So sánh trình tự nucleotide của đoạn SSR có liên quan đến protein thực hiện chức năng trao đổi chất ở một số mẫu chè tại thái nguyên

+ Cây chè có nguồn gốc ở Việt Nam: Những công trình nghiên cứu của Djemukhatze 1961 – 1976 về phứccatechin của lá chè từ các nguồn gốc khác nhau, so sánh về thành phần cácchất catechin g

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

HÀ THỊ THANH HOÀN

SO SÁNH TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE CỦA ĐOẠN SSR CÓ LIÊN QUAN ĐẾN PROTEIN THỰC HIỆN CHỨC NĂNG TRAO

LUẬN VĂN THẠC SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS Hoàng Thị Thu Yến

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các sốliệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bốtrong bất kỳ công trình nào khác Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõnguồn gốc

Tác giả

Hà Thị Thanh Hoàn

LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Hoàng Thị Thu Yến - Giảng viên, phó trưởng khoa - Khoa Khoa học Sự sống - Trường

Đại học Khoa học - người đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt những kiến thức

và kinh nghiệm quý báu để tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin cảm ơn các thầy cô và tập thể cán bộ phòng thí nghiệm KhoaKhoa học Sự sống, cảm ơn lãnh đạo Trường Đại học Khoa học - Đại học TháiNguyên đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình họctập và thực hiện đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn tới các cán bộ công tác tại Viện Nghiên cứu

hệ gen - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã nhiệt tình hướngdẫn tôi trong quá trình làm đề tài

Nhân dịp này tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tập thể cán bộ,Công ty chè Sông Cầu - Huyện Đồng Hỷ - Thành Phố Thái Nguyên, nhân dânvùng chè Trại Cài - Minh Lập - Đồng Hỷ và Vùng chè Tân Cương -ThànhPhố Thái Nguyên đã giúp đỡ tôi trong thời gian tôi thu thập vật liệu nghiêncứu làm đề tài

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới toàn thể gia đình, cảm ơn bạn

bè, đồng nghiệp và nhóm nghiên cứu di truyền đã luôn cổ vũ, động viên tôitrong suốt thời gian qua

Tác giả

Hà Thị Thanh Hoàn

DANH MỤC NHỮNG TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT

AFLP Amplified Fragment Length Polymorphic (đa hình chiều dài

các đoạn cắt khuếch đại)

DNA Deoxyribonucleic acid

dNTP Deoxynucleoside triphosphate

EDTA Ethyen Diamin Tetraacetic Acid

EtBr Ethidium Bromide

PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase)Primer F Primer Forward (mồi xuôi)

Primer R Primer Reverse (mồi ngược)

RAPD Random Amplify Polymorphic DNA (phân tích đa dạng DNA

khuếch đại ngẫu nhiên)

RFLP Restriction Fragment Length Polymorphic (đa hình chiều dài

đoạn cắt giới hạn)SSR Simple Sequence Repeat (đoạn lặp lại trình tự đơn giản)

VNTR Variable Number of Tandem Repeat (DNA lặp lại nối tiếp có

kích thước khác nhau)

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ii

LỜI CẢM ƠN iii

DANH MỤC NHỮNG TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT iv

MỤC LỤC v

DANH MỤC CÁC HÌNH TRONG LUẬN VĂN vii

DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN

viii MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu chung về cây chè 3

1.1.1 Nguồn gốc và phân loại cây chè 3

1.1.2 Đặc điểm sinh học của cây chè 5

1.1.3 Giá trị của cây chè 7

1.1.4 Đặc điểm một số giống chè tại Thái Nguyên 9

1.2 Tình hình nghiên cứu hệ gen chè trên thế giới và ở Việt Nam

10 1.2.1 Tình hình nghiên cứu hệ gen chè trên thế giới 10

1.2.2 Tình hình nghiên cứu hệ gen chè ở Việt Nam 13

1.3 Chỉ thị SSR và những ứng dụng trong nghiên cứu protein thực hiện chức năng trao đổi chất 14

1.3.1 Khát quát về chỉ thị SSR 14

1.3.2 Chỉ thị SSR liên quan đến protein thực hiện chức năng trao đổi chất17 CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Vật liệu nghiên cứu 22

2.1.1 Nguyên liệu 22

2.1.2 Hóa chất 22

2.1.3 Thiết bị 22

2.2 Phương pháp nghiên cứu 23

2.2.1 Phương pháp thu mẫu lá chè 23

2.2.2 Phương pháp tách chiết DNA tổng số từ lá chè 23

2.2.3 Phương pháp điện di 25

2.2.4 Phương pháp xác định hàm lượng và kiểm tra độ tinh sạch DNA tổng số 27 2.2.5 Kỹ thuật PCR-SSR 27

2.2.6 Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR 29

2.2.7 Phương pháp xác định và phân tích trình tự 30

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

3.1 Tách DNA tổng số từ các mẫu chè nghiên cứu 31

3.2 Phân tích chỉ thị SSR ở các mẫu chè nghiên cứu 32

3.2.1 Phân tích một số chỉ thị SSR ở các mẫu chè nghiên cứu bằng kỹ thuật PCR - SSR 32

3.2.2 Đánh giá mối quan hệ di truyền giữa các mẫu chè dựa trên phân tích chỉ thị SSR 38

3.3 Phân tích trình tự nucleotide các đoạn SSR liên quan đến protein thực hiện chức năng trao đổi chất 41

3.3.1 Phân tích trình tự nucleotid đoạn SSR liên quan đến glyoxalase 42

3.3.2 Phân tích trình tự nucleotid đoạn SSR liên quan đến sucrose 43

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45

TÀI LIỆU THAM KHẢO 46

PHỤ LỤC 1

DANH MỤC CÁC HÌNH TRONG LUẬN VĂN

Hình 1.1 Một số giống chè trồng tại Công ty chè Sông Cầu tỉnh Thái

Hình 3.6 Sơ đồ quan hệ di truyền của 18 mẫu chè nghiên cứu 40

Hình 3.7 So sánh trình tự nucleotide đoạn SSR của bốn mẫu nghiên cứu với

các trình tự đã công bố 43

Hình 3.8 So sánh trình tự nucleotide đoạn SSR của bốn mẫu nghiên cứu với

các trình tự đã công bố 44

DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN

Bảng 2.1 Danh mục các thiết bị, dụng cụ được sử dụng 23

Bảng 2.2 Thành phần gel polyacrylamide 8% 27

Bảng 2.3 Danh sách 14 cặp mồi SSR được sử dụng trong nghiên cứu 28

Bảng 2.4 Thành phần của phản ứng PCR - SSR 29

Bảng 2.5 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR – SSR 29

Bảng 3.1 Số phân đoạn DNA xuất hiện và số phân đoạn DNA đa hình đối với mỗi chỉ thị 37

Bảng 3.2 Bảng hệ số tương đồng di truyền của 18 mẫu chè nghiên cứu 39

đã trở thành một trong những nét văn hóa đặc trưng của nhiều quốc gia, đặcbiệt là các quốc gia vùng Đông Nam Á Trong chè chứa nhiều vitamin có giátrị dinh dưỡng và bảo vệ sức khỏe, có tác dụng giải khát, bổ dưỡng và kíchthích hệ thần kinh trung ương, giúp tiêu hóa chất mỡ và ngăn ngừa sự pháttriển của một số tế bào ung thư [43] Ngoài ra, cây chè còn mang lại nhiềulợi ích kinh tế xã hội như: giải quyết công ăn việc làm, đem lại nguồn thunhập ổn định cho người dân, thúc đẩy quá trình công nghiệp hóa và hiện đạihóa nông thôn [15] Cây chè giữ tầm quan trọng đối với sức khỏe, tinh thần vànền kinh tế của xã hội Tuy nhiên, sự hiểu biết các quá trình sinh học ở mức

độ phân tử ở Việt Nam cũng như trên thế giới vẫn còn hạn chế

Kích thước hệ gen chè là rất lớn (khoảng 4 Gb) nên việc giải mã toàn

bộ hê gen đòi hỏi thời gian nhiều năm và chi phí ước tính hàng chục triệuđôla Ngày nay, để làm sáng tỏ các quá trình sinh học ở chè, các nhà khoa họccũng bắt đầu tập trung nghiên cứu cây chè ở mức độ phân tử

Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về hệ gen chè ở mức độ phân tử,thông qua các chỉ thị: AFLP, RADP, RFLP, SSR Trong đó SSR là đoạnDNA vệ tinh có trình tự lặp lại đơn giản của trình tự nucleotide nào đó, nóphổ biến ở sinh vật và đặc biệt là các loài sinh vật nhân chuẩn Chỉ thị SSRvới nhiều đặc tính như độ chính xác cao, phân bố rộng rãi trong hệ gen, tuântheo định luật Menden

Trong những năm gần đây, người ta tập trung nghiên cứu cây chè ởmức độ phân tử, đặc biệt việc phân tích cDNA/EST chè đã đem lại nguồn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu –

thông tin khá lớn Khi so sánh các đoạn EST ở chè và các gen đã biết từ cácloài khác cho thấy rằng chỉ thị SSR-EST được nghiên cứu cho tới nay đượccho rằng có liên quan đến các quá trình sinh học

Trao đổi chất là những quá trình sinh hoá xảy ra trong cơ thể s in h

v ật v ới mục đích sản sinh nguồn năng lượng nuôi sống tế bào hoặc tổng hợpnhững vật chất cấu thành nên tế bào, đó là nền tảng của mọi hiện tượng si n h

h ọ c Đối với thực vật nói chung và cây chè nói riêng thì quá trình trao đổichất do nhân tố nào điều khiển đang được sự quan tâm của các nhà khoa họctrên thế giới

Xuất phát từ những thực tế trên, chúng tôi đã thực hiện đề tài: “So s nh

tr nh tự nuc eotide của đo n SSR iên quan tới protein thực hiện chức năng trao đổi chất ở t số ẫu ch t i Th i Nguyên”

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Đánh giá được mối quan hệ di truyền của 18 mẫu giống chè nghiên cứu

- Xác định được sự khác biệt trình tự nucleotide của đoạn SSR có liênquan đến protein thực hiện chức năng trao đổi chất ở một số mẫu chè tại TháiNguyên

3 N i dung nghiên cứu

Để đạt được mục tiêu đề tài chúng tôi tiến hành những nội dung nghiêncứu sau:

- Phân tích chỉ thị phân tử dựa vào kỹ thuật PCR-SSR và nghiên cứuquan hệ di truyền giữa các mẫu chè nghiên cứu

- Nghiên cứu và so sánh trình tự nucleotide của đoạn SSR có liên quanđến protein tham gia vào con đường trao đổi chất ở một số mẫu chè tại TháiNguyên

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung về cây chè

1.1.1 Nguồn gốc và phân loại cây chè

Cây chè có tên khoa học là Camellia sinnesis (L) O Kumtze và thuộc

hệ thống phân loại sau [10] :

Chi chè (Camellia hoặc Thea)

Loài (Camellia sinensis)

Họ chè có 29 chi và khoảng 550 loài phân bố chủ yếu ở các nước nhiệtđới và cận nhiệt ở cả hai bán cầu, đặc biệt ở Đông và Đông Nam Á Ở ViệtNam có khoảng 11 chi với trên 200 loài

Nguồn gốc cây chè là vấn đề phức tạp, cho đến nay có nhiều quan điểmkhác nhau về nguồn gốc cây chè, dựa trên những cơ sơ về lịch sử, khảo cổhọc và thực vật học Một số quan điểm được nhiều nhà khoa học công nhậnnhất là:

+ Cây chè có nguồn gốc ở Vân Nam Trung Quốc:

Nhiều công trình nghiên cứu, khảo sát trước đây cho rằng nguồn gốccủa cây chè là ở Vân Nam – Trung Quốc, nơi có khí hậu ẩm ướt và ấm Theocác tài liệu Trung Quốc thì cách đây trên 4000 năm người Trung Quốc đã biếtdùng chè làm dược liệu và sau đó là để uống [44] Năm 1753, Carl Van

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu –

+ Cây chè có nguồn gốc ở vùng Atxam (Ấn Độ):

Năm 1823, Bruce đã phát hiện được cây chè dại lá to ở vùng Atxam(Ấn Độ), từ đó các học giả người Anh cho rằng: Nguyên sản của cây chè là ởvùng Atxam chứ không phải ở Vân Nam – Trung Quốc [11]

+ Cây chè có nguồn gốc ở Việt Nam:

Những công trình nghiên cứu của Djemukhatze (1961 – 1976) về phứccatechin của lá chè từ các nguồn gốc khác nhau, so sánh về thành phần cácchất catechin giữa các loại chè được trồng trọt và chè mọc hoang dại đã nêu lênluận điểm về sự tiến hóa sinh hóa của cây chè, trên cơ sở đó xác minhnguồn gốc của cây chè Djemukhatze đã kết luận rằng những cây chè mọchoang dại từ cổ xưa, tổng hợp chủ yếu là (-) – epicatechin galat, ở chúng cókhả năng tổng hợp (-) - epigalocatechin và các galat của nó để tạo (+)galocatechin chậm hơn Nghiên cứu các cây chè dại ở Việt Nam cho thấy chủyếu là tổng hợp (-) – epicatechin và (-) – epicatechin galat (chiếm 70 % tổngcác loại catechin) Khi di thực các cây chè dại này lên phía Bắc với các điềukiện khí hậu khắc nghiệt hơn, chúng sẽ thích hợp dần với các điều kiện sinhthái bằng cách có thành phần catechin phức tạp hơn, cùng với tạo thành (-)epigalocatechin và các galat của nó Điều đó có nghĩa là trao đổi chất ở đây

hướng về phía tăng cường quá trình hidroxil hóa và galil hóa Từ những biếnđổi hóa sinh này của các cây chè

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu –

dại và cây chè được trồng trọt, chăm sóc cho phép đi tới một kết luận mới là

“Nguồn gốc cây chè chính là ở Việt Nam” Từ đó có sơ đồ tiến hóa cây chè

thế giới sau đây: Camellia Chè Việt Nam Chè Vân Nam lá to ChèTrung Quốc Chè Assam (Ấn Độ) [11], [16]

Tuy có sự khác nhau nhưng quan điểm nêu trên đều có sự thống nhấtrằng: Cây chè có nguồn gốc từ Châu Á, nơi có điều kiện khí hậu nóng, ẩm

1.1.2 Đặc điểm sinh học của cây chè

Cây chè có bộ nhi m sắc thể lưỡng bội 2n 30, thuộc loại thân gỗ hoặcthân bụi và được trồng để thu lá làm nguyên liệu cho công nghiệp chế biến vàmang một số đặc điểm sinh học sau đây 16]:

Đặc điểm hình thái

Thân: Thẳng và tròn, phân nhánh liên tục thành một hệ thống cành và

chồi Trên thân có mấu chia thành nhiều lóng

Cành: Do mầm dinh dưỡng biến đổi thành Trên cành chia ra làm nhiều

đốt, chiều dài đốt cành biến đổi từ 1 – 10 cm tùy theo giống và điều kiện sinhtrưởng Tùy theo lứa tuổi mà màu sắc cành chè biến đổi từ màu xanh thẫm,xanh nhạt, màu đỏ, màu nâu và khi cành già có màu xám

Chồi: Mọc ra từ nách lá, chia theo sự biệt hóa của chồi có chồi dinh

dưỡng mọc ra lá và chồi sinh thực mọc ra nụ, hoa, quả Chia theo vị trí trêncành có: Chồi ngọn (đỉnh), chồi nách, chồi ngủ (trong cành)

Lá: Lá chè là loại lá hình đơn nguyên, có hệ gân lá rất rõ, rìa lá có răng

cưa, chiều dài từ 4 – 15 cm, rộng từ 2 – 5 cm Mặt phiến lá có thể nhẵn, lồilõm, láng bóng Hệ gân lá hình mạng lông chim Lá chè có thể có hình thuôn,mũi mác, ô van, trứng gà, gần tròn Gốc lá nhọn, tròn đến tù; chóp lá nhọn tù

Lá chè thường thay đổi về hình dạng, màu sắc và kích thước tùy theo giống,điều kiện tự nhiên và điều kiện canh tác Các độ tuổi khác nhau của lá chè tạo

ra các các sản phẩm chè có chất lượng khác nhau do thành phần hóa học trongcác lá này khác nhau

Hoa: Hoa chè là loại hoa lưỡng tính, trong hoa có 5 - 8 cánh màu trắng,

có khi lại hơi phớt hồng Tràng có 5 - 9 cánh màu trắng hay phớt hồng, bộ nhịđực trung bình có 200 - 300 cái; bao phấn có hai nửa bao, chia 4 túi phấn, hạtphấn hình tam giác màu vàng nhạt (khi chín màu hoàng kim) Bầu nhị cái có

3 - 4 ô, chứa 3 - 4 noãn, ngoài phủ lớp lông tơ, núm nhị cái chẻ ba Ở gốc bầunhụy có tuyến mật làm thành một vòng tròn gọi là đĩa

Quả: Quả chè là một loại quả nang có từ 1- 4 hạt Quả chè có dạng hình

tròn, tam giác, vuông tùy theo số hạt Khi còn non quả chè có màu xanh, khichín chuyển sang màu xanh thẫm hoặc nâu Khi quả chín vỏ nứt ra giải phóngcác hạt chè Kích thước của hạt phụ thuộc vào giống, kỹ thuật canh tác Hạtchè có khối lượng từ 0,6 – 2g thường từ 1- 1,6g

Hạt: Hình cầu, bán cầu, tam giác tùy giống chè; vỏ sành thường màu

nâu, cứng, bên trong là lớp vỏ mỏng

Hệ rễ: Gồm r cọc (trụ), r dẫn (hay r nhánh, r bên) màu nâu hay nâu

đỏ và r hút hay r hấp thụ màu vàng ngà

Đặc t nh sinh sinh thái củ c ch

Nhiệt độ không khí thuận lợi cho sự sinh trưởng và phát triển của chè là

22 - 28oC, độ ẩm không khí tương đối thích hợp là 80 - 85 % Hàm lượngnước cần thiết cho cây chè biến động tùy từng giống chè Loại đất thích hợpcho trồng chè dày 60 – 100 cm; mực nước ngầm dưới 100 cm; độ chua pH:4,5 - 5,5; tỷ lệ mùn 3 - 4 %

inh tr n v phát triển củ c ch

Sự phát triển của cây chè chia làm hai chu kỳ: Chu kì phát triển lớngồm suốt đời sống cây chè từ khi hạt nảy mầm đến khi cây chết và chu kì phát

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu –

triển nhỏ bao gồm các giai đoạn sinh trưởng, phát triển lặp lại nhiều lần trong một năm

h nh ph n h học củ á ch

Thành phần hóa học có trong chè rất đa dạng bao gồm lượng lớn nước

và các thành phần hữu cơ và vô cơ khác như: nước; Flavanol(Epigallocatechin gallate (EGCG), Epicatechin gallate (ECG), Epigallocatechin (EGC), Epicatechin (EC), Catechin (C)); Cafein; Axit hữu cơ (citric,malic,…); Axit hữu cơ (citric, malic,…); xơ (cellulose, hemicellulose);protein và axit amin; lipid; khoáng; chất màu (carotenoid, chlorophyll) [42]

Đặc điểm di tru ền củ c ch

Chè là loại cây trồng quan trọng ở nhiều nơi trên thế giới nhưng chođến nay, vẫn chưa có nhiều thông tin về hệ gen của cây chè Những nghiêncứu trước đây đã cho ra những kết quả rất khác nhau Năm 2001, nghiên cứu

của Hanson cho thấy kích thước bộ gen của cây chè Camellia sinensis vào

khoảng 15.298 Mbp [34] Tuy nhiên gần đây, nghiên cứu của Tanaka vàTaniguchi (năm 2007) trên các giống chè Nhật Bản lại cho thấy kích thước bộgen của cây chè được ước tính khoảng 4 Gbase [37] Nghiên cứu tế bào họccác giống chè của Kondo (1979) đã xác định cây chè là loài thực vật lưỡngbội (2n = 30, số nhi m sắc thể cơ sở là 15) và kiểu nhân (karotype) biếnđổi khác nhau giữa các giống chè [29]

Nói chung, các nhi m sắc thể của chè có kích thước nhỏ và có xu

hướng kết lại với nhau thành khối Giá trị r (tỷ lệ chiều dài giữa cánh dài và

cánh ngắn của nhi m sắc thể) của 15 cặp nhi m sắc thể trong khoảng1,00 đến 1,9 Sự đồng nhất của các nhi m sắc thể lưỡng bội cho thấy đặc

điểm cùng nguồn (monophyletic) tất cả các loài thuộc chi Camellia.

1.1.3 Giá trị của cây chè

Cây chè là loại cây công nghiệp lâu năm, mau cho sản phẩm, cho hiệu

iá tr v m t th c ph m: Trong chè có các thành phần hóa học giàu

chất dinh dưỡng, có tác dụng tốt đối với cơ thể con người như hỗn hợp taninchè có khả năng giải khát, chữa một số bệnh đường ruột (tả l , thương hàn),các loại protein, vitamin, muối khoáng… Cafein và một số alkanoit khác làchất có thể kích thích hệ thần kinh trung ương, vỏ cầu đại não, giúp tăngcường sự hoạt động của cơ thể, giảm mệt nhọc [43]

iá tr y học Nước chè tươi còn giảm được các quá trình viêm như

viêm khớp, viêm gan mãn tính, tăng cường tính đàn hồi của thành mạch máu.Uống chè giảm nguy cơ tim mạch, chống lão hóa, chống nhi m độc Mới đâynhất, các nhà khoa học còn phát hiện ra chè còn có tác dụng chống khả nănggây ung thư của các chất phóng xạ Người ta đã trích ly các chất trong chè đểđiều chế các thuốc trợ tim, cầm máu, lợi tiểu… Những giá trị tiềm ẩn của câychè vẫn còn đang được quan tâm nghiên cứu [43]

iá tr v m t inh t h i Cây chè giữ vai trò quan trọng trong cơ

cấu cây trồng nông nghiệp, sản phẩm chè là mặt hàng xuất khẩu quan trọngcủa ngành nông nghiệp Việt Nam Sản xuất chè đã góp phần tạo công ăn việclàm, xóa đói giảm nghèo, tạo nguồn thu nhập ổn định cho người dân và thúcđẩy quá trình công nghiệp hóa, hiện đại hóa nông thôn, nhất là vùng Trung du

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu –

thành nét văn hóa đặc trưng của nhiều quốc gia Uống chè là nét văn hóa lâu

đời của người Việt Nam, mang một giá trị thiêng liêng, cao quý trong đờisống tinh thần của con người Thưởng thức chè là một thú vui tao nhã, tạođược cảm hứng trong văn thơ, hội họa… Ở Việt Nam chè không thể thiếutrong l nghi giao tiếp, giáo dục, cưới xin, ma chay, hội hè [5]

1.1.4 Đặc điểm một số giống chè tại Thái Nguyên

Thái Nguyên là một tỉnh Trung du miền núi, địa hình chủ yếu là đồi bát

úp, có độ dốc không lớn Với dạng địa hình này Thái Nguyên rất thuận lợicho việc phát triển sản xuất chè Trước đây, vùng chủ yếu tập trung trồng cácgiống chè địa phương như Trung Du, nhưng năng suất không cao Vì vậy vàinăm gần đây vùng đã nhập một số giống chè mới cho năng suất và sản lượngcao hơn, đồng thời có thể lai tạo một số giống mới… Dưới đây là một sốgiống chè hiện trồng nhiều ở Thái Nguyên:

Hiện nay 60% diện tích trồng chè ở Thái Nguyên là giống Trung du.Giống chè Trung du (hay còn gọi là chè ta) có đặc điểm búp nhỏ nên năngsuất không cao Nhưng nếu biết cách chế biến, chè Trung du sẽ cho ra sảnphẩm có chất lượng cao hơn hẳn các loại chè được làm từ các giống khác, đểchế biến loại chè thượng hạng tôm nõn thì nhất thiết nên dùng búp chè Trung

du Chè Trung du thường rất đậm đà, cánh nhỏ đều, nước chè sánh, và hậu vịngọt đậm, hương trà lưu lại lâu [14]

Chè Bát Tiên có nguồn gốc từ Đài Loan được nhập nội và trồng thànhcông ở một số tỉnh trung du miền núi phía Bắc Đặc điểm của chè Bát Tiên làcây to trung bình, tán đứng, mật độ cành hơi thưa, lá màu xanh nhạt, răng cưa

rõ, chóp lá hơi nhọn Do phù hợp với điều kiện thổ nhưỡng khí hậu, ngườidân lại có kinh nghiệm trồng chè nhiều năm nên khi đưa vào trồng chè BátTiên có tỷ lệ sống cao, cây sinh trưởng và phát triển tốt nhanh cho thu hoạch,năng suất khá [46]

Giống chè LDP1 và LDP2 là hai dòng chè được tạo ra từ phép lai hữutính giữa cây mẹ là Đại Bạch Trà và cây bố là giống PH1 Qua quá trình chọnlọc, hai dòng này biểu hiện nhiều ưu điểm như lá to, búp có màu xanh và mật

độ búp dày, cây sinh trưởng khỏe và cho năng suất cao

Giống chè TRI777 có nguồn gốc từ Srilanka, được chọn lọc từ chèShan Mộc Châu – Srilanka, có đặc điểm phân cành thấp, d giâm cành, hệ sốnhân giống cao, chịu hạn tốt, chống chịu sâu bệnh trung bình Búp 1 tôm 2 lá:

60 – 75 gram, tanin 30,5 % Dùng để chế biến chè xanh Trồng thích hợp nhất

ở vùng núi thấp 100 – 500 m so với mực nước biển [15]

Hình 1.1 Một số giống chè trồng tại Công ty chè Sông Cầu tỉnh Thái Nguyên 1.2 Tình hình nghiên cứu hệ gen chè trên thế giới và ở Việt Nam

1.2.1 Tình hình nghiên cứu hệ gen chè trên thế giới

Việc nghiên cứu các giống cây được coi là tiền đề, là nguồn tư liệu tiênquyết không thể thay thế trong sản xuất nông nghiệp Trong quá trình sản xuấtchè, giống có vai trò rất quan trọng trong việc nâng cao năng suất, sản lượng

và chất lượng sản phẩm Do đó các giống chè tốt không ngừng được quan tâm

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu –

nghiên cứu và triển khai vào trồng trên quy mô lớn

Ấn Độ là quốc gia đứng đầu thế giới về sản lượng chè do rất quan tâmnghiên cứu triển khai các giống tốt cho năng suất cao vào sản xuất Từ nhữngnăm 50 của thế kỷ XX Ấn Độ đã thành công trong việc chọn ra 110 giống chètốt Công tác chọn dòng chè, kết hợp chọn dòng có sản lượng cao và có khảnăng chống hạn, chống bệnh rất được chú ý ở Srilanca Nhờ đó đã tạo đượccác giống nổi tiếng như TRI777, TRI2043 Cũng theo Đỗ Ngọc Quỹ (2000)thì Ấn Độ, Nhật Bản, Srilanca, Trung Quốc, Liên Xô cũ…đã sử dụng côngnghệ sinh học trong chọn giống chè tốt, sử dụng ưu thế lai để tạo ra giốngchất lượng cao phục vụ cho sản xuất [17]

Trung Quốc là quốc gia sản xuất chè hàng đầu thế giới, các nhà khoahọc Trung Quốc đã nghiên cứu và sử dụng giống chè tốt trong sản xuất từ rấtsớm Ngoài những giống chè nổi tiếng từ lâu đời, hiện nay Trung Quốc cónhiều giống chè cho năng suất cao, chất lượng tốt để chế biến cả chè xanh vàchè đen như: Phúc Vân Tiên, Hoa Nhật Kim, Hùng Đỉnh Bạch (Phúc Kiến),Phú Thọ 10 [14]

Nhật Bản đặc biệt quan tâm chú ý đến nghiên cứu chọn dòng, nhiềugiống chè mới và cho năng suất cao đã được đưa vào sản xuất Trong đó cógiống Yabukita được trồng phổ biến nhất chiếm tới 70% diện tích chè ở NhậtBản [17]

Ngày nay, để có được các giống chè cho năng suất cao thì việc áp dụngcác tiến bộ khoa học kỹ thuật vào quá trình sản xuất chè luôn được chú trọngđầu tư Bên cạnh đó, các nhà khoa học cũng bắt đầu tập trung nghiên cứu sâuhơn về cây chè ở mức độ phân tử Kích thước hệ gen của chè lớn, khoảng 4

Gb Do thiếu sự hiểu biết về nuôi cấy mô cũng như quá trình dịch mã xảy ra

ở chè nên rất ít các thông tin về trình tự hệ gen được biết đến Đến năm 2010,chỉ có 819 trình tự nucleotide, 12.664 đoạn trình tự biểu hiện (Expressed

Sequence Tags - EST), và 478 protein từ chè được công bố trên ngân hànggen Các nghiên cứu về chè chủ yếu tập trung vào các gen liên quan đến quá

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu –

trình trao đổi chất thứ cấp, hầu hết được phát hiện qua trình tự EST [32]

Trong nghiên cứu đa dạng di truyền, chỉ thị SSR được sử dụng rất phổbiến Tuy nhiên cho tới nay, số lượng chỉ thị SSR đặc hiệu cho cây chè cònrất ít, do đó các nghiên cứu ứng dụng chỉ thị SSR trong phân tích di truyền hỗtrợ công tác chọn giống chè còn khiêm tốn Sự đa dạng di truyền sẽ chỉ rađược mức độ sai khác giữa các giống chè nghiên cứu ở mức độ phân tử, đồngthời giải thích được tính đa dạng nguồn gen của cây chè

Chỉ thị RFLP đã được sử dụng trong phân tích quan hệ di truyềngiữa các giống cây trồng và họ hàng hoang dại của chúng từ năm 1989 Ởcây chè, ít có những báo cáo về sử dụng chỉ thị RFLP trong nghiên cứu đadạng di truyền Phần lớn các nghiên cứu sử dụng RFLP đến nay đều đượcthực hiện ở Nhật Bản [14]

Năm 1997, Viện tài nguyên di truyền thực vật quốc tế (IPGRI) đã công

bố tiêu chuẩn đánh giá đặc điểm hình thái chè Dựa theo tiêu chuẩn này, một

số nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền các giống chè bằng chỉ thị hình thái

đã được thực hiện Chen và đtg (2005) đã sử dụng 33 chỉ tiêu hình thái để đánhgiá sự đa dạng di truyền của 87 giống chè ở tỉnh Vân Nam - Trung Quốc Kếtquả cho thấy sự đa dạng rất cao giữa các giống chè, đặc biệt các đặc điểm của

lá và hoa cho thấy sự đa dạng cao hơn so với các chỉ tiêu khác

Chỉ thị AFLP lần đầu tiên được áp dụng với cây chè Kết quả nghiêncứu với 32 dòng chè Kenia cho thấy sự phân nhóm của ba thứ chè Assam,Trung Quốc và Cambod, trong đó quần thể chè Trung Quốc có mức độ đadạng di truyền cao hơn cả Các nghiên cứu sau này của Lee (2003) và Mishra(2004, 2009), cũng cho kết quả tương tự [19], [20]

Năm 2004, Saravanan và đtg đã công bố sự đa dạng di truyền của 26dòng chè UPASI hoàn toàn dựa trên cơ sở catechin và các phân đoạn củachúng tại Ấn Độ

Singh và đtg vào năm 2006 đã sử dụng chỉ thị lặp trên đoạn 5S rDNA

để phân tích di truyền 28 dòng chè thuộc ba thứ chè Assam, Trung Quốc vàCambod, qua đó đã xác định được một số chỉ thị có thể phân biệt được cácgiống chè thuộc ba thứ chè này [30]

Năm 2008, Yao và đtg đã sử dụng chỉ thị ISSR nghiên cứu đa dạng ditruyền 48 giống chè có nguồn gốc từ Trung Quốc, Nhật Bản, Kenia và ứngdụng trong phân tích quan hệ di truyền các cây chè lai (xác định bố mẹ), hỗtrợ công tác lai tạo giống chè tại Trung Quốc [41]

Ujihara và đtg (2009) cũng sử dụng một số cặp mồi SSR thiết kế cho

cây chè hoa Camellia japonica để nhận dạng di truyền các giống chè bản địa,

phục vụ yêu cầu dán nhãn các sản phẩm chè lưu hành trên thị trường NhậtBản [38]

Năm 2009, Mishra và đtg đã sử dụng 8 tổ hợp mồi AFLP để phân tích

đa dạng di truyền của 29 giống chè chính của vùng Darjeeling (Ấn Độ) [30]

1.2.2 Tình hình nghiên cứu hệ gen chè Việt Nam

Ở nước ta, cây chè đang được coi là cây trồng chủ lực góp phần xóa đóigiảm nghèo cho vùng sâu, vùng xa, vùng núi cao Qua nhập nội, lai tạo, trongnhững năm gần đây nước đã tạo được nhiều giống chè mới đem lại hiệu quảkinh tế cao

Qua nhiều năm nghiên cứu, Viện nghiên cứu chè đã ứng dụng thống kêsinh học qua phân tích tương quan dựa vào đặc trưng hình thái kết hợp vớixem xét các đặc điểm phát triển bộ r , sinh trưởng sinh, màu sắc lá, sâu bệnh,khả năng giâm cành… để chọn nhanh các loại chè có triển vọng khi cây chè 2

- 3 tuổi Tại trung tâm nghiên cứu phát triển chè – Viện KHKT nông lâmnghiệp miền núi phía Bắc, bằng phương pháp gây đột biến bằng bức xạ đãchọn được một số cá thể chè sinh trưởng và phát triển tốt Ngoài ra, Viện còn

sử dụng consixin xử lý trên mầm chè giống PH1 trong thời gian 24 – 48h với

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu –

nồng độ 0,2 % cũng đã thu được kết quả bước đầu Ngoài ra, các nhà khoahọc đã tiến hành nghiên cứu nhân giống bằng phương pháp nhân vô tính từ rấtsớm như ghép, giâm cành và đã thu được những kết quả tốt [5]

Ngày nay, nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học trong chọn giốngcây trồng đã được nhiều nhà khoa học quan tâm Việc sử dụng các chỉ thị phân

tử khác nhau được nghiên cứu và phát triển đã trở thành công cụ mạnh mẽ đểphân tích đa dạng di truyền và xác định các mối quan hệ giữa các giống câytrồng, vật nuôi như RAPD, SSR, RFLP, AFLP Trong đó, chỉ thị SSR (SimpleSequence Repeats) là một loại chỉ thị được sử dụng khá phổ biến, chính xác vàhữu hiệu trong nghiên cứu đa dạng di truyền, xây dựng bản đồ liên kết,phân lập gen, xác định quan hệ di truyền giữa các giống, dòng cây trồng [18]

Ở Việt Nam, việc ứng dụng các kĩ thuật sinh học phân tử vào việc đánhgiá hệ gen của cây chè trong chọn tạo giống cây trồng còn là vấn đề mới mẻ.Năm 2004, nhóm tác giả Nguy n Minh Hùng, Đinh Thị Phòng đã sử dụng kỹthuật RAPD để nghiên cứu tính đa hình của một số dòng chè đột biến Năm

2010, Nguy n Thị Thu Hương và đtg đã sử dụng kỹ thuật này để phân tích sự

đa dạng trình tự hệ gen ở các dòng chè Shan [9] Một số giống chè trồng ở xãTân Cương - vùng chè đặc sản chè nổi tiếng của Tỉnh Thái Nguyên cũng đượcphân tích bằng kỹ thuật RAPD bởi Hoàng Thị Thu Yến và đtg [19] Năm

2009, Trần Đức Trung và đtg đã nghiên cứu đánh giá sự đa dạng di truyền 96giống/dòng chè trồng ở Việt Nam bằng kỹ thuật PCR-SSR [18] Với mục đíchnhằm tìm kiếm chỉ thị phân tử có tiềm năng ứng dụng trong chọn giống chè,chúng tôi tiến hành phân tích chỉ thị SSR ở một số giống/dòng chè trồng ở cácđịa phương của tỉnh Thái Nguyên

1.3 Chỉ thị SSR và những ứng dụng trong nghiên cứu protein thực hiện chức năng trao đổi chất

1.3.1 Khát quát về chỉ thị SSR

Kỹ thuật PCR-SSR còn được gọi là kỹ thuật microsatellies (vi vệ tinh) Kĩ

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu –

từ 1 đến 6 bp)

Theo Litt và Lutty (1989), vi vệ tinh có nhiều motif khác nhau, thường

có mức độ lặp lại thấp và biến đổi ở một locus nhất định, chính vì vậy sốlượng alen ở mỗi locus vi vệ tinh là rất nhiều Các vi vệ tinh có thể được tìmthấy khắp nơi, ở vùng mang mã (exon) và không mang mã (intron) trên hệgen nhân và cả hệ gen ngoài nhân (ti thể, lục lạp) Có nhiều danh pháp khácnhau được dùng để chỉ vi vệ tinh: Trình tự lặp đơn giản – SRS (SimpleRepetitive Sequences), đoạn lặp trình tự đơn giản - SSR (Simple SequenceRepeats) hay đoạn lặp nối tiếp đơn giản - STR (Simple Tandem Repeat),trong số này, SSR là danh pháp được sử dụng phổ biến nhất [12]

Vi vệ tinh - SSR có số lượng motif rất phong phú, phân tán đều khắp

hệ gen và có mức độ đa hình rất cao Theo Jurka và Pethiyagoda (1995), vớibốn loại base nitơ A-T-G-C, số lượng các motif SSR trên cấu trúc sợi đôi DNA

có thể lên đến 501 loại khác nhau, từ motif có một nucleotide (monomeric)

đến motif có sáu nucleotide (hexameric) Motif phổ biến nhất ở hệ gen thựcvật là

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu –

(A)n, (AT)n, (GA)n và (GAA)n Bên cạnh đa dạng về số lượng, sự sắp xếpcác motif trong đoạn trình tự lặp cũng góp phần làm phong phú SSR trong hệgen Dựa trên mức độ hoàn chỉnh của các motif lặp lại, đã phân chia các SSRthành ba nhóm khác nhau, bao gồm: (i) SSR lặp lại hoàn chỉnh (perfectrepeats), có chứa một motif lặp lại liên tục không bị ngắt quãng; (ii) SSR lặplại không hoàn chỉnh (imperfect repeat), chuỗi motif lặp lại bị gián đoạn bởimột hay một vài base không thuộc cấu trúc motif; (iii) SSR lặp lại phức hợp(compound repeat), là sự kết hợp xen kẽ có hoặc không có quy luật của hơnhai motif khác nhau [31]

Tính đặc hiệu cao: Các đoạn mồi SSR được thiết kế dựa trên vùng trình

tự sườn có tính bảo thủ cao của các đoạn lặp SSR, do đó sản phẩm nhân gencủa phản ứng SSR-PCR đặc hiệu và ổn định hơn các chỉ thị DNA ngẫu nhiên.Bên cạnh đó, nhờ tính chất bảo thủ của vùng trình tự sườn mà các mồi SSR

có thể được sử dụng chéo giữa các loài có quan hệ di truyền gần gũi [18]

Di truyền đồng trội và mức độ đa hình cao: Trải qua tiến hóa và cácbiến đổi di truyền, số lần lặp lại các motif SSR thay đổi rất nhiều và làm chocác đoạn SSR có chiều dài khác nhau Bởi vậy phản ứng SSR- PCR có thểphát hiện các alen khác nhau trong một locus SSR, qua đó phát hiện được các

cá thể đồng hợp tử/ dị hợp tử ở locus đó (chỉ thị đồng trội) [18]

Với nhiều ưu điểm, chỉ thị SSR được ưa chuộng nhất trong nghiên cứuđánh giá đa dạng hệ gen cũng như phân tích sự đa hình các gen chức năng ởchè Đến nay rất ít chỉ thị SSR được phát triển dựa vào hệ gen Chỉ thị SSRđược xác định chủ yếu tập trung vào trình tự EST của các gen đơn bản Zhao

và đtg là nhóm nghiên cứu đầu tiên xác định được 24 chỉ thị SSR từ 2119 EST.Năm 2009, nhóm nghiên cứu của Sharma đã thống kê có 2181 EST từ cơ sở

dữ liệu NCBI, trong đó có 1223 gen có trình tự SSR từ 2 – 34 nuleotide.Trong

109 gen phân tích nghiên cứu có chứa 120 SSR được xác định, 61 SSR lặp lại

2 nucleotide (50,8%), 37 lặp lại 3 nucleotide (30,8%), 8 lặp lại 4nucleotide

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu –

1.3.2 Chỉ thị R iên qu n đến protein thực hiện chức năn tr o đổi chất

Nghiên cứu của Sharman (2009), Ma và đtg (2010) khi so sánh cácđoạn EST ở chè với các gen đã biết trước từ các loài khác cho thấy hầu hếtcác chỉ thị SSR-EST được nghiên cứu cho đến nay được cho rằng có liênquan đến các quá trình sinh học, thành phần tế bào và chức năng phân tử ởchè Các chỉ thị SSR-EST liên quan đến quá trình sinh học ở chè bao gồm:quá trình trao đổi chất, protein đáp ứng lại stress, tổ chức tế bào Có 3 dạngchỉ thị SSR-EST liên quan đến thành phần tế bào là các đoạn SSR mã hóaprotein tham gia cấu tạo màng tế bào, nội bào và ngoại bào Khi phân tíchdưới dạng chức năng phân tử, các chỉ thị SSR-EST biểu hiện dưới các đoạnDNA mã hóa protein cấu trúc, protein bám, protein xúc tác Những chỉ thịSSR liên quan tới các protein thực hiện chức năng glyoxalase, tổng hợpsucrose, … [28], [33]

Sucrose là một disaccharide của glucose và fructose có công thứcphân tử là C12H22O11 Đây là sản phẩm chính của quá trình quang hợp, có vaitrò bổ sung năng lượng cho sự sinh trưởng và phát triển của thực vật cũngnhư các sinh vật sống Sucrose tích lũy phần lớn ở các mô thực vật, giúp chothực vật thích nghi tốt với các điều kiện bất lợi của môi trường như: Hạn, lạnh,mặn, và cường độ ánh sáng mạnh Sinh tổng hợp sucrose là một chu trìnhphức tạp di n ra ở cytosol trong lá của cây trồng với sự tham gia của nhiềuenzyme khác nhau, trong đó một một số enzyme chính có ảnh hưởng tới lượngsucrose được tổng hợp Các enzyme này có các dạng phản ứng: (1) tổng hợpsucrose như sucrose 6-phosphatephosphatase (SPS) hoặc sucrosesynthase (SS),(2) thủy phân sucrose như β- fructofuranosidase (Invertase), (3) vận chuyểncác hexose tới tế bào chất và chuyển hóa lại thành sucrose như pyrophosphatefructose 6- phosphate 1-phosphatetransferase (PFP) Dưới đây là hình ảnh chutrình sinh tổng hợp sucrose với sự tham gia của các enzyme chính 3

Hình 1.2 Chu trình sinh tổng hợp sucrose với sự tham gia

của các enzyme chínhCác enzyme liên quan đến quá trình sinh tổng hợp sucrose ở thực vật đãđược nghiên cứu trên nhiều đối tượng gồm cả thực vật hai lá mầm và một lá

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu –

loại thực vật khác nhau và cho đến nay ngân hàng NCBI đã có thông tin vềvài trăm trình tự có liên quan tới enzym tổng hợp sucrose của thự vật hai lámầm như khoai tây, thuốc lá, củ cải đường, arabidopsis; cây một lá mầm nhưlúa, ngô, mía…[3] Ở chè, gen mã hóa cho enzyme tổng hợp sucrose đã đượcphân lập bởi Ma và đtg (2010) bằng chỉ thị SSR Nghiên cứu này chỉ ra rằnghàm lượng sucrose trong lá chè có ảnh hưởng tới chất lượng thực phẩm chènhư hương thơm, độ ngậy 28] Ở Việt Nam chưa có nghiên cứu nào về gen

mã hóa cho protein có hoạt tính enzyme tổng hợp sucrose ở cây chè

Glyoxalase là một hệ thống bao gồm hai enzyme, lactoylglutathionelyase (glyoxalase I, GLX1) và hydroxyacylglutathione hydrolase (glyoxalase

II, GLX2), hai enzyme đồng giữ vai trò chuyển đổi các aldehyde α-keto vàohydroxyacids với sự có mặt của glutathione Glyoxalase được hình thành theochuỗi phản ứng sau [24]:

Glutathione + Methylglyoxal Adduct hemithioacetal (R) lactoylglutathione

-S-Hệ thống này hình thành và phát triển để khử MG (methylglyoxal); đây

là một chất độc có khả năng gây đột biến, được hình thành từ sản phẩm phụcủa quá trình chuyển hóa carbohydrate và lipid

Hình 1.3 Sơ đồ hệ thống enzyme glyoxilase

Glyoxalase đóng vai trò quan trọng và nhận tín hiệu tích cực như mộtchất chống ung thư GLX1 và 2 có thể ức chế sự hình thành các sản phẩmglycation do quá trình tăng đường huyết gây nên, do đó các enzyme này đóngvai trò ngăn ngừa bệnh đái tháo đường; đồng thời GLX2 được xác định nhưgen đích của p63 và p73, và kích thích sự hoạt hóa phiên mã của p53 Hiệnnay hệ thống glyoxalase được nghiên cứu rộng rãi trong giới sinh vật, từ vi

sinh vật, động – thực vật và con người [24] Ở Plasmodium falciparum và các sinh vật đơn bào như Leishmania donovani, việc chống lại methyglyoxal

được thực hiện bằng cách tăng mức độ hoạt động của GLX1 Ở Người, gen

mã hóa cho GLX2 nằm trong ty thể Có năm giả định về gen GLX2 trong hệ

gen của cây Arabidopsis thaliana bao gồm: GLX2-1, GLX2-4, GLX2-5 được

dự đoán có nguồn gốc từ ty thể; sự hiện diện của GLX2 trong ty thể rất đáng

ngạc nhiên bởi GLX1 của cây Arabidopsis thaliana chỉ quan sát thấy trong

bào tương Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng GLX2 (GLX2-2) có trong ty thể

của cây Arabidopsis thaliana có cấu trúc và vai trò giống với GLX2 có trong

ty thể của tế bào chất con người [35] Do đó có thể ứng dụng những sản phẩmtrao đổi chất từ GLX2 ở loài cây này để sản xuất thực phẩm chức năng phục

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu –

vụ sức khỏe con người Năm 2010 Ma và đtg đã chứng minh được trong hệgen của chè có đoạn gen liên quan đến sự trao đổi glyoxalase [28] Ở chè,việc nghiên cứu hệ thống glyoxalase còn hạn chế; Trung Quốc là nước đầutiên công bố trình tự gen mã hóa glyoxalase trên ngân hàng gen; Việt Namchưa có nghiên cứu nào về gen mã hóa cho glyoxalase

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu

Lá của 18 mẫu chè đặc sản đang được trồng tại một số vùng trồng chè ởThái Nguyên được thu hái làm vật liệu nghiên cứu Danh sách tên và nguồngốc các mẫu lá chè nghiên cứu được trình bày ở bảng 1 phụ lục 1

- Bộ kit dùng cho phản ứng PCR của hãng QIAGEN

- Bộ kit tinh sạch sản phẩm PCR (binding buffer, washing buffer,elusion buffer) – GeneJET Gel Extraction Kit của hãng Thermo Scientific

- Các hóa chất thông dụng khác như: Nước khử ion, ethanol, IPTG,TAE (Tris base, Axit acetic (CH3COOH), EDTA 0,5 M), nito lỏng…

2.1.3 Thiết bị

Các thiết bị, dụng cụ dùng trong nghiên cứu sinh học phân tử thuộcKhoa Khoa học Sự sống – Trường Đại học Khoa học, Viện Nghiên cứu hệgen – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu –

Bảng 2.1 Danh mục các thiết bị, dụng cụ được sử dụng

1 Máy soi gel với tia UV (USA) 1 Bình đá

2 Bể ổn nhiệt (Jeio Tech – Hàn

Quốc)

2Bình tam giác các cỡ

3 Máy đo quang phổ (Thermo

4 Bể điện di ngang và bể điện di

đứng

4Đầu côn các cỡ

5 Cân điện tử (Satorius – Đức) 5 Găng tay cao su

6 Lò vi sóng (Sharp, Malaysia) 6 Micropipet: 1 - 5 μl

7 Máy đo pH (Japan) 7 Micropipet: 5 - 10 μl

8 Máy PCR (Singapore) 8 Micropipet: 20 - 100 μl

10 Nồi hấp khử trùng (Đài Loan) 10 Micropipet: 100 - 1000 μl

2.2 Phương ph p nghiên cứu

2.2.1 Ph ơn pháp thu mẫu lá chè

Các mẫu lá chè tươi với phần búp non có 1 – 2 lá bánh tẻ (một tôm hailá) được thu hái trực tiếp ngay tại các địa điểm lấy mẫu Các mẫu lá chè đượcrửa sạch, và tiến hành tách chiết DNA tổng số ngay

2.2.2 Ph ơn pháp tách chiết DNA tổng số từ lá chè

DNA tổng số từ lá chè được tách chiết theo kít GeneJET ™ Plant DNA

Genomic Purification Mini Kit của hãng Thermo

Lá chè tươi thu về rửa sạch sau đó tiến hành tách chiết ngay, quy trìnhtách chiết DNA tổng số bằng kít bao gồm các bước cơ bản sau:

Bước 1: Dùng pipet hút 350 l lysis buffer A vào ống 1,5 ml vô trùng(dung dịch A bổ sung PVP đến nồng độ cuối cùng là 2 %) Lấy 100 mg mô látươi nghiền trong cối chày sứ với nitơ lỏng Chuyển nhanh bột mô đã nghiềnmịn vào ống ép 1.5 có chứa 350 l lysis buffer A Vortex 10 – 20s để trộn đều

Chú ý : Chuyển mô đã nghiền nhanh chóng để tránh DNA bị biến tính.Đảm bảo tất cả mô được trộn đều với đệm lysis buffer A, biến tính có thể xảy

ra với nguyên liệu còn sót trên thành ống Mô có thể sử dụng ngay để táchDNA hoặc bảo quản ở - 70 C đến khi dùng

Bước 2: Bổ sung 50 l lysis buffer B và 20 µl Rnase A Trộn bằngvortex hoặc pipet Để mô có thể kháng lại với sự gián đoạn của cơ học, thêmcát thủy tinh và vortex trong 1 phút

Bước 3: Ủ mẫu ở 65 C trong 10 phút, thỉnh thoảng đảo đều

Bước 4: Thêm 130 l dịch tủa đảo ngược ống 2 - 3 lần rồi đặt lên đátrong 5 phút

Bước 5: Ly tâm 12.000 v/p trong 10 phút

Bước 6: Thu dịch pha trên (thường 450 – 550 l) chuyển sang ống mới.Thêm 400 l dung dịch binding DNA genome và 400 l cồn 96 và đảo đều

Bước 7: Chuyển một nửa hỗn hợp (600 – 700 l) đến cột, ly tâm8000v/p trong 1 phút loại bỏ dịch nổi Đưa tiếp lượng dịch còn lại vào vào một cột để ly tâm 8000v/p trong 1 phút

Bước 8: Bổ sung 500 l đệm rửa I (ethanol phải được bổ sung vào bufferI) vào cột ly tâm 10000v/p trong 1 phút, loại bỏ dịch và đặt cột trở lại ống

Bước 9: Thêm 500 l đệm rửa II, ly tâm 12000 v/p trong 6 phút, đổ

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu –

dịch (mở nắp 5 phút) Đặt cột trở lại ống, ly tâm 12.000 v/3 phút Chuyển cộtvào ống 1.5 ml vô trùng

Bước 10: Để thu nhận DNA thêm 50 l Elution Buffer (hoặc H2O 2x

vô trùng), ủ trong khoảng 10 - 15 phút ở nhiệt độ phòng, sau đó ly tâm10.000v/p trong 3 phút Thu dịch trong ống, đậy nắp, ghi nhãn

Bước 11: Thực hiện thu DNA lần thứ hai, thêm 50 l Elution Buffer(hoặc H2O 2x vô trùng) vào cột và đặt lên 1 ống 1,5 ml vô trùng khác

Bước 12: DNA tinh sạch có thể sử dụng hoặc bảo quản ở – 20 ºC

2.2.3 Ph ơn pháp điện di

2.2.3.1 Phương pháp điện di trên gel agarose

Nguyên tắc của phương pháp điện di là dựa vào đặc tính cấu trúc củaaxit nucleic Axit nucleic là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp

bề mặt nên khi chịu tác động của dòng điện một chiều chúng sẽ di chuyển từcực âm về cực dương trong điện trường

Chúng tôi sử dụng phương pháp này để xác định DNA tổng số của 18mẫu chè nghiên cứu DNA tổng số được điện di trên gel agarose 0,8 % ở điềukiện 110V/30 phút, chạy với đệm TAE 1X Sau khi điện di, bản gel agaroseđược nhuộm 10 phút trong dung dịch EthBr 0,5ng/ml, sau đó soi chụp bằngmáy MultiDoc-It của hãng UVP

2.2.3.2 Phương pháp điện di trên gel polyacrylamide

Để phân tích đặc điểm di truyền các giống/dòng chè, sản phẩm PCR sẽ được điện di trên gel polyacrylamide 8% ở điều kiện 80V/90 phút,với đệm chạy là TBE 1X Sau khi điện di, bản gel polyacrilamide đượcnhuộm 10 phút trong dung dịch EthBr 0,5 ng/ml, sau đó soi chụp bằng máyMultiDoc-It của hãng UVP Thành phần gel polyacrylamide 8% (cho 2 bảngel kích thước 8cm x 7,3cm) được chuẩn bị như bảng 2.2