Nghiên cứu quy trình chế tạo và đánh giá hiệu quả tác động của hệ nano đa chức năng (polymer drug fe3o4 folate) lên tế bào ung thư

Để khắc phục những nhược Ďiểm của phương pháp nêu trên, các nhà nghiên cứu Ďã ứng dụng công nghệ nano, sử dụng vật liệu với kích thước nano mét làm phương tiện dẫn các loại thuốc Ďặc trị

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

LÊ THỊ THU HƯƠNG

NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO VÀ ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ TÁC ĐỘNG CỦA HỆ NANO ĐA CHỨC NĂNG

LUẬN ÁN TIẾN SỸ KHOA HỌC VẬT LIỆU

HÀ NỘI – 2018

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NA HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

LÊ THỊ THU HƯƠNG

NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO VÀ ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ TÁC ĐỘNG CỦA HỆ NANO ĐA CHỨC NĂNG (POLYMER-DRUG- Fe3O4-FOLATE) LÊN TẾ BÀO UNG THƯ

LUẬN ÁN TIẾN SỸ KHOA HỌC VẬT LIỆU

Chuyên ngành: Vật liệu điện tử

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam Ďoan Ďây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của TS Hà Phương Thư và GS.TSKH Nguyễn Xuân Phúc và không trùng lặp với bất kỳ công trình khoa học nào khác Các số liệu và kết quả nghiên cứu nêu trong luận án là trung thực, Ďược các Ďồng tác giả cho phép sử dụng và chưa Ďược sử dụng Ďể bảo vệ một học vị nào, chưa từng Ďược công bố trong bất kỳ một công trình nào khác

Hà Nội, tháng năm 2018

Tác giả luận án

Lê Thị Thu Hương

Xin chân thành cảm ơn Ban lãnh Ďạo Khoa Khoa học vật liệu và năng lượng - Học viện Khoa học và Công nghệ và Phòng Vật liệu Nano Y sinh, Phòng thí nghiệm trọng Ďiểm - Viện Khoa học Vật liệu, Viện Hàn làm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Ďã tạo Ďiều kiện thuận lợi về cơ sở vật chất cho tôi trong suốt quá trình thí nghiệm và Ďóng góp các ý kiến về chuyên môn trong suốt quá trình thực hiện và bảo vệ Luận án

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám Ďốc, BCN Khoa Môi trường và tập thể

Bộ môn Hoá học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Ďã tạo Ďiều kiện và giúp Ďỡ tôi trong quá trình công tác Ďể tôi hoàn thành luận án này

Xin cảm ơn Ban lãnh Ďạo và bộ phận Đào tạo Viện Khoa học Vật liệu Ďã hỗ trợ tôi hoàn thành các học phần của luận án và mọi thủ tục cần thiết khác trong quá trình thực hiện luận án

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc Ďến gia Ďình, Ďã luôn chia sẻ, Ďộng viên tinh thần và là nguồn cổ vũ, giúp Ďỡ tôi vượt qua mọi khó khăn trong suốt quá trình thực hiện Luận án

Hà nội, ngày tháng năm 2018

Nghiên cứu sinh

Lê Thị Thu Hương

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT v

DANH MỤC CÁC BẢNG viii

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ x

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 4

1.1 Khái quát về hệ vật liệu nano y sinh 4

1.1.1 Cấu trúc của hệ nano y sinh 4

1.1.2 Các chức năng y sinh của hệ 6

1.2 Phương pháp tổng hợp hạt nano Fe3O4 7

1.2.1 Phương pháp Ďồng kết tủa 7

1.2.2 Phương pháp thuỷ nhiệt 9

1.2.3 Phương pháp phân huỷ nhiệt 9

1.2.4 Sử dụng kĩ thuật vi sóng trong tổng hợp Fe3O4 10

1.3 Tính chất và ứng dụng của hạt nano Fe3O4 trong y sinh học 11

1.3.1 Một số tính chất từ cơ bản của hạt nano oxit sắt từ Fe3O4 11

1.3.2 Mang thuốc hướng Ďích 13

1.3.3 Nhiệt trị và phóng thích thuốc dựa trên hiệu ứng Ďốt nóng cảm ứng từ 15 1.3.4 Tăng cường Ďộ tương phản ảnh cộng hưởng từ hạt nhân 18

1.3.5 Hệ nano Ďa chức năng 20

1.4 Vấn Ďề của hạt nano oxit sắt từ cho các ứng dụng y sinh 23

1.5 Chức năng hoá bề mặt hạt Fe3O4 25

1.5.1 Bền hoá hạt nano Fe3O4 bằng polime tổng hợp 25

1.5.2 Bền hoá hạt nano Fe3O4 bằng polime tự nhiên 26

1.5.3 Kết hợp các thuốc chống ung thư 29

1.5.4 Yếu tố hướng Ďích folate 31

Kết luận chương 1 33

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34

2.1 Tổng hợp vật liệu 34

2.1.1 Nguyên vật liệu 34

2.1.2 Tổng hợp hạt nano oxit sắt từ bằng phương pháp Ďồng kết tủa 34

2.1.3 Tổng hợp hạt nano Fe3O4 theo phương pháp Ďồng kết tủa sử dụng kĩ

thuật vi sóng 34

2.1.4 Bọc hạt nano Fe3O4 bằng polime sinh học 36

2.1.5 Mang thuốc Curcumin và Doxorubicin lên hệ 36

2.1.6 Gắn yếu tố hướng Ďích folate 37

2.1.7 Kết hợp chấm lượng tử CdTe 38

2.2 Các phương pháp Ďặc trưng tính chất của hệ 39

2.2.1 Nhiễu xạ tia X 39

2.2.2 Phổ hấp thụ hồng ngoại 40

2.2.3 Phổ UV-Vis và huỳnh quang 40

2.2.4 Phân tích nhiệt 41

2.2.5 Hiển vi Ďiện tử 42

2.2.6 Các phương pháp Ďo từ 42

2.2.7 Phổ tán xạ ánh sáng Ďộng 42

2.2.8 Đốt nóng cảm ứng từ 43

2.2.9 Xác Ďịnh hiệu suất và dung lượng mang thuốc 43

2.2.10 Quá trình giải phóng thuốc in vitro 43

2.2.11 Giải phóng thuốc bằng Ďốt nóng cảm ứng 44

2.3 Thử nghiệm sinh học 44

2.3.1 Thử nghiệm khả năng nhập bào và Ďộc tính tế bào của FOC và FOCF 44 2.3.2 Xác Ďịnh phân bố của hệ nano mang curcumin tại các cơ quan trên chuột 45

2.3.3 Xác Ďịnh Ďộc tính tế bào của FAD, FADF, FAQ và FADQ 46

2.3.4 Thí nghiệm xác Ďịnh khả năng Ďiều trị in vivo của các hệ Ďa chức năng mang Dox kết hợp với Ďốt nóng cảm ứng từ 46

2.4 Phương pháp xử lí số liệu 48

CHƯƠNG 3: HẠT NANO Fe3O4 BỌC BẰNG OCMCS MANG CURCUMIN 49

3.1 Tổng hợp hạt nano Fe3O4 49

3.1.1 Hạt nano Fe3O4 tổng hợp theo phương pháp Ďồng kết tủa thông thường 49

3.1.2 Hạt nano Fe3O4 tổng hợp theo phương pháp Ďồng kết tủa có hỗ trợ của vi sóng 50

3.2 Ảnh hưởng của hàm lượng curcumin lên tính chất các hệ mang Curcumin

(FOC1-FOC5) 55

3.3 Hệ nano mang curcumin (FOC) và mang Curcumin gắn folate (FOCF) 57

3.3.1 Phổ hồng ngoại 57

3.3.2 Phổ huỳnh quang 58

3.3.3 Ảnh hiển vi Ďiện tử quét (FeSEM) 59

3.3.4 Phân tích nhiệt 60

3.3.5 Giản Ďồ nhiễu xạ tia X và Ďường cong từ trễ 61

3.3.6 Kết quả Ďốt nóng cảm ứng từ 62

3.3.7 Độ bền của FOC và FOCF trong môi trường sinh lí 64

3.3.8 Quá trình giải phóng thuốc in vitro 64

3.3.9 Độc tính tế bào 66

3.3.10 Phân bố sinh học 68

Kết luận chương 3: 71

CHƯƠNG 4: HẠT NANO Fe3O4 BỌC BẰNG ALGINATE MANG DOXORUBICIN 72

4.1 Ảnh hưởng của nồng Ďộ alginate Ďến khả năng mang Dox và các tính chất của hệ nano 72

4.1.1 Phổ hồng ngoại và phổ huỳnh quang 72

4.1.2 Dung lượng thuốc và hiệu suất mang thuốc 73

4.1.3 Phân bố kích thước và ảnh TEM 74

4.1.4 Giản Ďồ nhiễu xạ tia X và Ďường cong từ trễ 76

4.1.5 Kết quả Ďốt nóng cảm ứng từ 77

4.1.6 Phân tích nhiệt 80

4.1.7 Quá trình giải phóng thuốc in vitro 81

4.1.8 Độc tính tế bào 83

4.2 Ảnh hưởng của lõi Fe3O4 tổng hợp vi sóng tới tính chất hệ nano 86

4.2.1 Một số Ďặc trưng vật liệu và kết quả Ďốt nóng cảm ứng từ 86

4.2.2 Độc tính tế bào 88

4.3 Hệ nano mang Dox gắn folate (FADF) hoặc CdTe (FADQ) 88

4.3.1 Phổ hồng ngoại 89

4.3.2 Phổ huỳnh quang 89

4.3.3 Kích thước hạt và thế Zeta 91

4.3.4 Giản Ďồ XRD 91

4.3.5 Tính chất từ và khả năng Ďốt nóng cảm ứng 92

4.3.6 Quá trình giải phóng Dox thụ Ďộng và chủ Ďộng nhờ hiệu ứng Ďốt nóng cảm ứng 93

4.3.7 Độc tính tế bào 96

4.3.8 Độ bền của FAD, FADF và FADQ trong môi trường sinh lí 99

4.3.9 Kết quả thử nghiệm in vivo 100

Kết luận chương 4 105

KẾT LUẬN 107

NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN 109

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH SỬ DỤNG TRONG LUẬN ÁN 110

Tài liệu tham khảo 112

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DTA (differential thermal gravity analysis): phân tích nhiệt vi sai

EPR (enhanced permeability and retention effect):

Hiệu ứng tăng tính thấm và thời gian lưu

nồng Ďộ 4 mg/ml

nhau mang doxorubicin

nhau

nồng Ďộ 4 mg/ml mang doxorubicin

nồng Ďộ 4 mg/ml mang doxorubicin gắn folate

nồng Ďộ 4 mg/ml mang doxorubicin gắn CdTe FeSEM (field emission Scanning electron mỉctoscopy):

hiển vi Ďiện tử quét phát xạ trường

lượng curcumin tham gia phản ứng là 60 mg

lượng curcumin tham gia phản ứng khác nhau (từ 20-100 mg)

FOCF: Fe3O4 bọc bằng OCMCS mang curcumin gắn

folate (với lượng curcumin tham gia phản ứng là

MIH (magnetic inductive heating): Ďốt nóng cảm ứng từ

MRI (magnetic resonance image): ảnh cộng hưởng từ

SAR (specific absorption rate): tốc Ďộ hấp thụ riêng

TEM (transmission electron microscopy):

hiển vi Ďiện tử truyền qua TGA (thermal gravity analysis): phân tích nhiệt

VSM (vibration sample magnetometry):

từ kế mẫu rung

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Điều kiện thực nghiệm chế tạo Fe3O4 trong lò vi sóng 35

Bảng 2.2: Kí hiệu và mô tả mẫu 38

Bảng 3.1: Điều kiện phản ứng và thông số từ của các mẫu Fe3O4 tổng hợp bằng kĩ thuật vi sóng 51

Bảng 3.2: Kết quả khảo sát hàm lượng curcumin 55

Bảng 3.3: Số liệu từ Ďộ bão hoà của lõi Fe3O4 trong 2 hệ nano mang curcumin 62

Bảng 3.4: Thông số Ďốt nóng cảm ứng của các mẫu mang curcumin 63

Bảng 3.5: Thế Zeta (mV) của FOC và FOCF trong các dung dịch nồng Ďộ NaCl 0,2 M và có pH khác nhau 64

Bảng 3.6: Kết quả giải phóng curcumin theo thời gian 65

Bảng 4.1: Giá trị EE và LC của FA2D-FA10D 74

Bảng 4.2: Các thông số từ của các mẫu bọc bằng alginate 77

Bảng 4.3: Số liệu Ďốt nóng cảm ứng từ của các mẫu FA4, FA4D, FA8 và Fe3O4 79

Bảng 4.4: Từ Ďộ bão hoà của lõi Fe3O4 trong hệ FA4 và FA4D 80

Bảng 4.5: %Dox giải phóng từ FA4 ở pH 7,4 và pH 5 82

Bảng 4.6: Nhiệt Ďộ bão hoà (oC) trong quá trình Ďốt nóng cảm ứng từ của FA và FAD 87

Bảng 4.7: IC50 của hệ mẫu vi sóng so với mẫu Ďồng kết tủa thông thường 88

Bảng 4.8: Tính chất từ và nhiệt Ďộ bão hoà của quá trình Ďốt nóng cảm ứng của FAD, FADF, FAQ, FADQ 92

Bảng 4.9: Thông số giải phóng Dox khi Ďốt nóng với từ trường khác nhau 95

Bảng 4.10: Chỉ số tế bào sống sót (CS% ± SD) của các mẫu chứa CdTe trên các dòng tế bào tại nồng Ďộ khác nhau 97

Bảng 4.11: Giá trị IC50 (µg/ml) của các mẫu chứa CdTe trên các dòng tế bào 98

Bảng 4.12: Thế Zeta (mV) của FAD, FADF và FADQ trong dung dịch có nồng Ďộ NaCl 0,2 M và các pH khác nhau 99Bảng 4.13: Phân bố Fe trên các cơ quan của chuột (ppm) 101

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1: Sơ Ďồ cấu tạo hệ nano Ďa chức năng [21] 5

Hình 1.2: Cấu trúc Ďơn và Ďa Ďômen của hạt Fe3O4 theo kích thước (a) và Ďường cong từ hoá của vật liệu sắt từ dạng khối (hình lớn) so với dạng siêu thuận từ (hình nhỏ) (b) [62] 12

Hình 1.3: Sơ Ďồ minh họa cơ chế hướng Ďích bằng từ trường ngoài [62] 14

Hình 1.4: Nồng Ďộ hạt từ ở khối u và mô lành trong não của chuột Ďược hướng Ďích bằng từ (n=4) và chuột Ďối chứng (n=3) [72] 15

Hình 1.5: Chuyển Ďộng quay trong hồi phục Néel (a) momen từ quay trong khi hạt cố Ďịnh; hồi phục Brown (b) momen từ tương ứng với trục tinh thể, không Ďổi khi hạt quay [79] 16

Hình 1.6: (a) Sự tăng nhiệt Ďộ theo thời gian của hệ hạt nano từ 20 mg/ml mang TMX trong từ trường 230 kHz, 100 Oe (b) Phóng thích thuốc TMX chủ Ďộng bằng cách bật và tắt từ trường ngoài (c) Sơ Ďồ minh hoạ quá trình phóng thích thuốc nhờ áp từ trường xoay chiều [83] 18

Hình 1.7: Nguyên tắc chụp ảnh cộng hưởng từ [90] 19

Hình 1.8: Ảnh MRI chụp ở chế Ďộ T2 (TE=150 ms) các ống 5-mm với nồng Ďộ hạt từ bọc mantol khác nhau [93] 20

Hình 1.9: Ảnh MRI của khối u KB trên chuột nude trước (a, c) và 4h sau khi tiêm hạt từ (b, d) [95] 20

Hình 1.10: Hiệu ứng Ďốt nóng cảm ứng của hệ Fe3O4/SiO2 5 mg/ml và Ďồ thị SAR -Tmax theo cường Ďộ từ trường [97] 21

Hình 1.11: Ảnh MR theo nồng Ďộ của hạt nano Fe3O4/BSA–DEX–FA (chế Ďộ chụp TR¼ 3000 ms, TE¼ 13,2 ms)[99] 21

Hình 1.12: Phân tích ảnh hiển vi huỳnh quang của mẫu Rh123 và PAAIO-Rh123-FA-PEG với nồng Ďộ 100mg/mL nhập bào vào tế bào FR(+) KB theo các thời gian khác nhau ở 37oC [11] 23

Hình 1.13: Cấu tạo hoá học của OCMCS 27

Hình 1.14: Cấu tạo của mạch Alginat và hình ảnh rong nâu 28

Hình 1.15: Các bước tổng hợp hệ nano từ mang curcumin [139] 30

Hình 1.16: Cấu trúc hoá học của curcumin (a), Doxorubicin (b) và axit folic (c) 30

Hình 1.17: (a) Phân tử Doxorubicin, (b) Fe3O4 bọc bằng chitosan, (c) Fe3O4 bọc bằng chitosan mang Doxorubicin [143] 31

Hình 1.18: Ảnh hiển vi huỳnh quang Ďồng tiêu của tế bào ung thư gan HT29 nhuộm với thuốc nhuộm Hoechst 33342 (màu xanh) và Doxorubicin tự do, hạt nano PLA-TPGS mang Dox và hạt nano PLA-PLA-TPGS mang Dox có gắn folate (màu Ďỏ) [151] 32

Hình 2.1: Sơ Ďồ tổng hợp các hệ dẫn thuốc Ďa chức năng 39

Hình 2.2: Điều kiện nuôi chuột Ďược duy trì ổn Ďịnh và thực nghiệm tiêm thuốc vào khối u trên chân phải chuột 47

Hình 2.3: Hệ thiết bị Ďốt từ 48

Hình 3.1: Các Ďặc trưng của hạt nano Fe3O4 tổng hợp bằng phương pháp Ďồng kết tủa: a) Phổ hồng ngoại, b) Giản Ďồ XRD, c) Đường cong từ hoá, d) Ảnh SEM, e) Ảnh TEM 50

Hình 3.2: Đường cong từ hoá của các mẫu (các hình bên phải là hình phóng to của các Ďường từ hoá tương ứng tại vị trí gần gốc toạ Ďộ) 52

Hình 3.3: Giản Ďồ XRD của các mẫu Fe3O4 chế tạo bằng vi sóng 53

Hình 3.4: Phổ hồng ngoại của các mẫu Fe3O4 vi sóng 54

Hình 3.5: Ảnh SEM mẫu M5 54

Hình 3.6: Ảnh TEM và phổ DLS của mẫu Fe3O4 M5 phân tán trong nước 55

Hình 3.7: Đường cong từ hoá của các mẫu chế tạo với lượng curcumin khác nhau 56 Hình 3.8: Thế Zeta của các hệ mang curcumin a) FOC1, b) FOC2, c) FOC3, d) FOC4 và e) FOC5 57

Hình 3.9: Phổ hồng ngoại của (a) Fe3O4,(b) OCMCS, (c) Curcumin, (d) FOC 58

Hình 3.10: Phổ hồng ngoại của (a) folate, (b) FOC và (c) FOCF 58

Hình 3.11: Phổ huỳnh quang của FOC và curcumin 59

Hình 3.13: Giản Ďồ phân tích nhiệt (a) DrTGA, (b) TGA và (c) DTA của mẫu FOC

(trái) và FOCF (phải) 61

Hình 3.14: Mô hình cấu trúc hệ FOC và FOCF 61

Hình 3.15: Giản Ďồ nhiễu xạ tia X của (a) Fe3O4, (b) FOC và (c) FOCF 62

Hình 3.16: Đường cong từ trễ của (a) Fe3O4,(b) FOC và (c) FOCF 62

Hình 3.17: (a) Đường Ďốt nhiệt và (b) Đồ thị tương quan tốc Ďộ tăng nhiệt ban Ďầu (dT/dt) và nhiệt Ďộ bão hòa Ts theo nồng Ďộ hạt từ của hệ FOC 63

Hình 3.18: (a) Đường Ďốt nhiệt và (b) Đồ thị tương quan tốc Ďộ tăng nhiệt ban Ďầu (dT/dt) và nhiệt Ďộ bão hòa Ts theo nồng Ďộ hạt từ của hệ FOCF 64

Hình 3.19: (a) Phổ UV-vis của các dung dịch curcumin trong dung môi etanol/nước (1/1) ở các nồng Ďộ khác nhau (1) 0,01 mg/ml; (2) 0,008 mg/ml; (3) 0,06 mg/ml; (4) 0,04 mg/ml; (5) 0,04 mg/ml và (b) Đường chuẩn của curcumin trong dung môi etanol/nước (1/1) 65

Hình 3.20: Biểu Ďồ giải phóng curcumin của 2 hệ mẫu tại pH=7,4 và pH=5 66

Hình 3.21: Ảnh huỳnh quang của tế bào HT29 trong Ďiều kiện bình thường (control) và trong Ďiều kiện ủ 15 giờ với hệ FOC 67

Hình 3.22: Đường cong Ďáp ứng liều của tế bào HT29 ủ với curcumin tinh chất (a - Ďường phía trên), hệ FOC (a - Ďường phía dưới) và (b) Fe3O4/OCMCS 68

Hình 3.23: Phân bố của FOC và FOCF trên các cơ quan của chuột (hạt từ xuất hiện dưới dạng các chấm màu nâu Ďậm) 71

Hình 4.1: Phổ IR của Fe3O4, Alginate, Dox, FA4, FA8 và FA4D 73

Hình 4.2: Phổ huỳnh quang của Dox và FA4D (cùng nồng Ďộ Dox) 74

Hình 4.3: Phân bố kích thước của các mẫu FA4, FA8, FA4D, FA8D 74

Hình 4.4: Ảnh TEM và phân bố kích thước hạt của FA4D 75

Hình 4.5: Giản Ďồ XRD của FA4D 76

Hình 4.6: Tính chất từ của các hệ hạt 76

Hình 4.7: Đường cong Ďốt nóng cảm ứng từ (a, b, c) và so sánh nhiệt Ďộ bão hoà, tốc Ďộ tăng nhiệt ban Ďầu (d) của các mẫu 78

Hình 4.8: Biểu Ďồ so sánh giá trị SAR các mẫu ở nồng Ďộ 1 và 3 mg/ml 79

Hình 4.9: Giản Ďồ phân tích nhiệt của FA4 (a) và FA4D (b) 80

Hình 4.10: Sơ Ďồ cấu trúc của FAD và FADF 81

Hình 4.11: Quá trình giải phóng thuốc của FA4D ở pH 7,4 và pH 5 82

Hình 4.12: Đường cong Ďáp ứng liều và tương quan giá trị IC50 của hệ FA4D trên các dòng tế bào Hep-G2, LU-1, RD, FL và Vero 83

Hình 4.13: Hình ảnh tế bào LU-1 và Hep-G2 ủ với Dox và FA4D ở các nồng Ďộ khác nhau 86

Hình 4.14: Thế Zeta của FA (a) và FAD (b) 86

Hình 4.15: Đường cong Ďốt nóng cảm ứng từ của FA ở các từ trường khác nhau, nồng Ďộ 2 mg/ml (a) và ở từ trường 80 Oe, các nồng Ďộ khác nhau (b) và FAD ở Ďiều kiện tương tự (c), (d) 87

Hình 4.16: Phổ hồng ngoại của FADF so với các thành phần 89

Hình 4.17: Phổ huỳnh quang của FADF so với folate và Dox (a) và các mẫu chứa chấm lượng tử CdTe (b) 90

Hình 4.18: Ảnh TEM và phổ DLS của a) FADF và b) FADQ 91

Hình 4.19: Giản Ďồ XRD 92

Hình 4.20: Tính chất từ (a) và Ďường cong Ďốt nóng cảm ứng của FADF (b), FAQ (c) và FADQ (d) 93

Hình 4.21: Kết quả giải phóng Doxorubicin từ FADF 93

Hình 4.22: Khả năng Ďốt nóng cảm ứng từ ở pH 5 và pH 7,4 của mẫu FADF 1 mg/ml 94

Hình 4.23: Nhiệt Ďộ và %Dox giải phóng bởi từ trường 95

Hình 4.24: Độc tính tế bào của các hệ mẫu chứa Doxorubicin 96

Hình 4.25: Chỉ số sống sót của tế bào khi ủ với các mẫu chứa CdTe: (a) CdTe, (b) FAQ, (c) FADQ 97

Hình 4.26: Độc tính tế bào của các hệ mẫu chứa CdTe (CdTe, FAQ và FADQ) 99

Hình 4.27: Hình ảnh giải phẫu bệnh khối u có nhiều nhân quái, nhân chia 100

Hình 4.28: Hình ảnh giải phẫu các cơ quan : a - gan, b – lách, c - thận, d – u; trái – Ďối chứng, giữa – FAD, phải – FADF 102Hình 4.29: Kết quả Ďịnh lượng sắt ở các cơ quan sau tiêm tĩnh mạch (G: gan, L: lách, M: máu, T: thận, U: u) 102Hình 4.30: Trọng lượng của các nhóm chuột trong quá trình Ďiều trị 103Hình 4.31: Sự thay Ďổi kích thước khối u trong quá trình Ďiều trị in vivo 103Hình 4.32: (a) Các chuột trong quá trình Ďiều trị và (b) kích thước khối u sau Ďiều trị lần 8 - Đối chứng (Trái trên), FA (Phải trên), FAD (Trái dưới) và FADF (Phải dưới) 104Hình 4.33: Kích thước khối u giảm ở các nhóm chuột Ďược Ďiều trị 105

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Ngày nay, sự phát triển của khoa học và công nghệ Ďã Ďem lại nhiều tiến bộ vượt bậc trong sinh y học nhưng loài người vẫn Ďang phải Ďối diện với nhiều loại bệnh nan y, Ďiển hình nhất là bệnh ung thư Hiện nay có rất nhiều thuốc Ďiều trị ung thư trên thị trường Tuy nhiên, nhược Ďiểm lớn nhất của các loại thuốc Ďiều trị ung thư là ít tan trong nước hoặc dễ bị Ďào thải, tính Ďịnh hướng chọn lọc không cao và

dù ít hay nhiều Ďều ảnh hưởng không tốt Ďối với sức khỏe bệnh nhân vì có tác dụng phụ kèm theo như các triệu chứng buồn nôn, tiêu chảy, gây thiếu máu, giảm miễn

Ďộng cục bộ lên khối u mà còn ảnh hưởng Ďến một bộ phận lớn các mô và cơ quan lành của cơ thể [1]

Để khắc phục những nhược Ďiểm của phương pháp nêu trên, các nhà nghiên cứu Ďã ứng dụng công nghệ nano, sử dụng vật liệu với kích thước nano mét làm phương tiện dẫn các loại thuốc Ďặc trị ung thư như Curcumin, Paclitaxel, Doxorubicin… Ďến khối u một cách an toàn [2–4] Bên cạnh Ďó vật liệu nano từ Ďã

và Ďang Ďược nghiên cứu mạnh mẽ nhằm ứng dụng trong sàng lọc tế bào ung thư, chẩn Ďoán ung thư bằng hình ảnh cộng hưởng từ MRI, nhiệt trị bằng cách làm tăng nhiệt Ďộ vùng khối u khi Ďược Ďặt trong từ trường, và Ďặc biệt là dẫn truyền thuốc dưới ảnh hưởng của nam châm [5, 6] Các hạt nano từ và thuốc chống ung thư Ďược bọc bởi các lớp vỏ là các polymer thiên nhiên hoặc polymer tổng hợp như dextran, dextran biến tính, chitosan, chitosan biến tính, alginate, PLA-TPGS, PLA-PEG…và trên bề mặt có thể Ďược gắn thêm một số yếu tố hướng Ďích như acid folic (folate), aptamer, tranferin, lectin và kháng thể Hệ nano Ďa chức năng như vậy sẽ tăng hiệu quả tác Ďộng Ďối với các tế bào ung thư nhất Ďịnh, giải quyết phần nào yêu

ích là: Sử dụng vật liệu này cho phép giảm liều thuốc dùng, giúp người bệnh tránh Ďược các tác dụng phụ không mong muốn; tập trung thuốc vào vị trí khối u, tránh tác Ďộng Ďến tế bào lành [7, 8] Từ những vấn Ďề nêu trên cho thấy hoàn toàn có thể

biến tính, alginate, copolime…, gắn thêm Ďuôi folate như một phương tiện chuyên

chở thuốc Curcumin (Cur) hoặc Doxorubicin (Dox) Ďến Ďúng Ďích là khối u ung thư một cách an toàn Trên thế giới, một số nghiên cứu về hệ nano Ďa chức năng dùng trong y sinh học, Ďặc biệt là trong Ďiều trị ung thư Ďã Ďược công bố [9–11], tuy nhiên, Ďây vẫn là hướng nghiên cứu mới với nhiều triển vọng

Ở Việt Nam, một số nhóm nghiên cứu Ďã công bố các công trình liên quan Ďến việc tổng hợp hạt nano từ và ứng dụng trong xử lí môi trường [12, 13] Các nghiên cứu Ďịnh hướng sử dụng hạt nano từ trong y sinh chủ yếu khai thác khả năng nhiệt

từ trị của vật liệu này [14–16] Tính chất quang và khả năng hướng Ďích Ďược nghiên cứu rất hạn chế

Trên cơ sở các phân tích kể trên, chúng tôi thực hiện luận án “Nghiên cứu chế

tạo và đánh giá hiệu quả tác động của hệ nano đa chức năng

(polymer-drug-Fe 3 O 4 -folate) lên tế bào ung thư”

2 Mục tiêu nghiên cứu chính của luận án:

Mục tiêu chung của luận án là tạo Ďược các hệ nano Ďa chức năng có thể sử dụng Ďể chuẩn Ďoán và Ďiều trị ung thư Trong Ďó, mục Ďích Ďặc thù của luận án này

là tạo Ďược các hệ có Ďồng thời các chức năng: mang thuốc - từ - quang và hướng Ďích

Mục tiêu nghiên cứu cụ thể gồm có:

chất từ) Ďược bọc bởi polyme tương thích sinh học, gắn yếu tố hướng Ďích (folate), mang thuốc (drug) ((Curcumin, Doxorubicin) (tính chất quang)), phân tán tốt trong nước, có khả năng nhắm Ďích ung thư

- Thử nghiệm và Ďánh giá Ďược hiệu quả tác Ďộng của hệ hạt nano lên các dòng tế bào ung thư như HT29; HeLa; HepG2 và trên Ďộng vật thực nghiệm

3 Các nội dung nghiên cứu chính của luận án:

Luận án thực hiện các nội dung sau:

cacboxylmetyl chitosan hoặc alginate, mang thuốc curcumin hoặc doxorubicin, gắn folate

- Xác Ďịnh các Ďặc trưng về vật liệu: cấu trúc, hình thái, tính chất từ, quang, dung lượng mang thuốc, Ďộ bền, khả năng phân tán cả hệ nano Ďa chức năng Ďã chế tạo

- Xác Ďịnh khả năng ức chế các dòng tế bào ung thư in vitro

- Xác Ďịnh hiệu quả Ďiều trị ung thư trên chuột của hệ nano Ďa chức năng

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án:

Điều trị ung thư vẫn là một trong những thách thức lớn nhất của toàn nhân loại Một trong những nguyên nhân dẫn Ďến sự thất bại của các liệu pháp Ďó là khả năng hướng Ďích kém Ďến các tế bào ung thư và sự phát sinh các tác dụng phụ không mong muốn Chính vì vậy, việc tạo ra những hệ dẫn tryền thuốc hướng Ďích, Ďiều trị tập trung hiệu quả, giảm lượng thuốc cần sử dụng là mục tiêu nghiên cứu của rất nhiều nhà khoa học trong và ngoài nước Luận án Ďược thực hiện với mục Ďích chế tạo hệ hạt nano quang từ mang thuốc gắn yếu tố hướng Ďích Đây là hệ thuốc có nhiều ưu Ďiểm vượt trội như giúp tăng cường việc hấp thu vào mô, kích cỡ nanomet phù hợp giúp vận cuyển thuốc thụ Ďộng Ďến khối u, folate dẫn hệ thuốc Ďến và tập trung tại khối u Ďồng thời tăng cường khả năng Ďưa thuốc vào tế bào; doxorubicin tiêu diệt tế bào ung thư, curcumin vừa có chức năng Ďánh dấu vừa có khả năng tiêu diệt tế bào ung thư Do Ďó, việc phát triển hệ nano Ďa chức năng là một yêu cầu thực tế cấp thiết và có ý nghĩa khoa học

5 Bố cục luận án:

Luận án bao gồm các phần sau Ďây:

- Mở Ďầu

- Chương 1: Tổng quan

- Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

- Kết luận

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Khái quát về hệ vật liệu nano y sinh

1.1.1 Cấu trúc của hệ nano y sinh

Vật liệu nano là thuật ngữ dùng Ďể chỉ các vật liệu trong Ďó chứa các thành phần với ít nhất một chiều có kích thước nanomet (từ 1 Ďến 100 nm) Trong lĩnh vực y sinh, vật liệu nano có thể Ďược Ďịnh nghĩa với kích thước lớn hơn (Ďến vài trăm nanomét), do sự tương Ďồng về kích thước với các cấu trúc nano tự nhiên như

vi rút [17, 18] Vật liệu cấu trúc nano có nhiều Ďặc tính nổi trội và khác biệt với vật liệu dạng khối cũng như dạng phân tử như: kích thước Ďặc biệt (<1000 nm), tỷ lệ bề mặt/thể tích rất lớn, tiềm năng phản ứng cao, tạo ra hiệu ứng cộng hưởng bề mặt Plasmon… Những tính chất Ďặc biệt so với vật liệu kích thước lớn là do kích cỡ nano Ďạt tới kích thước tới hạn của nhiều tính chất hóa lý khác nhau Nhờ những tính chất này, vật liệu nano Ďược ứng dụng trong nhiều lĩnh vực, Ďặc biệt là trong y sinh [19]

1.1.1.1 Kết cấu chung

Nhiều vật liệu hữu cơ và vô cơ Ďã Ďược sử dụng Ďể tạo ra các hệ vật liệu nano

y sinh Ďa chức năng có kiến trúc Ďặc biệt với các chức năng Ďi kèm Cấu trúc của hệ thường là kiểu cấu trúc lõi vỏ Hình 1.1 mô tả kết cấu chung với nhiều chức năng của hệ vật liệu nano Ďa chức năng

1.1.1.2 Thành phần vật liệu

Về mặt hoá học, hệ Ďa chức năng có thể Ďược cấu thành từ cả vật liệu vô cơ và vật liệu hữu cơ Vật liệu hữu cơ thường gặp gồm có micell, liposome, nanogel và dendrime Trong khi Ďó, vật liệu nano vô cơ thường dùng là oxit sắt siêu thuận từ (SPIO), vàng, chấm lượng tử (quantum dot - QD) và hạt nano phát quang chứa các ion Ďất hiếm [1]

Dựa trên các Ďặc trưng vật lí, hệ có thể Ďược phân loại thành vật liệu từ, vật liệu quang học, vật liệu Ďiện Vật liệu nano từ bao gồm nano kim loại và nano oxit kim loại Các kim loại chuyển tiếp (Fe, Co, Ni), các hợp kim 2 kim loại và các vật liệu từ cứng như Nd-Fe-Bo, Sm-Co có thể Ďược sử dụng làm hạt từ lõi Mặc dù các kim loại tinh khiết (Fe, Co, Ni) có từ Ďộ bão hòa cao nhất, chúng rất Ďộc và rất dễ bị oxy hóa nên ít Ďược quan tâm Nd-Fe-B và Sm-Co lại cần có từ trường ngoài lớn

mới gây Ďược ảnh hưởng Ďến các vật liệu này Ngược lại, các oxit kim loại ít nhạy hơn với quá trình oxy hóa và có thể dễ dàng phản ứng với từ trường ngoài Các loại oxit từ tính Ďược sử dụng rộng rãi nhất là Mn ferrite, Co-ferrite, Ni-ferrite và Fe3O4 Trong khi các oxit khác Ďều có Ďộc tính nhất Ďịnh với cơ thể sinh vật, oxit sắt từ

Ďược ứng dụng trong y sinh học do từ Ďộ bão hòa cao, Ďộ cảm từ cao, bền về mặt hóa học, không gây ung thư, có thể phân huỷ sinh học, khả năng tương thích sinh học vốn có, dễ tổng hợp và tương Ďối dễ dàng Ďể chức năng hoá Đặc biệt chúng có thể dễ dàng biến Ďổi với các lớp phủ tương thích sinh học cũng như các tác nhân hướng Ďích, tác nhân tạo ảnh hay các phân tử dược chất [20]

Hình 1.1: Sơ Ďồ cấu tạo hệ nano Ďa chức năng [21]

Hình 1.1 mô tả sơ Ďồ cấu tạo chung của các hệ nano Ďa chức năng Các hệ này

có thể Ďược tạo ra bằng cách kết hợp các tinh thể nano vô cơ với các chức năng khác nhau hoặc kết hợp các tinh thể nano với các phân tử chức năng thông qua các

kỹ thuật biến Ďổi bề mặt khác nhau Các lớp phủ Ďiển hình thường Ďược phát triển cho các tinh thể nano vô cơ là (a) lớp bao gói của liposome hoặc micelle, (b) lớp silic xốp mesoporous, (c)tự hợp từng lớp, và (d) liên hợp bề mặt

1.1.2 Các chức năng y sinh của hệ

1.1.2.1 Chức năng chuẩn đoán (phân tích đặc hiệu, ảnh MRI, ảnh quang )

Nhiều nghiên cứu Ďã Ďược công bố về việc chế tạo các loại chất tương phản dựa trên hạt nano Ďể chụp ảnh y sinh học Chẳng hạn, chấm lượng tử Ďược sử dụng

Ďể chụp ảnh huỳnh quang Các hạt nano vàng với hóa học bề mặt phong phú và khả năng hấp thu tốt Ďược sử dụng trong chụp cắt lớp vi tính tia X (Computer tomography – CT) Các hạt nano oxit sắt với kích thước, thành phần chính xác và các hợp chất nano mới của gadolinium Ďang Ďược nghiên cứu làm tác nhân tương phản cho chụp ảnh cộng hưởng từ hạt nhân (Magnetic Resonance Imaging - MRI) [18]

Đối với chức năng chụp ảnh huỳnh quang, Ďể quan sát Ďược Ďộ thâm nhập vào bên trong tế bào, các phân tử phát huỳnh quang có thể Ďược Ďính kết vào hệ dẫn thuốc Việc nối kết các phân tử có khả năng phát huỳnh quang (fluorophore) như fluorescein (phát màu xanh lục) hay rhodamine (phát màu Ďỏ) vào các tế bào Ďể Ďịnh vị và quan sát sự phân bố trong những thí nghiệm sinh học Ďã Ďược thực hiện

từ nhiều năm nay [4] Tuy nhiên, các phân tử huỳnh quang này có cường Ďộ phát quang yếu và bị lu mờ sau vài phút hoạt Ďộng Hơn nữa, việc sử dụng một số 'chất màu' như rhodamine thường bị phê phán do Ďộc tính cao của các chất này [11] Sử dụng hạt nano với một số chất phát quang thích hợp khác (như curcumin, Doxorubicin) giải quyết Ďược những vướng mắc nêu trên Kết hợp chấm lượng tử trên hạt nano từ cũng cho phép thực hiện chức năng quang học tương tự Trong cùng một Ďiều kiện kích hoạt, hạt nano có thể tỏa sáng gấp 20 lần phân tử huỳnh quang và giữ Ďộ sáng liên tục không bị lu mờ theo thời gian Việc phát quang tạo ảnh giúp người quan sát nhìn thấy tế bào ở vùng sâu bên trong cơ thể và ước lượng Ďược mật Ďộ kết tập và phân bố của hệ mang thuốc tại một "Ďịa chỉ" nào Ďó [9] Khả năng tăng Ďộ tương phản ảnh MRI sẽ Ďược trình bày chi tiết hơn trong mục 1.3.4

Ďộc tính Ďối với tế bào thường

2 Đưa dược chất Ďến mục tiêu là các mô, tế bào hoặc cơ quan cụ thể

3 Tăng cường các tính chất của dược chất (ví dụ, sự ổn Ďịnh, Ďộ tan, thời gian lưu thông trong máu và khả năng tích tụ tại khối u)

4 Kích hoạt sự phóng thích thuốc kéo dài hoặc phóng thích thuốc dưới tác Ďộng của môi trường sinh lý khối u

5 Tạo thuận lợi cho việc mang các dạng thuốc sinh học phân tử (ví dụ DNA, RNA (siRNA) nhỏ, mRNA và protein) Ďến các Ďiểm hoạt Ďộng nội bào

6 Đồng phối hợp nhiều thuốc Ďể cải thiện hiệu quả Ďiều trị và chống kháng thuốc

7 Vận chuyển thuốc qua các hàng rào sinh học (ví dụ, Ďường tiêu hóa và hàng rào máu-não)

8 Hiển thị các Ďiểm phân phối thuốc bằng cách kết hợp các tác nhân trị liệu với chẩn Ďoán hình ảnh và/hoặc các phản hồi thời gian thực về tính hiệu quả của dược chất

9 Cung cấp các phương pháp tiếp cận mới cho việc phát triển vắc xin tổng hợp

10 Kết hợp tính chất Ďiều trị vốn có của một số vật liệu nano (ví dụ: nano vàng hoặc nano sắt oxit khi Ďược kích thích phù hợp) [18]

Trong nghiên cứu này, với những phân tích kể trên và kinh nghiệm của nhóm

1.2 Phương pháp tổng hợp hạt nano Fe 3 O 4

Có rất nhiều phương pháp Ďược sử dụng Ďể Ďiều chế hạt nano oxit sắt siêu thuận từ với kích thước xác Ďịnh và chất lượng cao như Ďồng kết tủa, phân huỷ nhiệt, thuỷ nhiệt, vi nhũ tương [23], nghiền cơ năng lượng cao [24], phản ứng sol-gel [25] hoặc mới Ďây là sử dụng kĩ thuật vi lưu [26] Phần dưới Ďây chỉ trình bày một số phương pháp Ďược sử dụng phổ biến

1.2.1 Phương pháp đồng kết tủa

Đây là phương pháp Ďơn giản và Ďược sử dụng rất rộng rãi Ďể Ďiều chế hạt nano oxit sắt (Cả oxit sắt từ Fe3O4 và γ-Fe2O3) Phương pháp này dựa trên quá trình

thêm từ từ dung dịch bazơ vào hỗn hợp muối Fe2+

và Fe3+ trong khí quyển trơ Kích thước, hình dạng và thành phần của hạt nano oxit sắt phụ thuộc vào loại muối sử

Fe2+ + 2 Fe3+ + 8 OH- → Fe3O4 + 4 H2O

mol Fe3+/Fe2+ = 2/1 và phản ứng Ďược thực hiện trong bình không chứa oxi Tuy

lớn nhất của phương pháp này là có khả năng tổng hợp lượng lớn với quy trình tổng hợp Ďơn giản

Ưu Ďiểm này Ďược nhiều nhóm nghiên cứu trên thế giới khai thác và sử dụng trong nhiều năm [29–32] và vẫn Ďang Ďược sử dụng phổ biến trong vài năm trở lại

hoà trong khoảng từ 20-60 emu/g

Các nhóm nghiên cứu ở Việt Nam cũng lợi dụng ưu Ďiểm này Ďể tổng hợp

Hải Ďã tổng hợp Fe3O4 kích thước khoảng 15 nm và tăng Ďộ bền của Fe3O4 bằng cách pha tạp vật liệu này với Co(II) hoặc Ni(II) theo phương pháp này Ďể hấp phụ asen trong nước [36] Vật liệu tương tự cũng Ďược cùng nhóm tác giả tổng hợp Ďể làm giàu DNA [37]

Sử dụng phương pháp Ďồng kết tủa nhưng tổng hợp trong không khí, hạt nano

-Fe2O3 [38]

Nhóm nghiên cứu của GS Nguyễn Xuân Phúc Ďã sử dụng phương pháp này

Luận án của TS Phạm Hoài Linh Ďã xác Ďịnh một số thông số kĩ thuật tối ưu (bao gồm nhiệt Ďộ phản ứng, tốc Ďộ khuấy trộn và nồng Ďộ tiền chất) Ďể chế tạo Ďược sản

phẩm Fe3O4 sạch pha và có từ Ďộ bão hoà cao theo phương pháp Ďồng kết tủa [16]

1.2.2 Phương pháp thuỷ nhiệt

sắt (II) hidroxit và goetit (FeO(OH)) Sự hình thành mầm tinh thể xảy ra nhanh chóng trong giai Ďoạn Ďầu của quá trình thuỷ nhiệt, tạo thành các hạt có kích thước nhỏ hơn và Ďộ tinh thể hoá thấp hơn Ngược lại, nếu tỉ lệ này cao hơn, kích thước

các hạt lớn lên từ từ trong Ďiều kiện thuỷ nhiệt Mặc dù vậy, hạt nano Fe3O4 thu Ďược ở các tỉ lệ mol khác nhau vẫn có tính chất từ rất tốt [44]

Các tác giả [45] sử dụng phương pháp này và thay Ďổi nhiệt Ďộ phản ứng từ

120oC-180oC Kết quả cho thấy, khi nhiệt Ďộ thay Ďổi, các mẫu vật liệu thu Ďược Ďều Ďơn pha, nhưng kích thước hạt và từ Ďộ bão hoà của vật liệu Ďều tăng dần theo nhiệt Ďộ

1.2.3 Phương pháp phân huỷ nhiệt

Một phương pháp khác Ďược sử dụng Ďể Ďiều chế hạt nano oxit sắt từ Ďơn phân tán là phương pháp phân huỷ nhiệt các hợp chất cơ kim, phức chất kim loại-chất hoạt Ďộng bề mặt hoặc muối kim loại trong các dung môi nhiệt Ďộ sôi cao Kích thước và hình thái học của hạt nano có thể Ďiều khiển khá chính xác bằng nhiệt Ďộ, thời gian phản ứng, nồng Ďộ và tỉ lệ của các chất tham gia phản ứng cũng như các chất tạo mầm tinh thể Phương pháp này Ďược các tác giả Sun và Zeng sử

huỷ sắt (III) axetylaxetonat ở nhiệt Ďộ cao (~ 300o

C) trong dung môi phenol ete chứa 1,2-hexadecanediol, axit oleic và oleylamin Hạt nano oxit sắt từ thu Ďược có

kích thước lớn hơn (khoảng 20 nm) có thể tổng hợp Ďược bằng cách gây mầm bởi

lượng nhỏ (dưới 1 g), do Ďó thường phải Ďiều chế nhiều lần Ďể có thể sử dụng cho các ứng dụng của nó Lượng lớn (khoảng vài chục gam) hạt nano Ďơn phân tán (Ďộ lệch chuẩn về kích thước <5%) với dải kích thước từ 5-22 nm Ďược tổng hợp bằng

C [47]

Tác giả Vương Thị Kim Oanh Ďã công bố trong luận án của mình [14] và bài

thấp hơn hoặc bằng nhiệt Ďộ sôi của dung môi dibenzyl ete Phương pháp này tạo

Hạn chế lớn nhất của phương pháp này chính là phải chuyển hạt Fe3O4 thu Ďược từ dung môi hữu cơ sang dung môi nước Quá trình này thường phức tạp với nhiều công Ďoạn và cần sử dụng nhiều loại hoá chất khác nhau [50, 51]

1.2.4 Sử dụng kĩ thuật vi sóng trong tổng hợp Fe 3 O 4

Sử dụng sự trợ giúp của vi sóng trong quá trình tổng hợp Fe3O4 theo các phương pháp khác nhau Ďược nhiều tác giả quan tâm do kĩ thuật này có nhiều ưu Ďiểm nổi bật Thiết bị vi sóng cho phép rút ngắn Ďáng kể thời gian phản ứng [52], hiệu suất phản ứng cao hơn do vi sóng chuyển hoá năng lượng hiệu quả hơn và phân bố nhiệt trong hệ phản ứng Ďồng Ďều hơn Ďiều kiện thường [53] Đặc biệt, tổng hợp vi sóng cho phép chế tạo vật liệu nano với lượng lớn và theo các quá trình thân thiện hơn với môi trường [54]

tủa hỗn hợp Fe(III) và Fe(II) (với tỉ lệ mol 1,75:1) bằng dung dịch amoniac và già hoá bằng chiếu vi sóng với tần số 2,45 GHz Kết quả cho thấy, sử dụng vi sóng cho

hoá bằng vi sóng có cấu trúc tinh thể hoàn thiện hơn và kích thước nhỏ hơn so với mẫu không sử dụng vi sóng

Cùng sử dụng phương pháp này, nhóm tác giả [34] Ďưa dung dịch hỗn hợp Fe(II) 0,02 M, Fe(III) 0,04 M và dung dịch bazơ Na2CO3 vào bình chịu áp suất

sóng 50 hoặc 300W) và thay Ďổi thời gian phản ứng (10 hoặc 60 phút) Kết quả nghiên cứu cho thấy việc Ďiều chỉnh các Ďiều kiện thí nghiệm cho phép Ďiều khiển Ďược kích thước hạt, tính chất từ cũng như tương tác giữa các hạt trong cấu trúc vỏ -

lõi của vật liệu

phút và duy trì nhiệt Ďộ này trong 2 h Hạt Fe3O4 thu Ďược có dạng hình lục giác Ďều, kích thước trung bình 48 nm và hiệu suất tổng hợp lên tới 90% [56]

Hạt nano Fe3O4 cũng thu Ďược bằng cách khử muối sắt (III) bằng hiĎrazin (N2H4) trong lò vi sóng ở nhiệt Ďộ 100 ± 5oC trong 10 phút với công suất vi sóng tối

Ďa là 300 W, áp suất tối Ďa là 250psi và khuấy mạnh Kích thước hạt thu Ďược theo

Ďóng vai trò chất khử, vừa tạo môi trường kiềm nên hàm lượng N2H4 gây ảnh hưởng tới cấu trúc tinh thể của hạt Fe3O4 thu Ďược [58]

Như vậy, có thể nhận thấy rằng kĩ thuật vi sóng có thể áp dụng Ďược trong

nhiều thuận lợi cho các quá trình tổng hợp này Trong luận án này, chúng tôi sử dụng kết hợp kĩ thuật này cho phương pháp tổng hợp truyền thống là Ďồng kết tủa

1.3 Tính chất và ứng dụng của hạt nano Fe 3 O 4 trong y sinh học

1.3.1 Một số tính chất từ cơ bản của hạt nano oxit sắt từ Fe 3 O 4

Vật liệu sắt từ dạng khối có momen từ (M) khi chưa có từ trường ngoài, chứa

Ďa Ďômen (multi domains) (hình 1.2a) Do sự Ďịnh hướng khác nhau của các momen

từ nguyên tử trong mỗi Ďômen, từ Ďộ chung của mẫu khối giảm so với giá trị tổng cộng của từ Ďộ các Ďômen Dưới tác dụng của từ trường ngoài H, từ Ďộ M của vật

Ďược như trên Ďồ thị M-H hình 1.2b [59]

Khi kích thước của vật liệu sắt từ giảm dần, vật liệu sẽ Ďạt Ďến kích thước tới hạn, tại Ďó, mỗi hạt chỉ chứa 1 (Ďơn) Ďômen, tức là spin từ của tất cả các nguyên tử sắp xếp theo cùng một hướng [60] Với những hạt Ďơn Ďômen này, Ďể Ďảo hướng từ trường, phải vượt qua Ďược hàng rào năng lượng KV, trong Ďó K là hằng số dị hướng hiệu dụng và V là thể tích hạt Khi kích thước hạt giảm, năng lượng nhiệt

kBT (trong Ďó kB là hằng số Boltzman và T là nhiệt Ďộ) lớn hơn hàng rào năng lượng KV, dẫn tới sự sắp xếp ngẫu nhiên các momen từ theo mọi hướng Hiện tượng này gọi là hiện tượng siêu thuận từ Trong trường hợp này, Ďường cong từ trễ

sẽ không xuất hiện trên Ďường từ hoá Mặt khác, khi nhiệt Ďộ giảm sao cho

kBT<KV, các hạt trải qua một trạng thái chuyển tiếp từ trạng thái siêu thuận từ sang trạng thái khoá (trạng thái trong Ďó các moment từ có hướng xác Ďịnh Ďược) Nhiệt

[5]

Nano Fe3O4 có thể Ďược dùng làm chất hấp phụ và xử lí các chất ô nhiễm trong môi trường [64, 65], Ďược dùng trong công nghệ thông tin và truyền thông [66] và Ďặc biệt Ďược sử dụng rất nhiều trong lĩnh vực y sinh Trong lĩnh vực này, hạt nano từ có thể Ďược dùng Ďể tách chiết, làm giàu các phân tử sinh học nhờ từ trường ngoài [67] Bên cạnh Ďó, là các ứng dụng: dẫn thuốc hướng Ďích, phóng thích thuốc chủ Ďộng, làm tăng Ďộ tương phản ảnh cộng hưởng từ và nhiệt trị nhờ hiệu ứng Ďốt nóng cảm ứng từ bằng từ trường xoay chiều Các ứng dụng này sẽ Ďược trình bày chi tiết dưới Ďây

1.3.2 Mang thuốc hướng đích

Nguyên tắc cơ bản của ứng dụng này là bao bọc, liên kết hoặc hấp phụ các dược chất lên hạt nano từ Trong Ďó, hạt nano có lõi là hạt từ và lớp vỏ có thể là polime Cách thức mang thuốc lên hạt từ phụ thuộc vào Ďặc tính của thuốc và cấu trúc hạt nano Với sự kết hợp của từ trường ngoài và các tác nhân hướng Ďích khác,

có khả năng thẩm thấu qua các lỗ trống trên các thành mạch máu bị rò rỉ ở khối u (hiệu ứng tăng tính thấm và thời gian lưu) Khi hệ mang thuốc Ďến các vị trí này, dược chất sẽ Ďược giải phóng khỏi hệ mang nhờ hoạt Ďộng của các enzym, các thay

Ďổi của Ďiều kiện môi trường in vivo như nhiệt Ďộ, pH…, hoặc các tác Ďộng khác

Phương pháp dẫn thuốc này có ưu Ďiểm là giảm liều dùng và các phản ứng phụ trên

tế bào khoẻ mạnh [6, 62]

Có nhiều nghiên cứu chứng minh ưu Ďiểm của phương pháp dẫn thuốc hướng

Ďích này Trong nghiên cứu in vitro [68], các tác giả Ďã sử dụng dãy các nam châm

NdFeB Ďường kính 4,5 mm và sắp xếp các cực một cách liên tiếp Bình chứa tế bào ung thư biểu mô vú Ďược Ďặt trên các nam châm, thêm hạt nano oxit sắt từ bọc tinh bột vào bình Sau khi ủ, mức Ďộ xâm nhập tế bào nhờ từ trường Ďược xác Ďịnh bằng cách Ďo hàm lượng sắt trong mẫu thí nghiệm và mẫu Ďối chứng Kết quả cho thấy, dưới tác Ďộng của từ trường, hạt từ tập trung trong tế bào ung thư nhiều hơn

Để xác Ďịnh khả năng hướng Ďích tới khối u trong não trong thử nghiệm in

vivo, chuột Ďược gây mê (qua Ďường hô hấp với hỗn hợp isofrurane/không khí nồng

Ďộ 1,5%), Ďầu chuột Ďược Ďặt giữa 2 cực của một nam châm Ďiện Hạt nano từ Ďược

tiêm vào tĩnh mạch Ďuôi chuột với liều 12 mg/kg, duy trì từ trường trong 30 phút Chuột Ďối chứng Ďược tiêm hạt từ với cùng nồng Ďộ nhưng không Ďặt trong từ trường Sau 30 phút, mổ chuột, tách các mô não bình thường và mô não ung thư Ďể xác Ďịnh hàm lượng Fe Kết quả Ďược chỉ ra trên hình 1.4 Rõ ràng, dưới tác Ďộng của từ trường, hệ hạt tập trung Ďến khối u với tỉ lệ cao hơn hẳn các trường hợp còn lại, chứng tỏ hiệu quả hướng Ďích tốt của hệ Cùng nhóm tác giả công trình [69] khẳng Ďịnh tính hiệu quả của hình thức hướng Ďích bằng từ trường, trong Ďó, chỉ rõ

sự khác nhau khi Ďưa hạt từ vào cơ thể qua Ďường tiêm tĩnh mạch và Ďưa qua Ďộng mạch cổ Các tác giả [70] Ďã chứng minh, từ trường ngoài có tác dụng Ďưa hạt từ

Ďến vị trí mong muốn cả in vitro và in vivo

Hình 1.3: Sơ Ďồ minh họa cơ chế hướng Ďích bằng từ trường ngoài [62]

kích thước thuỷ Ďộng khoảng 200 nm Ďược tổng hợp Ďể mang docetaxel (DTX) và xác Ďịnh hiệu quả Ďiều trị cho chuột có khối u CT26 khi áp dụng hướng Ďích bằng

từ trường [71] Kết quả cho thấy hướng Ďích chủ Ďộng nhờ từ trường ngoài cho phép Ďưa DTX với liều lượng 5-8 mg/kg Ďến khối u có hiệu quả hơn, làm tăng khả năng sống của nhóm chuột thí nghiệm so với nhóm Ďối chứng Nghiên cứu này Ďồng thời cũng Ďưa ra mô hình cho phép tính toán và dự Ďoán hiệu quả của hướng Ďích bằng từ trường cho các nghiên cứu tiếp theo

Hình 1.4: Nồng Ďộ hạt từ ở khối u và mô lành trong não của chuột Ďược hướng

Ďích bằng từ (n=4) và chuột Ďối chứng (n=3) [72]

1.3.3 Nhiệt trị và phóng thích thuốc dựa trên hiệu ứng đốt nóng cảm ứng từ

Nhiệt trị là phương pháp Ďiều trị dựa trên tác dụng của nhiệt Ďối với tế bào hay khối u Theo tác giả [73], nhiệt trị ung thư có thể thực hiện ở 2 vùng nhiệt Ďộ: nhiệt

bóc tách (abalation) Có nhiều vật liệu có khả năng sinh nhiệt trong cơ thể như hạt nano từ trong từ trường, hạt nano La0,7Sr0,3MnO3 dưới tác Ďộng của sóng radio [75] Trong Ďó, hạt nano từ rất Ďược quan tâm Khả năng sinh nhiệt của hạt từ dưới tác Ďộng của từ trường xoay chiều Ďược gọi là hiệu ứng Ďốt nóng cảm ứng từ (magnetic inductive heating - MIH) Quá trình sinh nhiệt này liên quan tới 4 cơ chế tổn hao từ:

cơ chế từ trễ - do chuyển Ďộng Ďảo chiều từ Ďộ theo từ trường ngoài; hồi phục Neel – do chuyển Ďộng quay mômen từ của hạt siêu thuận từ Ďơn Ďômen trong từ trường xoay chiều; hồi phục Brown - do chuyển Ďộng quay toàn bộ hạt trong môi trường chất lỏng; và dòng Fuco – do chuyển Ďộng của dòng electron trên bề mặt hạt [76] Trong Ďó, hồi phục Neel hoặc hồi phục Brown Ďóng vai trò chủ yếu trong quá trình sinh nhiệt của hạt nano Fe3O4 siêu thuận từ [77]

Các thông số Ďặc trưng cho khả năng sinh nhiệt của hạt nano oxit sắt từ là tốc

Ďộ hấp thụ riêng (specific absorption rate - SAR) và công suất tổn hao nội tại

Khối u Ďược hướng Ďích

Mô lành Ďược hướng Ďích Khối u không hướng Ďích

Mô lành không hướng Ďích

(intrinsic loss power – ILP) SAR còn Ďược gọi là công suất tổn hao riêng (specific loss power – SLP) có Ďơn vị W/g và tính theo công thức:

hạt (Ďược xác Ďịnh trực tiếp trên Ďồ thị nhiệt Ďộ-thời gian Ďốt của vật liệu) [78]

SAR phụ thuộc vào nhiều thông số khác nhau như hình dạng, kích thước hạt, phân bố kích thước hạt, thành phần hoá học, tính chất bề mặt, từ Ďộ bão hoà cũng như cường Ďộ từ trường và tần số của từ trường ngoài [80] Để loại trừ ảnh hưởng của từ trường ngoài, có thể sử dụng Ďại lượng ILP Ďược tính theo công thức:

[81]

Trong Ďó H là cường Ďộ và f là tần số của từ trường ngoài

Các nghiên cứu khảo sát khả năng sinh nhiệt cảm ứng từ của các vật liệu trên

Ďộ hạt từ 2 mg/ml có nhiệt Ďộ bão hoà tăng nhanh theo cường Ďộ từ trường, dung dịch nồng Ďộ từ 0,6 mg/ml (với từ trường 236 kHz, 65Oe) có thể Ďạt Ďược nhiệt Ďộ

Hình 1.5: Chuyển Ďộng quay trong hồi phục Néel (a) momen từ quay trong khi hạt cố Ďịnh; hồi phục Brown (b) momen từ tương ứng với trục tinh thể, không Ďổi khi hạt quay [79]

từ 45oC trở lên [39] Hạt nano Fe3O4 chức năng hoá với bán kính thuỷ Ďộng 12,4

nm, từ Ďộ bão hoà 51 emu/g, có khả năng sinh nhiệt với giá trị SAR Ďạt 132 W/g trong từ trường 230 kHz, 100 Oe [83] Hạt từ Ďiều chế bằng phương pháp phân huỷ

/kg [49]

Sử dụng hạt nano từ Ďể ứng dụng trong nhiệt trị liệu Ďã Ďược nghiên cứu từ

0,1 μm vào trong thành ruột của chó, sau Ďó cắt các hạch bạch cầu chứa hạt nano từ (với nồng Ďộ tiêm vào 5 mg/g hạch bạch cầu) và chiếu từ trường xoay chiều 200-

nhiệt Ďể diệt tế bào in vitro [8, 85] cũng như in vivo [86] của hạt nano Fe3O4 tiếp tục Ďược nghiên cứu rộng rãi Gần Ďây, các thử nghiệm nhiệt trị liệu bằng hạt từ trên người Ďã Ďược thực hiện với kết quả rất khả quan [87]

Bên cạnh ứng dụng nhiệt trị liệu, hiệu ứng Ďốt nóng cảm ứng có thể Ďược sử dụng Ďể kích thích quá trình phóng thích thuốc khỏi hạt từ một cách chủ Ďộng Chẳng hạn, tamoxifen citrat (TMX) Ďược mang trên hệ hạt nano oxit sắt từ bọc

mô hình nhiệt trị (hình 1.6a) Hiệu ứng sinh nhiệt này Ďóng vai trò là tác nhân phóng thích TMX khỏi lớp vỏ CD của hạt từ (hình 1.6c) Sự phóng thích thuốc chỉ diễn ra khi áp từ trường vào hệ (ON) và dừng lại khi ngừng áp từ trường (OFF) (hình 1.6b)

Hình 1.6: (a) Sự tăng nhiệt Ďộ theo thời gian của hệ hạt nano từ 20 mg/ml mang TMX trong từ trường 230 kHz, 100 Oe (b) Phóng thích thuốc TMX chủ Ďộng bằng cách bật và tắt từ trường ngoài (c) Sơ Ďồ minh hoạ quá trình phóng thích thuốc nhờ áp từ trường xoay

chiều [83]

Một nghiên cứu khác liên quan Ďến các liposome mang hạt từ gắn Doxorubicin có thể tăng nhiệt tới 42oC trong vài phút trong từ trường xoay chiều tần số 3,5 MHz Trong quá trình tăng nhiệt, Dox Ďược phóng thích ra với tỉ lệ lớn

Tetramethylrhodamine-5-C2-maleimide và xác Ďịnh Ďược rằng khi áp từ trường ngoài, hệ giải phóng rhodamine

mà không làm thay Ďổi Ďáng kể nhiệt Ďộ của môi trường

1.3.4 Tăng cường độ tương phản ảnh cộng hưởng từ hạt nhân

Độ tương phản là khái niệm Ďề cập Ďến sự khác biệt về tín hiệu giữa các khu vực liền nhau, có thể là giữa mô với mô, mô với mạch máu hoặc giữa mô với xương Tác nhân tương phản trong chụp X quang hoặc CT dựa trên sự khác biệt về mật Ďộ electron giữa các khu vực này Đối với chụp cộng hưởng từ (MRI), cơ chế tạo Ďộ tương phản phức tạp hơn nhiều Sự tương phản xảy ra do kết quả tương tác của chất tương phản với proton trong các phân tử nước xung quanh Tương tác này chịu ảnh hưởng của rất nhiều yếu tố cả bên trong và bên ngoài như mật Ďộ proton hay chuỗi xung MRI Nguyên tắc cơ bản của MRI là dựa trên cộng hưởng từ hạt nhân (nuclear magnetic resonance NMR) Ďi kèm với quá trình hồi phục spin proton trong từ trường Khi các proton bị Ďặt trong từ trường mạnh, spin của chúng sẽ Ďịnh hướng song song cùng hoặc ngược chiều với từ trường ngoài Hình 1.7 minh họa nguyên tắc của phương pháp chụp cộng hưởng từ Trong quá trình Ďịnh hướng này,

số cộng hưởng trong vùng sóng vô tuyến (radio frequency pulse) vào hạt nhân, các proton sẽ hấp thụ năng lượng và bị kích thích lên trạng thái song song ngược chiều Khi ngừng chiếu sóng vô tuyến, hạt nhân bị kích thích sẽ hồi phục trở về trạng thái ban Ďầu có năng lượng thấp hơn (hình 1.7b) Có 2 con Ďường hồi phục: hồi phục dọc (hay hồi phục T1) liên quan Ďến sự giảm từ Ďộ khi trở về trạng thái ban Ďầu

(hình 1.7d) Dựa trên các quá trình hồi phục, các tác nhân tương phản ảnh Ďược

có thể cao hơn so với phức chất Gd tới 10 lần [91]

Hình 1.7: Nguyên tắc chụp ảnh cộng hưởng từ [90]

Ďồ thị R2 theo nồng Ďộ mol của nguyên tử Fe và xác Ďịnh hệ số góc của Ďồ thị

lượng Ďặc trưng cho khả năng tăng Ďộ tương phản ảnh của mỗi chất [92]

Hình 1.8: Ảnh MRI chụp ở chế Ďộ T2 (TE=150 ms) các ống 5-mm với nồng Ďộ hạt

từ bọc mantol khác nhau [93]

sắt từ cần có kích thước và bề mặt thích hợp Sản phẩm thương mại Resovist® Ďược

dụng Ďể phân biệt các thương tổn lành tính so với ác tính Tuy sản phẩm này Ďã dừng sản xuất từ năm 2009 nhưng vẫn Ďược sử dụng phổ biến làm chất so sánh trong các nghiên cứu [94]

Trên cùng lõi từ, bọc bằng poly (ethylene glycol) (PEG), dopamin và các chất bọc khác nhau cho kết quả Ďộ hồi phục MRI khác nhau [96] Theo nghiên cứu này,

2 thông số ảnh hưởng Ďến Ďộ hồi phục là nhóm tạo phức và cách thức chức năng hoá bề mặt Trong Ďó, nhóm cacboxylat có thể làm giảm Ďộ hồi phục của hạt nano

từ

1.3.5 Hệ nano đa chức năng

Xu hướng kết hợp nhiều chức năng trong một hệ vật liệu y sinh học, Ďặc biệt

là trong chuẩn Ďoán và Ďiều trị ung thư Ďược nhiều nhóm nghiên cứu trên thế giới thực hiện

Với lớp vỏ bọc SiO2, thanh nano Fe3O4/SiO2 mang Doxorubicin với Ďộ dài

Hình 1.9: Ảnh MRI của khối u KB trên chuột nude trước (a, c) và 4h sau khi tiêm hạt

từ (b, d) [95]

~520 nm, Ďường kính ~180 nm, từ Ďộ bão hoà ~20 emu/g Ďược nghiên cứu với 2 chức năng: tăng Ďộ tương phản ảnh và mang thuốc Kết quả nghiên cứu cho thấy hệ vật liệu này tạo hiệu ứng làm tối với giá trị r2 cao (192 mM−1 s−1), dung lượng mang thuốc Ďạt 65% và có khả năng nhiệt trị trong Ďiều kiện từ trường tần số 247 kHz và cường Ďộ từ 293-419 Oe (hình 1.10)

Hình 1.10: Hiệu ứng Ďốt nóng cảm ứng của hệ Fe3O4/SiO2 5 mg/ml và Ďồ thị SAR -Tmax

theo cường Ďộ từ trường [97]

folate (Fe3O4/BSA–DEX–FA) có giá trị tốc Ďộ hồi phục r2 rất lớn (hơn 360 mM-1.s

in vivo Hệ vật liệu này Ďồng thời có khả năng hoá trị, làm tăng hiệu quả ức chế

khối u và kéo dài thời gian sống cho chuột mang khối u H22

Nhóm tác giả [98] Ďã chế tạo hệ Ďa chức năng kích thước 35-50 nm trên cơ sở

tương thích sinh học và khả năng hướng Ďích ung thư của hệ Kết quả nghiên cứu in vitro cho thấy hệ vật liệu này làm giảm mạnh Ďộc tính nano, Ďồng thời giảm tỉ lệ hạt

bị bắt bởi các Ďại thực bào Thêm vào Ďó, axit folic trên bề mặt làm tăng khả năng hướng Ďích in vivo, kết quả Ďược thể hiện trên ảnh MRI

3000 ms, TE¼ 13,2 ms)[99]

Các hệ nano kết hợp chức năng quang - từ hiện nay cũng Ďang là hướng nghiên cứu Ďược quan tâm phát triển Hình 1.12 là ảnh hiển vi huỳnh quang của tế bào FR(+) KB Ďược ủ với hạt nano oxit sắt từ bọc poli(acrylic axit) mang thuốc nhuộm huỳnh quang Rhodamine 123 không (PAAIO-Rh123) và có gắn axit folic PAAIO-Rh123-FA-PEG Các hệ nano này Ďược Ďiều chế bằng phương pháp hoá học với 2 chức năng: chụp ảnh cộng hưởng từ và làm Ďầu dò huỳnh quang Hệ PAAIO-Rh123-FA-PEG có từ tính tốt, cho phép hướng Ďích khối u bằng từ trường

phát hiện các yếu tố sinh học liên quan [11] Tính chất quang-từ cũng Ďược khai thác theo cách tương tự trong công trình [100] Năm 2016, polime liên hợp với các nhóm chức cation và anion Ďược phủ lên bề mặt hạt nano từ, sau Ďó kết hợp với các chất Ďánh dấu huỳnh quang với màu sắc khác nhau tạo ra phần vỏ 3 lớp Các lớp vỏ polime này có hiệu suất huỳnh quang lớn, cho phép quan sát Ďược hệ hạt ở nồng Ďộ thấp bên trong tế bào bằng các kĩ thuật huỳnh quang Đặc biệt, dưới tác Ďộng của từ trường ngoài, khả năng nhập bào của hệ nano tăng lên Ďáng kể so với mẫu Ďối chứng [9] Bên cạnh Ďó, hạt nano từ gắn borondipyrromethene có thể Ďánh dấu huỳnh quang và chụp cộng hưởng từ Ďể phát hiện các tổn thương vùng não [101]

huỳnh quang của các chấm lượng tử (quantum dots) trong việc phát hiện tế bào ung thư nhờ tín hiệu huỳnh quang, Ďồng thời mang thuốc Ďể diệt các tế bào này [102, 103]