Ứng dụng công nghệ sinh học xử lý rác hữu cơ phục vụ sản xuất nông nghiệp, tỉnh Sóc Trăng

TÓM TẮT Mục tiêu của luận án là phân lập và tuyển chọn các dòng vi khuẩn bản địa để xử lý sinh học rác hữu cơ và sử dụng thành phẩm sau xử lý trong sản xuất nông nghiệp.. Để hoàn thành c

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

MAI THI

ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC

XỬ LÝ RÁC HỮU CƠ PHỤC VỤ SẢN XUẤT

NÔNG NGHIỆP TỈNH SÓC TRĂNG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC

Mã số: 62 42 01 07

2018

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

MAI THI

ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC

XỬ LÝ RÁC HỮU CƠ PHỤC VỤ SẢN XUẤT

NÔNG NGHIỆP TỈNH SÓC TRĂNG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC

Mã số: 62 42 01 07

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN PGS TS Nguyễn Hữu Hiệp

2018

LỜI CÁM ƠN

Với tất cả lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cám ơn PGS TS

Nguyễn Hữu Hiệp đã tận tình hướng dẫn và giúp tôi hoàn thành luận án tiến sĩ

Thầy là người truyền cho tôi lòng nhiệt huyết và thổi lên ngọn lửa đam mê khoa

học; khơi dậy trong tôi sự nỗ lực, tự tin, ý chí kiên cường, cố gắng không ngừng

và không nản lòng trước những khó khăn và thử thách trong suốt tiến trình thực

hiện luận án này

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo Trường Đại học Cần Thơ, Khoa

Sau Đại học, thầy PGS TS Mai Văn Nam, cô Nguyễn Hữu Giao Tiên, cô Châu

Kim Khuyến đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi học tập và nghiên cứu hoàn

thành luận án

Trong tiến trình 5 năm nghiên cứu, tôi đã luôn được sự quan tâm, hỗ trợ

của Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học - Trường

Đại học Cần Thơ Tôi xin chân thành cảm ơn thầy PGS TS Trần Nhân Dũng,

PGS TS Nguyển Văn Thành, PGS TS Ngô Thị Phương Dung, PGS TS

Nguyễn Minh Chơn, PGS TS Trương Trọng Ngôn, TS Nguyễn Đắc Khoa,

TS Trương Thị Bích Vân đã hỗ trợ chuyên môn và giúp tôi có thêm nhiều

nghị lực để hoàn thành luận án

Tôi xin chân thành cảm ơn thầy PGS TS Trần Kim Tính và các anh chị

em phòng thí nghiệm chuyên sâu - Trường Đại học Cần Thơ đã hỗ trợ tôi các

phân tích chuyên sâu về sinh hóa, cán bộ phòng thí nghiệm Vi sinh vật

Nguyễn Thị Thúy Duy và cán bộ phòng Sinh học phân tử Trần Văn Bé Năm

thuộc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học - Trường đại học

Cần Thơ đã hổ trợ tôi về kỹ thuật vi sinh và sinh học phân tử

Anh chị Nghiên cứu sinh, Thạc sĩ Cao Mỹ Phượng, Thạc sĩ Chế Minh

Ngữ, Thạc sĩ Nguyễn Diệp Minh Tân và các em sinh viên đã đồng hành cùng

tôi trong suốt quá trình nghiên cứu

Tôi xin được gởi lời biết ơn đến Lãnh đạo Sở Nội Vụ, Sở Tài nguyên và

Môi trường, Trung tâm Quan Trắc tài nguyên và Môi trường tỉnh Sóc Trăng

đã sắp xếp công việc và tạo điều kiện thuận lợi về thời gian để tôi hoàn thành

kế hoạch học tập toàn khóa trong chương trình đào tạo tiến sĩ

Xin cảm ơn gia đình yêu thương, Ba Má, Ông xã Nguyễn Đăng Khoa,

hai con Khánh, Khanh và các em đã dành cho tôi tất cả tình yêu và sự khuyến

khích, ủng hộ tôi trong những chặn đường cam go để hoàn thành luận án này

Chân thành cám ơn./

Cần Thơ, ngày …… tháng …… năm 2018

TÓM TẮT

Mục tiêu của luận án là phân lập và tuyển chọn các dòng vi khuẩn bản địa để xử lý sinh học rác hữu cơ và sử dụng thành phẩm sau xử lý trong sản xuất nông nghiệp Để hoàn thành các mục tiêu của luận án, các kỹ thuật truyền thống cũng như kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại đã được sử dụng để phân lập và định danh các dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose, tinh bột

và protein từ rác hữu cơ, ruột con sùng đất và trùn đất Kết quả có 213 dòng vi khuẩn đã được phân lập Khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn đa số có dạng tròn hoặc không đều, độ nổi mô hay lài, bìa nguyên hay răng cưa, màu trắng hay trắng sữa; tế bào vi khuẩn phần lớn hình que ngắn, chuyển động và Gram dương Hai mươi dòng vi khuẩn triển vọng có hoạt tính enzyme cellulase, amylase và protease mạnh được chọn để giải trình tự gen 16S rRNA bằng kỹ thuật sinh học phân tử Tất cả các dòng vi khuẩn đều thuộc chi Bacillus gồm

Bacillus subtilis (6 dòng), Bacillus megaterium (5 dòng), Bacillus cereus (2

dòng), Bacillus flexus (2 dòng), Bacillus aquimaris (2 dòng), Bacillus

aryabhattai (1 dòng), Bacillus licheniformis (1 dòng) và Bacillus sp (1 dòng)

Mối quan hệ di truyền của những dòng vi khuẩn này đã được xác lập Các dòng vi khuẩn triển vọng của luận án và 3 chế phẩm sinh học ngoại nhập đã được sử dụng để xử lý rác thải hữu cơ (ủ phân hữu cơ vi sinh) tại bãi rác xã Đại Ngãi, huyện Long Phú, tỉnh Sóc Trăng Sự biến động về mật số vi khuẩn phân hủy, độ pH, nhiệt độ cho thấy sự hoạt động tích cực của vi khuẩn trong các mẻ ủ Thành phần của phân hữu cơ vi sinh thành phẩm đáp ứng được các yêu cầu về hàm lượng C, N, K và chỉ số C/N khi tham chiếu với tiêu chuẩn quy định về chất lượng phân hữu cơ vi sinh của Việt Nam TCVN 7185.2002

Phân hữu cơ vi sinh của luận án được dùng để bón cho dưa leo (Cucumis

sativus L.) và giúp giảm 50% phân hóa học trong khi các chỉ tiêu như chiều

dài trái, đường kính trái, trọng lượng trái, số trái/cây, ngày ra hoa và ngày thu hoạch khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với cách bón phân truyền thống

ở địa phương (100% phân hóa học)

Từ khóa: Bacillus, Cellulose, phân hủy sinh học, protein, tinh bột

ABSTRACT

The purpose of this thesis is isolation and selection of indigenous bacterial strains for the bio-degradation of organic waste and application of its products for agricultural production The traditional techniques as well as modern molecular techniques were used for the isolation and identification of cellulose, starch or protein degrading bacterial strains from organic waste

samples, liquid samples of organic waste, gut of Holotrichia parallela and

Lumbricus terrestris Two hundred and thirteen bacterial strains were isolated

Most of bacterial colonies were round or irregular, convex or raised elevation, entire margin and white color Bacterial cells were almost short rods, motile and Gram positive Twenty promising strains which had good cellulase, amylase and protease activity were chosen for 16S rRNA gene sequencing

using molecular biology technique All of them belonged to Bacillus genus including Bacillus subtilis (6 strains), Bacillus megaterium (5 strains), Bacillus

aquimaris (2 strains), Bacillus cereus (2 strains), Bacillus flexus (2 strains), Bacillus aryabhattai (1 strain), Bacillus licheniformis (1 strain) and Bacillus

sp (1 strain) The phylogenetic relationship of these bacterial strains was analysed The promising strains and 3 imported bio-products were applied in organic waste treatment (composting bio-fertilizer) at organic waste collection station at Dai Ngai commune, Long Phu district, Soc Trang province The fluctuation of beneficial bacteria density, pH, temperature of the compost showed that bacteria effectively worked during composting The final product

of bio-fertilizer containing carbon, potassium, nitrogen content and C/N met the requirement of Vietnamese standard of quality of biofertilizer (TCVN 7185.2002) Our bio-fertilizer was then applied in growing cucumber

(Cucumis sativus L.) and helped to reduce 50% of chemical fertilizer while the

parameters such as fruit length, fruit diameter, fruit weight, fruits/tree, flowering dates and harvesting dates were not significantly different from traditional local fertilizering (100% of chemical fertilizers)

Key words: Bacillus, bio-fertilizer, cellulose, protein, starch

MỤC LỤC

TÓM TẮT i

ABSTRACT ii

MỤC LỤC iii

DANH SÁCH HÌNH vi

DANH SÁCH BẢNG vii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ix

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu của đề tài 1

1.3 Nội dung của luận án 1

1.4 Những đóng góp mới, ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án 2

1.5 Cách tiếp cận và giả thuyết khoa học 2

1.6 Kết cấu của luận án 3

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Tình hình rác thải 4

2.1.1 Tình hình rác thải trên thế giới 4

2.1.2 Tình hình rác thải ở Việt Nam 4

2.1.3 Tình hình rác thải ở Sóc Trăng 4

2.2 Sự phân hủy chất thải hữu cơ 6

2.2.1 Sự phân hủy cellulose 6

2.2.2 Sự phân hủy tinh bột 8

2.2.3 Sự phân hủy protein 9

2.3 Vi sinh vật trong xử lý chất thải hữu cơ 11

2.3.1 Nấm 11

2.3.2 Xạ khuẩn 12

2.3.3 Vi khuẩn 12

2.3.4 Vi khuẩn trong ruột côn trùng 14

2.4 Đặc điểm vi khuẩn Bacillus 15

2.4.1 Đặc điểm hình thái 15

2.4.2 Những chỉ tiêu sinh hóa dùng để định danh vi khuẩn Bacillus 16

2.4.3 Vai trò của vi khuẩn Bacillus 17

2.5 Phân hữu cơ vi sinh 17

2.5.1 Các quá trình sinh hóa trong quá trình ủ phân hữu cơ vi sinh 17

2.5.2 Các yếu tố ảnh hưởng quá trình ủ phân hữu cơ vi sinh 18

2.5.3 Lợi ích của phân hữu cơ vi sinh 20

2.6 Đặc tính sinh học cây dưa leo và kỹ thuật trồng dưa leo 21

2.6.1 Đặc tính sinh học 21

2.6.2 Kỹ thuật trồng cây dưa leo (Cucumis sativus L.) 21

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP 23

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 23

3.2 Phương tiện nghiên cứu 23

3.2.1 Vật liệu 23

3.2.2 Dụng cụ 23

3.2.3 Thiết bị 23

3.2.4 Hóa chất và môi trường 24

3.3 Phương pháp nghiên cứu 26

3.3.1 Phân lập vi khuẩn 26

3.3.2 Quan sát đặc điểm hình thái và sinh hóa của vi khuẩn 27

3.3.3 Khảo sát khả năng phân hủy cellulose, tinh bột và protein 29

3.3.4 Xác định hoạt tính cellulase 29

3.3.5 Xác định hoạt tính amylase 31

3.3.6 Xác định hoạt tính protease 32

3.3.7 Khuếch đại đoạn gene 16S rRNA 33

3.3.8 Giải trình tự đoạn gen 16S rRNA 35

3.3.9 Ứng dụng vi khuẩn xử lý rác hữu cơ 35

3.3.10 Phương pháp xác định mật số vi khuẩn hiếu khí 35

3.3.11 Phương pháp xác định C, N, P, K trong phân hữu cơ 36

3.2.12 Ứng dụng phân hữu cơ trồng dưa leo 36

3.3.13 Xử lý kết quả thí nghiệm 37

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38

4.1 Vi khuẩn phân hủy cellulose từ rác và nước rỉ rác 38

4.1.1 Kết quả phân lập 38

4.1.2 Đặc điểm hình thái và sinh hóa 38

4.1.3 Khả năng phân hủy CMC của các dòng vi khuẩn 42

4.1.4 Kết quả định danh 43

4.2 Vi khuẩn phân hủy cellulose từ ruột sùng đất và trùn đất 45

4.2.1 Kết quả phân lập 45

4.2.2 Đặc điểm hình thái và sinh hóa 45

4.2.3 Khả năng phân hủy CMC của các dòng vi khuẩn 49

4.2.4 Kết quả định danh 52

4.3 Vi khuẩn phân hủy tinh bột từ rác và nước rỉ rác 53

4.3.1 Kết quả phân lập 53

4.3.2 Đặc điểm hình thái và sinh hóa 53

4.3.3 Khả năng phân hủy tinh bột của các dòng vi khuẩn 57

4.3.4 Kế t quả định danh 58

4.4 Vi khuẩn phân hủy tinh bột từ ruột sùng và trùn đất 59

4.4.1 Kết quả phân lập 59

4.4.2 Đặc điểm hình thái và sinh hóa 60

4.4.3 Khả năng phân hủy tinh bột của các dòng vi khuẩn 63

4.4.4 Kết quả định danh 64

4.5 Vi khuẩn phân hủy protein từ rác và nước rỉ rác 66

4.5.1 Kết quả phân lập 66

4.5.2 Đặc điểm hình thái và sinh hóa 66

4.5.3 Khả năng phân hủy protein của các dòng vi khuẩn 69

4.5.4 Kết quả định danh 70

4.6 Vi khuẩn phân hủy protein từ ruột sùng và trùn đất 72

4.6.1 Kết quả phân lập 72

4.6.2 Đặc điểm hình thái và sinh hóa 72

4.6.3 Khả năng phân hủy protein của các dòng vi khuẩn 77

4.6.4 Kết quả định danh 78

4.7 Thảo luận chung 80

4.8 Đánh giá khả năng phân hủy rác thải của các chế phẩm sinh học 82

4.8.1 Mật số vi khuẩn trong quá trình ủ 82

4.8.2 Nhiệt độ và pH trong quá trình ủ nguyên liệu 82

4.8.3 Hàm lượng (%) C, N, P, K và tỷ lệ C/N của mẻ ủ 83

4.9 Kết quả ứng dụng phân hữu cơ vi sinh trồng dưa leo 84

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 86

5.1 Kết luận 86

5.2 Kiến nghị 86

TÀI LIỆU THAM KHẢO 87

PHỤ LỤC 97

DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1: Sự phân cắt cellulose bởi enzyme cellulase 7

Hình 2.2: Cấu trúc phân tử amylose và amylopectin 8

Hình 2.3: Cơ chế phân hủy tinh bột 9

Hình 2.4: Sự hình thành chuỗi polypeptide 10

Hình 2.5: Cấu trúc của protein 10

Hình 2.6: Cơ chế phân hủy protein 11

Hình 2.7: Tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis 16

Hình 4.1: Đĩa trải mẫu nước rỉ rác trên môi trường CMC 1% 38

Hình 4.2: Khuẩn lạc của một số dòng vi khuẩn phân hủy tinh bột 39

Hình 4.3: Vòng sáng phân hủy CMC 42

Hình 4.4: Phổ điện di sản phẩm PCR của hai dòng vi khuẩn triển vọng 44

Hình 4.5: Khuẩn lạc của hai dòng vi khuẩn phân hủy tinh bột 46

Hình 4.6: Vòng sáng phân hủy CMC 50

Hình 4.7: Phổ điện di sản phẩm PCR của bốn dòng vi khuẩn triển vọng 52

Hình 4.8: Khuẩn lạc của một số dòng vi khuẩn phân hủy tinh bột 54

Hình 4.9: Vòng sáng phân hủy tinh bột 58

Hình 4.10: Phổ điện di sản phẩm PCR của hai dòng vi khuẩn triển vọng 58

Hình 4.11: Khuẩn lạc của hai dòng vi khuẩn phân hủy tinh bột 60

Hình 4.12: Vòng sáng phân hủy tinh bột 64

Hình 4.13 Phổ điện di sản phẩm PCR của các dòng vi khuẩn triển vọng 64

Hình 4.14: Đĩa trải mẫu nước rỉ rác trên môi trường peptone 1% 66

Hình 4.15: Khuẩn lạc của hai dòng vi khuẩn phân hủy protein 67

Hình 4.16: Vòng sáng phân hủy skim milk 70

Hình 4.17: Phổ điện di sản phẩm PCR của các dòng vi khuẩn triển vọng 71

Hình 4.18 Đĩa thạch trải ruột sùng đất (A) và ruột trùn đất (B) 72

Hình 4.19: Khuẩn lạc của dòng vi khuẩn TPs40 73

Hình 4.20: Vòng sáng phân hủy skim milk 78

Hình 4.21 Tỷ lệ các loài vi khuẩn đã được định danh 80

Hình 4.22: Mối quan hệ di truyền giữa 20 dòng vi khuẩn triển vọng 81 Hình 4.23: Kết quả phân tích haplotype của 20 dòng vi khuẩn đã định danh 82

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 2.1: Sự phát sinh và thu gom rác thải nông thôn ở tỉnh Sóc Trăng 5

Bảng 2.2: Tổng hợp phân loại rác thải ở chợ trung tâm TP Sóc Trăng 5

Bảng 2.3: Tổng hợp phân loại rác thải tại chợ thị trấn Mỹ Xuyên 6

Bảng 2.4: Tổng hợp phân loại rác thải tại chợ thị trấn Trần Đề 6

Bảng 2.5: Thành phần hóa học của xác thực vật nông nghiệp thường gặp 18

Bảng 3.1: Thành phần các chất trong một phản ứng PCR 34

Bảng 3.2: Các giai đoạn của phản ứng PCR 34

Bảng 4.1: Đặc điểm khuẩn lạc vi khuẩn 39

Bảng 4.2: Đặc điểm tế bào của 26 dòng vi khuẩn 40

Bảng 4.3: Khả năng sinh catalase và đổi màu Methyl red 41

Bảng 4.4: Khả năng phân hủy CMC của 22 dòng vi khuẩn 43

Bảng 4.5: Hoạt tính enzyme endoglucanase và exoglucanase 43

Bảng 4.6: Kết quả so sánh trình tự với dữ liệu NCBI 45

Bảng 4.7: Đặc điểm khuẩn lạc của 50 dòng vi khuẩn 46

Bảng 4.8: Đặc điểm tế bào của 50 dòng vi khuẩn 47

Bảng 4.9: Đặc tính sinh hóa của 50 dòng vi khuẩn 49

Bảng 4.10: Khả năng phân hủy CMC của các dòng vi khuẩn 50

Bảng 4.11: Khả năng phân hủy bột giấy của 10 dòng triển vọng 51

Bảng 4.12: Hoạt tính endoglucanase và exoglucanase 51

Bảng 4.13: Kết quả so sánh trình tự với dữ liệu NCBI 53

Bảng 4.14: Đặc điểm khuẩn lạc của 30 dòng vi khuẩn 54

Bảng 4.15: Đặc điểm tế bào của 30 dòng vi khuẩn 55

Bảng 4.16: Đặc điểm sinh hóa 30 dòng vi khuẩn 56

Bảng 4.17: Khả năng phân hủy tinh bột của 30 dòng vi khuẩn 57

Bảng 4.18: Hoạt tính enzyme amylase của hai dòng triển vọng 58

Bảng 4.19: Kết quả so sánh trình tự với dữ liệu NCBI 59

Bảng 4.20: Đặc điểm khuẩn lạc của 28 dòng vi khuẩn 60

Bảng 4.21: Đặc điểm tế bào của 28 các dòng vi khuẩn 61

Bảng 4.22: Đặc tính sinh hóa 30 dòng vi khuẩn 62

Bảng 4.23 Khả năng phân hủy tinh bột của 27 dòng vi khuẩn 63

Bảng 4.24: Hoạt tính enzyme amylase các dòng vi khuẩn 64

Bảng 4.25: Kết quả so sánh trình tự với dữ liệu NCBI 65

Bảng 4.26: Đặc điểm khuẩn lạc của 29 dòng vi khuẩn 67

Bảng 4.27: Đặc điểm tế bào của 29 dòng vi khuẩn 68

Bảng 4.28: Đặc điểm sinh hóa của 29 dòng vi khuẩn 69

Bảng 4.29: Khả năng phân hủy protein của 29 dòng vi khuẩn 70

Bảng 4.30: Hoạt tính enzyme protease các dòng RPp9, RPs19 và RPg15 70

Bảng 4.31: Kết quả so sánh trình tự với dữ liệu NCBI 72

Bảng 4.32: Đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn 73

Bảng 4.33: Đặc điểm tế bào của 35 dòng vi khuẩn 75

Bảng 4.34: Đặc điểm sinh hóa của 50 dòng vi khuẩn 76

Bảng 4.35: Khả năng phân hủy skim milk của 35 dòng vi khuẩn 77

Bảng 4.36: Hoạt tính protease của 3 dòng triển vọng 78

Bảng 4.37 Kết quả so sánh trình tự với dữ liệu NCBI 79

Bảng 4.38 Tỷ lệ vi khuẩn phân lập theo cơ chất hữu cơ 80

Bảng 4.39 Mật số vi khuẩn phân hủy rác (CFU/g) 82

Bảng 4.40 Sự biến động nhiệt độ (oC) trong quá trình ủ phân 83

Bảng 4.41 Sự biến động pH trong quá trình ủ 83

Bảng 4.42 Sự biến động thành phần (%) C,N , P, K và tỷ lệ C/N của mẻ ủ 84

Bảng 4.43 Ảnh hưởng của phân hữu cơ vi sinh lên cây dưa leo 85

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

ANOVA Analysis of variance

ARN Acid ribonucleic

BOD Biochemical oxygen demand

CMC Carboxymethyl cellulose

COD Chemical oxygen demand

CTR Chất thải rắn

CV Coefficient of variation

DNA Deoxyribonucleic acid

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

LB Luria broth

LSD Least significant difference

NCBI National Center for Biotechnology Information

OD Optical density

PCA Plate count agar

PCR Polymerase chain reaction

TCA Trichloroacetic acid

TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam

USA United States of America

UV Ultraviolet

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề

Cùng với sự gia tăng số lượng và quy mô các ngành nghề sản xuất, sự hình thành các khu dân cư tập trung, nhu cầu tiêu dùng hàng hoá, nguyên vật liệu và năng lượng ngày càng tăng Những sự gia tăng đó đã tạo điều kiện kích thích các ngành sản xuất, kinh doanh và dịch vụ mở rộng và phát triển nhanh chóng, đóng góp tích cực cho sự phát triển kinh tế - xã hội của đất nước Tuy nhiên, song song với sự phát triển mạnh mẽ là sự phóng thích một lượng lớn chất thải vào môi trường, đặc biệt là chất thải rắn như chất thải sinh hoạt, chất thải công nghiệp, chất thải y tế, chất thải nông nghiệp, chất thải xây dựng, chất thải nguy hại… Hiện nay, ô nhiễm môi trường đang là vấn đề cấp bách trên mỗi quốc gia và có rất nhiều phương án để khắc phục, giảm thiểu hậu quả của ô nhiễm môi trường Rác thải sinh hoạt tại Việt Nam, nhất là tại các thành phố lớn chủ yếu được xử lý thô sơ bằng cách vùi tại các bãi chôn lấp, có nguy cơ gây ô nhiễm không khí và

nguồn nước ngầm Tỉnh Sóc Trăng hàng ngày có hơn 248,2 tấn rác thải; hiện nay

tỉnh chưa có quy trình công nghệ xử lý rác đạt yêu cầu mà chủ yếu chỉ đổ vào bãi rác hở chờ phân hủy tự nhiên, vừa chiếm diện tích lớn vừa mất vệ sinh tạo nên những điểm nóng ô nhiễm môi trường nghiêm trọng Chính điều này tác động lớn đến môi trường xung quanh, là nguy cơ tiềm ẩn những dịch bệnh cho con người

và làm cho môi trường ngày càng ô nhiễm Từ những lý do trên, đề tài nghiên

cứu “Ứng dụng công nghệ sinh học xử lý rác hữu cơ phục vụ sản xuất nông

nghiệp, tỉnh Sóc Trăng” góp phần bảo vệ môi trường hướng đến phát triển bền

vững kinh tế - xã hội đi đôi với bảo vệ môi trường đã được thực hiện

1.2 Mục tiêu của đề tài

Phân lập và chọn lọc được các dòng vi khuẩn bản địa để xử lý rác hữu cơ

và ứng dụng phân hữu cơ vi sinh trong sản xuất nông nghiệp tỉnh Sóc Trăng

1.3 Nội dung của luận án

Phân lập và tuyển chọn các dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose, tinh bột và protein triển vọng từ ruột con sùng đất, trùn đất và các bãi rác trên địa bàn tỉnh Sóc Trăng để chế tạo chế phẩm sinh học xử lý rác Thử nghiệm xử lý rác thải hữu cơ bằng vi khuẩn của luận án và so sánh đối chiếu với một số chế phẩm ngoại nhập tại bãi rác Đại Ngãi thuộc bàn tỉnh Sóc Trăng Rác thải hữu cơ sau xử lý được dùng làm phân hữu cơ vi sinh và bón thử nghiệm trên cây dưa leo ở Sóc Trăng

1.4 Những đóng góp mới, ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án

1.4.1 Những đóng góp mới

Hai trăm mười ba dòng vi khuẩn bản địa đã được phân lập có khả năng phân hủy cellulose, tinh bột và protein Trong đó, hai mươi dòng có khả năng phân hủy cellulose, tinh bột và protein triển vọng nhất được định danh dựa vào đặc điểm hình thái, sinh hóa và kỹ thuật sinh học phân tử và đều thuộc chi Bacillus

Việc sử dụng những dòng vi khuẩn triển vọng của luận án thử nghiệm xử

lý rác thải hữu cơ tại bãi rác Đại Ngãi cho kết quả khả quan và hiệu quả xử lý không thua kém những chế phẩm ngoại nhập Việc thử nghiệm bón phân hữu

cơ vi sinh trên cây dưa leo cho thấy phân hữu cơ vi sinh sau khi ủ với các dòng vi khuẩn triển vọng của luận án có hiệu quả ứng dụng nhất định

1.4.2 Ý nghĩa khoa học

Tuyển chọn được các dòng vi khuẩn bản địa có khả năng phân hủy cellulose, tinh bột, protein triển vọng từ các bãi rác, ruột con sùng đất và trùn đất thuộc tỉnh Sóc Trăng Xây dựng được cây phả hệ, mô tả mối quan hệ di truyền giữa các dòng vi khuẩn đã giải trình tự

Các kết quả khoa học của luận án có thể sử dụng bổ sung tài liệu tham khảo về nhóm vi khuẩn phân hủy cellulose, tinh bột và protein và có thể bổ sung giáo trình giảng dạy vi sinh vật môi trường cho Đại học, Cao học và Nghiên cứu sinh

1.5 Cách tiếp cận và giả thuyết khoa học

Vi khuẩn phân hủy cellulose, tinh bột và protein được phân lập trên môi

trường của Shengwei et al (2012) và được kiểm tra các đặc điểm hình thái và

sinh hoá theo mô tả của Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp (2002)

Hoạt tính enzyme endoglucanase, exoglucanase và amylase được xác định bằng phương pháp Nelson-Somogyi (Nelson, 1944) Hoạt tính protease được xác định bằng phương pháp của Cupp-Enyard (2008)

Các kỹ thuật sinh học phân tử dùng trong định danh loài vi khuẩn gồm ly trích DNA (Carr and Kaguni, 2001), phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen 16S rRNA (Lane, 1991), điện di và giải trình tự Cây phả hệ được xây dựng dựa

trên khoảng cách tiến hóa bằng phần mềm phân tích MEGA.5 (Tamura et al.,

2011)

Hàm lượng C, N, P, K trong phân hữu cơ vi sinh được đánh giá dựa theo tiêu chuẩn của TCVN 7185:2002 về chất lượng phân hữu cơ vi sinh thành phẩm Sử dụng phân hữu cơ vi sinh trồng dưa leo, so sánh năng suất và chất lượng trái dưa leo với cách trồng ở địa phương (Trần Thi Lệ và Nguyễn Hồng Phương, 2009)

Số liệu được xử lý thống kê với phần mềm Minitap 17 với phương pháp phân tích phương sai (ANOVA) và kiểm định Fisher (LSD)

1.6 Kết cấu của luận án

Luận án có 3 phần:

- Phần đầu (Tóm tắt, abstract, mục lục, ): 10 trang

- Phần chính luận án gồm 5 chương:

+ Chương 1: Giới thiệu: 3 trang;

+ Chương 2: Tổng quan tài liệu: 19 trang;

+ Chương 3: Phương tiện và phương pháp nghiên cứu: 15 trang;

+ Chương 4: Kết quả và thảo luận: 48 trang;

+ Chương 5: Kết luận : 1 trang

- Phần cuối:

+ Tài liệu tham khảo: 11 trang;

+ Phụ lục: 40 trang

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tình hình rác thải

2.1.1 Tình hình rác thải trên thế giới

Trên thế giới, việc xử lý rác thải được các nước rất quan tâm và thực hiện một cách nghiêm ngặt phải đáp ứng các tiêu chuẩn đối với môi trường Một số nước tiên tiến đã đưa ra các biện pháp tối ưu, áp dụng nhiều kỹ thuật khoa học tiên tiến để tái chế, tái sử dụng các loại rác thải thành sản phẩm có giá trị sử dụng thực tế Thêm vào đó, với sự phát triển của Công nghệ sinh học, đặc biệt

là vi sinh vật học, các nhà nghiên cứu đã ứng dụng thành công nhiều vi sinh vật trong việc xử lý môi trường Các loại vi sinh vật có khả năng tạo ra các hệ enzyme giúp chúng lên men phân hủy rác thải

2.1.2 Tình hình rác thải ở Việt Nam

Theo báo cáo hiện trạng môi trường tỉnh Sóc Trăng (2016), ở Việt Nam, rác thải được xử lý bằng biện pháp đơn giản phổ biến là tái chế, đốt, chôn lấp hoặc ủ phân tùy loại rác Các loại rác như nylon, bìa giấy, chai nhựa, …là các loại rác khó phân hủy được tái chế để dùng làm nguyên liệu cho quá trình sản xuất các sản phẩm giấy và nhựa thứ cấp, còn các loại rác vô cơ được tái chế thành vật liệu xây dựng nhẹ cấp thấp được dùng cho các công trình cảnh quan

đô thị Đối với những loại rác hữu cơ dễ phân hủy và đồng nhất thì thường được ủ phân làm phân bón hữu cơ dùng cho cây trồng

2.1.3 Tình hình rác thải ở Sóc Trăng

Rác thải sinh hoạt tập trung chủ yếu tại thành phố Sóc Trăng, thị trấn và thị tứ thuộc các huyện trên địa bàn tỉnh và chiếm tỷ lệ khoảng 22% với khoảng 248,2 tấn/ngày Do còn nhiều khó khăn như thiếu kinh phí đầu tư, thiếu trang thiết bị thu gom và thiếu công nghệ xử lý nên vấn đề ô nhiễm môi trường từ rác thải diễn ra thường xuyên, tạo áp lực cho quá trình phát triển kinh tế - xã hội, ảnh hưởng xấu tới sức khỏe dân cư và mỹ quan đô thị

Rác thải thải sinh hoạt phát sinh từ nhiều nguồn khác nhau như đời sống của dân cư, các khu dịch vụ, các khu vực chợ, trung tâm thương mại, các địa điểm du lịch, các cơ sở tiểu thủ công nghiệp, hoạt động sản xuất nông nghiệp

và các làng nghề Tổng lượng rác thải sinh hoạt phát sinh trên địa bàn tỉnh khoảng hơn 6.169.258,3 tấn/năm và hơn 80% là rác hữu cơ dễ bị phân hủy (Bảng 2.1, Bảng 2.2, Bảng 2.3 và Bảng 2.4)

Bảng 2.1: Sự phát sinh và thu gom rác thải nông thôn ở tỉnh Sóc Trăng

Huyện, thị xã

Dân số nông thôn1

Chỉ số phát sinh rác thải2 (kg/người/ngày)

Khối lượng phát sinh3 (tấn/ngày)

Khối lượng thu gom4 (tấn/ngày)

Tỷ lệ thu gom5(%)

(1) Số liệu của Cục thống kê tỉnh Sóc Trăng, năm 2015;

(2) Chỉ số phát sinh rác thải sinh hoạt nông thôn: Tính theo Báo cáo môi trường quốc gia Chất thải rắn, 2011;

(3) Số liệu của Xí nghiệp quản lý công trình đô thị thị xã Vĩnh Châu;

(4) Số liệu của Xí nghiệp quản lý công trình đô thị Thị xã Ngã Năm.

Bảng 2.2: Tổng hợp phân loại rác thải ở chợ trung tâm TP Sóc Trăng

giá trị trung bình (%) Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3

Rác hữu cơ (rau củ, trái cây hư,…) 3.659,6 4.390,4 4.493,8 89,92

Nguồn: Báo cáo hiện trạng môi trường chợ tỉnh Sóc Trăng 2016.

Bảng 2.3: Tổng hợp phân loại rác thải tại chợ thị trấn Mỹ Xuyên

Thành phần rác

Mẫu phân loại

Tỷ lệ tính trên gía trị trung bình (%) Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3

Nguồn: Báo cáo hiện trạng môi trường chợ tỉnh Sóc Trăng 2016

Bảng 2.4: Tổng hợp phân loại rác thải tại chợ thị trấn Trần Đề

Thành phần rác

Mẫu phân loại

Tỷ lệ tính trên giá trị trung bình (%) Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3

Rác hữu cơ (rau củ, trái cây hư,…) 711,5 740,4 725,3 85,22

Lông (heo, gà, vịt), đầu tép 12,4 15,0 11,5 1,52

Nguồn: Báo cáo hiện trạng môi trường chợ tỉnh Sóc Trăng 2016

Rác thải sinh hoạt từ nơi phát thải được thu gom và vận chuyển đến bãi rác Sóc Vồ, phường 7, thành phố Sóc Trăng, tỉnh Sóc Trăng để phân loại và

xử lý Rác hữu cơ dễ phân hủy được xử lý bằng phương thức phun trực tiếp chế phẩm sinh học được các phòng Tài nguyên và Môi trường các huyện trong tỉnh Sóc Trăng cung cấp Tuy nhiên công suất và hiệu quả xử lý từ các chế phẩm đó chưa đáp ứng được nhu cầu xử lý

2.2 Sự phân hủy chất thải hữu cơ

2.2.1 Sự phân hủy cellulose

Cellulose là đơn vị cấu thành của sinh khối thực vật, được tìm thấy trong

tự nhiên, nhiều nhất là vách tế bào thực vật Cellulose trong sinh khối thực vật

có thể chiếm 35-50% khối lượng khô (Lynd et al., 1999) Cellulose là một

chất đa phân tử có thể có đến 10.000 đơn phân β-D-glucose, nối với nhau bằng

cầu nối β-1,4-glycoside tạo thành chuỗi thẳng, nhóm hydroxyl của chuỗi thứ nhất tạo liên kết hydro với phân tử oxy của chuỗi bên cạnh, sự liên kết chặt chẽ giữa những chuỗi bên cạnh nhau hình thành cấu trúc tinh thể (crystalline) chắc chắn, rất khó phân hủy Vì cấu trúc mạng lưới vững chắc nên không có một enzyme đơn lẻ nào có thể phân hủy hoàn toàn mà phải có sự phối hợp của

một hệ thống enzyme (Nguyễn Lân Dũng và ctv., 2007)

Theo Nguyễn Đức Lượng và ctv (2004), một phân tử cellulose có cấu

trúc không đồng đều gồm vùng kết tinh và vùng vô định hình Đối với vùng kết tinh, cellulose có cấu trúc trật tự rất cao và rất bền vững Endoglucanase chỉ có tác dụng trên bề mặt hệ sợi này Còn đối với vùng vô định hình, cellulose có cấu trúc không bền và dễ bị tác động bởi các yếu tố bên ngoài Exoglucanase có thể phân hủy vùng này dễ dàng và làm thay đổi toàn bộ cấu

trúc phân tử cellulose (Hình 2.1)

Cellulose được phân hủy hoàn toàn nhờ sự phối hợp của các loại cellulase khác nhau gồm endoglucanase (1,4-β-D-glucan-4 glucanohydrolase), exoglucanase (1,4-β-D-glucan glucohydrolase) và cellobiase (β-glucosidase) (Teeri, 1997) Trong đó, endoglucanase chứa 418 acid amine, có trọng lượng phân tử 42-49 kDa, chúng tham gia phân hủy một cách ngẫu nhiên các liên kết β-1,4-glycoside trong phân tử cellulose để tạo ra các đoạn oligosaccharide có chiều dài khác nhau Exoglucanase cắt đầu không khử của chuỗi cellulose để tạo thành cellobiose và giải phóng từng đơn vị glucose hoặc cellobiose Trọng lượng phân tử của enzyme này từ 53-75 kDa Enzyme cellobiase có trọng lượng phân tử khoảng 50-98 kDa, họat động ở pH 4,4-4,8, phân cắt cellobiose

thành glucose (Saha et al., 2006) (Hình 2.1)

Hình 2.1: Sự phân cắt cellulose bởi enzyme cellulase

Nguồn: Saha et al (2006)

2.2.2 Sự phân hủy tinh bột

Tinh bột là chất rắn vô định hình, màu trắng, không tan trong nước nguội; trong nước nóng từ 65oC trở lên tinh bột chuyển thành hồ tinh bột Tinh bột có nhiều trong các loại hạt (gạo, mì, bắp…), củ (khoai, sắn, …) và quả (táo, chuối,…) Tinh bột gồm hai đại phân tử là amylose và amylopectin Cả hai đều có công thức phân tử là (C6H10O5)n trong đó C6H10O5 là gốc α-D-glucose và n nằm trong khoảng 1000-4000 đối với amylose và 2000-20.000 đối với amylopectin Phân tử amylose gồm các gốc α-D-glucose nối với nhau bởi liên kết α-1,4-glicosidic tạo thành một chuỗi dài không phân nhánh và xoắn thành hình lò xo trong khi amylopectin có cấu trúc phân nhánh do sự liên kết giữa C1 của chuỗi này với C6 của chuỗi kia qua nguyên tử O (gọi là liên kết α-1,6-glycoside) (French, 1973)

Hình 2.2: Cấu trúc phân tử amylose và amylopectin

Nguồn: French (1973)

Theo Marc et al (2002), quá trình phân hủy một phân tử tinh bột có sự

tham gia của 4 nhóm enzyme gồm enzyme phân cắt nhánh (isoamylase và pullulanase), endoamylase (α-amylase), exoamylase (β-amylase, γ-amylase và α-glucosidase) và các transferase (enzyme tạo nhánh, α-1,4-transferase và α-1,6-transferase) Enzyme phân cắt nhánh cắt những liên kết α-1,6-glycoside tạo thành các chuỗi dextrin mạch thẳng Endoamylase hay α-amylase phân cắt ngẫu các liên kết α-1,4-glycoside bên trong phân tử amylose và amylopectin giải phóng hỗn hợp các sản phẩm gồm các oligosaccharides, maltose và α-D-glucose Các sản phẩm từ quá trình phân cắt của α-amylase tiếp tục được phân cắt bởi exoamylase, là enzyme cũng hoạt động trên liên kết α-1,4-glycoside Trong quá trình phân cắt của các exoenzyme, β-amylase chỉ phân cắt liên kết α-1,4-glycoside để tạo thành các sản phẩm như maltose và β-dextrin Enzyme

γ-amylase và α-glucosidase phân cắt cả hai liên kết α-1,4-glycoside và glycoside giải phòng ß-D-glucose Sự hoạt động của transferase gồm có tạo liên kết α-1,6-glycoside giữa các dextrin bởi enzyme tạo nhánh (α-1,6-transferase), tạo cyclodextrin hoặc dextrin bởi α-1,4-transferase (cyclodextrin glycosyltransferase và amylomaltase) Sự hoạt động của transferase thực chất

α-1,6-là phá vỡ liên kết α-1,4-glycoside và thiết lập lại liên kết khác để tạo thành những sản phẩm chuyển hóa (Hình 2.3)

Hình 2.3: Cơ chế phân hủy tinh bột

Nguồn: Marc et al (2002)

2.2.3 Sự phân hủy protein

Protein là những polypeptide có trọng lượng phân tử lớn, đóng vai trò quan trọng về chức năng và cấu trúc của tế bào sinh vật Protein có thể cấu tạo

từ một hay nhiều chuỗi amino acid gọi là polypeptide Các acid amin trong chuỗi polypeptide liên kết bền vững với nhau thông qua liên kết peptide Trong tự nhiên có khoảng 20 acid amin tham gia phản ứng ngẫu nhiên tạo thành các chuỗi polypeptide nên polypeptide rất đa dạng kéo theo sự đa dạng của protein (Hình 2.4) Các acid amin của cùng hoặc khác chuỗi polypeptide cũng có thể liên kết với nhau qua các liên kết như liên kết hydro, liên kết ion

và liên kết disulfide làm cho phân tử protein có cấu trúc đa dạng (Hình 2.5) Một số loại protein như myoglobin và hemoglobin có nhóm heme trong cấu trúc bậc 3 hoặc bậc 4 cho phép các phân tử oxy bám vào (Hình 2.5)

“2 bước”, nhóm trung tính của protease tấn công vào liên kết peptide và cắt chuỗi peptide tạo thành một chuỗi polypeptide mới và một chất trung gian

không bền tạo bởi protease và chuỗi poly peptide còn lại Chất trung gian này

dễ dàng phản ứng với nước hoàn trả lại protease và tạo thêm một chuỗi polypeptide Đến đây quá trình phân hủy protein theo cơ chế “2 bước” kết thúc (Hình 2.6)

Hình 2.6: Cơ chế phân hủy protein

Paecilomyces, Penicillium và Trichoderma Một số loại nấm như Penicillium sp., Sordaria humana, Alternaria alternata, Apiosordaria otanii, ….đã được

ứng dụng trong phân hủy bả mía của các nhà máy sản xuất đường mía (Saim

et al., 2013) Nấm phân hủy tinh bột đa phần đều tiết ra α-amylase có thể phân

hủy tinh bột thô tạo điều kiện để các sinh vật khác tham gia thúc đẩy quá trình phân hủy nhanh hơn Nhiều loài nấm phân hủy tinh bột đã được ứng dụng

trong thực tế như Aspergillus niger, Aspergillus flavus và Rhizopus stolonifer

(thuộc nhóm nấm mốc) được sử dụng phân hủy các phế phẩm của nhà máy

chế biến khoai mì (Pothiraj et al., 2006) hoặc nấm Rhizopus oligosporus dùng trong xứ lý nước thải của nhà máy bột lúa mì (Leeuwen et al., 2012) Nấm còn được dùng trong xử lý chất thải protein như nấm Aspergillus niger dùng để xử

lý nước thải của quá trình chế biến đậu nành (Zhang et al., 2016)

2.3.2 Xạ khuẩn

Xạ khuẩn là sinh vật có kích thước hiển vi, thuộc giới Bacteria và ngành Actinobacteria Xạ khuẩn tồn tại dạng đơn bào hay đa bào tùy giai đoạn sinh trưởng Cũng như vi khuẩn, chúng không có màng nhân và tiểu hạch, vách tế bào không có cellulose hoặc chitin, không giới tính, sinh sản bằng cách phân chia tế bào và sống ký sinh hoặc hoại sinh Xạ khuẩn phân bố rộng rãi trong tự nhiên và tham gia chuyển hóa nhiều hợp chất hữu cơ (cellulose, tinh bột và protein, …) trong môi trường sống của chúng (wikipedia)

Có nhiều loài Actinomycetes như Cellulomonas fimi, Cellulomonas

bioazotea, Cellulomonas duda,… có khả năng tiết ra enzyme cellulase phân

hủy cellulose (Ramesh et al., 2011) và nhiệt độ tối ưu để chúng tham gia phân hủy cellulose là 44ºC (Limaye et al., 2017) Nghiên cứu của Hesham (2007) cho thấy ba loài Micromonospore, Streptomyces và Nocardiodes có khả năng

phân hủy rơm rạ sau thu hoạch làm giàu dinh dưỡng hữu cơ cho đất trồng

Ngoài ra, một số Actinomycetes như Streptomyces drozdowiczii, Streptomyces

lividans có khả năng phân hủy được lignin và hemicellulose là những chất có

cấu trúc phân tử tương tự tương tự như cellulose (Roshan et al., 2013)

Đã có những nghiên cứu cho thấy khả năng phân hủy tinh bột và protein

triển vọng của xạ khuẩn Chẳng hạn như nghiên cứu của Muhammad et al (2014) cho thấy dòng Streptomyces erumpens MTCC 7317 tiết ra enzyme α-

amylase chịu nhiệt và cũng theo tác giả này có khoảng sáu mươi giống Actinomycete phân lập ở vùng Azad Jammu và Kashmir thuộc Pakistan có khả năng tiết amylase ngoại bào được sử dụng thủy phân tinh bột ở quy mô

công nghiệp Đối với khả năng phân hủy protein, Veloorvalappil et al (2013)

đã phân lập được các dòng Streptomyces isolate EGS-5, Streptomyces

microflavus, Streptomyces moderatus, Streptomyces rectus, Streptomyces rectus var proteolythicus, Streptomyces rimosus, Streptomyces sp YSA-130,

tiết ra protease có hoạt tính mạnh và đã được dùng để sản xuất protease thương mại

2.3.3 Vi khuẩn

Ở vi khuẩn có sự khác nhau trong con đường phân hủy cellulose giữa nhóm hiếu khí và kỵ khí Vi khuẩn kỵ khí phân hủy cellulose nhờ phức hệ enzyme trên bề mặt tế bào bao phủ bên ngoài cơ chất và lên men cho sản

phẩm cuối cùng gồm ethanol, acid hữu cơ, CO2, H2O (Rainey et al., 1994) Ở điều kiện hiếu khí, vi khuẩn sử dụng những enzyme ngoại bào phối hợp phân hủy cellulose (Rapp and Beerman,1991) Vi khuẩn phân hủy cellulose thuộc

một trong các chi Bacillus, Pseudomonas, Cytophaga, Clostridium,

Xanthomonas, Acinetobacter, Acidothermus, Anoxybacillus, Salinivibrio, Rhodothermus, Acetivibrio, Butyrivibrio, Acetobutylium, Fibrobacter,

Ruminococcus (Ramesh et al., 2011) Trong xử lý chất thải cellulose, chi

Bacillus giữ vai trò quan trọng hơn hết vì hiệu quả xử lý cao và đã có nhiều

dòng thuộc chi này đã được ứng dụng trong thực tiễn chẳng hạn như Bacillus

subtilis AMS6 được dùng để phân hủy thân cây bắp sau thu hoạch để làm thức

ăn gia súc (Ajay et al., 2016), Bacillus cereus được dùng để xử lý chất thải của

quá trình sản xuất giấy và bột giấy với hiệu quả làm giảm COD và BOD tương

ứng 61% và 66% (Saleem et al., 2014) hay Bacillus subtilis B2 được dùng kết

hợp với các vi sinh vật khác đạt để xử lý rơm nguyên liệu giúp tăng năng suất

nấm rơm (Payapanon et al., 2011) Hầu hết những dòng Bacillus spp đã được

ứng dụng đều có khả năng tổng hợp đầy đủ hệ enzyme cellulase gồm endoglucanase và exoglucanase trong quá trình phân hủy cellulose của chúng (Fergusg, 1977)

Trong môi trường tự nhiên có nhiều loài vi khuẩn có khả năng phân hủy tinh bột thuộc các chi như như Bacillus, Lactobacillus, Clostridium,

Pseudomona, Planococcus,… (Nguyễn Hữu Hiệp và Nguyễn Thị Hải Lý,

2012) Những loài vi khuẩn này tiết ra các loại enzyme trong hệ enzyme

amylase để phân hủy tinh bột thành những hợp chất đơn giản hơn (như glucose) để đáp ứng quá trình sinh tổng hợp của chúng Vi khuẩn phân hủy

tinh bột được dùng trong xử lý chất thải hữu cơ như dòng Bacillus

axarquiensis phân lập từ nước thải của nhà máy chế biến khoai tây Saudi

Snack Foods Company và được làm chế phẩm để xử lý nước thải của chính

nhà máy này (Sulaiman et al., 2014) Một ví dụ khác là Bacillus megaterium

có khả năng tổng hợp enzyme β-amylase và được dùng cùng các vi khuẩn

khác để xử lý nước thải từ các cơ sở chế biến, sản xuất sản phẩm có liên quan

đến tinh bột (Mary et al., 1980)

Protein có thể bị phân hủy bởi nhiều loài vi khuẩn thuộc các chi như

Bacillus, Pseudomonas, Xanhthomonas, Lactobacillus,… (Veloorvalappil et

al., 2013) Hệ enzyme protease của các vi khuẩn phân hủy protein có khác

nhau về điều kiện hoạt động chẳng hạn như alkalophilic protease của

Alkalophilic Bacillus spp có hoạt động rất tốt ở pH cao, enzyme protease của

một số loài như B amyloliquefaciens, B cereus, B licheniformis, B

megaterium, B polymyxa B subtilis, B subtilis và amylosacchariticus,

thermoproteolyticus, B Thurigiensis thì cần Ca2+ và Zn2+ để được bền vững và

hoạt động tốt hơn (Fergusg, 1977) Theo Veloorvalappil et al (2013) thì chi Bacillus có nhiều loài phân hủy protein triển vọng ví dụ như các loài Bacillus

pumilus CBS, Bacillus thermoruber BT2T và Bacillus sp B001 là những loài

tiết ra hoạt tính protease rất mạnh đã được ứng dụng trong việc sản xuất protease thương mại Gần đây nhất, một loài phân hủy protein mạnh đã được

phân lập ở Trung Quốc là Bacillus megaterium SP1 đã được dùng để xử lý nước thải công nghiệp chế biến thủy sản (Liang et al., 2016)

2.3.4 Vi khuẩn trong ruột côn trùng

2.3.4.1 Vi khuẩn trong ruột trùn đất (Lumbricus terrestris)

Trùn đất (Lumbricus terrestris) thuộc bộ Megadrilacea, lớp Oligochaeta

và ngành Annelida sống trong đất ẩm, tơi xốp nơi có nhiều xác thực vật hoai mục (www.ncbi.nlm.nih.gov) Cơ thể trùn đất là một chuỗi các đơn vị giống nhau gọi là các đốt, các đốt này cách nhau bởi một vách ngăn tạo nên những phần riêng biệt của cơ thể; nếu các đốt tương đối giống nhau thì gọi là đốt đồng hình, còn khác nhau thì gọi là dị hình và có thể có lông tơ để hổ trợ di chuyển Tùy theo loài mà trùn đất có kích thước khác nhau từ 10 x 1 mm đến

3000 x 25 mm (www.ncbi.nlm.nih.gov) Các mãnh đất, nơi trùn đất tập trung

nhiều thường rất màu mỡ, tốt cho cây trồng (Lavelle et al., 2004) Trùn đất có

thể sống ở những nơi đất cằn cỗi nhưng với mật số khá thấp và có vai trò cải tạo chất lượng đất tại những nơi này (Brown and Double, 2004)

Nhiều nghiên cứu cho thấy vi khuẩn trong ruột trùn đất rất rất đa dạng và mật số rất cao Theo Parle (1963) mật số vi khuẩn trong ruột trùn đất cao gấp 2,5 lần so với mật số trong môi trường đất mà chúng sinh sống và những vi khuẩn này góp phần tiêu hóa những thành phần hữu cơ mà trùn đưa vào cơ thể Những khảo sát trên các loài vi khuẩn được phân lập từ ruột trùn đất cho thấy chúng có thể phân hủy nhiều chất hữu cơ nhờ hệ enzyme đa dạng như

cellulase, hemicellulase, lignin perosidase, protease và amylase (Fujii et al.,

2012 ; Sumathi and Arockiam, 2013) Năm 2011, Shankar et al cũng phân lập

được 9 dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose trong ruột trùn đất ở Ấn

Độ với hoạt tính cellulase dao động từ 0,035 UI/mL đến 0,127 UI/mL

2.3.2.2 Vi khuẩn trong ruột sùng đất (Holotrichia parallela)

Sùng đất (Holotrichia parallela), thuộc họ Scarabaeidae, bộ Coleoptera,

lớp Insecta và ngành Arthropoda, sống ở những nơi đất tơi xốp, đất pha cát và

lá cây mục, rơm rạ là thức ăn của chúng (www.ncbi.nlm.nih.gov) Vòng đời của sùng đất kéo dài khoảng 1 năm bao gồm 4 giai đoạn: trứng, ấu trùng, nhộng và sùng trưởng thành (bọ rầy) Bọ rầy đẻ vào trong lòng đất và sau

khoảng 15 ngày trứng sẽ nở thành ấu trùng Ấu trùng khi mới nở có kích thước trung bình 4x1,5 cm, có các màu sắc trắng ngà, trắng xanh hoặc màu vàng Cơ thể có 3 cặp chân và rất giống ấu trùng của kiến vương (bọ hung) Ấu trùng sùng đất ẩn mình đưới đất xốp và ăn lá cây mục hay rễ cây trong khoảng 270-

300 ngày trước khi chuyển thành nhộng Tính từ khi sùng đất đã bắt đầu nhả kén để hóa nhộng, chúng phải mất khoảng 10-15 ngày để hoàn tất chiếc kén của mình Và tốn thêm khoảng 20-30 ngày để hoàn toàn lột xác bay ra khỏi kén thành con bọ rầy và sống thêm được tối đa khoảng 30 ngày nữa Sùng đất còn tấn công cả rễ cây (như rễ cây chuối) để làm thức ăn vì vậy chúng cũng là một trong những loại côn trùng phá hoại mùa màng (http://bocanhcung.vn)

Hệ tiêu hóa của sùng đất còn là nơi sinh sống của nhiều chi vi khuẩn với

hệ enzyme đa dạng đặc biệt là cellulase (Shengwei et al., 2012 ; Sheng et al., 2015) Năm 2012, Shengwei et al đã phân lập và định danh được 21 dòng vi

khuẩn trong điều kiện hiếu khí lẫn kỵ khí thuộc nhiều chi vi khuẩn khác nhau như Pseudomonas, Ochrobactrum, Rhizobium, Cellulosimicrobium, Microbacterium, Bacillus, Dyadobacter, Siphonobacter, Paracoccus, Kaistia, Devosia, Labrys, Ensifer, Variovorax, Shinella, Citrobacter và Stenotrophomonas đều có khả năng phân hủy cellulose Trong đó có 11 dòng

bao gồm Siphonobacter aquaeclarae, Cellulosimicrobium funkei, Paracoccus

sulfuroxidans, Ochrobactrum cytisi, Ochrobactrum haematophilum, Kaistia adipata, Devosia riboflavina, Labrys neptuniae, Ensifer adhaerens, Shinella zoogloeoides, Citrobacter freundii và Pseudomonas nitroreducens lần đầu tiên

được công bố về khả năng sản xuất cellulase cho thấy sùng đất là một đối

tượng nghiên cứu nhiều tiềm năng (Shengwei et al., 2012)

2.4 Đặc điểm vi khuẩn Bacillus

2.4.1 Đặc điểm hình thái

Vi khuẩn Bacillus được tìm thấy ở rất nhiều nơi trên thế giới như trong đất, nước ngọt, nước biển, ruột côn trùng, dạ cỏ của động vật nhai lại và nội

sinh trong mô thực vật (Hong et al., 2009; Sushil et al., 2013) Chi Bacillus

thuộc họ Bacillaceae, bộ Bacillales, lớp Bacilli và ngành Firmicutes (Bergey

et al., 1957) Màng tế bào Bacillus có lớp peptidoglycan; tăng trưởng số lượng

bằng hình thức phân chia tách đôi tế bào; một số loài di chuyển được nhờ có chiên mao (Mukherjee và Kearns, 2014) Bacillus là chi vi khuẩn Gram dương, dạng que (Hình 2.7) hoặc đôi khi các tế bào ở dạng chuỗi; nhu cầu oxy

là hiếu khí bắt buộc hoặc kỵ khí tùy nghi; một số loài có thể sống ở nhiệt độ cao nhất đến 55oC (Bergey et al., 1957) Khả năng sinh nội bào tử giúp vi

khuẩn thuộc chi này có thể tồn tại khi gặp một số điều kiện vô cùng khắc

nghiệt như khô hạn hoặc thiếu dinh dưỡng dinh dưỡng (Bergey et al., 1957;

Turnbull, 1996) Tế bào dạng que hoặc chuỗi, không phải loài kỵ khí bắt buộc, Gram dương và sinh nội bào từ là những tiêu chí phải thỏa để nhận diện vi

khuẩn thuộc chi Bacillus (Bergey et al., 1957)

Hình 2.7: Tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis

A) Tế bào Bacillus subtilis dưới kính hiển vi điện tử quét

(https://digital.wwnorton.com)

B) Hình nhuộm Gram vi khuẩn Bacillus subtilis

(https://en.wikipedia.org)

2.4.2 Những chỉ tiêu sinh hóa dùng để định danh vi khuẩn Bacillus

Để định danh được một loài Bacillus sp., bước đầu tiên là phải xác định

được hình dạng tế bào, Gram và khả năng sinh nội bào tử của các loài vi khuẩn mục tiêu Những vi khuẩn Gram dương, tế bào dạng que hoặc chuỗi và

có khả năng sinh nội bào tử được kỳ vọng là những vi khuẩn Bacillus spp

Nếu những vi khuẩn này có thêm khả năng sinh catalase phân hủy H2O2 tức chúng có thể sống được trong điều kiện có oxy thì chúng thuộc chi Bacillus

Để xác định đến loài thì cần kết hợp thêm nhiều chỉ tiêu hình thái lẫn sinh hóa như kích thước tế bào, khả năng di động, khả năng sinh acid với nguồn carbon mannitol và nguồn nitrogen muối amonium, khả năng sinh acetylmethylcarbinol, khả năng làm tan chảy gelatin, khả năng phân giải tinh bột, khả năng sử dụng đường (glucose, xylose, saccharose, lactose), …Ví dụ

như một loài Bacillus sp có đường kính (hay chiều rộng) tế bào lớn hơn

0,9µm và có khả năng sinh acid khi nuôi với mannitol và muối amonium,

không sinh acetylmethylcarbinol thì được nhận diện là Bacillus megaterium Một ví dụ khác khi một loài Bacillus sp có đường kính (hay chiều rộng) tế

bào nhỏ hơn 0,9 µm, sinh trưởng tốt trên môi trường thạch glucose và môi trường thạch đậu nành, có khả năng sinh trưởng khi nuôi nồng độ NaCl 7%, có khả năng phân hủy tinh bột, có khả năng khử nitrate (NO3-) thành nitrite (NO2) trong điều kiện pH kiềm, phát triển tốt khi nuôi kỵ khí trong dung dịch glucose

và làm giảm pH của dịch nuôi ≤5,2 thì loài đó là Bacillus licheniformis (Bergey et al., 1957)

2.4.3 Vai trò của vi khuẩn Bacillus

Vi khuẩn Bacillus đã được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực thực tiễn như lĩnh vực y học, sản xuất dược phẩm, nông nghiệp (gen Bt kháng sâu bệnh từ

loài Bacillus thuringiensis), công nghiệp và xử lý ô nhiễm môi trường Trong

y học và sản xuất dược phẩm, nhiều loài Bacillus spp có khả năng tổng hợp

bacteriocin là các thành phần dùng để bào chế thuốc chẳng hạn như bacitracin

được tổng hợp bởi Bacillus licheniformis B5 là một kháng sinh đã được sử dụng trong thực tiễn (Haddar et al., 2007) Vi khuẩn Bacillus đã được dùng phục vụ nông nghiệp và được biết đến nhiều nhất là loài Bacillus thuringiensis

với gen BT kháng côn trùng được chuyển vào và hoạt động ở nhiều cây nông

nghiệp (Castagnola and Jurat-Fuentes, 2012) Nhiều loài Bacillus spp có thể

tổng hợp nhiều enzyme ngoại bào hữu ích điển hình như amylase, protease, cellulase và lipase đã được ứng dụng và tiếp tục nghiên cứu ứng dụng trong công nghiệp cũng như xử lý ô nhiễm môi trường (Turnbull, 1996; Schallmey

et al., 2004)

Hầu hết vi khuẩn thuộc chi Bacillus không gây bệnh ngoại trừ hai loài là

Bacillus anthracis gây bệnh than (Anthrax) và Bacillus cereus gây ngộ độc

thực phẩm (Turnbull, 1996)

2.5 Phân hữu cơ vi sinh

2.5.1 Các quá trình sinh hóa trong quá trình ủ phân hữu cơ vi sinh

Phân hữu cơ vi sinh bao gồm các chất hữu cơ đã trải qua quá trình phân hủy và các vi sinh vật sống bám trên những chất hữu cơ đó (www.biotechnologyforums.com) Quá trình sinh hóa xảy ra trong quá trình ủ phân hữu cơ vi sinh là sự phân hủy các cơ chất hữu cơ trong nguồn nguyên liệu bởi các vi sinh nhằm để đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng của chúng Các chất hữu cơ bị phân hủy bởi vi sinh vật thông qua rất nhiều loại enzyme đặc hiệu với từng loại cơ chất Ví dụ, cellulose bị phân hủy bởi cellulase tạo thành glucose, H2O và CO2 trong khi protein bị phân cắt bởi protease tại những liên kết peptide giải phóng các chuỗi polypeptide, các acid amin, lưu huỳnh và nitơ (dưới dạng SO42- vật và NH4+) Trải qua quá trình nitrat hóa, NH4+ được chuyển hóa thành NO3- do tác động của những vi khuẩn Nitrosomonas sp và

Nitrobacter sp Vi sinh vật sử dụng các sản phẩm từ quá trình phân hủy cho

quá trình trao đổi chất và tăng trưởng mật số của chúng trong mẻ ủ (Chandrakant and Shwetha, 2011) Đồng thời, các cơ chất hữu cơ cũng bị biến đổi khi nhiệt độ trong mẻ ủ tăng cao

2.5.2 Các yếu tố ảnh hưởng quá trình ủ phân hữu cơ vi sinh

2.5.2.1 Nguyên liệu

Nguồn nguyên liệu dùng để ủ phân hữu cơ rất dồi dào như chất thải cotton, bả mía, rơm rạ và chất thải nông nghiệp; tuy nhiên, nguồn nguyên liệu này chưa được khai thác sử dụng hiệu quả (Bhattacharyya, 2007) Thành phần dinh dưỡng của nguồn nguyên liệu có ảnh hưởng quyết định đến thành phần

dinh dưỡng của phân hữu cơ vi sinh sau khi ủ (Ranalli et al., 2001) Những

nguồn nguyên liệu khác nhau có bản chất sinh hóa khác nhau (Bảng 2.5); vì vậy phải tùy vào loại nguyên liệu mà theo dõi, bổ sung và điều chỉnh các yếu

tố khác một cách phù hợp trong quá trình ủ để có được loại phân hữu cơ vi

sinh như yêu cầu (Benito et al., 2003)

Bảng 2.5: Thành phần hóa học của xác thực vật nông nghiệp thường gặp

được bổ sung thêm vào mẻ ủ Theo nghiên cứu của Hassen et al (2001), trong

các nguồn nguyên liệu dùng để ủ phân vi sinh thì thường chứa sẵn những vi

sinh vật như nấm sợi, nấm men, coliforms và bào tử Bacillus sp., và tùy giai

đoạn ủ mà có những loài chiếm ưu thế riêng Cụ thể, ở giai đoạn nhiệt độ từ

20ºC đến 40ºC thì các loại vi sinh vật như Bacillus sp., Paenibacillus sp.,

Actinomycetes chiếm ưu thế; giai đoạn nhiệt cao từ 40oC đến 60oC thì các loài

coliforms, Pseudomonas sp., Bacillus sp phát triển vượt trội và ở giai đoạn

cuối của quá trình ủ phân hữu cơ khi nhiệt độ giảm xuống thì các loài vi khuẩn

như Pseudomonas sp., Azotobacter sp., Azospirillum sp và Bacillus sp lại chiếm đa số (Hassen et al., 2001; Rebollido et al., 2008; Silva et al., 2009;

Taiwo and Oso, 2004) Việc bổ sung những loài vi sinh vào mẻ ủ là tùy vào

thành phần của nguyên liệu chẳng hạn như các vi sinh vật phân hủy cellulose được bổ sung vào mẻ ủ có thành phần cellulose là chủ yếu để đẩy nhanh quá trình phân hủy cơ chất này Các vi sinh vật còn được bổ sung vào để khử mùi của mẻ ủ Ngoài ra, những vi sinh vật cố định đạm cũng có thể được thêm vào sản phẩm phân hữu cơ vi sinh nhằm giúp cây trồng sử dụng được nguồn đạm dồi dào trong khí quyển

2.5.2.3 Nhiệt độ

Nhiệt độ của mẻ ủ sinh ra bởi sự giải phòng nhiệt năng trong quá trình

phân cắt các cơ chất của nguyên liệu Theo Brito et al., 2008, từ nhiệt độ mẻ ủ

ban đầu là 30oC thì sau khoảng 8 ngày nhiệt độ này tăng đến gần 70oC và bình

ổn cho đến khi giảm ở cuối quá trình ủ Nhiệt độ của mẻ ủ tăng sẽ kéo theo sự phát triển vượt trội của các vi sinh vật ưa nhiệt và cũng giảm mật số đối với những vi sinh vật nhạy nhiệt; do đó ứng với những giai đoạn có nhiệt độ khác

nhau thì hệ vi sinh vật trong mẻ ủ cũng khác nhau (Ryckeboer et al., 2002)

Nhiệt độ ở bên trong mẻ ủ luôn cao hơn bên ngoài mẻ ủ do sự thoát nhiệt ra môi trường Nhiệt độ của mẻ ủ nhìn chung khó điều chỉnh vì vậy khi bổ sung các vi sinh vật vào mẻ ủ cần phải đảm bảo sự phù hợp nhiệt độ ở các giai đoạn đối với loại vi sinh vật được bổ sung

2.5.2.4 Độ ẩm

Độ ẩm là một yếu tố rất quan trọng trong quá trình ủ phân hữu cơ vi sinh

vì cần thiết cho sự phát triển của vi sinh vật cũng như hoạt động của enzyme của các vi sinh vật này Độ ẩm trong mẻ ủ phù hợp nhất khi dao động trong

khoảng 50-60% (Brito et al., 2008) Mẻ ủ phân hữu cơ vi sinh, nếu không đủ

ẩm thì hoạt động của vi sinh vật gặp trở ngại, nếu quá ẩm thì dễ dẫn đến đọng nước rỉ có thể gây thiếu oxy cũng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của vi sinh

vật hiếu khí (Misra et al., 2003)

2.5.2.5 pH

Độ pH của mẻ ủ phân hữu cơ vi sinh thường thay đổi do ảnh hưởng của

vi sinh vật trong suốt quá trình ủ và không nên vượt quá 8 vì pH cao sẽ khiến thất thoát nitơ qua sự giải phóng NH3 Cũng như nhiệt độ, giá trị pH thay đổi

do sự hoạt động của vi sinh vật và thường thấp ở giai đoạn ủ ban đầu (nhiệt độ thấp) và sau đó tăng khi nhiệt độ tăng; sau đó giảm dần và trở nên ổn định khi

mẻ ủ đã hoai mục (Misra et al., 2003)

2.5.2.6 Khí oxy

Nguyên liệu hữu cơ có thể được ủ phân ở điều kiện hiếu khí hoặc yếm

khí tùy thuộc vào nguồn vi sinh vật mà chúng ta sử dụng trong mẻ ủ Nguyên

liệu thường được hoai mục nhanh hơn với sự phân cắt của các vi sinh vật hiếu khí so với vi sinh vật kỵ khí; do đó ủ hiếu khí thường được chuộng hơn trong

việc sản xuất phân hữu cơ vi sinh Ủ hiếu khí yêu cầu lượng lớn oxy đặc biệt

trong giai đoạn đầu Nồng độ oxy trong mẻ ủ phụ thuộc rất nhiều vào độ ẩm

và sự thoáng khí; vì vậy nên xáo trộn định kỳ giúp mẻ ủ thoáng khí và thoát hơi nước, đảm bảo được nồng độ oxy thích hợp trong suốt quá trình ủ (Misra

et al., 2003)

2.5.2.7 Tỷ lệ C/N

C và N là cơ chất chính của vi sinh vật phân hủy chất thải thành phân hữu cơ Nguyên liệu trước khi được sử dụng ủ phân hữu cơ vi sinh cần được kiểm tra tỷ lệ C/N để đảm bảo nguồn dinh dưỡng cho vi sinh vật trong quá trình ủ Nếu tỷ lệ C/N chưa phù hợp thì phải bổ sung cơ chất vào mẻ ủ Phân đạm thường được chọn để bổ sung N vào mẻ ủ Tỷ lệ C/N của nguyên liệu thô tối ưu là khoảng từ 25:1 đến 30:1 Tỷ lệ C/N của sản phẩm cuối cùng nên từ

10:1 đến 15:1 (Misra et al., 2003)

2.5.2.8 Các độc tố

Một vài nguyên liệu hữu cơ có chứa những chất độc đối với các vi khuẩn

ưa nhiệt hiếu khí Các kim loại nặng như mangan, đồng, kẽm, niken, crom, chì thuộc về nhóm này Các kim loại nặng có thể làm bất hoạt về phương diện hóa học trước khi ủ phân Trong một vài loại phân bón hữu cơ vi sinh, các kim loại

nặng tập trung đáng kể (Misra et al., 2003)

2.5.3 Lợi ích của phân hữu cơ vi sinh

Phân hữu cơ vi sinh đã và đang được sử dụng rộng rãi cho cây trồng có khả năng làm tăng độ phì nhiêu của đất và có thể giúp cải tạo đất bạc màu Chất hữu cơ trong phân khi được bón vào đất sẽ tồn tại xen kẽ với các thành phần kết cấu của đất giúp đất giữ ẩm và tạo sự tơi xốp giúp bộ rễ cây hô hấp tối đa và dễ dàng hấp thu các nguồn dinh dưỡng Khi được bón vào đất, những

vi sinh vật trong phân sẽ phát triển giúp cân bằng môi trường của hệ sinh thái đất; vì vậy sẽ hạn chế được phần nào các mầm bệnh trên cây trồng, góp phần

tăng năng suất và chất lượng sản phẩm cây trồng (Ibrahim et al., 2008)

Việc sản xuất và sử dụng phân hữu cơ vi sinh còn giúp tăng hiệu quả kinh tế và làm giảm ô nhiễm môi trường Sử dụng nguồn chất thải hữu cơ từ các hoạt động sinh hoạt và sản xuất để làm phân hữu cơ vi sinh là trực tiếp làm giảm đi yếu tố gây ô nhiễm và cũng là tận dụng nguồn nguyên liệu tiềm năng sẵn có Ngoài ra, khi được dùng song song với phân hóa học, các chất hữu cơ trong phân hữu cơ vi sinh sẽ giúp giữ lại các thành phần dinh dưỡng trong

phân hóa học không bị rữa trôi làm tăng hiệu quả sử dụng phân bón Vì có nhiều lợi ích thực tiễn nên việc sản xuất và sử dụng phân hữu cơ vi sinh được xem là một giải pháp nông nghiệp bền vững được các nhà khoa học khuyến cáo thực hiện (https://www.biotechnologyforums.com)

2.6 Đặc tính sinh học cây dưa leo và kỹ thuật trồng dưa leo

2.6.1 Đặc tính sinh học

Dưa leo (Cucumis sativus L.) thuộc họ bầu bí, thuộc nhóm cây thân thảo

ngắn ngày, thân dài từ 0,5-2,5 m tùy thuộc giống và điều kiện canh tác Lá dưa leo là đơn, to, mọc cách nhau trên thân, có hình dạng gần như hình tam giác với cuống lá dài từ 5-15 cm, bìa lá nguyên hay răng cưa Bộ rễ chỉ phát triển ở tầng đất mặt với độ sâu 30-40 cm Dưa leo có cả hoa lưỡng tính và đơn tính; hoa cái mọc ở nách lá thành từng đôi hay riêng biệt, hoa đực mọc thành cụm

từ 5-7 hoa; hoa có màu vàng, thụ phấn nhờ côn trùng, bầu noãn của hoa cái phát triển rất nhanh ngay trước khi hoa nở Trái dưa leo lúc còn non có gai xù

xì, khi trái lớn thì các gai từ từ mất đi; màu sắc trái chuyển từ màu xanh đậm hoặc xanh nhạt sang màu vàng sậm, nâu hay trắng xanh; trái tăng trưởng rất nhanh tùy theo giống, có thể thu trái từ 8-10 ngày sau khi hoa nở Phẩm chất trái phụ thuộc vào giống và thành phần các chất dinh dưỡng, thể hiện qua độ chặc của thịt trái, độ lớn của ruột trái và hương vị trái Dưa leo có giá trị dinh dưỡng cao được sử dụng phổ biến trong bữa ăn hằng ngày của nhiều dân tộc trên thế giới Trái dưa leo chứa 96% nước, 100 g trái tươi chứa khoảng 0,7 mg protein, 24 mg calcium, 50-80 mg kali, 20 UI vitamine A, 12 mg vitamine C, 0,024 mg vitamine B1, 0,075 mg vitamine B2 và 0,3 mg niacin (http://caab.ctu.edu.vn)

2.6.2 Kỹ thuật trồng cây dưa leo (Cucumis sativus L.)

Ở Việt Nam, dưa leo được trồng ở nhiều nơi và có thể trồng quanh năm, tốt nhất vào mùa nắng Đất trồng dưa leo tốt nhất là đất thịt pha cát nhẹ với nhiều chất hữu cơ và thoáng khí để bộ rễ phát triển Đất trồng dưa leo cũng cần độ pH vừa phải, cụ thể dao động trong khoảng từ 6,5-7,5 Nếu pH đất nhỏ hơn 5,7 thì cần được bón vôi để giảm chua trước khi gieo hạt Đất được lên luống cao khoảng 30 cm, rộng khoảng 120 cm và rãnh rộng khoảng 60 cm (http://caab.ctu.edu.vn)

Hạt giống dưa leo trước khi gieo trồng cần được ngâm trong nước ấm khoảng 4 giờ, vớt ra, để ráo nước, ủ ở nhiệt độ khoảng 30oC trong 24h Sau

đó, hạt dưa leo được gieo vào các lổ lấp với tro trấu ở độ sâu chừng 2-3 cm với số lượng 2-3 hạt/lổ Tạo các lỗ gieo hạt thành hàng đôi, các hàng cách nhau khoảng 60 cm, các lổ cách nhau khoảng 40 cm Làm giàn khi dưa cao

khoảng 30 cm và đã phát triển tay cuốn Có thể dùng các thanh tre dài khoảng 2,5 m cắm trên mặt luống thành hai hàng kiểu chữ A để làm giàn (http://caab.ctu.edu.vn)

Dưa leo cần nhiều dinh dưỡng nhưng lại mẫn cảm khi nồng độ phân bón quá cao; vì thế cần bón thúc nhiều lần Ở giai đoạn đầu sinh trưởng, dưa leo chủ yếu cần đạm; đến giai đạn phân nhánh và đậu trái thì dưa leo hấp thụ rất nhiều kali Công thức phân thường dùng cho dưa leo ở đồng bằng N:140-220 kg/ha; P2O5: 150-180 kg/ha; K2O 120-150 kg/ha Tưới nước, mùa nắng tưới 2 lần trên ngày vào buổi sáng và buổi chiều, cần thoát nước tốt trong mùa mưa

và rút cạn nước dưới mương tránh rễ mọc dài ra mương (http://caab.ctu.edu.vn)

Dưa leo sau khi được trồng khoảng 4 tuần thì có thể thu hoạch trái Tùy giống mà kích thước trái có khác nhau và nằm trong khoảng 10-30 cm chiều dài trái và 1,5 -2,5 cm đường kính trái Khi trái đã đạt kích thước để thu hoạch thì hái trái khoảng 2 ngày thu 1 lần và đến gần 10 lần thì mới hết trái (http://caab.ctu.edu.vn)

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Luận án được thực hiện từ tháng 08/2013 đến tháng 12/2016 tại Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học và phòng thí nghiệm chuyên sâu của trường Đại học Cần Thơ; phòng thí nghiệm Hóa Sinh thuộc Trung tâm Quan trắc Tài nguyên và Môi trường tỉnh Sóc Trăng; các bãi rác trên địa bàn tỉnh Sóc Trăng như bãi rác thị trấn Đại Ngãi (huyện Long Phú), bãi rác thị trấn Trần Đề (huyện Trần Đề), bãi rác thị trấn Kế Sách (huyện Kế Sách) và bãi rác

xã Tân Long (huyện Ngã Năm) và trang trại của Ông Phạm Hữu Lai (ấp Thạnh An 3, xã Thạnh Thới Thuận, huyện Trần Đề, tỉnh Sóc Trăng)

3.2 Phương tiện nghiên cứu

3.2.1 Vật liệu

Ba mẫu rác hữu cơ và ba mẫu nước rỉ rác được thu từ mỗi bãi rác ở các huyện Trần Đề, Kế Sách và Ngã Năm thuộc tỉnh Sóc Trăng Mẫu được lưu trữ trong chai thủy tinh vô trùng, trữ ở 4ºC đến khi sử dụng

Các mẫu sùng gồm 12 con có trọng lượng từ 2,5 g đến 15 g và các mẫu trùn đất gồm 12 con có trọng lượng từ 3 g đến 11 g được thu thập từ những đóng rơm đang hoai mục ở huyện Ngã Năm, tỉnh Sóc Trăng Những mẫu sùng đất và trùn đất được trữ trong thùng có chứa đất mùn hơi ẩm và rơm hoai mục làm thức ăn cho đến khi sử dụng

Các chế phẩm sinh học được dùng trong thí nghiệm ủ phân hữu cơ vi sinh bao gồm chế phẩm sinh học EcoClean 1XF HC được sử dụng để xử lý rác thải hữu cơ nhập khẩu từ Mỹ; chế phẩm sinh học SEMSR xử lý rác do Trung tâm nghiên cứu phát triển công nghệ sinh học Môi trường TP HCM sản xuất; chế phẩm sinh học EM do Trung tâm Ứng dụng Khoa học và Công nghệ Tiền Giang phân phối; những dòng vi khuẩn triển vọng đã được định danh của luận

án Hai tấn rác thải hữu cơ, hạt giống dưa leo và phân bón NPK 16-16-8

3.2.2 Dụng cụ

Đĩa petri, que cấy, que trải, đèn cồn, ống đong, đầu col, eppendorf 1,5mL

và 2,2mL, kẹp, kéo, bình tam giác, chai nhựa, ống nghiệm 10mL, cốc thủy tinh, lame, lammelle, túi nylon, 20 bồn gốm (sức chứa rác 100 kg/bồn) và bạt nylon

3.2.3 Thiết bị

Luận án sử dụng các thiết bị hiện có tại Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ và Trung tâm Quan trắc Tài

nguyên và Môi trường tỉnh Sóc Trăng bao gồm tủ cấy vô trùng Biosafe II ESCO (Đức), máy PCR Perkin Elmer 9700 (Hoa Kỳ), hệ thống chụp hình gel Bio-Rad UV 2000 (Hoa Kỳ), máy ly tâm Eppendorf Centrifuge 5417C (Đức),

bộ điện di một chiều Embi-Tec (Hoa Kỳ), bộ micropipet Bio-rad P10, P20, P200, P1000 (Hoa Kỳ), các loại ống tuýp dùng trích mẫu DNA và để chạy PCR, tủ lạnh -20oC Electrolux Confor Plus (Thụy Điển), máy lắc mẫu 3005 (Đức), nồi khử trùng nhiệt ướt Pbi-international (Ý), máy khuấy từ (Hoa kỳ), máy so màu UV-VIS (Cary 50, Varian-USA), Máy Hấp thu nguyên tử (AA 7000_Shimadzu_Nhật Bản), máy đo pH Sension 378 (Mỹ), nhiệt kế thủy ngân (Trung Quốc), máy ảnh kỹ thuật số và máy vi tính

3.2.4 Hóa chất và môi trường

3.2.4.1 Hóa chất

Hóa chất khử trùng bề mặt mẫu sùng đất và trùn đất gồm ethanol 70º, H2O2 3% và nước cất vô trùng Ngoài ra, H2O2 3% còn được dùng để thử khả năng sinh catalase của các dòng vi khuẩn Chất kháng nấm cycloheximide (0,1 g/L) Thuốc thử lugol gồm các thành phần I2 0,5g, KI 1g và nước cất vừa đủ 100ml Thuốc thử Methyl red gồm 0,1 g Methyl red, 300 mL ethanol 95% và nước cất vừa đủ 500ml

Hóa chất nhuộm Gram gồm có dung dịch Iod (gồm I2 1 g, KI 2 g và NaHCO3 5% 60 mL và nước cất 24 mL), dung dịch fuchsin (fuchsin 1 g, ethanol 95% 100 mL và dung dịch phenol 5% 100 mL) và phẩm nhuộm crystal violet Hóa chất nhuộm bào tử gồm có dung dịch malachite green (7,6%) và dung dịch safarin (0,5%)

Hóa chất xác định hoạt tính enzyme theo phương pháp Nelson-Somogyi gồm dung dịch cơ chất 5%, thuốc thử đồng và thuốc thử asenomolybdate Cơ chất gồm có CMC (endoglucanase), bột cellulose (exoglucanase) hoặc tinh bột (amylase) Thuốc thử đồng được chuẩn bị bằng cách hoà tan hoàn toàn 15 g KNaC4H4O6 và 30 g Na2CO3 khan trong 300 mL nước cất Dùng một bình khác để hòa tan 5 g CuSO4.5H2O với một ít nước cất; sau đó cho toàn bộ dung dịch CuSO4 vào hỗn hợp ban đầu Tiếp tục hòa tan vào đó 20 g NaHCO3 để được dung dịch X Dùng 500 mL nước cất tinh khiết đun sôi với 180 g Na2SO4 trong 10 phút để loại hết khí; để nguội rồi cho vào dung dịch X, thêm nước cất đến 1 lít để được thuốc thử đồng Giữ thuốc thử đồng trong 1 tuần, sau đó lọc trước khi sử dụng.Thuốc thử asenomolybdate được pha bởi hòa tan

50 g [(NH4)6Mo7O24.4H2O] vào trong 900 mL nước cất tinh khiết Thêm từ từ

42 mL H2SO4 vào dung dịch và trộn đều Hòa tan 6 g Na2HAsO4.H2O với 50

mL nước cất tinh khiết vào một bình khác; sau đó cho vào hỗn hợp ban đầu

Hỗn hợp được thêm nước đến 1 lít; giữ hỗn hợp trong tối ở 37oC trong 24 giờ trước khi sử dụng

Hóa chất dùng để xác định hoạt tính protease gồm có dung dịch đệm K2HPO4.3H2O, pH 7,5 (trữ ở 37°C); dung dịch casein 0,65% (hòa tan casein trong K2HPO4.3H2O 50 mM, pH 7,5 ); dung dịch Trichloroacetic acid (TCA)

110 mM; thuốc thử Folin (C10H5NaO5S) 0,5 mM; dung dịch Na2CO3 500 mM; dung dịch pha loãng enzyme gồm dung dịch đệm CH3COONa 10 mM với Ca(CH3COO)2 5mM (pH 7.5, tở tữ 37°C) và dung dịch tyrosin 1,1 mM

Hóa chất dùng để trích DNA từ khuẩn lạc vi khuẩn gồm lysis buffer, ethanol 95%, ethanol 70% và TE (0,1X) Hóa chất dùng để thực hiện phản ứng PCR gồm PCR buffer, MgCl2, đoạn mồi, Taq polymerase, DNA của vi khuẩn

đã phân lập, nước cất hai lần vô trùng và dNTPs Hóa chất dùng để điện di DNA gồm agarose 2%, TBE (Tris/Borate/EDTA) buffer 1X, loading buffer, thang chuẩn và dung dịch Safeview

Hóa chất được dùng để định lượng C, N, P, K trong phân hữu cơ gồm có K2Cr2O7, H2SO4, H3PO4, FeSO4, H2SO4, H2O2, acid ascorbic (vitamin C) và antimon (Sb)

3.2.4.2 Môi trường

Môi trường phân lập các dòng vi khuẩn phân hủy cellulose (môi trường CMC 1%) gồm các thành phần K2HPO2 1,9 g/L, KH2PO4 0,94 g/L, KCl 1,6 g/L, NaCL 1,43 g/L, NH4Cl 0,15 g/L, MgSO4.7H2O 0,037 g/L, CaCl2.2H2O 0,017g/L, yeast extract 0,1 g/L, CMC 10 g/L và agar 18 g/L và chuẩn pH về

7,2 (Shengwei et al., 2012) Thay CMC 10 g/L bằng bột giấy lọc 10 g/L để

được môi trường để kiểm tra khả năng phân hủy bột giấy (môi trường bột giấy)

Môi trường phân lập các dòng vi khuẩn phân hủy tinh bột (môi trường tinh bột 1%) gồm các thành phần K2HPO2 1,9 g/L, KH2PO4 0,94 g/L, KCl 1,6 g/L, NaCL 1,43 g/L, NH4Cl 0,15 g/L, MgSO4.7H2O 0,037 g/L, CaCl2.2H2O 0,017 g/L, yeast extract 0,1 g/L, tinh bột gạo 10 g/L, pH 7,02 và agar 18g/L

(Shengwei et al., 2012)

Môi trường phân lập các dòng vi khuẩn phân hủy protein gồm môi trường peptone, gelatin skim milk Môi trường peptone 1% gồm các thành phần peptone 10 g/L, K2HPO4 1,9 g/L, KH2PO4 0,94 g/L, KCl 1,6 g/L, NaCL 1,43 g/L, NH4Cl 0,15 g/L, MgSO4.7H2O 0,037 g/L, CaCl2.2H2O 0,017 g/L,

yeast extract 0,1 g/L, pH 6,7 và agar 18 g/L (Shengwei et al., 2012) Thay

peptone 10 g/L bằng skim milk 10 g/L hoặc gelatin 10g/L để được môi trường skim milk 1% hoặc môi trường gelatin 1%

Môi trường LB (Luria Broth) dùng để tăng sinh khối vi khuẩn gồm các thành phần tryptone 10g/L, NaCl 10g/L, cao nấm men 5 g/L và chuẩn pH khoảng 7-7,2 (Ronald, 2010) Môi trường LB đặc có thêm agar 20 g/L

Môi trường plate count agar (PCA) dùng để xác định mật số vi khuẩn hiếu khí gồm các thành phần casein 5g/L, yeast extract 2,5 g/L, glucose 1 g/L

và agar 18 g/L, pH 6,8-7,2 (Massa et al., 1998) Dung dịch peptone water

được dùng để pha loãng mẫu khi xác định mật số gồm các thành phần peptone 10g/L, NaCl 5 g/L và pH 6,8-7,2

Môi trường glucose - phosphate dùng để kiểm tra khả năng sinh acid của

vi khuẩn khi môi trường khi có glucose gồm các thành phần peptone 5g/L, glucose 5g/L, K2HPO4 5g/L và chuẩn pH khoảng 7-7,2 (Nguyễn Lân Dũng, 2007)

Môi trường xác định hoạt tính enzyme cellulase gồm các thành phần CMC (để khảo sát endoglucanase) 10 g/L hoặc bột cellulose 10 g/L (để khảo sát exocglucanase), glucose 1 g/L, pepton 50 g/L, yeast extract 25 g/L

Môi trường xác định hoạt tính enzyme amylase gồm các thành phần bacteriological peptone 6 g/L, MgSO4.7H2O 0,5 g/L, KCl 0,5 g/L, tinh bột 1 g/L (Ekunsanmi, 2009)

Môi trường xác định hoạt tính enzyme protease gồm các thành phần galactose 10 g/L, casein 5 g/L, peptone 5,5 g/L, KH2PO4 2g/L, Na2CO3 10 g/L, MgSO4.7H2O 2g/L và pH 8 (Pant et al., 2015)

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Phân lập vi khuẩn

Môi trường phân lập vi khuẩn gồm có môi trường CMC 1%, tinh bột %, peptone 1% và skim milk 1% Trong đó môi trường CMC 1% và tinh bột 1% tương ứng được sử dụng để phân lập vi khuẩn phân hủy cellulose và vi khuẩn phân hủy tinh bột; môi trường peptone 1 % và skim milk 1% được dùng để phân lập vi khuẩn phân hủy protein Cycloheximide (0,1 g/L) được thêm vào môi trường phân lập để kháng nấm

Mẫu rác và nước rỉ rác được pha loãng mẫu với các độ pha loãng 10-1,

10-2, 10-3, 10-4 và 10-5 Sau đó trải đều 0,1 mL mẫu ở các nồng độ lên môi trường phân lập vi khuẩn bằng que trải thủy tinh Sau đó đậy nắp, úp ngược và

ủ hiếu khí ở 30oC trong 72 giờ Đối với sùng và trùn đất, mẫu được rửa sạch

bằng nước cất, khử trùng bề mặt bằng cồn 70o trong 5 phút sau đó bằng H2O2 3% trong 5 phút, mổ lấy ít ruột (khoảng một vòng que cấy) trải đều lên môi trường phân lập bằng que trải thủy tinh, ủ ở 30ºC trong 72 giờ ở điều kiện hiếu

khí (Shengwei et al., 2012; Kumar et al., 2012)

Khi khuẩn lạc phát triển, chọn những khuẩn lạc rời rạc để tách ròng bằng phương pháp cấy ria trên môi trường phân lập Mỗi lần cấy chuyển đều ủ hiếu khí ở 30oC trong 72 giờ Cấy chuyển cho đến khi xuất hiện những khuẩn lạc rời rạc có những đặc điểm hoàn toàn giống nhau thì làm mẫu và quan sát tế bào vi khuẩn trên kính hiển vi để kiểm tra sự đồng nhất của tế bào vi khuẩn Nếu các tế bào đều đồng nhất thì kết luận vi khuẩn đã ròng Vi khuẩn ròng được trữ trong môi trường phân lập ống thạch nghiêng

3.3.2 Quan sát đặc điểm hình thái và sinh hóa của vi khuẩn

số khoảng thước trắc vi nằm trong hai vạch này và suy ra kích thước của tế bào vi khuẩn

Gram của tế bào vi khuẩn được xác định lần lượt theo các bước như sau Nhỏ 1 giọt nước cất vô trùng lên lame, lấy 1 khuẩn lạc cho vào giọt nước, dùng que cấy trải ra cho thật đều Lướt mặt dưới của lame trên ngọn lửa cách khoảng 10 cm vài lần để cố định chúng lên lame Nhỏ 1 hay 2 giọt crystal violet cho phủ vùng mẫu đã được cố định, để 1-2 phút Rửa nước từ 2-3 giây, chậm nhẹ bằng giấy thấm cho khô nước Nhỏ dung dịch iod trong 1-2 phút Rửa nước, chậm nhẹ bằng giấy thấm Rửa bằng ethanol 70% thật nhanh để tẩy sạch màu từ đầu đến cuối lame Rửa với nước vài giây, chậm nhẹ bằng giấy