Nghiên cứu ứng dụng protease trong thuỷ phân phế liệu tôm sú penaeus monodon nhằm tận thu protein phù hợp cho mục đích thực phẩm

I- Tên đề tài: NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PROTEASE TRONG THUỶ PHÂN PHẾ LIỆU TÔM SÚPENAEUS MONODON NHẰM TẬN THU PROTEIN PHÙ HỢP CHO MỤC ĐÍCH THỰC PHẨM II- Nhiệm vụ và nội dung: Nhiệm vụcủa đề tà

Cán bộ hướng dẫn khoa học : TS NGUYỄN LỆ HÀ

Luận văn Thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Công nghệ TP HCMngày … tháng … năm …

Thành phần Hội đồng đánh giá Luận văn Thạc sĩ

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá Luận sau khi Luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV

PHÒNG QLKH – ĐTSĐH Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

TP HCM, ngày … tháng… năm 20

…

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: .ĐỖ TIẾN NAM Giới tính: … Nam

Ngày, tháng, năm sinh: 15-12-1988 Nơi sinh: ….Hải

Hưng Chuyên ngành: .KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG MSHV:…

1441810005 I- Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PROTEASE TRONG THUỶ PHÂN PHẾ LIỆU TÔM SÚPENAEUS MONODON NHẰM TẬN THU PROTEIN PHÙ HỢP CHO MỤC ĐÍCH THỰC PHẨM

II- Nhiệm vụ và nội

dung:

Nhiệm vụcủa đề tài là nghiên cứu ứng dụng protease trong việc thủy phân phế liệu tôm súnhằm thu được protein với hiệu suất cao nhất, nâng cao hiệu quả sản xuất và góp phần giảmthiểu ô nhiễm môi trường

III- Ngày giao nhiệm

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quảnêu trong Luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳcông trình nào khác

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện Luận văn này

đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong Luận văn đã được chỉ rõ nguồngốc

Học viên thực hiện Luận văn

Đỗ Tiến Nam

LỜI CẢM ƠN

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban lãnh đạo nhà trường, quý thầy cô khoaCông nghệ Sinh học – Thực Phẩm – Môi Trường đã khơi nguồn động lực, tin tưởnggiao cho em đề tài đồ án tốt nghiệp “ NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PROTEASE TRONG THUỶ PHÂN PHẾ LIỆU TÔM SÚ PENAEUS MONODON NHẰM TẬN THU PROTEIN PHÙ HỢP CHO MỤC ĐÍCH THỰC PHẨM”

Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến cô TS.Nguyễn Lệ Hà đã tận tìnhhướng dẫn và giúp em từng ngày hoàn thiện đề tài nghiên cứu

Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn và kính chúc quí thầy cô, gia đình và nhữngngười thân yêu luôn dồi dào sức khỏe

Đỗ Tiến Nam

TÓM TẮT

Mục tiêu của đề tài là nghiên cứu ứng dụng enzyme protease - TEGALASE R660L

trong việc thủy phân phế liệu tôm sú nhằm thu được protein với hiệu suất cao nhất.Thông qua nội dung nghiên cứu, một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phânprotein như thời gian thủy phân thích hợp, ảnh hưởng của thời gian, nồng độenzyme cho thuỷ phân đã được xem xét đánh giá nhằm tìm kết quả tối ưu Từ cáckết quả thí nghiệm cho thấy, thời gian thủy phân protein tối ưu nhất là 9h, nồng độenzyme là 0.075% với nhiệt độ là 55oC

Target of this study are enzymatic hydrolysis of protein from head meat of Black

Tigershrimp using protease - TEGALASE R660L Factors affecting the hydrolysis

of protein including time, temperature and concentration were investigated Theexperimental results showed that, the optimal hydrolysis time for the best efficiencywas 9 hours The optimal conditions for the besthydrolysis included temperature55oC combined with the concentration 0.075%

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN……… ……i

LỜI CẢM ƠN……… …….ii

TÓM TẮT……… ……… iii

ABSTRACT……… ………iv

MỤC LỤC……… ……… v

DANH MỤC BẢNG viii

DANH MỤC BIỂU ĐỒ, HÌNHẢNH viii

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Tính cấp thiết của đề tài nghiên cứu 1

Mục đích chung của đề tài nghiên cứu : 2

Phương pháp nghiên cứu : 2

CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN 3

1.1) Nguồn phế liệu tôm .3

1.1.1) Thành phần hóa học trong đầu tôm .3

1.1.2) Tình hình sử dụng nguồn phế liệu đầu và vỏ tôm .4

1.1.3) Hiệu quả môi trường mà đề tài mang lại……… …………6

1.2) Giới thiệu proteaza .6

1.2.1) Giới thiệu chung về protease : 6

1.2.2) Tính chất chung của một enzyme: 8

Giới thiệu Enzyme proteaza sử dụng : 14

1.3) Ứng dụng của proteaza: 14

1.3.1) Trong công nghiệp: 14

1.3.2) Trong nông nghiệp : 15

1.3.3) Trong mỹ phẩm : 15

1.3.4) Trong y học : 15

1.3.5) Trong kỹ nghệ phim ảnh : 16

1.4) Các nghiên cứu trong và ngoài nước về việc sử dụng enzyme proteaza thủy

phân protein .16

1.4.1) Các nghiên cứu trong nước : 16

1.4.2) Các nghiên cứu ngoài nước: 17

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .18

2.1) Nguyên liệu nghiên cứu 18

2.2) Phương pháp nghiên cứu .18

2.2.1) Quy trình nghiên cứu .18

2.2.2) Phương pháp phân tích đã áp dụng: 20

Phương pháp xác định hoạt tính enzyme protease (Phương Pháp Amano) 21

Phương pháp xác định hàm lượng chất khô .21

Phương pháp xác định hàm lượng chất tro 21

2.2.3) Phương pháp xử lý số liệu: 21

2.3) So sánh chi phí lợi ích mở rộng giữa kế hoạch thuỷ phân phế liệu tôm sú nhằm tận thu protein với các phương pháp khác để thấy hiệu quả 21

2.3.1) Phương pháp 1 : Sản xuất thức ăn gia súc : 21

2.3.2) Phương pháp 2 : Tận thu Chitin và Chitosan bằng phương pháp hoá học : 22

2.3.3) Phương pháp 3 : Phương pháp tận thu protein .23

CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 24

3.1) Kết quả nghiên cứu : 24

3.1.1) Ảnh hưởng của nồng độ enzyme, thời gian đến quá trình thuỷ phân ở nhiệt độ 50oC 24

3.1.2) Ảnh hưởng của nồng độ enzyme, thời gian đến quá trình thuỷ phân ở nhiệt 55oC .28

3.1.3) Ảnh hưởng của nồng độ enzyme, thời gian đến quá trình thuỷ phân ở nhiệt độ 60oC .31

3.2) Thảo luận ảnh hưởng của các yếu tố khác nhau đến quá trình thuỷ phân 33

3.2.1) Ảnh hưởng của nhiệt độ : 33

3.2.2) Ảnh hưởng của nồng độ enzyme: 34

3.2.3) Ảnh hưởng của thời gian thuỷ phân .34

3.3) Thành phần hoá học trong đầu tôm trước và sau phản ứng : 35

3.4 ) Hiệu quả kinh tế và khả năng ứng dụng : 36

3.5 ) Thành phần, tính chất nguồn thải và phương pháp xử lý 37

3.5.1) Nguồn thải trong quá trình thủy phân .37

3.5.2) Thành phần và tính chất nước thải 37

3.5.3) Công nghệ có thể áp dụng để xử lý nguồn thải này .38

4.1) Kết luận 39

4.2) Đề xuất cho những nghiên cứu tiếp theo 39

TÀI LIỆU THAM KHẢO 40

PHỤ LỤC 42

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1: Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme từ thực vật ………19

Bảng 2: Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme từ động vật……… 20

Bảng 3: Thành phần hoá học của đầu tôm trước và sau khi thuỷ phân………… 44

DANH MỤC BIỂU ĐỒ, HÌNH ẢNH. Hình 1 : sơ đồ Bố trí thí nghiệm nghiên cứu quá trình thủy phân phế liệu đầu, vỏ tôm………27

Hình 2 : Một số sản phẩm bột cá trên thị trường……… 29

Hình 3 : Kết quả thuỷ phân ở nhiệt độ là 50oC……….31

Hình 4 : Kết quả thuỷ phân ở nhiệt độ là 55oC……….37

Hình 5 : Kết quả thuỷ phân ở nhiệt độ là 60oC……….38

ĐẶT VẤN ĐỀ

Tính cấp thiết của đề tài nghiên cứu

Với diện tích nuôi trồng thuỷ hải sản lớn, Việt Nam là một đất nước có thế mạnh

về nuôi trồng và xuất khẩu thuỷ hải sản Sản lượng thủy sản năm 2013 khoảng 5,9triệu tấn, riêng mặt hàng tôm sú đạt 193.000 tấn tăng 6,4% so với cùng kỳ nămtrước (http:/ / ww w.sea f ood.vasep.c o m v n/Fishe r y S tatist i c s/12 3 _898 7 /Vie t n a m -

seafood-exports -in- 2013.htm).Tương ứng thì hằng năm sẽ có một khối lượngkhổng lồ phế liệu từ tôm được thải ra, vì với tôm chỉ có 65% là ăn được, phần cònlại là đầu và vỏ tôm sẽ được loại bỏ trong quá trình làm sơ chế Nếu không được xử

lý tốt đây sẽ là một mối nguy lớn gây ô nhiễm môi trường, vì vậy, yêu cầu đặt ra làphải xử lý thật hữu dụng nguồn phế thải này Bên cạnh đó trong đầu tôm chứa mộtlượng lớn protein, chitin, chất màu astaxanthin và nhiều hợp chất sinh họckhác.Việcthủy phân protein làm nhằm tạo peptid và acid amin để sử dụng vào các mục đíchkhác nhau trong thực phẩm đã được tiến hành Tuy nhiên việc thuỷ phân bằngphương pháp hoá học, sử dụng các loại acid mạnh hoặc bazơ mạnh như HCl 1M,sodium sulfite, NaOH hay KOH là nguyên nhân tạo ra các sản phẩm phụ có tác hạivới môi trường Vì vậy, thực hiện thủy phân protein từ thịt đầu tôm sú theo phươngpháp enzyme có nhiều thuận lợi trong việc kiểm soát các quá trình thủy phân và do

đó giảm thiểu các phản ứng không mong muốn, nhằmgiảm ô thiểu nguy cơ gâynhiễm môi trường Bên cạnh đó việc sử dụng protease để thuỷ phân như thế nàođểđạt hiệu quả kinh tế cao nhất, tránh gâng lãng phí là điều cần thực hiện Vì vậy đềtài “Nghiên cứu ứng dụng protease trong thuỷ phân phế liệu tôm sú Penaeus

monodon nhằm tận thu protein phù hợp cho mục đích thực phẩm.” được tiến

hành với mong muốn ứng dụng protease để thu được nguồn protein với hiệu suấtcao nhất từ phế liệu tôm sú nhằm nâng cao hiệu quả sản xuất và góp phần giảmthiểu ô nhiễm môi trường

Mục đích chung của đề tài nghiên cứu :

Mục đích chung của đề tài là nghiên cứu ứng dụng enzyme protease - TEGALASE R660L trong việc thủy phân phế liệu tôm sú nhằm thu được protein với hiệu suất

cao nhất So với những nghiên cứu khác từ phế liệu đầu tôm thì tính mới của đề tàinày là sử dụng enzyme công nghiệp và xác định điều kiện tối ưu nhằm cho hiệu suấtcao nhất Bên cạnh đó đề tài này có ý nghĩa về mặt môi trường là tận thu proteintrước cho các mục đích thực phẩm sau đó ta có thể tách chiết để thu chitin vàchitosan,so với một số đề tài khác đã được tiến hành như thu chitin và chitosan từphế liệu tôm bằng phương pháp hoá học thì bên cạnh việc tốn hoá chất để khử cácchất khoáng và protein thì sau khi thu chitin và chitosan ta lại phải tốn nhiều hoáchất để xử lý protein trong nước thải như dùng dung dịch HCl hay dung dịchNaOH,KOH điều chỉnh pH về điểm đông tụ protein nhằm thu hồi protein trong nước thải

vì protein trong phế liệu tôm hàm lượng cao (25% - 28% )

Phương pháp nghiên cứu :

Dựa trên các cơ sở dữ liệu và thông tin liên quan từ nguồn tài liệu tham khảo,nghiên cứu thực hiện bố trí thí nghiệm nhằm ứng dụng enzyme protease -

TEGALASE R660L vào thủy phân phế liệu tôm và thu nhận dịch lọc sau khi thuỷ

phân Dịch lọc được ổn định hàm lượng peptid và axitamin, loại bỏ tủa, và đượctiến hành đo mật độ quang ở bước sóng 660 nm Tuỳ vào nồng độ enzyme, nhiệt độthuỷ phân và thời gian sẽ cho ta kết quả thuỷ phân khác nhau như sau

CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN

1.1) Nguồn phế liệu tôm.

1.1.1) Thành phần hóa học trong đầu tôm.

Thành phần hóa học trong vỏ tôm:chitin 27.2%, canxi 10%, tro 31,7 %, photpho3,16 %, lipit 0.4 % Trong đầu tôm có 25-28% protein, trong đó có 4-5% lizin,2,7% metionin, giàu canxi, photpho, các khoáng vi lượng và chất màu

- Protein: thành phần protein trong phế liệu tôm thường tôn tại ở 2 dạng: dạng

• Dạng phức tạp: ở dạng này protein không hòa tan và thường liên kết

với chitin,canxicacbonat, với lipit tạo thành lipoprotein, với sắc tố tạoproteincarotenoit…như một phần thống nhất quyết định tính bền vữngcủa vỏ tôm

- Chitin: tồn tại dưới dạng liên kết bởi những liên kết đồng hóa trị với cácprotein dưới dạng phức hợp chitin – protein, liên kết với các hợp chất khoáng

và các hợp chất hữu cơ khác gây khó khăn cho việc tách và chiết chúng

- Canxi: trong vỏ, đầu tôm…có chứa một lượng lớn muối vô cơ, chủ yếu làmuối CaCO3, hàm lượng Ca3(PO4)2 mặc dù không nhiều nhưng trong quátrình khử khoáng dễ hình thành hợp chất CaHPO4 không tan trong HCl gâykhó khăn cho quá trình khử khoáng

- Sắc tố: trong vỏ tôm thường có nhiều loại sắc tố nhưng chủ yếu làastaxanthin

1.1.2) Tình hình sử dụng nguồn phế liệu đầu và vỏ tôm.

Vấn đề xử lí phụ phế phẩm (đầu, vỏ) từ tôm và các phế phẩm từ tôm xuất khẩu hiệnnay đang là vấn đề khó khăn Hiện tại, các công ty, cơ sở chế biến thuỷ sản cũng đã

có một số giải pháp:

- Bán tươi (hoặc khô) một phần phụ phế phẩm làm thức ăn gia súc Việc sửdụng tươi phế rất đòi hỏi phải tiến hành nhanh chóng nếu chậm nguồn phếliệu này phân hủy gây ô nhiễm môi trường và là chất độc đối với gia súc, giacầm Việc sấy khô đòi hỏi năng lượng lớn, tốn kém Phơi nắng thì phụ thuộcvào thời tiết, mất vệ sinh, và gây ô nhiễm môi trường Dù phơi nắng hay sấykhô đều không loại được khoáng và chitin mà 2 chất này gây khó tiêu chogia súc, gia cầm Phần phế phẩm dư không bán dược hoặc bỏ làm rác thảigây ô nhiểm môi trường.Giải pháp này không cho giá trị kinh tế cao, nguồnphế phẩm dư không xử lý hết gây ô nhiễm môi trường

- Một vài phương pháp tận dụng nguồn phế thải này làm thức ăn gia súc theophương pháp vi sinh cũng đã được tiến hành : sử dụng vỏ đầu tôm ủ chuanuôi heo Phương pháp này chỉ thực hiện nhỏ giọt, không đồng bộ, hiệu suấtkhông cao, tốn kém

- Sản xuất chitin từ vỏ tôm bằng phương pháp thuỷ phân protein theo phươngpháp hoá học.Quy trình này cần khử protein trong đầu tôm, phương pháp phổbiến hiện nay là khử protein bằng NAOH hoặc KOH Quy trình như sau:

Quy trình khử protein bằng NAOH hoặc KOH

• Khử protein bằng NAOH là phương pháp sử dụng NAOH ở nồng độ thấp để

thủy phân các liên kết peptit của protein không hòa tan tạo thành các dạngpeptit,acid amin hòa tan trong nước và dễ dàng loại bỏ ra khỏi nguyên liệu.Nồng độ NaOH thường dùng được sử dụng trong khoảng 1 – 10 % và ở nhiệt

độ 50

– 100 0C Hiệu quả của quá trình khử protein phụ thuộc vào nhiệt độ, nồng

độ và tỉ lệ của dung dịch với khối lượng vỏ giáp xác Quá trình khử protein thích hợp cũng có thể đạt được bằng việc xử lý với dung dịch KOH.

• Quá trình khử protein thường kèm theo quá trình khử lipid do lipid có

thểphản ứng với kiềm tạo thành xà phòng theo phương trình phản ứng sau:

đến suy giảm chất lượng chitin đồng thời cũng làm giảm chất lượng củaprotein tách ra Bên cạnh đó, quy trình này còn tạo ra một lượng chất thảilớn, trong đó có chứa các chất ăn mòn, các chất lơ lửng khó xử lý với khốilượng lớn Chính vì vậy, cần thiết phải có các biện pháp xử lý trước khithải ra môi trường

Do vậy, việc nghiên cứu và đưa ra giải pháp xử lý protein trong đầu tôm làcần thiết nhằm giảm thiểu chi phí cho việc xử lý, nâng cao giá trị sử dụngcủa phụ, phế phẩm từ tôm Đồng thời nâng cao hiệu quả kinh tế của ngànhcông nghiệp chế biến tôm và hạn chế ô nhiễm môi trường do phụ, phế phẩm

từ tôm cũng như lượng chất thải từ việc xử lý nguồn phế phẩm này

1.1.3) Hiệu quả môi trường mà đề tài mang lại :

- Hàng năm, ngành chế biến thuỷ hải sản thải ra hàng chục ngàn tấn phế liệuđầu và vỏ tôm, chỉ một phần nhỏ của lượng phế thải này thải ra môi trườngcũng đủ làm ô nhiễm nguồn nước, không khí…nếu không được xử lý triệt

để, nguy cơ gây ô nhiễm môi trường là rất lớn

- Các phương pháp xử lý truyền thống đã được thực hiện nhằm tận dụngnguồn phế thải nay, tuy nhiên từ các phương pháp truyền thống như phơi,sấy…sẽ gây ra mùi khó chịu, ảnh hưởng đến môi trường sống và làm việccủa những hộ dân gần các cơ sở tái chế này

- Việc tận dụng nguồn phế thải này bằng phương pháp hoá học sẽ tiêu tốn mộtlượng lớn hoá chất, bên cạnh đó cũng tạo ra một lượng nước thải hóa học vàcác chất phân giải protein thải ra môi trường kéo theo việc phải xử lý nguồnnước thải này nhằm tránh gây ô nhiễm môi trường

Như vậy, việc xử dụng enzyme thủy phân protein mang lại hiệu quả môitrường là rất lơn : vừa tránh được việc dùng hóa chất như NAOH, KOH

để khử protein, bên cạnh đó cũng giảm được phần lớn các chất phân giảiprotein thải ra môi trường góp phần làm giảm nguy cơ gây ô nhiễm môitrường

1.2) Giới thiệu proteaza.

1.2.1) Giới thiệu chung về protease :

- Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ

tế bào,cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng

từ vi sinh vật(vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa ) và động vật(gan, dạ dày bê )

- So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc điểmkhácbiệt Trước hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp baogồm nhiềuenzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân

tử nên rất khótáchra dưới dạng tinh thể đồng nhất

- Cũng do phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh vậtthường cótinh đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thuỷ phân triệt để và đa dạng

- Protease được phân chia thanh hai loại: endopeptidase va exopeptidase.

- Dựa vào vị tri tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase được phân chia

• Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của

chuỗi polypeptidevà giải phóng ra một amino acid hoặc mộtdipeptide

- Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành bốn

nhóm:

• Serin proteinase: la những proteinase chứa nhom –OH của gốc serine

trong trung tâmhoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối vớihoạt động xúc tác của enzyme.Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ:chymotrypsin va subtilisin Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzyme

động vật như chymotrypsin, trypsin, elastase Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme vi khuẩn như subtilisin Carlsberg, subtilisin BPN Các serineproteinase thường hoạt động mạnh ở vung kiềm tính

và thể hiện tính đặc hiệu cơ chấttương đối rộng

• Cysteine proteinase: Các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt động Cystein proteinase bao gồm các proteinase thực vật như papayin, bromelin, một vài protein động vật và proteinase ký sinh chung Các cystein proteinase thường hoạt độngở vùng pH trung tính,

có tính đặc hiệu cơ chất rộng

• Aspartic proteinase: Hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin Nhóm pepsin bao gồm cac enzyme tiêu hóa như : pepsin, chymosin, cathepsin, renin Các asparticproteinase có chứa nhóm

carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở pHtrung tính

• Metallo proteinase: là nhóm proteinase được tim thấy ở vi

khuẩn,nấm

mốc cũng như cac vi sinh vật bậc cao hơn Các metallo proteinase

thường hoạt động vùng pH trung tính va hoạt độ giảm mạnh dưới tacdụng của EDTA

- Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm:

• Protease acid: pH 2-4

• Protease trung tính: pH 7-8

• Protease kiềm: pH 9-11

1.2.2) Tính chất chung của một enzyme:

- Hòa tan được trong nước, dung dịch nước muối sinh lý đệm phosphate trungtính, đệm Tris-HCl và một số dung môi hữu cơ nên dựa vào những đặc tínhnày để tách chiết chúng

- Bị kết tủa thuận nghịch bởi một số muối trung hòa (sulfate amonium),ethanol, acetone…để thu nhận chế phẩm enzyme

- Hoạt tính của enzyme có thể tăng hoặc giảm dưới tác dụng của các chất hoạthóa hay ức chế

- Độ hoạt động của enzyme chịu ảnh hưởng rất lớn bởi các yếu tố: nhiệt độ,

pH môi trường

Yếu tố chính ảnh hưởng hoạt tính enzyme

- Ảnh hưởng của nhiệt độ : giống như các phản ứng hóa học, các phảnứng choenzyme xúc tác phụ thuộc rất nhiều vào nhiệt độ Theo quy luật của phảnứng hóa học thì khi nhiệt độ tăng thì tốc độ phản ứng tăng, nhưng vì bản chấtcủa enzyme là protein nên nhiệ tđộ chỉ tăng cao đến mức nhất định Đa

số các enzyme sẽ bị mất hoạt tính ở nhiệt độ 60oC trở lên, trong nhiệt độthích hợp nếu cứ tăng lên 10oC thì tốc độ phản ứng tăng lên 1,5-2 lần.Nhiệt độ thích hợp của enzyme phụ thuộc vào nhiều yếu tố : thời giantác dụng dài thì nhiệt độ thích hợp của enzyme càng thấp Ngoài ra còn phụ

thuộc vào nồng độ enzyme, nồng độ cơ chất, dạng tồn tại của enzyme cũng

sẽ làm biến đổi tác dung của nhiệt độ

- Ảnh hưởng của pH : enzyme rất nhạy cảm với pH của môitrường.Mỗienzyme chỉ thích hợp ở một pH xác định gọi là pH tối thích củaenzyme

• Một số enzyme hoạt động ở pH thấp như pepsin pH=1,8-2,2 và hoạt

động ở pH cao như tripsine pH=5-9, cùng một số loại enzyme thuđược ở các nguồn khác nhau cũng có pH tối thích khác nhau pH củamôi trường ảnh hưởng tới tốc độ phản ứng có thể do:

- PH làm thay đổi trạng thái ion hóa của các nhóm định chức ở trungtâm hoạt động của enzyme, làm thay đổi khả năng phản ứng của cácnhómnàytrongphản ứng xúc tác và có thể làm thay đổi cấu trúc trungtâm của enzyme

• PH cũng làm thay đổi trạng thái ion hóa cơ chất, tại pH tối thích, phân

tử cơ chất được ion hóa tới trạng thái thích hợp nhất cho sự kết hợpvớienzyme, nhờ đó phản ứng có vận tốc cao nhất

- Ảnh hưởng của thời gian: trong quá trình thủy phân, thời gian tác dụng củaenzyme lên cơ chất có ảnh hưởng tới hoạt động của nó và đến chất lượngcủa sản phẩm Thời gian tác dụng càng dài thì sự tác dụng càng triệt để Mặtkhác nếu thời gian tác dụng quá ngắn thì sự phân giải protein chưa triệt để,như vậy hiệu suất thủy phân thấp gây khó khăn cho công đoạn tiếp theo, gâylãng phí nguyên vật liệu, không tận dụng hết nguyên liệu ban đầu

- Ảnh hưởng của nồng độ muối: muối ăn có tác dụng kìm hãm hoạt độngcủa visinh vật gây thối rữa và các vi sinh vật không chịu muối, có tác dụngbảo quản nguyên liệu trong quá trình thủy phân Mặt khác, muối ăn còn điều

vị mặn tùy theo lượng muối bổ sung vào, ở nồng độ giới hạn cho phép thìthúc đẩy enzyme hoạt động mạnh, nếu vượt qua giới hạn cho phép thì sẽ kìmhãm sự hoạt động của enzyme

- Ảnh hưởng của ion kim loại: một số enzyme không bị ảnh hưởng rõ rệtcủa

sự có mặt hay không có mặt đối với ion kim loại, nhưng có nhiềuenzyme khác chịu ảnh hưởng sâu sắc của nồng độ và bản chất của ion kimloại Có những ion kim loại hầu như tuyệt đối cần thiết cho sự hoạt động củamột số enzyme, nhưng một số ion kim loại lại ức chế hoạt động của enzymenày

- Ảnh hưởng của chất kìm hãm: chất kìm hãm là chất làm yếu hoặcchấm dứttoàn bộ phản ứng của enzyme Có hai loại chất kìm hãm :Kìm hãm cạnh tranh: là những chất kìm hãm thuận nghịch enzyme, cócấu trúc tương tự với cấu trúc cơ chất, do đó có khả năng kết hợp vào trungtâm hoạt động của enzyme, do vậy nó chiếm chổ kết hợp của cơ chất làmgiảm vận tốc xúc tác

Kìm hãm không cạnh tranh: là chất kết hợp ở vị trí khác với trungtâm hoạt động làmthay đổi cấu trúc không gian của phân tử enzyme theohướng không có lợi cho hoạt động xúc tác của enzyme, làm giảm vận tốcphản ứng xúc tác

Ảnh hưởng của chất hoạt hóa : chất hoạt hóa là những chất có khảnănglàm tăng hoạtđộng xúc tác của enzyme hoặc làm cho enzyme ở dạngkhông hoạt động thành dạng hoạt động Chất hoạt hóa có thể làm tăng hayphục hổi hoạt động của enzyme một cách gián tiếp hay trực tiếp.Hoạt hóa không gián tiếp: làm tăng tốc độ phản ứng của enzyme bằng cáchloại trừ chất kìm hãm ra khỏi hỗn hợp phản ứng hoặc tham gia trực tiếpphản ứng, nhưng không tác dụng trực tiếp với phân tử enzyme.Hoạt hóa gián tiếp: chất này có tác dụng trực tiếp vào trung tâm hoạt độngcủa enzyme hoặc làm thay đổi cấu hình không gian của phân tử enzyme theohướng có lợi cho hoạt động xúc tác

- Ảnh hưởng của nồng độ enzyme:

Đối với các phản ứng enzyme, tốc độ phản ứng thủy phân tỉ lệ với nồng enzyme Khi nồng độ enzyme quá cao nếu tiếp tục thêm enzyme, sự biến đổi

của tốc độ thủy phân là không đáng kể Vì vậy, tốt hơn là sử dụng nồng độenzyme thích hợp để đạt hiệu quả thủy phân cực đại và giảm giá thành.

- Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất:

Trong các phản ứng do enzyme và cơ chất, trước hết phải tạo thành phứctrung gian giữa enzyme và cơ chất Sau đó, phức này chuyển hóa tiếp tục tạothành sản phẩm cuối cùng và enzyme tự do, enzyme lại kết hợp với phân tửcủa cơ chất khác Nếu nồng độ cơ chất đầy đủ thích hợp với lượng enzyme sẽlàm quá trình thủy phân diễn ra đều đặn nhanh chóng

ỷ phâncácliên

t động30-

ạt độngtừ

4Bảng 1: Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme từ thực vật

C h y m

LK

của

lysi

Cấu

tạo

từ

3s

i ưu8

p

H tố

i ư

u Bảng 2: Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme từ động vật

Giới thiệu Enzyme proteaza sử dụng :

Enzyme Protease sử dụng ở đây là TEGALASE R660L thủy phân protein trong đầu

tôm thành polypeptid

- Liều lượng: 0.5 - 1kg enzyme/1 tấn protein khô

- Nhiệt độ15-60 độ C Nhiệt độ tối ưu: 50-60 độ C

- Đóng gói: thùng 25kg Dạng lỏng Xuất xứ: Áo

1.3) Ứng dụng của proteaza:

Các protease nói chung được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau

1.3.1) Trong công nghiệp:

- Trong công nghệ thuộc da : Làm mềm lông, sạch lông, bóng da,…

- Công nghệ dệt: Protease VSV làm sạch tơ tằm, làm bong và tách rời các loại

- Sản xuất bia: pepsin, ficin,…rất tốt trong quá trình ổn định chất lượng bia

- Sản xuất chất tẩy rửa: Enzyme có những tác dụng giảm thời gian giặt, giảmlượng nước tiêu thụ

- Trong thực phẩm : do bản chất sinh hóa khác nhau giữa các bộ phận hìnhthái học của động vật thủy sản, người ta có thể sử dụng enzyme để thực hiệnquá trình phân giải một cách có định hướng vào những mục đích như loại da

cá đuối, cá trích, các loại cá da trơn…., tách vỏ hàu, hến, tôm, mực…Phươngpháp cho hiệu suất cao hơn nhiều lần so với thực hiện thủ công hay hóa học

• Bên cạnh đó protease còn có thể làm sạch vảy cá, bóc tách màng và

cơ quan nội tạng thủy sản

• Sử dụng enzyme protease trong tách chiết carotenoprotein từ phế liệucủa quá trình chế biến các loài giáp xác hiện nay là một hướng nghiêncứu đang rất được chú ý vì giúp nâng cao lợi nhuận sản xuất giảm thiểu ô nhiễm môi trường Carotenoprotein từ đầu, vỏ tôm hiện đang rất được quan tâm để sử dụng làm thực phẩm chức năng cho người vìthành phần carotenoid chủ yếu là astaxanthin, một hợp chất chống oxyhóa thiên nhiên

- Công nghệ sữa: sản xuất phomat nhờ enzyme renin…

- Chế biến nước mắm: bromelin, papain rút ngắn thời gian ủ và cải thiệnhương vị nước mắm

- Công nghệ chế biến thịt: Papain, bromelin, ficin…thủy phân protein trong thịt nên làm thịt mềm

- Sản xuất bánh kẹo: tăng mùi vị của bánh, kẹo

1.3.2) Trong nông nghiệp :

Protease được dùng để sản xuất dịch thủy phân làm giàu đạm bổ sung vào thức ăn của lợn và gia cầm

- Ứng dụng đặc tính của papain, trypsin, bromelin…để SX dược phẩm

- Sử dụng enzyme collagenase trong điều trị cơ gân, mạch máu… bị sơ cứng

- Dùng để phân hủy các cục máu đông trong cơ thể, chữa bệnh nghẽn tĩnhmạch…

- Sử dụng các chất hoạt hóa và kìm hãm protease để điều trị các bệnh đặctrưng.

- Sản xuất thuốc làm tăng khả năng tiêu hóa protein của những người bị tiêuhóa kém…

1.3.5) Trong kỹ nghệ phim ảnh :

- Protease từ vi khuẩn được dùng để tái sinh các nguyên liệu như phim điệnảnh, phim Rơnghen…Protease phân giải và hòa tan lớp nhũ tương gelatintrên phim và giấy ảnh, do đó có thể làm sạch và sử dụng trở lại các loại phim

và giấy ảnh quý

1.4) Các nghiên cứu trong và ngoài nước về việc sử dụng enzyme proteaza

thủy phân protein.

- Với nguyên liệu thuỷ sản, trong và ngoàinước đã có một số công trình nghiêncứu về đề tài thuỷ phân protein bằng enzyme nhưng đa phần chỉ dừng lại ởviệc dùng protein nội tại có sẵn trong nguyên liệu thuỷ sản, chưa có côngtrình nào nghiên cứu về việc sử dụng enzyme công nghiệp để thuỷ phânprotein Việc xác định điều kiện tối ưu cho thuỷ phân protein bằng enzymecông nghiệp nhằm tạo hiệu quả kinh tế cao nhất chưa được xác định Hiệntrong và ngoài nước đã có một số công trình nghiên cứu khoa học của các tácgiả như :

1.4.1) Các nghiên cứu trong nước :

• “Nghiên cứu tách chiết và ứng dụng enzyme protease từ tôm sú Penaeus monodon vào chế biến thủy sản” TS Nguyễn Lệ Hà, 2011.

• “Nghiên cứu khả năng thuỷ phân dịch protein của thịt đầu tôm sú bằng enzyme proteaza nội tại “ Trần Thanh Trúc, 2015, tạp chí khoa học, Đại

Học Cần Thơ

• “Ứng dụng phương pháp sinh học để tổng hợp chitin từ phế liệu chế biến

thủy sản”: Bùi Xuân Đông và cộng sự ( 2013)

• “Nghiên cứu ứng dụng protease Bacillus subtilis trong sản xuất bột đạm thủy phân từ cá Mối”, Vũ Ngọc Bội, Trường ĐH thủy sản Nha Trang.

Protease B subtilis thủy phân mạnh thịt cá mối vàcó thể sử dụng enzyme này trong sản xuất bột đạm thủy phân Khi bổ sung protease B subtilis với nồng

độ 0,3% vào hỗn hợp cơ thịt cá mối và thủy phân ở 500C

• Vũ Ngọc Bội, 2004 Nghiên cứu quá trình thủy phân protein cá bằng

Enzyme protease từ B subtilis S5 Luận án tiến sĩ sinh học, trường Khoa học

tự nhiên - Đại học quốc gia TP HCM

• Đỗ Văn Ninh, 2003 Tối ưu hóa quá trình thủy phân protein của

protease

trong thịt cá và thử nghiệm sản xuất sản phẩm mới từ protein được thủy phân Luận án tiến sĩ kỹ thuật, Đại học Thủy sản, Nha Trang.

• Nguyễn Văn Thiết và Đỗ Ngọc Tú, Viện Công Nghệ Sinh Học - Viện KH và

CN Việt Nam, số 2/2006 Phương pháp Enzyme tách chiết Chitin từ vỏ tôm.

• Trần Văn Thảo, 2011“Nghiên cứu sản xuất sản phẩm thủy phân từ đầu tôm

bằng enzyme Flavourzyme và ứng dụng trong sản xuất nước chấm” Đại Học

Thuỷ Sản Nha Trang

1.4.2) Các nghiên cứu ngoài nước:

• Nielsen (2001) nghiên cứu cải tiến phương pháp xác định mức độ thủy phân protein cho kết quả nhanh chóng và chính xác

• Stein (2004) sử dụng protease nội sinh thủy phân nội tạng cá tuyết Đại Tây

Dương cho hiệu suất thủy phân khá cao

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU.

2.1) Nguyên liệu nghiên cứu

- Nguyên liệu để tiến hành nghiên cứu làđầu tôm sú Penaeus monodon được phân

tách trực tiếp tại xưởng sản xuất của Công Ty Cổ Phần Thuỷ Hải Sản Việt Nhật, sau

đó được cấpđông và bảo quảnởnhiệt độ -20oC cho đến khi sử dụng

- Proteaza được mua tại CÔNG TY TNHH THƯƠNG MẠI HÓA CHẤT VÀ

NÔNG SẢN PHƯƠNG TRÂM

2.2) Phương pháp nghiên cứu.

2.2.1) Quy trình nghiên cứu.

Quy trình thuỷ phân được tiến hành qua các bước như sau :

Rửa sạch , để ráo

Gia nhiệt 5 phút , 98oC

Nghiền nhỏ 3-5 mm

Bổ sung Proteaza 0.025% 0.05% 0.075% 0.1% 0.125% 0.15%

Thủy phân ở các nhiệt độ:

Lắng lạnh 4 o C ,2 h

Dịch trong Ly tâm 10000 vòng/ph, 15 phút

Bột nhão protein Sấy Sản phẩm protein

Hình 1 : Sơ đồBố trí thí nghiệm nghiên cứu quá trình thủy phân phế liệu đầu, vỏ tôm