Nghiên cứu ứng dụng protease trong thuỷ phân phế liệu tôm sú penaeus monodon nhằm tận thu protein phù hợp cho mục đích thực phẩm

I- Tên đề tài: NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PROTEASE TRONG THUỶ PHÂN PHẾ LIỆU TÔM SÚ PENAEUS MONODON NHẰM TẬN THU PROTEIN PHÙ HỢP CHO MỤC ĐÍCH THỰC PHẨM II- Nhiệm vụ và nội dung: Nhiệm vụcủa đề

Cán bộ hướng dẫn khoa học : TS NGUYỄN LỆ HÀ

Luận văn Thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Công nghệ TP HCM ngày … tháng … năm …

Thành phần Hội đồng đánh giá Luận văn Thạc sĩ gồm:

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá Luận sau khi Luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV

PHÒNG QLKH – ĐTSĐH Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

TP HCM, ngày … tháng… năm 20 …

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: ĐỖ TIẾN NAM Giới tính: … Nam

Ngày, tháng, năm sinh: 15-12-1988 Nơi sinh: ….Hải Hưng

Chuyên ngành: KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG MSHV:…1441810005

I- Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PROTEASE TRONG THUỶ PHÂN PHẾ LIỆU TÔM SÚ PENAEUS MONODON NHẰM TẬN THU PROTEIN PHÙ HỢP CHO MỤC ĐÍCH

THỰC PHẨM

II- Nhiệm vụ và nội dung:

Nhiệm vụcủa đề tài là nghiên cứu ứng dụng protease trong việc thủy phân phế liệu tôm sú nhằm thu được protein với hiệu suất cao nhất, nâng cao hiệu quả sản xuất và góp phần giảm

thiểu ô nhiễm môi trường

III- Ngày giao nhiệm vụ:

IV- Ngày hoàn thành nhiệm vụ: 22-08-2016

V- Cán bộ hướng dẫn: TS NGUYỄN LỆ HÀ

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA QUẢN LÝ CHUYÊN NGÀNH

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong Luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện Luận văn này

đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong Luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc

Học viên thực hiện Luận văn

Đỗ Tiến Nam

LỜI CẢM ƠN

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban lãnh đạo nhà trường, quý thầy cô khoa Công nghệ Sinh học – Thực Phẩm – Môi Trường đã khơi nguồn động lực, tin tưởng giao cho em đề tài đồ án tốt nghiệp “ NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PROTEASE TRONG THUỶ PHÂN PHẾ LIỆU TÔM SÚ PENAEUS MONODON NHẰM TẬN THU PROTEIN PHÙ HỢP CHO MỤC ĐÍCH THỰC PHẨM”

Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến cô TS.Nguyễn Lệ Hà đã tận tình hướng dẫn và giúp em từng ngày hoàn thiện đề tài nghiên cứu

Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn và kính chúc quí thầy cô, gia đình và những người thân yêu luôn dồi dào sức khỏe

Đỗ Tiến Nam

TÓM TẮT

Mục tiêu của đề tài là nghiên cứu ứng dụng enzyme protease - TEGALASE R660L

trong việc thủy phân phế liệu tôm sú nhằm thu được protein với hiệu suất cao nhất Thông qua nội dung nghiên cứu, một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân protein như thời gian thủy phân thích hợp, ảnh hưởng của thời gian, nồng độ enzyme cho thuỷ phân đã được xem xét đánh giá nhằm tìm kết quả tối ưu Từ các kết quả thí nghiệm cho thấy, thời gian thủy phân protein tối ưu nhất là 9h, nồng độ enzyme là 0.075% với nhiệt độ là 55oC

ABSTRACT

Target of this study are enzymatic hydrolysis of protein from head meat of Black

Tigershrimp using protease - TEGALASE R660L Factors affecting the hydrolysis

of protein including time, temperature and concentration were investigated The experimental results showed that, the optimal hydrolysis time for the best efficiency was 9 hours The optimal conditions for the besthydrolysis included temperature 55oC combined with the concentration 0.075%

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN……… ……i

LỜI CẢM ƠN……… …….ii

TÓM TẮT……… ……… iii

ABSTRACT……… ………iv

MỤC LỤC……… ……… v

DANH MỤC BẢNG viii

DANH MỤC BIỂU ĐỒ, HÌNHẢNH viii

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Tính cấp thiết của đề tài nghiên cứu 1

Mục đích chung của đề tài nghiên cứu : 2

Phương pháp nghiên cứu : 2

CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN 3

1.1) Nguồn phế liệu tôm 3

1.1.1) Thành phần hóa học trong đầu tôm 3

1.1.2) Tình hình sử dụng nguồn phế liệu đầu và vỏ tôm 4

1.1.3) Hiệu quả môi trường mà đề tài mang lại……… …………6

1.2) Giới thiệu proteaza 6

1.2.1) Giới thiệu chung về protease : 6

1.2.2) Tính chất chung của một enzyme: 8

Giới thiệu Enzyme proteaza sử dụng : 14

1.3) Ứng dụng của proteaza: 14

1.3.1) Trong công nghiệp: 14

1.3.2) Trong nông nghiệp : 15

1.3.3) Trong mỹ phẩm : 15

1.3.4) Trong y học : 15

1.3.5) Trong kỹ nghệ phim ảnh : 16

1.4) Các nghiên cứu trong và ngoài nước về việc sử dụng enzyme proteaza thủy

phân protein 16

1.4.1) Các nghiên cứu trong nước : 16

1.4.2) Các nghiên cứu ngoài nước: 17

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1) Nguyên liệu nghiên cứu 18

2.2) Phương pháp nghiên cứu 18

2.2.1) Quy trình nghiên cứu 18

2.2.2) Phương pháp phân tích đã áp dụng: 20

Phương pháp xác định hoạt tính enzyme protease (Phương Pháp Amano) 21

Phương pháp xác định hàm lượng chất khô 21

Phương pháp xác định hàm lượng chất tro 21

2.2.3) Phương pháp xử lý số liệu: 21

2.3) So sánh chi phí lợi ích mở rộng giữa kế hoạch thuỷ phân phế liệu tôm sú nhằm tận thu protein với các phương pháp khác để thấy hiệu quả 21

2.3.1) Phương pháp 1 : Sản xuất thức ăn gia súc : 21

2.3.2) Phương pháp 2 : Tận thu Chitin và Chitosan bằng phương pháp hoá học : 22 2.3.3) Phương pháp 3 : Phương pháp tận thu protein 23

CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 24

3.1) Kết quả nghiên cứu : 24

3.1.1) Ảnh hưởng của nồng độ enzyme, thời gian đến quá trình thuỷ phân ở nhiệt độ 50oC 24

3.1.2) Ảnh hưởng của nồng độ enzyme, thời gian đến quá trình thuỷ phân ở nhiệt 55oC 28

3.1.3) Ảnh hưởng của nồng độ enzyme, thời gian đến quá trình thuỷ phân ở nhiệt độ 60oC 31

3.2) Thảo luận ảnh hưởng của các yếu tố khác nhau đến quá trình thuỷ phân 33

3.2.1) Ảnh hưởng của nhiệt độ : 33

3.2.2) Ảnh hưởng của nồng độ enzyme: 34

3.2.3) Ảnh hưởng của thời gian thuỷ phân 34

3.3) Thành phần hoá học trong đầu tôm trước và sau phản ứng : 35

3.4 ) Hiệu quả kinh tế và khả năng ứng dụng : 36

3.5 ) Thành phần, tính chất nguồn thải và phương pháp xử lý 37

3.5.1) Nguồn thải trong quá trình thủy phân 37

3.5.2) Thành phần và tính chất nước thải 37

3.5.3) Công nghệ có thể áp dụng để xử lý nguồn thải này 38

4.1) Kết luận 39

4.2) Đề xuất cho những nghiên cứu tiếp theo 39

TÀI LIỆU THAM KHẢO 40

PHỤ LỤC 42

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1: Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme từ thực vật ………19

Bảng 2: Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme từ động vật……… 20

Bảng 3: Thành phần hoá học của đầu tôm trước và sau khi thuỷ phân………… 44

DANH MỤC BIỂU ĐỒ, HÌNH ẢNH Hình 1 : sơ đồ Bố trí thí nghiệm nghiên cứu quá trình thủy phân phế liệu đầu, vỏ tôm………27

Hình 2 : Một số sản phẩm bột cá trên thị trường……… 29

Hình 3 : Kết quả thuỷ phân ở nhiệt độ là 50oC……….31

Hình 4 : Kết quả thuỷ phân ở nhiệt độ là 55oC……….37

Hình 5 : Kết quả thuỷ phân ở nhiệt độ là 60oC……….38

ĐẶT VẤN ĐỀ

Tính cấp thiết của đề tài nghiên cứu

Với diện tích nuôi trồng thuỷ hải sản lớn, Việt Nam là một đất nước có thế mạnh

về nuôi trồng và xuất khẩu thuỷ hải sản Sản lượng thủy sản năm 2013 khoảng 5,9 triệu tấn, riêng mặt hàng tôm sú đạt 193.000 tấn tăng 6,4% so với cùng kỳ năm trước (http://www.seafood.vasep.com.vn/FisheryStatistics/123_8987/Vietnam-seafood-exports -in- 2013.htm).Tương ứng thì hằng năm sẽ có một khối lượng khổng lồ phế liệu từ tôm được thải ra, vì với tôm chỉ có 65% là ăn được, phần còn lại là đầu và vỏ tôm sẽ được loại bỏ trong quá trình làm sơ chế Nếu không được xử

lý tốt đây sẽ là một mối nguy lớn gây ô nhiễm môi trường, vì vậy, yêu cầu đặt ra là phải xử lý thật hữu dụng nguồn phế thải này Bên cạnh đó trong đầu tôm chứa một lượng lớn protein, chitin, chất màu astaxanthin và nhiều hợp chất sinh họckhác.Việc thủy phân protein làm nhằm tạo peptid và acid amin để sử dụng vào các mục đích khác nhau trong thực phẩm đã được tiến hành Tuy nhiên việc thuỷ phân bằng phương pháp hoá học, sử dụng các loại acid mạnh hoặc bazơ mạnh như HCl 1M, sodium sulfite, NaOH hay KOH là nguyên nhân tạo ra các sản phẩm phụ có tác hại với môi trường Vì vậy, thực hiện thủy phân protein từ thịt đầu tôm sú theo phương pháp enzyme có nhiều thuận lợi trong việc kiểm soát các quá trình thủy phân và do

đó giảm thiểu các phản ứng không mong muốn, nhằmgiảm ô thiểu nguy cơ gây nhiễm môi trường Bên cạnh đó việc sử dụng protease để thuỷ phân như thế nào đểđạt hiệu quả kinh tế cao nhất, tránh gâng lãng phí là điều cần thực hiện Vì vậy đề tài “Nghiên cứu ứng dụng protease trong thuỷ phân phế liệu tôm sú Penaeus

monodon nhằm tận thu protein phù hợp cho mục đích thực phẩm.” được tiến

hành với mong muốn ứng dụng protease để thu được nguồn protein với hiệu suất cao nhất từ phế liệu tôm sú nhằm nâng cao hiệu quả sản xuất và góp phần giảm thiểu ô nhiễm môi trường

Mục đích chung của đề tài nghiên cứu :

Mục đích chung của đề tài là nghiên cứu ứng dụng enzyme protease - TEGALASE

R660L trong việc thủy phân phế liệu tôm sú nhằm thu được protein với hiệu suất

cao nhất So với những nghiên cứu khác từ phế liệu đầu tôm thì tính mới của đề tài này là sử dụng enzyme công nghiệp và xác định điều kiện tối ưu nhằm cho hiệu suất cao nhất Bên cạnh đó đề tài này có ý nghĩa về mặt môi trường là tận thu protein trước cho các mục đích thực phẩm sau đó ta có thể tách chiết để thu chitin và chitosan,so với một số đề tài khác đã được tiến hành như thu chitin và chitosan từ phế liệu tôm bằng phương pháp hoá học thì bên cạnh việc tốn hoá chất để khử các chất khoáng và protein thì sau khi thu chitin và chitosan ta lại phải tốn nhiều hoá chất để xử lý protein trong nước thải như dùng dung dịch HCl hay dung dịchNaOH, KOH điều chỉnh pH về điểm đông tụ protein nhằm thu hồi protein trong nước thải

vì protein trong phế liệu tôm hàm lượng cao (25% - 28% )

Phương pháp nghiên cứu :

Dựa trên các cơ sở dữ liệu và thông tin liên quan từ nguồn tài liệu tham khảo, nghiên cứu thực hiện bố trí thí nghiệm nhằm ứng dụng enzyme protease -

TEGALASE R660L vào thủy phân phế liệu tôm và thu nhận dịch lọc sau khi thuỷ

phân Dịch lọc được ổn định hàm lượng peptid và axitamin, loại bỏ tủa, và được tiến hành đo mật độ quang ở bước sóng 660 nm Tuỳ vào nồng độ enzyme, nhiệt độ thuỷ phân và thời gian sẽ cho ta kết quả thuỷ phân khác nhau như sau

CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN

1.1) Nguồn phế liệu tôm

1.1.1) Thành phần hóa học trong đầu tôm

Thành phần hóa học trong vỏ tôm:chitin 27.2%, canxi 10%, tro 31,7 %, photpho 3,16 %, lipit 0.4 % Trong đầu tôm có 25-28% protein, trong đó có 4-5% lizin,

2,7% metionin, giàu canxi, photpho, các khoáng vi lượng và chất màu

- Protein: thành phần protein trong phế liệu tôm thường tôn tại ở 2 dạng: dạng

tự do và dạng liên kết

• Dạng tự do: dạng này là tồn tại ở phần thịt tôm từ một số tôm bị biến đổi và vứt đi lẫn vào phế liệu hoặc phần đầu và thịt còn sót lại trong đầu và nội tạng của tôm Nếu công nhân vặt đầu không đúng kĩ thuật thì phần protein bị tổn thất vào phế liệu nhiều làm tăng tiêu hao nguyên vật liệu, mặt khác phế liệu này khó xử lý hơn

• Dạng phức tạp: ở dạng này protein không hòa tan và thường liên kết với chitin,canxicacbonat, với lipit tạo thành lipoprotein, với sắc tố tạo proteincarotenoit…như một phần thống nhất quyết định tính bền vững

của vỏ tôm

- Chitin: tồn tại dưới dạng liên kết bởi những liên kết đồng hóa trị với các protein dưới dạng phức hợp chitin – protein, liên kết với các hợp chất khoáng

và các hợp chất hữu cơ khác gây khó khăn cho việc tách và chiết chúng

- Canxi: trong vỏ, đầu tôm…có chứa một lượng lớn muối vô cơ, chủ yếu là muối CaCO3, hàm lượng Ca3(PO4)2 mặc dù không nhiều nhưng trong quá trình khử khoáng dễ hình thành hợp chất CaHPO4 không tan trong HCl gây khó khăn cho quá trình khử khoáng

- Sắc tố: trong vỏ tôm thường có nhiều loại sắc tố nhưng chủ yếu là astaxanthin

1.1.2) Tình hình sử dụng nguồn phế liệu đầu và vỏ tôm

Vấn đề xử lí phụ phế phẩm (đầu, vỏ) từ tôm và các phế phẩm từ tôm xuất khẩu hiện nay đang là vấn đề khó khăn Hiện tại, các công ty, cơ sở chế biến thuỷ sản cũng đã

có một số giải pháp:

- Bán tươi (hoặc khô) một phần phụ phế phẩm làm thức ăn gia súc Việc sử dụng tươi phế rất đòi hỏi phải tiến hành nhanh chóng nếu chậm nguồn phế liệu này phân hủy gây ô nhiễm môi trường và là chất độc đối với gia súc, gia cầm Việc sấy khô đòi hỏi năng lượng lớn, tốn kém Phơi nắng thì phụ thuộc vào thời tiết, mất vệ sinh, và gây ô nhiễm môi trường Dù phơi nắng hay sấy khô đều không loại được khoáng và chitin mà 2 chất này gây khó tiêu cho gia súc, gia cầm Phần phế phẩm dư không bán dược hoặc bỏ làm rác thải gây ô nhiểm môi trường.Giải pháp này không cho giá trị kinh tế cao, nguồn phế phẩm dư không xử lý hết gây ô nhiễm môi trường

- Một vài phương pháp tận dụng nguồn phế thải này làm thức ăn gia súc theo phương pháp vi sinh cũng đã được tiến hành : sử dụng vỏ đầu tôm ủ chua nuôi heo Phương pháp này chỉ thực hiện nhỏ giọt, không đồng bộ, hiệu suất không cao, tốn kém

- Sản xuất chitin từ vỏ tôm bằng phương pháp thuỷ phân protein theo phương pháp hoá học.Quy trình này cần khử protein trong đầu tôm, phương pháp phổ biến hiện nay là khử protein bằng NAOH hoặc KOH Quy trình như sau:

Quy trình khử protein bằng NAOH hoặc KOH

• Khử protein bằng NAOH là phương pháp sử dụng NAOH ở nồng độ thấp để thủy phân các liên kết peptit của protein không hòa tan tạo thành các dạng peptit,acid amin hòa tan trong nước và dễ dàng loại bỏ ra khỏi nguyên liệu Nồng

độ NaOH thường dùng được sử dụng trong khoảng 1 – 10 % và ở nhiệt độ 50 – 100 0C Hiệu quả của quá trình khử protein phụ thuộc vào nhiệt độ, nồng

độ và tỉ lệ của dung dịch với khối lượng vỏ giáp xác Quá trình khử protein thích hợp cũng có thể đạt được bằng việc xử lý với dung dịch KOH

• Quá trình khử protein thường kèm theo quá trình khử lipid do lipid có thể phản ứng với kiềm tạo thành xà phòng theo phương trình phản ứng sau:

 Do vậy, việc nghiên cứu và đưa ra giải pháp xử lý protein trong đầu tôm là cần thiết nhằm giảm thiểu chi phí cho việc xử lý, nâng cao giá trị sử dụng của phụ, phế phẩm từ tôm Đồng thời nâng cao hiệu quả kinh tế của ngành công nghiệp chế biến tôm và hạn chế ô nhiễm môi trường do phụ, phế phẩm

từ tôm cũng như lượng chất thải từ việc xử lý nguồn phế phẩm này

1.1.3) Hiệu quả môi trường mà đề tài mang lại :

- Hàng năm, ngành chế biến thuỷ hải sản thải ra hàng chục ngàn tấn phế liệu đầu và vỏ tôm, chỉ một phần nhỏ của lượng phế thải này thải ra môi trường cũng đủ làm ô nhiễm nguồn nước, không khí…nếu không được xử lý triệt

để, nguy cơ gây ô nhiễm môi trường là rất lớn

- Các phương pháp xử lý truyền thống đã được thực hiện nhằm tận dụng nguồn phế thải nay, tuy nhiên từ các phương pháp truyền thống như phơi, sấy…sẽ gây ra mùi khó chịu, ảnh hưởng đến môi trường sống và làm việc của những hộ dân gần các cơ sở tái chế này

- Việc tận dụng nguồn phế thải này bằng phương pháp hoá học sẽ tiêu tốn một lượng lớn hoá chất, bên cạnh đó cũng tạo ra một lượng nước thải hóa học và các chất phân giải protein thải ra môi trường kéo theo việc phải xử lý nguồn nước thải này nhằm tránh gây ô nhiễm môi trường

 Như vậy, việc xử dụng enzyme thủy phân protein mang lại hiệu quả môi trường là rất lơn : vừa tránh được việc dùng hóa chất như NAOH, KOH

để khử protein, bên cạnh đó cũng giảm được phần lớn các chất phân giải protein thải ra môi trường góp phần làm giảm nguy cơ gây ô nhiễm môi trường

1.2) Giới thiệu proteaza

1.2.1) Giới thiệu chung về protease :

- Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ

tế bào,cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng

từ vi sinh vật(vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa ) và động vật (gan, dạ dày bê )

- So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc điểm khácbiệt Trước hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiềuenzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân

tử nên rất khótáchra dưới dạng tinh thể đồng nhất

- Cũng do phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh vật thường cótinh đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thuỷ phân triệt để và đa dạng

- Protease được phân chia thanh hai loại: endopeptidase va exopeptidase

- Dựa vào vị tri tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase được phân chia

thành hai loại:

• Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của

chuỗipolypeptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một tripeptide

• Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của

chuỗi polypeptidevà giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide

- Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành bốn

nhóm:

• Serin proteinase: la những proteinase chứa nhom –OH của gốc serine

trong trung tâmhoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme.Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin va subtilisin Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzyme

động vật như chymotrypsin, trypsin, elastase Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme vi khuẩn như subtilisin Carlsberg, subtilisin

BPN Các serineproteinase thường hoạt động mạnh ở vung kiềm tính

và thể hiện tính đặc hiệu cơ chấttương đối rộng

• Cysteine proteinase: Các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt động Cystein proteinase bao gồm các proteinase thực vật như

papayin, bromelin, một vài protein động vật và proteinase ký sinh

chung Các cystein proteinase thường hoạt độngở vùng pH trung tính,

có tính đặc hiệu cơ chất rộng

• Aspartic proteinase: Hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm

pepsin Nhóm pepsin bao gồm cac enzyme tiêu hóa như : pepsin, chymosin, cathepsin, renin Các asparticproteinase có chứa nhóm

carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính

• Metallo proteinase: là nhóm proteinase được tim thấy ở vi khuẩn,nấm mốc cũng như cac vi sinh vật bậc cao hơn Các metallo proteinase

thường hoạt động vùng pH trung tính va hoạt độ giảm mạnh dưới tac dụng của EDTA

- Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm:

• Protease acid: pH 2-4

• Protease trung tính: pH 7-8

• Protease kiềm: pH 9-11

1.2.2) Tính chất chung của một enzyme:

- Hòa tan được trong nước, dung dịch nước muối sinh lý đệm phosphate trung tính, đệm Tris-HCl và một số dung môi hữu cơ nên dựa vào những đặc tính này để tách chiết chúng

- Bị kết tủa thuận nghịch bởi một số muối trung hòa (sulfate amonium), ethanol, acetone…để thu nhận chế phẩm enzyme

- Hoạt tính của enzyme có thể tăng hoặc giảm dưới tác dụng của các chất hoạt hóa hay ức chế

- Độ hoạt động của enzyme chịu ảnh hưởng rất lớn bởi các yếu tố: nhiệt độ,

pH môi trường

Yếu tố chính ảnh hưởng hoạt tính enzyme

- Ảnh hưởng của nhiệt độ : giống như các phản ứng hóa học, các phảnứng cho enzyme xúc tác phụ thuộc rất nhiều vào nhiệt độ Theo quy luật của phản ứng hóa học thì khi nhiệt độ tăng thì tốc độ phản ứng tăng, nhưng vì bản chất của enzyme là protein nên nhiệ tđộ chỉ tăng cao đến mức nhất định Đa

số các enzyme sẽ bị mất hoạt tính ở nhiệt độ 60oC trở lên, trong nhiệt độ thích hợp nếu cứ tăng lên 10oC thì tốc độ phản ứng tăng lên 1,5-2 lần Nhiệt độ thích hợp của enzyme phụ thuộc vào nhiều yếu tố : thời gian tác dụng dài thì nhiệt độ thích hợp của enzyme càng thấp Ngoài ra còn phụ

thuộc vào nồng độ enzyme, nồng độ cơ chất, dạng tồn tại của enzyme cũng

sẽ làm biến đổi tác dung của nhiệt độ

- Ảnh hưởng của pH : enzyme rất nhạy cảm với pH của môi trường.Mỗienzyme chỉ thích hợp ở một pH xác định gọi là pH tối thích của enzyme

• Một số enzyme hoạt động ở pH thấp như pepsin pH=1,8-2,2 và hoạt động ở pH cao như tripsine pH=5-9, cùng một số loại enzyme thu được ở các nguồn khác nhau cũng có pH tối thích khác nhau pH của môi trường ảnh hưởng tới tốc độ phản ứng có thể do:

- PH làm thay đổi trạng thái ion hóa của các nhóm định chức ở trung tâm hoạt động của enzyme, làm thay đổi khả năng phản ứng của các nhómnàytrongphản ứng xúc tác và có thể làm thay đổi cấu trúc trung tâm của enzyme

• PH cũng làm thay đổi trạng thái ion hóa cơ chất, tại pH tối thích, phân

tử cơ chất được ion hóa tới trạng thái thích hợp nhất cho sự kết hợp vớienzyme, nhờ đó phản ứng có vận tốc cao nhất

- Ảnh hưởng của thời gian: trong quá trình thủy phân, thời gian tác dụng của enzyme lên cơ chất có ảnh hưởng tới hoạt động của nó và đến chất lượng của sản phẩm Thời gian tác dụng càng dài thì sự tác dụng càng triệt để Mặt khác nếu thời gian tác dụng quá ngắn thì sự phân giải protein chưa triệt để, như vậy hiệu suất thủy phân thấp gây khó khăn cho công đoạn tiếp theo, gây lãng phí nguyên vật liệu, không tận dụng hết nguyên liệu ban đầu

- Ảnh hưởng của nồng độ muối: muối ăn có tác dụng kìm hãm hoạt độngcủa vi sinh vật gây thối rữa và các vi sinh vật không chịu muối, có tác dụng bảo quản nguyên liệu trong quá trình thủy phân Mặt khác, muối ăn còn điều

vị mặn tùy theo lượng muối bổ sung vào, ở nồng độ giới hạn cho phép thì thúc đẩy enzyme hoạt động mạnh, nếu vượt qua giới hạn cho phép thì sẽ kìm hãm sự hoạt động của enzyme

- Ảnh hưởng của ion kim loại: một số enzyme không bị ảnh hưởng rõ rệtcủa

sự có mặt hay không có mặt đối với ion kim loại, nhưng có nhiều enzyme khác chịu ảnh hưởng sâu sắc của nồng độ và bản chất của ion kim loại Có những ion kim loại hầu như tuyệt đối cần thiết cho sự hoạt động của một số enzyme, nhưng một số ion kim loại lại ức chế hoạt động của enzyme này

- Ảnh hưởng của chất kìm hãm: chất kìm hãm là chất làm yếu hoặcchấm dứt toàn bộ phản ứng của enzyme Có hai loại chất kìm hãm : Kìm hãm cạnh tranh: là những chất kìm hãm thuận nghịch enzyme, có cấu trúc tương tự với cấu trúc cơ chất, do đó có khả năng kết hợp vào trung tâm hoạt động của enzyme, do vậy nó chiếm chổ kết hợp của cơ chất làm giảm vận tốc xúc tác

Kìm hãm không cạnh tranh: là chất kết hợp ở vị trí khác với trung tâm hoạt động làmthay đổi cấu trúc không gian của phân tử enzyme theo hướng không có lợi cho hoạt động xúc tác của enzyme, làm giảm vận tốc phản ứng xúc tác

Ảnh hưởng của chất hoạt hóa : chất hoạt hóa là những chất có khả nănglàm tăng hoạtđộng xúc tác của enzyme hoặc làm cho enzyme ở dạng không hoạt động thành dạng hoạt động Chất hoạt hóa có thể làm tăng hay phục hổi hoạt động của enzyme một cách gián tiếp hay trực tiếp Hoạt hóa không gián tiếp: làm tăng tốc độ phản ứng của enzyme bằng cách loại trừ chất kìm hãm ra khỏi hỗn hợp phản ứng hoặc tham gia trực tiếp phản ứng, nhưng không tác dụng trực tiếp với phân tử enzyme Hoạt hóa gián tiếp: chất này có tác dụng trực tiếp vào trung tâm hoạt động của enzyme hoặc làm thay đổi cấu hình không gian của phân tử enzyme theo hướng có lợi cho hoạt động xúc tác

- Ảnh hưởng của nồng độ enzyme:

Đối với các phản ứng enzyme, tốc độ phản ứng thủy phân tỉ lệ với nồng enzyme Khi nồng độ enzyme quá cao nếu tiếp tục thêm enzyme, sự biến đổi

của tốc độ thủy phân là không đáng kể Vì vậy, tốt hơn là sử dụng nồng độ enzyme thích hợp để đạt hiệu quả thủy phân cực đại và giảm giá thành

- Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất:

Trong các phản ứng do enzyme và cơ chất, trước hết phải tạo thành phức trung gian giữa enzyme và cơ chất Sau đó, phức này chuyển hóa tiếp tục tạo thành sản phẩm cuối cùng và enzyme tự do, enzyme lại kết hợp với phân tử của cơ chất khác Nếu nồng độ cơ chất đầy đủ thích hợp với lượng enzyme sẽ làm quá trình thủy phân diễn ra đều đặn nhanh chóng

Proteaza từ thực vật

Cấu trúc và chức năng

Là một glycoprotein, mỗi phân tử có glycan gồm 3 maltose, 2 glucosamine, 2 xylose và 1 fructose

Là thiol, trung tâm hoạt động có nhóm –SH quyết định hoạt tính của papain

protease-Thuỷ phân các liên kết

peptide của nhiều loại protein tự nhiên (protein sữa, đậu nành,…)

Chịu được nhiệt độ tương đối cao

Hoạt động 30 -

800C Nhiệt độ tối hảo xúc tác

50 - 650C

pH

Bromelin có biên

độ pH từ 3-10, pH tối thiểu 5-8 tuỳ thuộc cơ chất

Papain dạng ổn định (cấu trúc không gian của enzym ổn định)

có thể chịu được pH = 1,5

và pH = 8,5

pH hoạt động

từ 4 – 9.5, pH tối thích phụ thuộc vào loại

cơ chất:

gelatin: pH =

5, casein: pH = 9.5

Bảng 1: Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme từ thực vật

329 amino acid, đầu C là alanin và đầu

N là isoleusine

Thủy phân

LK peptide, là enzym đông tụ sữa Rennin chứa nhiều a.acid tính acid hơn a.acid kiềm (thấp hơn

pepsin)

Xúc tác phản ứng chuyển hóa đạm, đường, chất béo và một số chất khác ở trong ruột

Cắt LK của lysine a.acid bất

kì và không cắt liên kết giữa lysine

và arginine

Cấu tạo từ 3 sợi

polypetide: Sợi A: a.acid 1–13

Sợi B: a.acid 16-146 Sợi C: a.acid 149–245

1.5 - 2.4

pH = 2,3 – 6,8

Có hoạt tính trong kiềm và bất hoạt trong acid mạnh

pH tối ưu

8

pH thích hơp là 7,8-9,5

pH tối ưu là 8-9

Bảng 2: Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme từ động vật

Giới thiệu Enzyme proteaza sử dụng :

Enzyme Protease sử dụng ở đây là TEGALASE R660L thủy phân protein trong đầu

tôm thành polypeptid

- Liều lượng: 0.5 - 1kg enzyme/1 tấn protein khô

- Nhiệt độ15-60 độ C Nhiệt độ tối ưu: 50-60 độ C

- Đóng gói: thùng 25kg Dạng lỏng Xuất xứ: Áo

1.3) Ứng dụng của proteaza:

Các protease nói chung được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau

1.3.1) Trong công nghiệp:

- Trong công nghệ thuộc da : Làm mềm lông, sạch lông, bóng da,…

- Công nghệ dệt: Protease VSV làm sạch tơ tằm, làm bong và tách rời các loại

- Sản xuất bia: pepsin, ficin,…rất tốt trong quá trình ổn định chất lượng bia

- Sản xuất chất tẩy rửa: Enzyme có những tác dụng giảm thời gian giặt, giảm lượng nước tiêu thụ

- Trong thực phẩm : do bản chất sinh hóa khác nhau giữa các bộ phận hình thái học của động vật thủy sản, người ta có thể sử dụng enzyme để thực hiện quá trình phân giải một cách có định hướng vào những mục đích như loại da

cá đuối, cá trích, các loại cá da trơn…., tách vỏ hàu, hến, tôm, mực…Phương pháp cho hiệu suất cao hơn nhiều lần so với thực hiện thủ công hay hóa học

• Bên cạnh đó protease còn có thể làm sạch vảy cá, bóc tách màng và

cơ quan nội tạng thủy sản

• Sử dụng enzyme protease trong tách chiết carotenoprotein từ phế liệu của quá trình chế biến các loài giáp xác hiện nay là một hướng nghiên cứu đang rất được chú ý vì giúp nâng cao lợi nhuận sản xuất giảm thiểu ô nhiễm môi trường Carotenoprotein từ đầu, vỏ tôm hiện đang rất được quan tâm để sử dụng làm thực phẩm chức năng cho người vì thành phần carotenoid chủ yếu là astaxanthin, một hợp chất chống oxy hóa thiên nhiên

- Công nghệ sữa: sản xuất phomat nhờ enzyme renin…

- Chế biến nước mắm: bromelin, papain rút ngắn thời gian ủ và cải thiện hương vị nước mắm

- Công nghệ chế biến thịt: Papain, bromelin, ficin…thủy phân protein trong thịt nên làm thịt mềm

- Sản xuất bánh kẹo: tăng mùi vị của bánh, kẹo

1.3.2) Trong nông nghiệp :

Protease được dùng để sản xuất dịch thủy phân làm giàu đạm bổ sung vào thức ăn của lợn và gia cầm

- Ứng dụng đặc tính của papain, trypsin, bromelin…để SX dược phẩm

- Sử dụng enzyme collagenase trong điều trị cơ gân, mạch máu… bị sơ cứng

- Dùng để phân hủy các cục máu đông trong cơ thể, chữa bệnh nghẽn tĩnh mạch…

- Sử dụng các chất hoạt hóa và kìm hãm protease để điều trị các bệnh đặc trưng

- Sản xuất thuốc làm tăng khả năng tiêu hóa protein của những người bị tiêu hóa kém…

1.3.5) Trong kỹ nghệ phim ảnh :

- Protease từ vi khuẩn được dùng để tái sinh các nguyên liệu như phim điện ảnh, phim Rơnghen…Protease phân giải và hòa tan lớp nhũ tương gelatin trên phim và giấy ảnh, do đó có thể làm sạch và sử dụng trở lại các loại phim

và giấy ảnh quý

1.4) Các nghiên cứu trong và ngoài nước về việc sử dụng enzyme proteaza

thủy phân protein

- Với nguyên liệu thuỷ sản, trong và ngoàinước đã có một số công trình nghiên cứu về đề tài thuỷ phân protein bằng enzyme nhưng đa phần chỉ dừng lại ở việc dùng protein nội tại có sẵn trong nguyên liệu thuỷ sản, chưa có công trình nào nghiên cứu về việc sử dụng enzyme công nghiệp để thuỷ phân protein Việc xác định điều kiện tối ưu cho thuỷ phân protein bằng enzyme công nghiệp nhằm tạo hiệu quả kinh tế cao nhất chưa được xác định Hiện trong và ngoài nước đã có một số công trình nghiên cứu khoa học của các tác giả như :

1.4.1) Các nghiên cứu trong nước :

• “Nghiên cứu tách chiết và ứng dụng enzyme protease từ tôm sú Penaeus

monodon vào chế biến thủy sản” TS Nguyễn Lệ Hà, 2011

• “Nghiên cứu khả năng thuỷ phân dịch protein của thịt đầu tôm sú bằng

enzyme proteaza nội tại “ Trần Thanh Trúc, 2015, tạp chí khoa học, Đại

Học Cần Thơ

• “Ứng dụng phương pháp sinh học để tổng hợp chitin từ phế liệu chế biến

thủy sản”: Bùi Xuân Đông và cộng sự ( 2013)

• “Nghiên cứu ứng dụng protease Bacillus subtilis trong sản xuất bột đạm

thủy phân từ cá Mối”, Vũ Ngọc Bội, Trường ĐH thủy sản Nha Trang

Protease B subtilis thủy phân mạnh thịt cá mối vàcó thể sử dụng enzyme này trong sản xuất bột đạm thủy phân Khi bổ sung protease B subtilis với nồng

độ 0,3% vào hỗn hợp cơ thịt cá mối và thủy phân ở 500C

• Vũ Ngọc Bội, 2004 Nghiên cứu quá trình thủy phân protein cá bằng

Enzyme protease từ B subtilis S5 Luận án tiến sĩ sinh học, trường Khoa học

tự nhiên - Đại học quốc gia TP HCM

• Đỗ Văn Ninh, 2003 Tối ưu hóa quá trình thủy phân protein của protease

trong thịt cá và thử nghiệm sản xuất sản phẩm mới từ protein được thủy phân Luận án tiến sĩ kỹ thuật, Đại học Thủy sản, Nha Trang

• Nguyễn Văn Thiết và Đỗ Ngọc Tú, Viện Công Nghệ Sinh Học - Viện KH và

CN Việt Nam, số 2/2006 Phương pháp Enzyme tách chiết Chitin từ vỏ tôm

• Trần Văn Thảo, 2011“Nghiên cứu sản xuất sản phẩm thủy phân từ đầu tôm

bằng enzyme Flavourzyme và ứng dụng trong sản xuất nước chấm” Đại Học

Thuỷ Sản Nha Trang

1.4.2) Các nghiên cứu ngoài nước:

• Nielsen (2001) nghiên cứu cải tiến phương pháp xác định mức độ thủy phân protein cho kết quả nhanh chóng và chính xác

• Stein (2004) sử dụng protease nội sinh thủy phân nội tạng cá tuyết Đại Tây Dương cho hiệu suất thủy phân khá cao

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU

2.1) Nguyên liệu nghiên cứu

- Nguyên liệu để tiến hành nghiên cứu làđầu tôm sú Penaeus monodon được phân

tách trực tiếp tại xưởng sản xuất của Công Ty Cổ Phần Thuỷ Hải Sản Việt Nhật, sau

đó được cấpđông và bảo quảnởnhiệt độ -20oC cho đến khi sử dụng

- Proteaza được mua tại CÔNG TY TNHH THƯƠNG MẠI HÓA CHẤT VÀ

NÔNG SẢN PHƯƠNG TRÂM

2.2) Phương pháp nghiên cứu

2.2.1) Quy trình nghiên cứu

Quy trình thuỷ phân được tiến hành qua các bước như sau :

Hình 1 : Sơ đồBố trí thí nghiệm nghiên cứu quá trình thủy phân phế liệu đầu, vỏ tôm

Rửa sạch , để ráo

Bổ sung Proteaza 0.025% 0.05% 0.075% 0.1% 0.125% 0.15%

Thủy phân ở các nhiệt độ: