều photphat tự do, sây nhiễu phép đo quanR phổ; do vậy để 2,iúp việc xác định hoạt tính phytase được chính xác trong các thí nghiệm sau, môi trường nẹô vỡ tiếp tục được sử dụng để nghiên cứu

Nghiên cún các y ếu tố ảnh hưởng đến lên men xop Độ ẩm thích hợp cho sinh tổng hợp

phytase của chủng 180 là 55% Khi cấy giống với tỷ lệ 5-7% cho hoạt tính phytase cao nhất (đạt 3,78-3,9 u /g ) và khi tỷ lệ cấy giống tăng dần không làm tăng hoạt tính phytase mà có

xu thế giảm dần Chủng 180 có thể sử dụng nhiều nguồn cacbon khác nhau và n^uồn cacbon có ảnh hưởng đến sinh tône hợp phytase Trong các nguôn cacbon dược nghiên cứu glucose và sucrose có ảnh hưởng tích cực đến sinh tổng hợp phytase, với hoạt tính phytase đạt 3,96 và 4,38 u /g cơ chất khô Với mẫu đối chứng không bổ sung nguồn cacbon, hoạt tính phytase vẫn đạt khá cao 3,5 u /g , như vậy chứng tỏ chủng nấm men có khả năna sử dụng nguồn cacbon có sẵn trong cơ chất N suồn nitơ bổ sung có ảnh hưởng đến khả năne sinh phytase của chủng 180, trong đó N a N 0 3, N a N 0 2, cao thịt làm tăng khả năns sinh tổne hợp phytase so với đối chứng dươns từ 3,8 đến 5,6% Còn nguồn nitơ cao men ure, (NH4)2S0 4 làm siảm sinh tổna hợp phytase so với đối chứng dương từ 23-72% Chủns

LM 17 cho hoạt tính phytase cao nhất vào ngày nuôi cấy thứ 4, đạt sần 4,3 Ư/g CO' chất Khi tăng thời 2Ìan nuôi thì hoạt tính phytase có xu hướna giảm đần

4.8 Nghiên cứu điểu kiện thu hồi em ytne phytase

Nghiên círu dung dịch chiết enzyme phytase Nước máy có khả năng chiết được phytase tôt

nhất từ môi trườne lên men xốp, với hoạt tính enzyme đạt 4.93 u / s , cao hơn so với đối chứn£ dươne nước cất 2ần 19% Đối với d u n s dịch Triton-XlOO 1% và NaCl 50 mM thì có kết quả tương tự như khi chiết bằne nước cất Đ áns chú ý là duna dịch Tween 20 1% hầu

Thu hói enzyme phytase từ môi trường lên men xốp ở tât cả các phân đoạn tủa dịch chiêt

enzym e phytase của muối ammonium sunfate đều thu được protein nhưng hoàn toàn không xác định được hoạt tính phytase Do đó không thể sử dụng muối ammonium suníầte khi tủa phytase trong trườne hợp này Trone khi đó duns môi cồn và aceton ở nồng độ tủa cuối cùng lần lượt là 70% - 80% cho hoạt tính phytase cao, hiệu suất thu hồi đạt sấp xỉ 90-92%

5 Đánh giá về các kết quả đã đạt đuọc và kết luận

5.1 Đánh giá về các kết quả đã đạt đuọc

- Tính mới và giá trị khoa học: phát hiện ra 3 hai chủng nấm men có khả năne sinh phvtase

có khả năng thủv phân hoàn toàn 6 sốc phosphate

- Giá trị thực tiễn và khả năng ứng dụng: chủna nấm men được lựa chọn trons, nehiên cứu

có đầy đủ tính chất cho ứne dụns, thực tiễn trons cône nehiệp thức ăn chăn nuôi

5.2 Kết luận

-Sàng lọc được 127 chủng nấm men sinh phytase trên đĩa thạch 7 chủng sinh phytase cao trên môi trường dịch thể, 5 chủng sinh phytase cao trên môi trường lên men xốp

- Phân loại 5 chủng nấm men có hoạt tính phytase cao thuộc các loài Candida blankii,

W ickerhamomyces anomalus, Candida tropicalis; Saccharomycopsis jìbuligera.

-Lựa chọn được 2 chủne nấm men sinh phytase thủy phân hoàn toàn 6 2 0C phosphate

-Tinh sạch và xác định kích thước phân tử của phytase thủy phân 6 gốc phosphate từ hai chủng nấm men lựa chọn Nghiên cứu được đặc điểm hoạt động của enzyme này

- Toi ưu hóa điều kiện lên men xốp chủng nấm men 180 cho phytase cao

- N ghiên cứu điều kiện chiết và thu hồi phytase của chủne 180

- Đ ưa ra quy trình lên men và thu hồi phytase phytase từ chủng 180

- Đ ưa ra quy trình bước đầu tinh sạch phytase chủne 180

6 T ó m tắ t k ế t q u ả (tiếns Việt và tiếng Anh)

6.1 Tiếng việt

Hoạt hóa thành côn? 415/418 chủng nấm men được bảo quản ở -8 0 °c thuộc bộ eions nấm m en của VTCC Trong số 415 chủne có 127 chủne sinh phytase trên đĩa thạch, 7 chủng cho hoạt tính phytase trên môi trường lên men dịch thể và 5 chủnR cho phytase cao trên m ôi trường lên men xốp

Phân loại bành phương pháp quan sát hình thái tế bào, khuân lạc và sinh học phân tử

cho thấy 5 chủng nấm men lựa chọn thuộc về các loài Candìda blankii, Wickerhamomyces anomalus, Candida tropicalis; Saccharom vcopsisfìbuligera.

T rons số 5 chủne nấm men lựa chọn có 3 chủns nấm men (180, BS 9 và LM17) sinh phytase thủy phân 6 gốc phosphate và hai chủne 180, L M 17 thuộc nhóm nấm men an toàn, cho sinh khối cao, chịu được các điều kiện trona đườne tiêu hóa nhân tạo

Phương pháp tinh sạch enzyme cho thấy phytase của hai chủna nấm men nshiên cửu

có kích thước 75 và 61 kDa

Chủne nấm men 180 cho hoạt tính phytase cao nhất trên môi trườn £ naô vỡ được

làm âm đến 50% với dịch khoáng Tsane, tỉ lệ giống cấy 5-7% bố suna nguồn c là sucrose hoặc elucose 1% nguồn nitơ 0,1%, nuôi ở 28°c, trong 4 nsày

Enzym e phytase của chủng 180 được chiết từ môi trường lên men xốp băns nước máy và tủa bana cồn hoặc aceton lạnh nồng độ 70%-80%, hiệu suất thu hồi 90-93%

6.2 Tiếng Anh

415/418 yeast strains stored at -80°c o f the yeast strains o f VTCC were activated succcssíully O f the 415 strains, 127 ones exhibited phytase activity on aear plates 7 strains produced hieh level o f phvtase in liquid medium and 5 strains shovved hiah level o f phytase

in solid State medium

The taxonomy o f fíve strains baseđ on m orpholoay and molecular bioloey shows that

they belone to species Candida blankii, Wickerhamomyces anomaỉus, Candida tropicalis; Saccharomycopsis f i buligera.

O f the íĩve selected yeast strains with three yeast strains (180, BS9 and LM17) produced 6 phosphate completely hydrolysis phytase and 180, LM17 strains belons to safety yeast group, w ith high biomass, stabilize with conditions o f the eastrointestinal tract

Phytases o f two strains LM17 and 180 have size 75 and 61 kDa resspectively

Strain 180 showed the highest phytase activity in solid State o f broken corn moistened to 50% with Tsana broth, the rate o f 5-7% innoculum, additional carbon source is glucose or sucrose 1%, nitrogen meat extract 0, 1%, incubate at 28°c for 4 days

Phytase o f this strain is extracted from the fennentation m edium with tap water and precipitated by alcohol or cold acetone concentration o f 70%-80%, 90-92% recovery

effíciency, respectively

PHẦN III SẢN PHẢM , CÔNG BỐ VÀ KÉT QUẢ ĐÀO TẠO CỦA ĐÈ TÀI

3.1 Kết quả nghiên cứu

Yêu cầu khoa học hoặc/và chỉ tiêu kinh tế - kỹ thuật

1 1 bộ các chủng nấm men

sinh phytase có khả năng

thủy phân được 6 gốc

3 Quy trình lên men và thu

hồi enzvme phytase

nhận đơn hợp lệ/ đã được cấp giấy xúc nhận SHTT/

xác nhận sử dụng sản

phàm)

của

ĐHQGHN đúng quy

định

không đạt)

1 Cône trình côna bô trên tạp chí khoa học quôc tê iheo hệ thông ISI/Scopus

5 Bài báo trên các tạp chí khoa học của ĐHQGHN tạp chí khoa học chuyên

ngành quốc gia hoặc báo cáo khoa học đăns trong kỷ yếu hội nghị quốc tế

5.11 Trân Thị Lệ Quyên, Lưu Thị

Ngọc, Đào Thị Lương (2014)

Tuyển chọn và nghiên cứu chủng

nấm men sinh phytase lưu giữ tại

Bảo tàng Giống chuẩn Vi sinh vật

đề tài Q G 12.23

Đạt

5.2 Trân Thị Lệ Quyên (2014) Nghiên

cứu điều kiện lên men xốp và thu

hồi enzyme phytase từ chủng nấm

men Candida blankii 180 Di

truyền và ứng dụng-Chuyên san

Công nghệ sinh học, 9, 18-24

ơn sự hỗ trợ kinh phí từ

7 Kêt quả dự kiên được ứ n s dụna tại các cơ quan hoạch định chính sách hoặc

cơ sở ứne dụng KH&CN

(số tháng/sỏ tiền)

Công trình công bố liên quan

1 Tràn Thị Lệ Quyên Tháng

1 0/2 0 1 2 10/2014

Hoc viên cao hoc

1

Cử nhân

1 0/2 0 1 2tháng10/2013

-Sàng lọc và nghiên cứu các chủng nấm men sinh phytase

từ các bộ eiống nấm men lưu eiữ tại Bảo tàng Giống chuẩn

Vi sinh vật (VTCC) nhằm ứna dụne trona sản xuất thức ăn chăn nuôi

Đă bảo vệ

Ghi chú:

Gửi kèm bàn photo trang bìa luận á n / luận văn/ khóa luận và băng hoặc giây chửng nhận nghiên cím sinh/thạc sỹ nếu học viên đã bảo vệ thành công luận án/ luận văn;

Cột công trình công bo ghi như mục III 1.

PHẦN IV TỎNG HỢP KÉT QUẢ CÁC SẢN PHẲM KH&CN VÀ ĐÀO TẠO CỦA

Số lượng

đã hoàn thành

1 Bài báo công bổ trên tạp chí khoa học quốc tế theo hệ

thống ISI/Scopus

2 Sách chuyên khảo được xuât bản hoặc ký họp đône

xuất bản

3 Đăng ký sở hữu trí tuệ

4 Bài báo quôc tê khône thuộc hệ thông ISI/Scopus

5 Sô lượng bài báo trên các tạp chí khoa học của

ĐHQGHN, tạp chí khoa học chuyên ngành quốc gia

hoặc báo cáo khoa học đăne trong kỷ yếu hội n^hị quốc

tế

6 Báo cáo khoa học kiên nehị, tư vân chính sách theo đặt

hàng của đơn vị sử dụns

7 Kêt quả dự kiên được ứne dụng tại các cơ quan hoạch

định chính sách hoặc cơ sở ứng dụng KH&CN

9 Đ ào tao thac sĩ

PH ẢN V TÌNH HÌNH s ử DỤNG KINH PHÍ

A Chi p h í trực tiêp

V

HỢP

V ă n

11

PHỤ LỤC

PHỤ LỤC 1

BÁO-ĐÀO

Di truyền học vù ímg dụng - Chuyên sun Công nghệ sinh học S ố 9 - 2014

N G H IÊN CỨ U ĐIÈU KIỆN LÊN M EN XÓP VÀ TH U HÒI EN ZY M E PH YTASE T Ừ

CH Ủ N G NÁM M EN CANDIDA B L A N K II180

Trần Thị Lệ Q uyên

Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học

MỞ ĐẦU

Phytases phân bố phố biến trong tự nhiên,

được tìm thấy trong thực vật, vi sinh vật và

một số mô động vật Chúng xúc tác cho sự

thủy phân acid phytic và các muối của acid

phytic để tạo thành photphat vô CO' và các

dẫn xuất myo-inositol Dựa vào vị trí c

trong vào myo-inisitol của phytic mà tại đó

phản ứng dephotphoryl hóa bắt đầu phytase

có thể được xếp vào nhóm 3-phytases (EC

3.1.3,8) và 6-phytases (EC 3.1.3.26) [3]

Do tiềm năng của chúng trong các ứng dụng

công nghiệp mà phytase được đặc biệt quan

tâm nghiên cứu trong các thập kỷ gần đây

Một Số vi khuẩn, nấm sợi và nấm men được

công bố có khả năng sinh phytase Trong

thực tể, việc sản xuất thương mại enzyme

phytase cho công nghiệp thức ăn chăn nuôi

giai đoạn đầu chủ vếu tập trung vào đối

tượna nấm mốc và nấm men Gần đây,

phytase từ các loài Bacillus được công bố có

những ưu điểm như bền nhiệt và đặc hiệu

cao Tuy nhiên, có thể phần nào do các

phương pháp sản xuất enzvme thiếu hiệu

quả mà phytase từ Bacilỉus không được áp

dụng trên quy mô lớn Có hai phương pháp

được sử dụng trong sản xuất phytase vi sinh

vật được biết đến là lên men xốp và lên men

bề mặt Lên men xốp đã thu hút được nhiều

sự quan tâm trong những năm gần đây, chủ

yếu do chúng tiêu tốn ít năng lượng, lượng

nước thải đầu ra thấp, môi trưòng lên men

đơn giàn, thôníì khí dề dàng và sự tạp nhiễm

vi khuẩn được hạn chế [3]

Các điều kiện nuôi cấy, chủng giống, tính chất tự nhiên của cơ chất và hàm lượng các chất dinh dưỡng được đưa vào bài toán đầu vào để quyết định năng suất sản xuất các sản phẩm enzyme Các cơ chất hiệu quả kinh tế nhất được sử dụng phổ biển là cám mỳ, bột đậu tương nguyên chất, bột canola thô rỉ đường, bã ép dầu thô [3]

Trong nghiên cứu này chủng nấm men

Candida bỉankii 180 sinh phytase có khả

năng thủy phân 6 gốc phosphate, sinh khối tốt và an toàn cho vật nuôi được nghiên cứu một số điều kiện lên men xốp và bước đầu tách chiết enzyme phytase phục vụ cho các nghiên cứu về sau

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Chủng giống Chủng nấm men Candida blankii 180 sinh phytase thủy phân 6 gốc phosphate có nguồn gốc từ bánh men được lưu giữ tại VTCC

Môi trường nhăn giong YM (g/1: glucose -

10; cao men - 3; cao malt - 3: pepton - 5:

pH 6,5); Hansen (g/l: glucose - 30; pepton -

10 ; cao men - 1 ; MgSOí - 2 ; KH2PO4 - 3;

pH 6,5); PDA (g/1: khoai tây - 200 , glucose

- 10; pH 6,5); YDP (g/l: cao men - 10 , pepton - 20 alucose - 20; pH 6.5); Tsang [8].

18

./ Genelics and Applications - Speciaì ỉssue: Biotechnology InstUute ofM icrobìolog\’ and Biotechnology, Vietnam National Ưniversity, Hanoi

Di truyền học và úvg dụng - Chuyên san Công nghệ sinh học Số 9 - 2014

N g h iê n c ứ u đ iều kiện n h â n g iố n g Chủng

nấm men I 80 được nuôi cấy trên các môi

trường nhân giống khác nhau, với thể tích

môi trường 2 0 ml/bình tam giác 1 0 0 ml, ở

nhiệt độ 28°c trong khoảng thời gian 16, 24,

36 giờ, tốc độ lắc 140 vòng/phút, sau đó xác

định khả năn? sinh trườne; của chùng nấm

men tròn các môi trường bàng phương pháp

xác định cfu/ml

N g h iên c ứ u cá c đ iều k iện lên m en x ố p

thích h ọ p ch o k h ả n ă n g sin h p h y ta se

Nguồn cơ chất, thời gian nuôi, ti lệ giống, độ

ẩm, nguồn cacbon, nguồn nitơ và các ion

kim loại được thực hiện theo phương pháp

mô tả của Gulati và cộng sự (2007) [ 1 ]

Chiết enzxme Enzym phytase được chiết từ

môi trường lên men xốp bằng các dung dịch:

Triton X I00 1%, NaCl 50 mM, SDS 1%,

Tween 20 1%, Tris HC1 0,1 M pH 7, nước

cất, nước máy vói tỷ lệ cơ chất : dịch chiết =

1:2, sau đó lắc 1 giờ và ly tâm 8000

vòng/phút/15 phút, thu dịch trong xác định

hoạt tính phytase

Thu h ồ i e n z v m e

Tủa enzyme bang muối (NH4) 2 SO/ dịch

chiết enzvme phytase được tủa bằng muối

(NH4)2S 04 ở các phân đoạn từ 30-90% Cặn

tủa được hòa tan về thể tích ban đầu bằngnước cất và xác định hoạt tính phytase

Tủa emyme bănq các dung môi hữu cơ: dịch

chiết enzyme phytase được tủa bằng haidung môi ethanol và aceton lạnh đến nồng

độ cuối cùng là 70% Cặn tủa được hòa tan

về thể tích ban đầu bằng nước cất và xácđịnh hoạt tính phytase

số lượng tế bào đạt 4,5xl09 CFU/ml Trên môi trường Tsang và PDA, chủng 180 cho sinh khối tốt nhất vào giờ lên men 36, với số lượng đạt lần lượt 2 2x1 o8 và 8,7x108CFU/ml Như vậy, để nhân giống cho các nghiên cứu tiếp theo, chùng 180 được nuôi lắc 140 vòng/phút, trong 24 giờ trên 20 ml môi trường Hansen ở nhiệt độ 28°c (Hình 1)

Di tniyờn học và ứng dụng Chuyên san Công nghệ sinh học Số 9 - 2014

Hình 1 Môi trưòìig và thòi gian nhân giống khỏi động

L ự a ch ọ n c ơ c h ấ t thích h ọ p ch o kh á n ă n g

sin h trư ở n g và sìn h p h y ta s e củ a ch ủ n g

nấm men Dựa vào ưu điểm của môi trường

lên men xốp khá giống với môi trường tự

nhiên của vi sinh vật, cơ chất rắn vừa có vai

trò là nguôn dinh dưỡng vừa là giá thê giúp

tế bào vi sinh vật bám vào Với đặc điểm

nước ta là nước nông nghiệp, nên việc tìm

nguồn cơ chất là sản phẩm hoặc phụ phẩm

từ nông sản với giá thành hợp ]ý tương đối

dễ dàng Trong nghiên cứu này, hoạt tính

phytase của chủng 180 đạt cao nhất trên 3

môi trưòng gạo lúrt+cám; malt+trấu và ngô

vỡ (lần lưọt là 4,4; 4,1 và 3,8 u/g cơ chất

khô), tuy nhiên trong quá trình chiết

enzyme, hai môi trường gạo lứt+cám;

malt+trấu cho rất nhiều photphat tự do, gây

nhiễu phép đo quang phổ; do vậy để giúp việc xác định hoạt tính phytase được chính xác trong các thí nghiệm sau, môi trường ngô vỡ tiếp tục được sử dụng để nghiên cứu (Hình 2) Trong khi đó nghiên cứu cùa Vohra (2011) cho thấy nấm men

Wickerhamomyces unomaỉus cho hoạt tính

cao nhất khi nuôi trên bột đậu tương, đạt

1000 u/kg [9] Đối với vi khuẩn Bacillus

một số tác giả lại cho rằng cám lúa mỳ là nguồn cacbon thích họp nhất cho sản xuất

phytase ở B amyỉoìique/aciens DS11 [5] và

B amylolique/aciens FZB45 [5] Tuy nhiên,

cơ chất này lại không có ảnh hường tích cực

đến quá trinh sản sinh phytase từ B laevolacticus [1]

J Genelics and Applications - Special Issue: Biotechnoìog)' Insútute o f Microbiolog}' and Bioteclmology, Vietnam National University, Hanni

20

Di truyền học rà ứng dụng - Chuyên san Công nghệ sinh học Số 9 - 2014

5 4 5

4 3.5

Hình 2 Co’ chất thích họp cho lên men xốp sinh phytase

Nghiên cứu các yểu tổ ảnlĩ hưởng đến lên

men xốp Trong lên men xốp, độ ẩm có ảnh

hưởng rất lớn đến quá trình sinh trường

cũng như sinh tổng hợp enzyme của vi sinh

vật Không giống như lên men dịch thể,

tròng lên men xốp, vi sinh vật sinh trưởng

và sinh enzyme trên hoặc gần bề mặt cơ chất

có độ ẩm thấp, do vậy mà chỉ một số giới

hạn vi sinh vật nào đó mới thích hợp cho lên

men xốp Trong nghiên cứu này, độ ẩm thích hợp cho sinh tổng họp phytase cùa chủng 180 là 55% (Hình 3).Tỷ lệ cấy giống cũng là một trong các yếu tố quan trọng trong quá trình sản xuất phytase Khi cấy giống với tỷ lệ 5-7% cho hoạt tính phytase cao nhất (đạt 3,78-3,9 u/g) và khi tỷ lệ cấy giống tăng dần không làm tăng hoạt tính phytase mà có xu thế giảm dần (Hình 4)

Di truyền học và ứng dụng - Chuyên san Công nghệ sinh học Sổ 9 -2 0 1 4

Hình 4 Ánh hưỏng của tí lệ giống đến khả năng phytase

Ket quả trên hình 5 cho thấy chùng

180 có thể sử dụng nhiều nguồn cacbon

khác nhau và nguồn cacbon có ảnh hường

đến sinh tổng họp phytase Trong các nguồn

cacbon được nghiên cứu, glucose và sucrose

có ảnh hường tích cực đến sinh tổng hợp

phytase, với hoạt tính phytase đạt 3,96 và

4,38 u/g cơ chất khô Với mẫu đối chứng

không bổ sung nguồn cacbon hoạt tính

phytase vẫn đạt khá cao 3,5 u/g, như vậy

chứng tỏ chủng nấm men có khả năng sử

dụng nguồn cacbon có sẵn trong cơ chất Ở

một số nghiên cứu, glucose được coi là

nguồn cacbon được sử dụng rộng rãi bời

nhiều vi sinh vật Nồng độ glucose 1% là

nồng độ tối ưu cho quá trình sản xuất

phytase ở Lactobacillus amylovorus và

Enterobacter sp 4, trong khi đó Bacillus

subtilis thích họp với nồng độ elucose 2%

[4,11]

Nguồn nitơ bổ sung có ảnh hưởng đến

khả năng sinh phytase của chủng 180 (Hình

6), trong đó NaNƠ3, NaNƠ2, cao thịt làm

tăng khả năng sinh tổng hợp phytase so với

đối chứng dương từ 3,8 đến 5,6% Còn

nguồn nitơ cao men, ure, (NH4)2S04 làm

giảm sinh tổng hợp phytase so với đối chứng dương từ 23-72% Nghiên cứu của Gulati và

cs (2007) cho thấy quá trình sinh phytase

bời Bacillus laevoìacticus được kích thích

nhờ sự có mặt cùa NH4H2PO4 B subtilis sử

dụng casein thủy phân 1% và (NH^SCU

0,1% là nguồn nitơ trong quá trình tổng họp phytase [1]

Ket quả trong hình 7 chỉ ra rằng chùng 180 cho hoạt tính phytase cao nhất vào ngày nuôi cấy thứ 4, đạt 4,3 u/g cơ chất Khi tăng thời gian nuôi thì hoạt tính phytase

có xu hướng giảm dần Nghiên cứu cùa

Gulati và cộng* sự (20Ơ7) cho thay tí laevolacticus cho hoạt tính phytase cao nhất

sau 60 giờ nuôi cấy Nghiên cứu của Ramesh và Lonsane (1987) cho kết quả phytase đạt tối đa ỏ' 72 giờ, sau đó giảm dần Nguyên nhân của sự giảm sinh tổng họp phyatse có thể là do sự tăng sinh trưởng sinh khối tế bào làm giảm hàm lượng các yếu tố dinh dưỡng trong môi trường, cũng có thể là

do sự ức chế tế bào hoặc biến tính protein do

sự tương tác với các thành phần khác trong môi trường [1]

Di In iy ê n học và ÚVỈỊ CỈỊIIIÍỊ - Chuyên san Công nghệ sinh học Sổ 9 - 2014

1 n g à v 2 n g à y 3 n g à y 4 n g à y 5 n g à y 6 n g à y 7 n g à y

T h ò i g ia n lê n m en

Hình 7 Ánh hưởng của thời gian lên men xốp đến khả năng sinh phytase

N g h iên cứu d u n g dịch c h iết enzvme tốt nhất từ môi trườna lên men xốp với hoạt

Di In iyê n học và ím g dụng - Chuyên san Công nghệ sinh học Sổ 9 - 2 0 1 4

dung dịch Triton-XlOO 1% và NaCl 50 mM

thì có kết quả tu'0'ng tự như khi chiết bằng

nước cất Đáng chú ý là dung dịcli Tvveen 20

1% hâu như không chiết được phytase, hoạt

lính enzyme thấp hon 96% so với khi chiết

bằng nước cất Dung dịch SDS 1% cũng cho

tỉ lệ chiết phvtase rất thấp, chỉ bằna 35% đối

chứng (Hình 8) Đối với từng vi sinh vật

khác nhau lên men trên các loại môi trường

khác nhau thì việc sử dụng các dung dịch

đệm khác nhau cũng ảnh hưởng nhiều đến

quá trình thu hồi enzyme Trong nghiên cứu của Rezaei và cộng sự (2011) trên đối tượng

cơ chất là cỏ switchgrass được bổ sung enzyme xylanase thương mại (nguồn gốc nấm sợi) thỉ đệm natri acetate 50 lĩiM là một đệm chiết xuất lý tưởng, trong khi đó cùng loại cò này được lên men xốp bởi chủng

Axilothermus celỉuỉolyticus lại cho thấy

nước là một đệm chiết xuất ưa thích để thu hồi xylanase [6]

Hình 8 Khả năng chiết phytase từ môi trường lên men xốp của các dung dịch

Thu hồi enzvme p h y ta s e từ môi trường lên

men xốp Ket quả thể hiện trên hình 9 cho

thấy ờ tất cả các phân đoạn tủa dịch chiết

enzyme phytase của muối ammonium

sunfate đều thu được protein nhưng hoàn

toàn không xác định được hoạt tính phytase

Do đó không thể sử dụng muối ammonium

sunfate khi tủa phytase trong trường hợp

này, tuy nhiên theo nhiều nghiên cứu cùa

các tác già khác như Kerovuo (1998) đã tủa

phytase bằng (NH4)2S0 4 65% và thu hồi được 56% hoạt tính phytase; theo Wang xueying (2003) thu hồi được phytase ờ các phân đoạn từ 20-80% (NH4)2S0 4 [4,

1 0].Trong khi đó dung môi cồn và aceton ở nồng độ tủa cuối cùng là 70% cho hoạt tính phytase cao, hiệu suất thu hồi đạt sấp xí 100% Trong nghiên cứu của Kerưvo (1998)

đã sử dụng cồn 75% để tủa phytase và thu hồi được 93% hoạt tính phytase [4]

J Genetics a nd Applications - Special Issue: Biolechnology ỉnstitute o f Microbiolog}' and Biotechnologỵ, Vietnam National Universitỵ, Hanoi

24

Di Iruvữn học và ứng dụng - Chuyên san Công nghệ sinh học Số 9 - 20 ỉ 4

Chủng nấm men Ccmdida bìankii 180 là

chủng nấm men có tính an toàn sinh học,

cho hoạt tính phytase cao trên môi trường

lên men xốp với cơ chất ngô vỡ, đồng thời

được tách chiết dễ dàng với hiệu xuất thu

hồi cao nhờ dung môi là cồn, thứ hóa chất

dễ tìm và dễ sử dụng Ket quả của thí

nghiệm cho thấy chùng nấm men 180 có thể

được ứng dụng vào sàn xuất thức ăn chăn

nuôi sừ dụng nguồn cơ chất có sẵn trong

nước, vừa cung cấp nguồn enzyme phytase

vừa cung cấp lượng protein đơn bào cho vật

nuôi Dựa vào kết quả thu được, một quy mô

lên men xốp lớn hơn có thể được thiết kế với

mục đích sản xuất thử

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Gulati H.K., Chadha B.S., Saini U.S

alkaline phytase from Bacillus

rhizosphere soil J Ind Microbiol Diotechnol 34:91-98

2 Idriss E.E., Makarewicz o., Farouk A., Rosner K., Greiner R., Bochow H., Richter T., Borriss R., (2002) Extracellular phytase activity of

Bacillus arnvloliquefacierts FZB45

contributes to its plant-growth-

promoting effect Microbiology 148:

2097-2109

3 Kammoun R., Farhat A., Chouayekh H„ Bouchaala K„ Bejar s (2011) Phytase production by Bacillus subtilis US417 in submerged and

solid State fermentations Ann Microbioh 1-10

4 Kerovuo J., Lauraeus M., Nurminen p., Kalkkinen N., Apajalahti J (1998) Isolation, characterization, molecular gene cloning and sequencing of novel phytase from

Di Inivên học và ứng dụng — Chuyên san Công nghệ sinh học Số 9 - 2 0 1 4

5 Kim Y„ Kim H.K., Bae K.S., Yu

J.H., Oh T.K (1998) Puriíìcation

and properties of a thermostable

phytase from Baciìỉus sp DSI1

Enzyme and Microbial Technology

22:2-7

6 Rezaei F., Joh L.D., Kashima H.,

Reddy A.P., VanderGheynst J.s

(2011) Selection of conditions for

cellulase and xylanase extraction

from switchgrass colonized by

Acidothermus celỉuìolyticus Applied

Biochemicaỉ Biotechnology 164(6):

793-803

7 Shimizu M (1992) Purifícation and

characterization of phytase from

Bacilỉus subtilis (natto) N-77 Biosci

and applications of the cell-bound

phytase of Pichia anomaỉa Antonie van Leeinvenhoek 99:51-55

10 Wang xueying (2003) Phytase studies: producer screening, enzyme puri/ìcation and characleri-ation and gene cìoning PhD thesis,

Facultv of graduate studies Mahidol University

11.Yoon S.J., Choi Y.J., Ki M.H., Kwang C.K., Wook K.J„ Cheol L.C.,

identiíication of phytase producing

bacterium, Enterobacterium sp 4 and, enzymatic properties of phytase enzyme Enzyme Microbial Technology 18(6): 449-45

L òi cảm ơn

*Công trình được hỗ trợ kinh phí từ đề tài:

“Sàng lọc và nghiên cíni enzym phytase có khả năng thủy phản hoàn toàn 6 gốc photphat từ nam men nhằm ứng dụng trong chăn nuôF- QG 12.23.

*Người thẳm định: GS TS Phạm Văn Ty

SU M M A R Y

O P T IM A L C O N D IT IO N S FO R SO LIĐ ST A TE FE R M E N T A T IO N AND R E C O V E R

EN Z Y M E PH Y T A SE FROM ST R A IN CAND ID A B L A N K I I 180

Tran Thi Le Q uyen

Institute o f Microbioìogy & Biotechnology (IMBT), Vietnam National University, Hanoi (VNU)

Optimal conditions for solid - State fermentation of strain Candida bỉankii 180 were raw

corn substrate with moisture content 55%, inoculum size ranging from 5-7%, previously grown for 24 hours in Hansen broth, 4 days fermentation time Higher amount of enzyme phytase was obtained in presence of sucrose and either NaNC>3, NaNO: or meat extract Of the seven studied solutions, tap water was the best one for extracting phytase from substrate Alcohol and acetone

at 75% íinal concentration were suitable for enzyme recovery \vith performance of approximatelv 1 0 0%

J Genetics and Applications - Special Issue: Biotechnology Institule o f M icrobiolog}’ and Biolecìmology, Vietnam N ational University, Hanoi

D i tr u y ề n h ọ c và íhỉíỊ d ụ n g - ( 'huyên s a n C ô n ẹ n g h ệ sìn h h ọ c SỐ 9 - 2 0 1 4

T U Y Ẻ N C H Ọ N VÀ N G H IÊ N c ử u C H Ủ N G NẤ M M EN SIN H P H Y T A SE

L Ư U G IŨ TẠI BẢ O T À N G G IÓ N G C H U À N VI SIN H V Ậ T

Trần Thị Lệ Quyên1, Lưu Thị N gọc2 Đào Thị Lương1

'v iệ n Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học Đại học Quốc gia Hà Nội

2Viện Đại học Mỏ- Hà Nội

ĐẶT VÁN ĐÈ

A xit phytic là một dạng dự trữ photplio

chủ yếu trong hạt ngũ cốc và các cây họ đậu

nhưng chi một lượng rất nhỏ đưọc thúy phân

tạo photphat vô cơ và nó được xem như một

chất kháng dinh dưỡng, cản trờ sự tiêu hóa các

protein và các ion kim loại [23].

Phytases là enzym e xúc tác cho phản ứng

thùy phân axit phytic thành photphat vô cơ tự

do Phytases được sản sinh bởi thực vật động

vật và vi sinh vật [18, 35] Những nghiên cứu

gần đây chi ra rằng nguồn vi sinh vật mang

đầy hứa hẹn cho sản xuất phytase thương

phẩm, với sản phẩm thương mại đầu tiên là

PhyA từ chủng nấm sợi Aspergillus niger [18]

Ngoài phytase từ nấm sợi, các nhà khoa học

trên thế giới cũng rất quan tâm đến đối tượng

nấm men Từ việc nghiên cứu 738 chủng nấm

men, Nakamura và cs (2000) đã phát hiện

hoạt tính phytase ỏ' 35 chủng, với khoảng pH

và nhiệt độ tối ưu rộng [17] Gần đây nhất

nhóm tác giả Ragon và cs., (2008, 2009) đã

nshiên cứu sâu về cấu trúc và hoạt động của

phytase quý từ nấm men có khả năng thủy

phân hoàn toàn 6 gốc photphat [22].

PhyA từ A spergilìus niger được biết đến là

sản phẩm thương mại đầu tiên với vai trò là

dạng bổ sung vào thức ăn Việc bổ sung

phytase vi sinh vật vào chế độ ăn cùa vật nuôi

giúp hạn chế việc cung cấp photphat và làm

tăng khả năng hấp thu sinh học các protein và

khoáng chất thiết yếu do đó làm tăng hiệu quả

chăn nuôi, giảm lượng photpliat trons bã thải

chăn nuôi, giảm ô nhiễm môi trưòng [3].

ơ Việt Nam, chưa có một báo cáo nào về

khác, như Vũ Nguyên Thành đã nghiên cửu sản xuất phytase tái tổ hợp từ nấm sợi

Aspergillus niger [31], Trần Thị Thúy nghiên

cứu nhân dòng và biểu hiện gen phytase chịu

nhiệt cùa Bacilìus sp MD2 trên E Coìi [32].

Vói nguồn gen nấm men lớn lưu giữ tại Bảo tàng giống chuẩn Vi sinh vật (VTCC), cùng với sự đa dạng về nấm men cùa Việt nam ỏ' các vùng sinh thái khác nhau, thì việc tìm kiếm được nguồn phytase mới từ chúng rất khả quan Ngoài ra, nấm men đưọc xem là vi sinh vật hầu như không gây bệnh và đưọc coi

là an toàn (GRAS) [26], sinh khối nấm men đang được sử dụng làm nguồn protein đon bào cho ngưòi và động vật, do vậy, việc bổ sung nấm men sinh phytase vào thức ăn chăn nuôi

có thể làm được đồng thời hai nhiệm vụ cung

cấp enzymtí phytase và bổ sung protein cho

vật nuôi.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Đ ổi tượng nghiên cứu: 418 chủng nấm men

lưu giữ tại VTCC phân lập từ Cúc Phương, Trùng Khánh, Cát Tiên, Lang Bi-ang, bánh men, thực phẩm lên men, sân bay quân sự Đà Nang.

- Mỏi trưòns lên men xốp kích thích nấm men sinh ph)tase: môi trường cơ chất khác nhau

D i tru y ề n h ọ c và ứ n g d ụ n g - ( 'h u yên su n CôìiiỊ n g h ệ sin h h ọ c Sổ 9 - 2014

Tsang [33] Các cơ chất sử dụim gồm: uạo,

ngô võ', đậu tương vỡ, gạo+bột đậu tưona,

cám+trấu naô vỡ+aạo ngô vỡ+bột đậu tương,

ngô võ'+cáin; malt+trấu (ti lệ 3:1).

- Môi trường tăng sinh nấm men: YM (ạ/1:

pepton - 5; pH 6,5); H ansen (g/1: glucose - 30;

pepton - 10 ; cao men - 1 ; MÍ1SO4 - 2 ;

KH2PO4 - 3; pH 6.5); PD A (g/l: khoai tây -

200 , glucose - 10; pH 6,5); Y D P (g/1: cao men

- 10 , pepton - 20 , glucose - 20; pH 6,5);

T sang [33].

Anh hướiig cua muôi mật đèn sinh trưởng cua

nấm men Chùng nấm men được cấy eạt trên

đĩa thạch YM có bồ sung thêm muối mật ỏ' các

nồng độ 1, 3, 5, 7, 9% Đối chứng là đĩa thạch

YM không chứa muối mật Sau 48 giò' quan

sát mật độ và kích thước khuân lạc nấm men

trên đĩa thạch.

Anh hưởng cùa em ym e đường tiêu hóa đến

sinh trướng cùa ìiâni men Tê bào chủng nấm

men được ủ trong dung dịch pepsin và trypsin

ở 3 7 °c trong 1 giờ theo Zhu [38], sau đó cấy

gạt trẽn dĩa thạch YM, sau 48 giờ quan sát khả

năng sinh trường của nấm men Đồi chứna là

mẫu ủ với nước cất.

Phân loại nấm men

- Quan sát hình thái khuẩn lạc và tế bào nam

men theo phương pháp cùa Yarrovv [36].

- Phàn loại nấm men bằng sinh học phân tử:

DNA tổng số của các chủng nấm men đưọc

tách chiết theo Manitis [14] Trình tự 1'DNA 26S đoạn D1/D2 được xác định theo phương pháp cùa Kurtman và Robnett [12] sử dụng

máy đọc trình tự 3100 - Avant Genetic

Analyzer và hóa chất cùa hãng AB Apply Biosystem So sánh và xử lý số liệu dùng chương trinh máy tính CLUSTAL X cùa Thompson và cs (1997) Các trình tự tham khảo dùng trong nghiên cứu cây phát sinh chủng loại được lấy từ dữ liệu cùa GenBank Cây phát sinh chùng loại được xây dựng theo Kimura [10], sử dụng phương pháp cùa Saitou

và Nei [25]; pliân tích bootstrap được thực hiện từ 1000 lần lặp lại ngẫu nhiên.

Hoạt độ phylase: Xác định theo phương pháp

mô tả cùa Zhu [38].

KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

S àn g lọc trên đĩa thạch: 127/415 chùng nấm

men sinh phytase trên đĩa thạch, trong đó 32 chủng có hoạt tính phytase mạnh (D-d>10 mm), 63 chùng có hoạt tính trung bình (5 mm<D-d<10mm) và 32 chủng có hoạt tính yếu (D-d<5 mm), với D-d là đưòng kính vòng trong phân giải cơ chất.

.;■* * • »

-\ % *' ■ ^ gg w- #

* # * 0 # *

V ề l ý

Hình 1: Khả năng sinh phvtase của các chủng nấm men trên môi trưòng sàng lọc đĩa thạch

phytate lớn trên môi trưòng đĩa thạch được nuôi cấy trên môi trường dịch tliể Tsana, có 7

S àng lọc trên m ôi trường dịch thể: 32 cliủng

trong phân giải CO' chất

2 8

J G enetics a n d Applications - Special Issue: Biotechnology Insiiiute o f M icrobiology and Biotechnology, Vietnam N ational University, H anoi

D i tr u y ề n h ọ c và ử n q d ụ n g - C h u y ê n su n C ô n g n ơ h ệ sin h h ọ c Sỏ 9 - 2014

chùng cho hoạt tính phytase cao (U/m l>0 ,l),

15 chủng có hoạt tính phvtase trunu bình

(0.05< u/m ! <0,1) và 10 có hoạt tính phytase

thấp (U /inl<0,05) Trong số 7 chùng có hoạt

tính phytase cao thì có 5 chùng thuộc bộ bánh

men, 1 chùng thuộc bộ thực phẩm lên men, 1

chủng thuộc bộ Cúc Phương Ket quả cho thấy

các chủng nấm men có hoạt tính cao chủ yếu

có mặt ờ bộ bánh men nguyên nhân có thê do

thành phần chủ yếu của bánh men là cám trấu

với hàm lưọng phytate cao đã chọn lọc tự

nhiên các chủng nấm men sử dụng nguồn

photphat này sinh trưởng trên sản phẩm.

S àn g lọ c trên m ôi trư ờng xốp: vói 32 chủng

nấm men được nghiên cứu trong thí nghiệm

này, chỉ có 5 chủng sinh phytase cao

((U /m l> l), 16 chủng có hoạt tính phytase

trung bình ( l> u /m l> 0 5 ), và 11 chùng sinh

phytase yếu((U /m l<0,5) 5 chủng sinh phytase

cao trên môi trường xốp nam trong số 7 chùng

có phytase cao trên môi trường dịch thể Ọua

ba thí nghiệm trên, 5 chủng nấm men ký hiệu

81 102, 180, LM17 và BS9 có hoạt tính phytase cao trên cả 3 mỏi trường sàng lọc được sử dụnti cho các nghiêm cứu tiếp theo Trong nghiên cứu của Nakamura, tác giả đã sàng lọc 738 chùng nấm men thuộc hơn 500 loài khác nhau, có 300 chùng tạo vòng trong phân giải CO' chất pliytate, trong sổ này có 35 chùng có hoạt tính phytase đáng chú ý khi sàns lọc trẽn môi trường dịch thể [17].

K hả năng tăng sinlí của các chủng nấm

m en: với mục đích tuyên chọn các chủng nấm

men vừa có khả năng sinh phytase cao vừa có sinh khối lớn để bổ sung vào thức ăn chăn nuôi như một loại protein đon bào, 5 chùng nấm men đưọc nuôi cấy trên các môi trưòng dinh dưỡng dịch thể thu sinh khối Kết quả cho thấy các chùng nấm men sinh trưởng tốt nhất trên môi trường Hansen (chùng I 80, LM 17, BS9 đạt 7-8g/l), sau đó là môi trường YM và Tsang, trên 2 môi trưòng PDA và YDP các chủng nấm men sinh trường kém nhất.

Môi truòng dinh duõng Hình 2: Khả năng sinh trưỏng của 5 chủng nấm men trên môi trưòng dinh dưõng

K hả năng ch ịu m u ối m ật: Ket quả thí nghiệm

cho thấy 2 chủng LM17 và 180 không bị ảnh

hường nhiều bởi muối mật, vói nồng độ 1-9 %

chùng LM 17 và 180 vẫn đạt đến 1 o 10 CFU/ ml,

tuy nhiên ờ nồng độ 7-9% cà hai chủng này

đều có đường kính khuẩn lạc nhỏ bằng 1/3 so

vói khi nuôi cây ở nồng độ 0-5% Các chùng

81, BS9, 102 có chịu ảnh hưởng bởi muối mật

nhiều hon so với 180 và LM17, tuy nhiên vẫn

đạt 10SCFU/ ml.

K hả năng ch ịu en ixm e và p H đường tiêu

môi trường axit và kiềm, kết quả chủng 180

pepsin và 7 x l0 10 CFU/ml đối với trypsin; chủng L M 17 khi ủ trong pepsin thì số lưọne; tế bào chỉ đạt 107CFU/ml, còn mẫu ù với trypsin thì số lượng tế bào là 3 x l0 g Trong khi đó 3 chủng còn lại khả năng chịu enzyme tiêu hóa kém hơn hẳn hai chùng 180 và L M 17, đặc biệt chủng 81 chỉ còn lại 10: CFU/ml khi được ĨI với trvpsin.

Di tỉruyín hục vù ứ ng dụng - Cluirứn san Cóng nghệ sinh học S ổ 9 - 2014

100 Cam ìida blankii_\J45704

■ Saccharom ycopsìs selenospora_\J40099

Saccharom ycopsìs malangaJỊỎAQ 135

“ Saccharom ycopsis capsularis_U40082

C andida am apae U69880 Saccharom ycopsis crcitaegensis U40079

Wickerhamomvces ciferrii_ EF550339

y j Wìckerhamomyces s ydo w /or wm_EF5 50343 _[ Wickerhamomyces subpellicuỉosa EF550340 7g Wickerhamomyces ìynýerdii EF550342

Cancỉida so ja e_ u 71070

1BS9

10 0 1 Candida tropicalis U45749

Saccharom yce cerevisiae_A Y 048154

H ình 4: Vị trí phân loại của 5 chủng nấm men nghiên cứu và các loài có quan hệ họ

hàng gần dựa vào phân tích trình tự đoạn D1/D2 của ADNr 26S

J G enetics and Applications - Special Issue: Biolechnology ãnstiuie o f M icrobiology and Bioíechnology, Vietnam N ational University, Hanoi

Di Iru y ên h ọ c và í n iiỊ c/iing - Chuyên sa n Công n g h ệ sin h học S ố 9 - 2014

Cây phát sinh c lùm lĩ loại của 5 chủng nấm

men và 21 loài thuộc các chi Candida,

Saccharonĩycopsis, ỈVickerhamomyces được

xây dựng dựa vào trình tự đoạn D1/D2 của

rDNA 26S, Sacchciromyces cerevisiae được

dùng làm nhóm ngoài (Hình 4) Quan sát cây

phát sinh chủníỉ loại cho thay: cluìng 180 nằm

cùng vị trí với loài C andida blankii (trình tự

rDNA 26S đoạn D1/D2 tưong đồng 100%;

chủng 180, LM17, BS9 lần lượt thuộc loài

Candida blankii, Wickerhamomyces anomaỉus,

Candida tropicalis; hai chùng 102 và 81 cùng

thuộc loài Saccharom ycopsis fibuììgera.

Tính an toàn sinh học củ a các clĩiing nghiên

cứu: Meyer khi nghiên cứu một chủng

Candida blankii được phân lập bã mía cho

thấy chủng này có khả năng sinh enzyme thủy

phân hem icellulose khi nuôi cấy trên môi

trường nhân tạo với nguồn carbon tối thiểu

Ngoài ra, chủng c blankii này còn có tiềm

năng lớn trong việc sản xuất protein đon bào

nhò' khả năng đồng hoá được rất nhiều nguồn

carbon khác nhau trong quá trình sinh trường

sinh enzyme tliũy phân hemicellulose ở pH

thấp, nhiệt độ cao và hàm lượng protein cao

[15].

ÌVickerhamomyces anomalus thường có trong

bông hoặc các sản phẩm thực phẩm và ngũ

cốc w anomalus có khả năng phát triển trên

nhiều nguồn carbon tại pH thấp và dưó'i áp

suất thâm thấu cao và có rất ít hoặc không có

ôxy cho phép nó sinh sản trong nhiều loại môi

trường w anomaìus là một loại nấm men

rượu, 2Óp phần tạo mùi thơm của rượu thông

qua việc sản xuất các họp chất dễ bay hơi [19, 30].

Saccharoììiycopsis ỷìhuligera được coi là một

loại nấm men rượu, đóng vai trò đường lìóa tinh bột, nó phổ biến trong men khỏi động dùii" đê sản xuất các sản phàm lẻn men cồn truyền thống của các quốc gia châu Á Tlieo nghiên cứu cùa Kozaki và Uchimura trên men Budod của người Philipin thì thành phần vi

sinh vật gồm các loài Mucor circinelloides, M

grisecycmus, Rhizopus cohnii, Saccharom yces cerevisiae và Saccharom ycopsis ỷìbuligera,

trong đó Saccharom ycopsis ỷìbuligera là loài

chiếm ưu thể [30].

Ccmdida tropicaìis được xem là loài nấm men

gây bệnh phổ biến nhất cùa nhóm Candida non aìbicans Trong lịch sử y học, Candida

albicans là vi sinh vật chù yếu sảy ra bệnh

candidiasis ỏ' bệnh nhân suy giảm miễn dịch Tuy nhiên, những ca mắc bệnh candidiasis đã

tăng lên đáng kể trên toàn cầu do loài C andida

tropicaìis đã được công bố rằng đây là một

loài nấm men gây bệnh mới nổi [11] Còn theo

tác già Haas các chủng cùa loài C.tropìcalis

được biết đến là các loài gây bệnh cơ hội và

chi đứng sau c aỉbicans [5].

Hai chùng LM17 và 180 được chọn để nghiên cứu đặc tính phytase do chúng có ưu điểm hon các chủng còn lại như cho sinh khối cao, chịu được các điều kiện đường tiêu hóa và thuộc nhóm nấm men an toàn.

A nh hưởng của các y ế u tố đến h oạt động của

phytase hai chủng 180 và L M 17

- Nhiệt độ hoạt động tối iru: trong dải nhiệt

nghiên cứu 30-70°C, pliytase của 2 chùng

L M 17 và 180 hoạt động tốt trong khoảng 45-

5 0 °c Theo các kêt quà nshiên cứu cùa

Harnpicharnchai, phytase cùa Pichia pastoris

có nhiệt độ hoạt động tối ưu nằm trong khoảng

50-55°C [6] Trong khi phytase cũa Ccmdida

krusei WZ-001 hoạt động tối ưu ỏ' 4 0 ° c và bất

D i tr u y ề n h ọ c và ím g d ụ n g - ( 'huyên sa n ( 'ông n g h ệ sin h h ọ c Số 9 - 2014

K lebsiella sp no PG-2 lại lioạt độne tôi im ỏ'

37°c [27].

- p H hoại động tòi mi: giá trị pH tối ưu có ảnh

hưởng lớn đên tiêm năng ứng dụng cùa

dụng làm phụ gia thức ăn chăn nuôi do ảnh

hường tính axit trong ống tiêu hóa của động

vật Theo kết quả ỏ' hình 5b, plivtase của cả 2

chùng LM17 và i 80 hoạt động tối ưu trong

khoảng pH từ 4-5.5 và từ pH 6 phytase dần

-ầ?

LM 17 180

30 35 37 40 45 50 60 70

Nhiệt độ (°C)

giảm hoạt tính Trong nsỉhiẽn cửu của Harnpicharnchai, phvtase có pH tối ưu ỏ' 2 điẻin pH là 3 và 5.5 [6] Gulati đã công bố

phytase cùa chùng Bacillus ỉaevolaclicus có

pH hoạt động tối ưu là pH 7, ỏ' pH 3 hoạt tính vẫn giữ được trên 20% và hoạt tính phytase cũng bắt đầu giảm dần khi pH trên 7 [4] Theo một nghiên cứu mới đây của Moushree,

phytase cùa chùng Shigella sp CD2 có pH

hoạt động tối ưu là 5,5 [16].

Hình 5: Nhiệt độ (a) và pH (b) hoạt động

-Tỉnh bền nhiệt cùa enzyme: sau khi ủ phytase

ở dải nhiệt độ 50-80°C trong khoảng thòi gian

5-30 phút, kết quả ở hình 6 cho thấy, phytase

cùa chùntỉ LM17 bền nhiệt ở 50°c sau 30 phút

xử lý, hoạt tính vẫn giữ được trên 60% Ở 60,

70 và 80°c hoạt tính gần như mất hoàn toàn

sau 30 phút Phytase của chùng 180 bền nhiệt

ờ 60°c sau 30 phút xử lý, hoạt tính vẫn giữ

(b)

tố i ưu của p h ytase 2 ch ủ n g L M 17 v à 180

tính chỉ còn dưới 20% sau 30 phút Trong nghiên cứu của Farhat, phytase cùa chùng

Bacilìus subtiỉis u s 417 bền ở 50°c sau 30 phút xử lý, tuy nhiên hoạt tính chi còn 22% sau 10 phút xử lý ỏ' 60°c [1] Phytase cùa

Aspergillus /um igatus có tính bền nhiệt cao,

sau khi bị biến tính ỏ' 90°c đã hồi tính trờ lại

và giữ nguyên hoạt tính [8].

J G enetics and Applications - Special Issue: Biolechnology ỉnslilute o f M icrobiology and Biotechnoìogy, Vieínam National University, H anoi

32

D i tr u y ề n h ọ c v à ứ n g d ụ n g - C h u y ê n sa n C ô n g n g h ệ sin h h ọ c SỔ 9 - 2014

1 2 0

ổb

D i tr u y ề n h ọ c và ứ n g d ụ n g - C h u y ê n sa n C ô n g n g h ệ sin h h ọ c Số 9 - 2014

20% hoạt tính, phytase chủng LM 17 sần như

mất hoàn toàn hoạt tính Tại pH 9 phytase

chủng 1 80 bền sau 30 phút xử lý, hoạt tính còn

70%, chùng LM 17 sau 30 phút chi còn 30%

hoạt tính Sự khác nhau khi xử lý ỏ' hai pH 8

và 9 có thê do dùng các loại đệm khác nhau.

Anh hường cua ion kim loại: sự có mặt cùa ion

Na+ và EDTA làm tăng nhẹ hoạt tính phytase ỏ'

cả 2 chủng LM17 và 180 Hiện tượng EDTA

không những không làm giảm hoạt tính

phytase mà còn làm tăng nhẹ có thể do EDTA

làm kết tủa một số tác nhân ức chế hoạt động

của enzvine Sự có mặt của SDS làm mất hoàn

toàn hoạt tính cùa enzym e phytase ỏ' cả 2

chủng LM17 và 180 Sự có mặt cua các ion

K , CaÍT, Cu2\Z n 2+, Mg :+, Mn ", Ba : làm giảm một phần lioạt tính phytase cùa 2 chủng

LM 17 và 180 Moushree cũng đã nghiên cứu ảnh hường của các ion kim loại lên hoạt động

của pliytase của chủng Slìigella sp CD2 và

Shigella sp CD2 không hoàn toàn đòi hỏi sự

có mặt của các ion kim loại [16] Trong khi

— và 0.2mg/ml (LM 17) trong pH 8

Hình 10: Ảnh hưỏng của enzyme tiêu hóa đến hoạt động của phytase 2 chủng

LM 17 và 180.

Anh hường cùa enzym e v à p H đường tiêu hỏa\ pepsin (0,2 mg/ml) pH 2 và trypsin (0,2

34

J G enetics and Applications - Special Issue: Biotechnology Insiitute o f M icrobiology and Biotechnoìogy, Vietnam National University, H anoi

D i tr u y ề n học v à ứ níỊ d ụ n g ( 'h u yên sa n C ô n g n g h ệ s in h h ọ c S ổ 9 - 2014

vân giữ nsuyẻn được hoạt tính Thực hiện thí

iìiíhiệm tiẻp với phytase chùng 180 ỏ' nồng độ

pepsin và trvpsin cao hơn vói pepsin 1 mg/ml

sau 30 phút ủ phytase vẫn giữ được trên 70%

hoạt tính, với trypsin 1 mg/ml trong 30 phút ủ

hoạt tính chi còn dirói 20% Ớ các loại phytase

khác nhau thì kliả năng kháng các enzyme

thủy phàn protein Iilur pancreatic và pepsin là

khác nhau Phillippy cho rằng các pliytase

trong lúa mỳ còn 70% hoạt tính khi ủ với

pepsin, trong khi phytase cùa A niger vẫn giữ

được 95% hoạt tính ban đầu [20] lebasan và

cs (20 00 ) đã côrm bố phytase của E coli

không mẫn cảm vói pepsin và pancretine [8].

KẾT LUẬN

Năm chùng nấm men sinh phytase cao

được lựa chọn từ 418 chủng thuộc bộ giống

nấm men cùa VTCC bằng các phương pháp

sàng lọc trên đĩa thạch, trên môi trường xốp và

dịch thề Dựa vào đặc điểm hình thái và so

sánh trình tự đoạn D1/D2 cùa ADNr 26S, các

C andida balnkii, Wickerhamomyces anomaỉus

và C andida tropicalis, hai chủng 81 và 102

cùng thuộc loài Sacchrom yces fihuìigera Hai

chủng 180 và LM17 cho sinh khổi cao, chịu

được muối mật, enzym e và pH đường tiêu hóa

tốt hơn các chủng còn lại Phytase của cả hai

chủng này hoạt động tối ưu ờ 4 5 °c , pH 5,5

Phytase chùng ] 80 duy trì trên 90% hoạt tính

sau 30 phút ủ ở 60°c, trong khi phytase chủng

LM 17 chỉ còn 60% hoạt tính khi ù ở 50°c

trong cùng thời gian trên Phytase chùng LM

17 bền ờ pH 3 và 4, chùng 180 bền ở pH 9 Sự

có mặt của Na4 và EDTA ờ nồng độ 5 mM

làm tăng nhẹ hoạt tính cùa 2 chủng LM 17 và

180, trong khi SDS làm mất hoàn toàn hoạt

tính phvtase Pliytase cùa chủng 180 bền với

pepsin (lm g/m l) sau thời gian ủ 30 phút,

chùng LM 17 hoạt tính bị giảm mạnh với

pepsin và trypsin ( 0,2 mg/ml).

1 Farhat A Chouayekh H., Mounira B Boucliaala K., Bejar s (2008) Gene cloning and cliaracterization o f a

suhnlis U S4I7 and assessment o f its

Ị3otentialas a f e e d a d d i t i v e in

40(2): 127-135

Carvalho J c., Karp S.G., Stunn w ,

fermentation Bioresource Technology

11 8 :6 03 -60 6

3 Greiner R and Konietzny u (2010) Phytases: Biochemistry, enzymo!ogy and characteristics relevant to animal

feed use In Enzymes in farm animai

nutrition, 2nd edition, edit by Bedford

M.R and Partridge G.G MPG Books Group, Bodmin, UK: 96-128

4 Gulati H.K., Chadha B.S., Saini H s.

ỉaevolacticus isolated from

rhizosphere soil J Ind M icrobiol

Biotechnol 34:91-98

M.A.G (1990) Development o f an

tropicaìis Journaì o f Bacterioỉogy-

4571-4577

6 Hampicharnchai p., Somlake w.,

Tanapongpipat s (2010) Cell-surface

phytase on Pichia p asloris cell wall

supplement FEMS M icrobiol Lett

302: 8-14

R., Salleh M.H., Ismail A.F (2007), Phytate-degradino enzyme production

by bacteria isolated from Malaysian

soil Worỉd J M icrobioì Biotechnoỉ

23:1653-1660

D i tr u y ề n h ọ c v à ứ n íỉ d ụ n g - ( 'huyên sa n C ô n g n g h ệ sin h h ọ c Số 9 - 2 0 / 4

properties o f phytases from various

microbial origins Archives ()f Aiiimal

Nutrition 53(4): 353-373

Marschner p., Greiner R., Fernandez

M.T., Romero D., Blackburn D.M.,

Mora M de la L (2010) Identi0cation

o f (3-propeller phytase-encoding genes

Baciììus spp from the rhizospliere o f

pasture plants on volcanic soils FEMS

M icrobiol E col 75: 163-172

10 Kimura M (1980) A simple method

for estimating evolutionary rate o f

seq u en ce / Mtìl Evol., 16: I 11-120.

1 1 Kothavade R.J., Kura M.M., Valand

Candida tropicalis: its prevalence,

resistance to f!uconazole JournaI o f

M edical M icrobiology (59): 873-880

112 Kurtzman C.P., Robnnet C.J (1998),

ascom ycetous yeasts from analysis o f

nuclear large subunit (26S) ribosomal

DNA partial sequences Antoniẹ van

Leeuwenhoek 67: 151-171

113 Lambrechts c , Boze H., Segueilha L.,

Moulin G and Galzy p (1993)

Iníluence o f culture conditions on the

ìaboralory manuaỉ Coìd Sprìng

tìa rb o r laboratory: C oìd Spring

H arbor ”, N ew York U.S.A 187-209.

115 Meyer P.S., Du Preez J c., Kilian S.G

C andida bìankii on sugar cane bagasse

hem icellulose liydrolysate Biotechnol

Bioeng 40(3): 353-8

116 Moushree P.R., Madhumita p„ Kamal

K s và Shilpi G (2012) Puriíìcation,

phytase from Shigella sp CD2 India

ịournaỉ Biochem istry & Biophysics

18 Pandey A., Szakacs G., Soccol C.R.,

(2001) Production, puriíication and

Bioresource Technology 77: 203-214

19 Passoth V., Predlund E., Druvefors

anomaìa FEMS Yeast Research 6:3-

13

gastrointestinal enzymes Journaỉ o f

A griculture and F ood Chemistry

47(4): 1385-8

21 Quan C.S., Difan s , Zhang L.H.,

phytase from Ccmdida krusei W Z-001

Journal o f Bioscience and Bioenginering 94(5): 419-425

22 Ragon M., Aumelas A., Chemardin p.,

Galvez s., Moulin G., Boze H (2008)

Complete hydrolysis o f myo-inositol hexakisphosphate by a novel phytase

from D ebaryom yces casteỉlii CBS

Research Vol 2011, ópages

25 Saitou N and Nei M (1987) The

phylogenetic trees Mol Biol Evol., 4:

406-425.

26 Sakharkar K.R and Sakharkar M.K (2009) Yeast Genomics for Bread, Beer, Biologv, Bucks and Breath In

Yeasí Bìotechnoìogy: D iversity and

J Genetics and Applications - Special Issue: Biotechnology ũnsiitute o f M icrobiology and Bioíechnoìogy, Vietnam N ational University, Hanoi

D i tru y ề n h ọ c và ỉ/77" d ụ n g - C h u y ê n sa n C ô n g n g h ệ sin h h ọ c S ố 9 - 201 4

A pplications edit by Satyanaravana

T„ Kunze G Springer Science +

Business Media B.V.: 473-489

27 Sliah V and Parekh L.J (1990)

Phytase froin K ìebsieìla sp 110 PG-2:

puriíication and properties ỉnd J

Biochem Biophys 27: 98-102

Bacilìus subtilis (natto) N-77 Biosci

Biotechnoì Biochem 56: 1266-1269.

29 Staden V.J., Haan D.R Willem H

van z , Botha A & Bloom V.M

C ryptococcus ìaureníii ABO 510

FEMS Yeasl Res 7: 442-448

Yeasts Diversity in Fermented Foods

B iotecỉm oỉogy: D iversity and

Applications edit by Satyanarayana

T., Kunze G Springer Science +

Business Media B.V.: 170-193

31 Thành V N (2009) Khai thác và phát

triên nguồn gen Vi sinh vật Công

nghiệp Thực phẩm Báo cáo tổng kết

nhiệm vụ khoa học công nghệ khoa

học thường xuyên, Bộ Công nghiệp,

Viện Công nghiệp Thực phâm.

32 Thuy T.T., Mamo G., Mattiasson B

thermostable phvtase from Baciììus sp

MD2: cloning, expression and

iiigh-Lòi cảm 0'n

!evel production in E scherichia Ctìli ./

IndM icrobiol Bioteclniol 37: 279-287

phytate utilization in Candida species

M ycopathologia 172:473-479

34 Volira A., Satyanarayana T (2001)

Phytase prođuction by the yeast Pichia

anomala Biotecỉviology Letters 23:

551-554

35 Volira A Satyanarayana T (2003)

production puriíĩcation, and potential

C rìticaì Reviews in Biotechnology

23(1): 29-60

36 Yarrow D (1998), "Methods for

iso la tio n , m ain ten an ce and

identification of yeasts”, in The

Yeasts, a Taxonomic Study, 4th ed ed

by Kurztman c p and Fell J w.,

Elsevier Science Publ., Amsterdam, 77-100.

37 Yoon S.J„ Choi Y.J„ Ki M.H., Kwang C.K., Wook K J„ Cheol L.C., Hoo

J.Y (1996) Isolation and identiíication

EìUerobacíerium sp 4 and, enzymatic

propertics o f phytase enzyme Em ym e

M icrobiaì Technology 18(6): 449-454

38 Zhu w., Qiao D., Huang M., Yang G.,

Xu H„ Cao Y (2010) M odiẶing

Escherichia coìi Curr M icrobiol 61:

267-273

*Công trình được hỗ trợ kinh phí từ đề tài: “Sàng lọc và nghiên cứu enzym ph ytase có khả năng thủy

phân hoàn toàn 6 gốc ph otph at từ nấm men nham ứng dụng trong chăn nuôi'"- QG 12.23.

*Ngưò'i thẩm định: GS.TS Phạm Văn Ty

S u m m ary

S E L E C T IN G A N D S T U D Y IN G O N P H Y T A S E -P R O D Ư C IN G Y E A S T ST R A IN S

R E M A IN E D IN V IE T N A M T Y P E C Ư LTƯ R E C O L L E C T IO N

Tran Thi Le Q uyen1, Luu Thi N goe2, Dao Thi Luong1

'institute o f Microoreanism and Biotechnology, VNU

:Hanoi Open University

Five high plivtase-produciníĩ yeast strains were selected from 418 ones o f VTCC bv screening

Di truyền ĨỌC vờ //7 7" dụng - Chuyên san c 'ỏng nghệ sinh học S ố 9 - 2 01 4

tropìcalis Vickerhamomvces anomalus, respectively; two strains 81 and 102 belong to the same

species Sacchromyces fìb u lig era Tvvo strains 180 and L M 1 7 show liig h biomass, s ta b ility w ith bile

salt pH ard digestive enzym es better than the others Both phytase o f tliese strains shown liighest activity at - 5 ° c and pH 5.5 Phvtase 1 80 retained about 90% activity after 30 min incubation at 60°c,

while phvtíse LM 17 liad only 60% activity at 5 0 °c for 30 min incubation Pliytase LM 17, 180 were stable at pH 3-4; pH 9, respectively The enzymes vvere stimulated by Na+, EDTA at 5mM; pliytases activity wai almost lost in the presence ot'SDS Phvtase 180 lias a strong ability to resist the pepsin hydrolysis 1 mg/ml) after 30 min incubation, phytase LM 17 vvas significantly reduced with pepsin and trjpsin at concentration o f 0.2 mg/ml.

Key words phytase, activity, yeast, screen

J G enetics and Applications - Special Issue: Biotechnology Instiute o f M icrobiology and Bioíechnoìogy, Vietnam National University, H anoi

'* ^3ok^Sj £yi Ií^i> c3 '^ _^Ta ^ • ;

SÀNG LỌC VÀ NGHIÊN c ứ u CÁC CHỦNG NẤM MEN SINH

PHYTASE TỪ CÁC BỘ GIỐNG NẤM MEN L ư u GIỮ TẠI BẢO TÀNG GIÓNG CHUẨN VI SINH VẬT (VTCC) NHẰM ỨNG DỤNG

TRONG SẢN XUẤT THỨC ĂN CHĂN NUÔI

G iáo viên hướng đẫn

S in h viêH th ự c h iện

L ớ p

: T S Đ ào Thị L ương

T h s Trần T h ị Lệ Quyên : Lưu Thị N gọc

: 10.04 K 17

ĐẠI p ọ c QUỐC GIA HÀ NÔI CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIÊT n a m

ƯỜN ị G đ a h ọ c k h o a h ọ c t ự n h i ê n Đ ộc lập - Tự do - Hanh phúc

Hà Nội, ngày Ả-2, tháng M năm 2010

Q U Y Ế T Đ ỊN H

Về việc C(ng n h ận đề tài luận án và cán bộ hướng dẫn nghiên cứu sinh n ă m 2010

H Ệ U T R Ư Ở N G TRƯ Ờ N G ĐẠI H Ọ C K H O A H Ọ C T ự N H IÊN

- Căn cứ Quy định về tổ chức và hoạt động của Đại học Quốc gia Hà Nôi được ban hoih theo Quyết định số 600/TCCB ngày 01/10/2001 của Giám đốc Đai hoc Quốc gia Hà Nội;

Can (ữ Quy chê đao tạo sau đai học ở Đai hoc Quốc gia Hà Nôi đưo'c bàn hành theo Quyết định ố 3810/KHCN ngày 10/10/2007 của Giám đốc Đại học Quốc giã Hà Nội;

- Can cư Quyêt đinh sô 2048/QĐ-SĐH ngày 9/7/2010 của Giám đốc Đại học Quốc gia

Hà N^™ ê vi;c CÔng nh^n nghlên cứu sin!l nãm 2 0 1 0 của Trường Đại học Khoa học Tự nhiên

- Theo tề nghị của: Trưởng phòng Sau đại học và Chủ nhiệm Khoa Sinh học,

Q U Y Ế T Đ ỊN H :

Điều 1 Côig nhận đề tài luận án tiến sĩ và người hướng dẫn của nghiên cứu sinh

T rín Thị Lệ Quyên, như sau:

Têi đề tài: Nghiên cứu và sản xuất thử nghiêm enzym phytasc chịu nhiệt

Khói học: 2010 - 2013 (Thời gian đào tạo chuẩn)

H ìnl thức đào tạo: Không tập trung

>iều 2 Ngưri hướng dẫn nghiên cún sinh có nhiệm vụ và quyền lợi ghi trong

Q u y :h ếĐ à o tạo sau đại học hiện hành

Ịiều 3 Các ong (bà): Trưởng phòng Sau đại học, Chủ nhiệm Khoa Sinh học, Thủ trưởng

cấc đơn vị liên quan, nghiên cứu sinh và người hướng dẫn có tên trong Điều 1 chịu

tráchnhiệm thi hành Quyết định này./

KT HIỆU TRƯỞNG HIỆU TRƯỞNG /V -

PHỤ LỤC 2

THUYẾT MINH-HỢP ĐỒNG

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI VĨỆN VI SỈNH VẬT VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

THUYẾT MINH ĐỀ CƯƠNG ĐÊ TÀI NGHIÊN c ứ u KHOA HỌC

THỦY PH Â N HOÀN TOÀN 6 GÓC PHOTPHAT TỪ NÁM MEN

NHẰM ỨNG DỤNG TRONG CHĂN NUÔI

M ã số

Chủ trì đề tài: NCS Trần Thị L ệ Q uvên

Hà Nội, 2012

THƯYÉT MINH ĐÈ CƯƠNG ĐÈ TÀI NGHIÊN c ử u

3 - M ụ c ti*u và sảo p hẩm d ự kiến của đề tài

3.JLMục têu ( Bám sát và cụ thế hóa định hướng mục tiêu theo đặt hàng - nếu có )

- Tuyên clọn được 1 bộ nấm men có khả năng sinh enzyme phytase ngoại bào thủy phân

hoàn toàn » gốc photphat

- Tm h sạcl và nghiên cứu các đặc điểm của phytase ngoại bào sinh ra từ bộ nấm men lựa chọn

3.2 Sản Ịhẩm (Ghi tóm tắt tên các sản phẩm nêu ở mục 12 và III - 21,22,23,24,25,26)

- Tìm đượ< 1 bộ nấm men sinh phytase có khả năng thủy phân được 6 gốc photphat đầu tiên

ờ Việt Nan và có tiềm năng ứng dụng trong chăn nuôi

- Quy trìnl tách chiết, tinh sạch và xác định trọng lượng phân tò của phytase lựa chọn

- Quy trìnl lên men và thu hồi phytase ở quy mô 5-10 lít hoặc kilogram

- 0 2 bài bát đăng trên tạp chí chuyên ngành

4 - T h òi gan thực hiện: 24 tháng