Nghiên cứu chế biến phụ phẩm thủy sản thành chế phẩm protein thủy phân dùng trong nuôi cấy nấm men yarrowia lipolytica

Đánh giá khả năng sử dụng chất dinh dưỡng trong dịch thủy phân đầu cá ngừ vây vàng của nấm men Y.. lipolytica trên môi trường dịch thủy phân có thể làm giảm hàm lượng lipid trong dịch th

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & MÔI TRƯỜNG

Giảng viên hướng dẫn : ThS TRẦN HẢI ĐĂNG

Sinh viên thực hiện : PHẠM THỊ NHƯ Ý

Mã số sinh viên : 56130574

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & MÔI TRƯỜNG

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ MÔI TRƯỜNG

LỜI CAM ĐOAN

Tôi tên là : PHẠM THỊ NHƯ Ý

MSSV : 56130574

Hiện đang là sinh viên lớp Công Nghệ kỹ thuật môi trường (khóa 2014-2018)

Tôi xin cam đoan mọi kết quả của đề tài: “Nghiên cứu chế biến phụ phẩm thủy

sản thành chế phẩm protein thủy phân dùng trong nuôi cấy nấm men Yarrowia lipolytica” là công trình nghiên cứu của cá nhân tôi và chưa từng được công bố trong

bất cứ công trình khoa học khác cho tới thời điểm này

Sinh viên thực hiện

PHẠM THỊ NHƯ Ý

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian thực hiện đề tài, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ của quý Thầy Cô Trường Đại Học Nha Trang, đã tạo điều kiện tốt nhất cho tôi được hoàn thành đề tài Xin cám ơn Quý Thầy Cô giáo viện Công Nghệ Sinh Học & Môi Trường

và các cán bộ - Trung tâm thí nghiệm thực hành Trường Đại Học Nha Trang đã tận tình giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi thực hiện đề tài trong suốt thời gian qua

Sự biết ơn sâu sắc nhất của tôi được dành cho Thầy Trần Hải Đăng đã tận tình hướng dẫn và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Xin cảm ơn cô Tạ Thị Minh Ngọc, cô Phạm Thị Lan và cô Nguyễn Hồng Ngân đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện nghiên cứu

Đặc biệt, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình và tất cả bạn bè đã giúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đồ án tốt nghiệp

Sau cùng, em xin kính chúc Quý thầy cô trong viện Công nghệ sinh học & môi trường và Thầy Trần Hải Đăng thật dồi dào sức khỏe, niềm tin để tiếp tục thực hiện sứ mệnh cao đẹp của mình là truyền đạt kiến thức cho thế hệ mai sau

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Sinh viên thực hiện

PHẠM THỊ NHƯ Ý

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH vii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ix

MỞ ĐẦU x

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1

1.1 Tổng quan về cá ngừ và phế liệu cá ngừ 1

1.1.1 Cá ngừ và cá ngừ vây vàng 1

1.1.2 Tình hình khai thác, chế biến và xuất khẩu cá ngừ ở Việt Nam và trên thế giới 4 1.2 Phế liệu cá ngừ và hướng tận dụng 6

1.3 Tổng quan về enzyme Protease 8

1.3.1 Giới thiệu chung về enzyme Protease 8

1.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân protease 10

1.3.3 Các sản phẩm của quá trình thủy phân phế liệu thủy sản sử dụng protease 11

1.4 Sản xuất sinh khối nấm men 12

1.4.1 Tổng quan về nấm men Yarrowia lipolytica 12

1.4.2 Quy trình sản xuất sinh khối nấm men 20

CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 Nguyên vật liệu 24

2.1.1 Đầu cá ngừ vây vàng 24

2.1.2 Enzyme Protamex 24

2.1.3 Nấm men Yarrowia lipolitica 24

2.1.4 Dụng cụ, máy móc và thiết bị 24

2.1.5 Hóa chất 25

2.2 Nội dung nghiên cứu 26

2.3 Phương pháp nghiên cứu 27

2.3.1 Phương pháp xử lý nguyên liệu đầu cá 27

2.3.2 Phân tích hàm lượng protein theo phương pháp Kjeldahl 30

2.3.3 Phân tích hàm lượng lipid theo phương pháp Bligh-Dyers 31

2.3.4 Phương pháp xác định độ ẩm theo phương pháp chuẩn AOAC 950.46 (2000) 32 2.3.5 Xác định hàm lượng tro theo phương pháp AOAC 923.03 (2000) 33

2.4 Phương pháp nghiên cứu vi sinh 34

2.4.1 Điều kiện bảo quản, hoạt hóa và nuôi cấy 34

2.4.2 Xác định năng suất tạo sinh khối 34

2.4.3 Xác định tốc động tăng trưởng riêng tối đa µmax 35

2.4.4 Xác định hàm lượng lipid trong sinh khối nấm men 35

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ KẾT LUẬN 36

3.1 Thành phần hóa học đầu cá ngừ vây vàng 36

3.2 Ảnh hưởng của pH tới quá trình thủy phân đầu cá ngừ vây vàng bằng enzyme Protamex 36

3.3 Đánh giá khả năng sinh trưởng của Y lipolytica trên môi trường dịch thủy phân.38 3.3.1 Năng suất tạo sinh khối của Y lipolytica khi nuôi trên dịch thuỷ phân 38

3.3.2 Đánh giá khả năng sử dụng chất dinh dưỡng trong dịch thủy phân đầu cá ngừ vây vàng của nấm men Y lipolytica 39

3.4 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng của nấm men Y lipolytica trên môi trường dịch thủy phân đầu cá ngừ 41

3.4.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ cấy giống đến khả năng sinh trưởng của nấm men Y lipolytica trên môi trường dịch thủy phân đầu cá ngừ 41

3.4.2 Ảnh hưởng của pH nuôi đến khả năng sinh trưởng của nấm men Y lipolytica trên

môi trường dịch thủy phân đầu cá ngừ 43

3.4.3 Ảnh hưởng của thể tích nuôi đến khả năng sinh trưởng của nấm men Y lipolytica trên môi trường dịch thủy phân đầu cá ngừ 44

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 48

Kết luận 48

Kiến nghị 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO 50

Tài liệu tiếng Việt 50

Tài liệu tiếng Anh 51

Tài liệu internet 54

PHỤ LỤC 55

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1 1: Thành phần hóa học của cá ngừ 3

Bảng 1 2: Thành phần hóa học của cá ngừ vây vàng 3

Bảng 1 3: Sản lượng khai thác cá ngừ đại dương tháng 5 và 5 tháng đầu năm 2016 4

Bảng 1 4: Thành phần hóa học của đầu một số cá béo 8

Bảng 1 5: Tổng hợp một số protease thương mại 9

Bảng 1 6: Ví dụ sử dụng Y lipolytica để xử lý hay nâng cao giá trị cho phế phẩm (theo Bankar và cộng sự, 2009) 18

Bảng 2 1: Dụng cụ và máy móc thiết bị dùng trong quá trình nghiên cứu 25

Bảng 2 2: Thành phần các môi trường sử dụng 34

Bảng 3 1: Thành phần hóa học của đầu cá ngừ vây vàng 36

Bảng 3.2: Thành phần dịch thủy phân đầu cá ngừ vây vàng 38

Bảng 3 3: Mật độ tế bào và năng suất tạo sinh khối khô sau 72h của Y lipolytica 39

DANH MỤC HÌNH

Hình 1 1: Cá ngừ vây vàng 2

Hình 1 2: Sản lượng khai thác cá ngừ 5 tháng đầu năm 2016 và cùng kỳ 5

Hình 1 3: Tổng giá trị xuất khẩu của cá ngừ Việt Nam đạt 271 USD trong nửa đầu năm 2017 5

Hình 1 4: Hình tll, M.Y lipolytica 0544 13

Hình 1 5: Quy trình chung sản xuất sinh khối nấm men 20

Hình 2 1: Đầu cá ngừ vây vàng 24

Hình 2 2: Sơ đồ nội dung nghiên cứu 26

Hình 2 3: Sơ đồ xử lý và thủy phân đầu cá ngừ vây vàng 27

Hình 2 4: Nguyên liệu đầu cá ngừ vây vàng 28

Hình 2 5: Đầu cá được xay nhỏ bởi máy xay thịt cá TA57/D 29

Hình 2 6: Tủ sấy chân không LVO2040+LVO1003 32

Hình 3 1: Hiệu suất thu hồi protein khi thuỷ phân đầu cá ngừ vây vàng với Protamex theo pH 37

Hình 3 2: Hiệu suất thu hồi lipid khi thuỷ phân đầu cá ngừ vây vàng với Protamex theo pH 37

Hình 3 3: Ảnh hưởng của môi trường đến năng suất tạo sinh khối của Y lipolytica 39

Hình 3 4: Tỷ lệ sử dụng chất dinh dưỡng khi nuôi cấy Y lipolytica trên DTP đầu cá và trên môi trường YPD 40

Hình 3 5: Khả năng sinh trưởng của Y lipolytica khi nuôi trên dịch thủy phân đầu cá ngừ vây vàng theo tỷ lệ cấy giống 41

Hình 3 6: Hiệu quả sử dụng dinh dưỡng của Y lipolytica khi nuôi trên dịch thủy phân đầu cá ngừ vây vàng theo tỷ lệ cấy giống 42

Hình 3 7: Khả năng sinh trưởng của Y lipolytica khi nuôi trên dịch thủy phân đầu cá vây vàng theo pH nuôi 43

Hình 3 8: Hiệu quả sử dụng dinh dưỡng của Y lipolytica trên dịch thủy phân đầu cá

ngừ vây vàng theo pH nuôi 43

Hình 3 9: Khả năng sinh trưởng của Y lipolytica khi nuôi trên dịch thủy phân đầu cá

ngừ vây vàng theo thể tích nuôi 45

Hình 3 10: Hiệu quả sử dụng dinh dưỡng của Y lipolytica khi nuôi trên dịch thủy phân

đầu cá ngừ theo thể tích nuôi 45Hình 3 11: Ảnh hưởng của thể tích dịch đến hiệu quả tạo năng suất sinh khối và hàm

lượng lipid trong sinh khối của Y lipolytica trên môi trường dịch thủy phân đầu cá ngừ

vây vàng 46

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Food and Agriculture Qrganization of the United

Nations

Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp

Liên Hiệp Quốc

6 YPDA Yeast pepton dextrose agar Môi trường yeast pepton dextrose

agar

7 YPD Yeast pepton dextrose Môi trường yeast pepton dextrose

MỞ ĐẦU

Ngày nay, khi chất lượng cuộc sống con người càng được nâng cao thì ô nhiễm môi trường lại trở thành vấn đề cần được quan tâm vì nó ảnh hưởng đến sức khỏe con người và mọi thứ xung quanh ta Đáng kể nhất, ngành chế biến thủy sản thải ra môi trường một lượng phế liệu rất lớn và được xem là một trong 6 ngành gây ô nhiễm môi trường lớn nhất Ở Việt Nam, cá ngừ là mặt hàng xuất khẩu đứng thứ 3 sau tôm và cá tra Cùng với các mặt hàng khác, cá ngừ được tiêu thụ nhiều tại Mỹ, Nhật Bản, EU… Tuy nhiên chỉ có khoảng 70-80 % thịt cá được chế biến thành sản phẩm, còn lại hàng năm các nhà máy thải ra 20 % sản phẩm phụ, chủ yếu là đầu cá ngừ Các nghiên cứu cho thấy thành phần đầu cá ngừ rất giàu protein và lipid, nếu không xử lý sẽ để lại hậu quả rất lớn do đặc trưng của thủy sản là dễ ươn hỏng gây mùi hôi thối, khó chịu Khi thải bỏ các phế liệu cá này thì các cơn mưa cuốn trôi các hợp chất phân hủy phế liệu ra sông, hồ…làm ô nhiễm môi trường nước Chưa kể, nhiều hợp chất mùi được tạo thành

từ các phản ứng phân hủy các acid amin trong phế liệu cá Ví dụ sự phân hủy do vi khuẩn của các acid amin chứa cystein và methyonin làm sản sinh ra các khí H2S,

CH3SH … là nguyên nhân chính làm ô nhiễm môi trường xung quanh Trong phế thải

có chứa mầm bệnh là các vi sinh vật kí sinh có thể gây bệnh cho con người Ngoài ra trong phế liệu cá chứa một lượng lớn chất vô cơ, khi thải ra môi trường mà không có xử

lý hợp lý thì ảnh hưởng đến môi trường như là chất thải rắn trong công nghiệp Vì vậy, việc chú trọng thu triệt để nguồn nguyên liệu phụ phẩm này rất cần thiết, đặc biệt khi các doanh nghiệp thủy sản đang muốn hướng tới mục tiêu phát triển bền vững

Hiện nay đã có nhiều nghiên cứu về tận dụng phụ phẩm thuỷ sản để sản xuất các chế phẩm có giá trị kinh tế như dầu diesel sinh học, gelatin, collagen, chitosan, dầu cá, bột cá… Nhìn chung với tất cả các nghiên cứu này thì công đoạn đầu tiên là khử protein

và chất béo trong phụ phẩm – một trong những khâu quyết định hiệu suất và chất lượng của chế phẩm Các nghiên cứu này thường sử dụng các biện pháp hóa học (thuỷ phân bằng acid, kiềm), phương thuỷ phần bằng nhiệt hoặc bổ sung enzyme protease để khử protein và chất béo Đối với đầu cá ngừ vây vàng, quá trình thuỷ phân có thể được thực hiện với nhiều loại protease khác nhau Sản phẩm thu được gồm dầu cá, phần không hoà tan và dịch thuỷ phân Tuy nhiên, dịch thủy phân đầu cá ngừ thường có hàm lượng lipid cao nên bột đạm thu được sau khi sấy dịch thủy phân rất dễ oxy hóa, khó bảo quản lâu

Nấm men Yarrowia lipolytica là nấm men ưa béo điển hình, có khả năng sử dụng lipid làm nguồn cacbon sinh trưởng tế bào Nuôi cấy Y lipolytica trên môi trường dịch thủy

phân có thể làm giảm hàm lượng lipid trong dịch thủy phân, đồng thời tạo ra sản phẩm sinh khối giàu chất dinh dưỡng cho con người, góp phần đa dạng hóa sản phẩm thu được

từ phế liệu đầu cá và góp phần bảo vệ môi trường

Mục tiêu đề tài

Nghiên cứu chế biến phụ phẩm thủy sản thành chế phẩm protein thủy phân dùng

trong nuôi cấy nấm men Yarowia lipolytica

Nội dung nghiên cứu

- Lựa chọn điều kiện pH thích hợp để thủy phân đầu cá ngừ vây vàng với enzyme

protamex nhằm thu dịch thuỷ phân nuôi cấy nấm men Y lipolytica

- Đánh giá khả năng sinh trưởng của nấm men Y lipolytica trên dịch thủy phân

đầu cá ngừ vây vàng

- Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy (pH, tỷ lệ cấy giống, thể tích

nuôi) đến khả năng sinh trưởng của nấm men Y lipolytica trên dịch thuỷ phân

đầu cá ngừ vây vàng

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Giúp các doanh nghiệp xử lí được nguồn phụ phẩm bảo vệ môi trường, đồng thời

tạo ra sản phẩm sinh khối nấm men Y lipolytica mang giá trị dinh dưỡng cao góp phần

đa dạng hóa sản phẩm trên thị trường

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về cá ngừ và phế liệu cá ngừ

1.1.1 Cá ngừ và cá ngừ vây vàng

Cá ngừ là tên gọi chung của một số loại cá nổi thuộc ngành động vật có xương

sống Vertebrata, thuộc lớp cá Pisces, Bộ cá vược Perciforms, Họ cá Thu ngừ

Scombridae

Cá ngừ là loài cá rất nhanh nhẹn và năng động, đa số các loài cá ngừ có thể di cư qua những khoảng cách rất xa với tốc độ cao Cá ngừ là loài cá đứng đầu trong chuỗi thức ăn ở biển, thức ăn của chúng là những loài cá nhỏ hơn, giáp xác, mực

Cá ngừ phân bố ở Thái Bình Dương, Ấn Độ Dương, Đại Tây Dương, biển Caribe

và Địa Trung Hải, khoảng từ 40 vĩ độ Bắc đến 40 vĩ độ Nam Biển Việt Nam có nhiều loài cá ngừ, ngư trường đánh bắt chủ yếu là vùng giữa biển Đông Tây Nam Bộ, Vịnh Bắc Bộ cũng có cá ngừ như ít hơn nhiều (Nhung, 2003)

Ở Việt Nam, nhóm cá ngừ chủ yếu gồm các loài cá ngừ đại dương và một số loài

có kích thước nhỏ: ngừ sọc dưa, ngừ bông, ngừ đen, ngừ chù và ngừ ồ (Nhung, 2003; Son & Nghia, 2006) Cá ngừ đại dương ở nước ta có 2 loại:

- Cá ngừ vây vàng (Thunnus albacares): Ngư trường chính là vùng biển miền

Trung Kích thước đánh bắt lớn nhất: dài 2,3 m; nặng 200 kg

- Cá ngừ mắt to (Thunnus obesus): Ngư trường chính là vùng biển miền Trung

và Đông Nam Bộ Kích thước đánh bắt lớn nhất: dài 2,5 m; nặng 210 kg (Nhung, 2003)

Trong tổng số 4 triệu tấn cá ngừ đánh bắt được hằng năm trên thế giới, có tới 65 % sản lượng khai thác ở Thái Bình Dương, 21 % ở Ấn Độ Dương và 14 % ở Đại Tây Dương, trong đó cá ngừ vây vằng chiếm 30 % và cá ngừ mắt to chiếm khoảng 10 % tổng sản lượng cá ngừ thế giới (Son, 2004)

Cá ngừ vây vàng

Cá ngừ vây vàng có tên tiếng anh là Yellowfin tuna, tên khoa học là Thunnus

albacares, thuộc học Scombridae (Mackerels, tunnas, bonitơs), bộ Perciformes và lớp Actinopterygii (ray-finned finshes)

Cá ngừ vây vàng sống ở các đại dương, cá ở vùng biển nhiệt đới và ôn đới nhưng ngoại trừ vùng biển Địa Trung Hải Ngư trường chính của loài cá này kéo dài 25o theo đường kinh tuyến Bắc

Cá ngừ vây vàng chủ yếu ăn các loài cá khác, giáp xác và động vật chân đầu Ngư dân thường sử dụng lưới vây để đánh bắt cá ngừ vây vàng kích thước nhỏ, thường sống

ở tầng mặt Đối với cá có kích thước lớn, sống sâu hơn ở tầng giữa, ngư dân sử dụng câu vàng để khai thác Sản lượng khai thác cá ngừ vây vàng hằng năm chiếm khoảng

62 % tổng sản lượng cá ngừ trên thế giới (1,6 triệu tấn) (Son, 2004)

Cá ngừ vây vàng có kích thước tối đa đạt 239 cm, trọng lượng tối đa được công bố

200 kg và tuổi tối đa 8 năm Loại cá này sinh trưởng ở môi trường có rạn đá ngầm, ở phạm vi độ sâu từ 1 đến 250 m Đây là loài ưa khí hậu nhiệt đới (15-31oC), phân bố trên toàn thế giới ở các vùng biển nhiệt đới và cận nhiệt đới nhưng không sống ở Địa Trung Hải Cá ngừ vây vàng là loài có tính di cư cao

Về đặc điểm hình dáng, cá ngừ vây vàng có 11 đến 14 tia vây lưng cứng, 12 đến

16 tia vây mềm, không có tia vây hậu môn cứng, có 11 đến 16 tia vây hậu môn mềm và

có 39 đốt sống lưng Vây lưng thứ 2 và vây đuôi có chiều dài bằng 20 % chiều dài toàn thân cá Vây bụng thường rất dài, thường kéo dài đến vây lưng thứ 2 nhưng không vượt

Hình 1 1: Cá ngừ vây vàng

quá tia vây cuối cùng của vây lưng thứ 2 Màu sắc của cá ngừ vây vàng thay đổi từ màu xanh đen đậm có ánh kim, màu vàng đến màu bạc trên vùng bụng

Về đặc điểm sinh học đây là loài cá xuất hiện ở bên trên và bên dưới các tầng có nhiệt độ đột biến Kết đàn chủ yếu theo kích cỡ, thành phần các nhóm đơn loài hoặc đa loài Cá lớn thì thường kết đàn với cá heo, và cũng đi theo các vật trôi nổi hoặc vật khác Thức ăn chủ yếu của loài cá này là cá, giáp xác và mực Cá ngừ vây vàng rất nhạy cảm với những nơi nồng độ oxy thấp, vì thế thường không bắt gặp ở độ sâu dưới 250 m ở các vùng biển nhiệt đới Thời kỳ đẻ cao điểm nhất là vào mùa hè, theo từng đợt Ngư dân thường dùng lưới vây bắt những đàn cá ở gần bề mặt nước Sản phẩm cá ngừ vây vàng được đóng hộp hoặc cấp đông, cũng có thể để tươi, hun khói hoặc dùng làm sashimi (Thong và cộng sự, 2007)

Thành phần hóa học của cá ngừ vây vàng

Thành phần hóa học và dinh dưỡng của cá ngừ phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: Giống loài, kích thước, mùa vụ, vị trí địa lý khu vực khai thác, thời kỳ sinh sản… Thành phần hóa học và dinh dưỡng quyết định đến giá trị của từng loại cá ngừ Thành phần hóa học của cá ngừ được thể hiện ở bảng 1.1 dưới đây:

Bảng 1 1: Thành phần hóa học của cá ngừ

Nước (%) Protein (%) Chất béo (%) Carbonhydrate

Nguồn: Infofish International No5/1997

Bảng 1 2: Thành phần hóa học của cá ngừ vây vàng

Thành phần dinh dưỡng trong 100 g thực phẩm ăn được

Năng

lượng

Thành phần chính Muối khoáng Vitamin

Nước Protein Lipit Tro Ca P Fe Na K A B1 B2 PP

Nguồn: dau-dong-hop/

https://cntp11htp01.wordpress.com/2012/11/09/nhom-9-ca-ngu-ngam-1.1.2 Tình hình khai thác, chế biến và xuất khẩu cá ngừ ở Việt Nam và trên thế

giới

Thủy sản là một trong những ngành chủ lực của Việt Nam, đóng góp không nhỏ vào GDP quốc gia Theo bộ thủy sản, hàng thủy sản Việt Nam hiện đã có mặt gần 100 nước và vùng lãnh thổ Các mặt hàng cá ngừ đại dương là một trong những mặt hàng chủ lực của Việt Nam đứng thứ ba sau tôm và cá tra hàng năm đem về cho nước nhà một nguồn ngoại tệ đáng kể Phần lớn cá ngừ được xuất khẩu sang các nước, khu vực

có nhu cầu lớn về hàng hải: Nhật Bản, EU, Mỹ… Từ cá ngừ có thể sản xuất các sản phẩm có giá trị kinh tế là Shasimi, Shusi Trong đó, cá ngừ vây vàng và cá ngừ mắt to được chú trọng nhất

Sản lượng khai thác cá ngừ đại dương 5 tháng đầu năm 2016 tăng 7,1 % so với cùng kỳ, ước đạt 9.605 tấn, trong đó Bình Định ước đạt 4.720 tấn, Phú Yên 2.911 tấn, Khánh Hòa 1.974 tấn

Bảng 1 3: Sản lượng khai thác cá ngừ đại dương tháng 5 và 5 tháng đầu năm 2016

Ước năm 2016 So sánh cùng

kỳ 5 tháng (%) Ước tháng 5 Ước 5 tháng

Nguồn: Trung tâm Thông tin Thủy sản tổng hợp

Hình 1 2: Sản lượng khai thác cá ngừ 5 tháng đầu năm 2016 và cùng kỳ

Nửa đầu năm 2017, tổng giá trị xuất khẩu của ngành cá ngừ đạt 271 triệu USD, tăng 21 % so với cùng kỳ

năm 2016 Trong đó, xuất khẩu cá ngừ chế biến đóng hộp tăng mạnh 33,7 % so với cùng

kỳ năm trước

Cá ngừ đông lạnh mã HS0304 tiếp tục là sản phẩm xuất khẩu chủ lực của Việt Nam, chiếm hơn 48 % tổng giá trị xuất khẩu cá ngừ của Việt Nam trong 6 tháng đầu năm, đạt 129 triệu USD Tiếp đến là cá cá ngừ đóng hộp chiếm 30 %, đạt 81 triệu USD, tăng 33 % Xuất khẩu cá ngừ chế biến khác chiếm 15 %, đạt 39 triệu USD Còn xuất khẩu cá ngừ tươi sống, đông lạnh và khô mã HS03 (trừ HS0304) chiếm 7,8 %, đạt 21 triệu USD

Hiện các sản phẩm cá ngừ của Việt Nam đã xuất được sang 97 nước trên thế giới,

mở rộng so với cùng kỳ năm ngoái, điều này đã giúp đẩy mạnh xuất khẩu cá ngừ của Việt Nam trong nửa đầu năm 2017 Top 8 thị trường xuất khẩu cá ngừ chính của Việt Nam không có sự thay đổi so với quý trước, bao gồm Mỹ, EU, Israel, ASEAN, Nhật Bản, Canada, Trung Quốc và Mexico, chiếm 88 % tổng giá trị xuất khẩu cá ngừ trong 6 tháng đầu năm 2017 Trong đó, xuất khẩu cá ngừ sang thị trường Mexico tăng trưởng rất ấn tượng 125 % Với tốc độ tăng trưởng cao như vậy nước này đã vượt qua Canada

và Trung Quốc trở thành thị trường xuất khẩu lớn thứ 6 của Việt Nam

1.2 Phế liệu cá ngừ và hướng tận dụng

Sản lượng khai thác cá ngừ trên thế giới đạt khoảng trên 4 triệu tấn, trong đó

40-60 % là phế liệu trong chế biến Cá ngừ thường được chế biến tươi sống và tiêu thụ dưới dạng cắt khoanh, fillet hoặc đóng hộp Trong đóng hộp, chỉ khoảng 1/3 toàn bộ thân cá

là có thể dùng để gia tăng giá trị Hàng năm, phế liệu từ ngành chế biến cá ngừ đóng hộp ước đạt khoảng 450.000 tấn Bởi vậy, ngành công nghiệp chế biến cá ngừ phải tìm cách để tận dụng các phế liệu sẵn có không mất công khai thác, làm cho chúng trở thành những sản phẩm có giá trị, từ đó tăng thêm thu nhập cho doanh nghiệp Ở nước ta sản lượng cá ngừ khai thác trên 30.000 tấn mỗi năm, như vậy lượng phế liệu cá ngừ khoảng 12.000-18.000 tấn Đây là một nguồn phế liệu khá lớn, cần nhiều biện pháp thích hợp

để tận dụng góp ý nâng cao giá trị trên một đơn vị nguyên liệu (Hương, 2006)

Phế liệu từ cá ngừ phụ thuộc vào phương pháp chế biến và dạng sản phẩm sản xuất, thông thường phế liệu bao gồm: đầu cá, xương, vây, vẩy, da, nội tạng, cơ thịt đen Doanh nghiệp bắt buộc xử lí phế liệu này trước khi xả thải ra môi trường Đây lại là

nguồn tài nguyên quý giá, nếu tận dụng để gia tăng giá trị thì có thể đem lại lợi nhuận rất lớn

Cụ thể, nội tạng cá là nguồn enzyme protease rất lớn mà hiện nay đang được các nhà khoa học quan tâm và khai thác, enzyme được chiết rút được bổ sung vào các quá trình thủy phân protein Các chất thủy phân protein bị phân tách về mặt hóa học hoặc sinh học thành các chuỗi peptide có kích thước khác nhau Điều này tạo điều kiện cho việc tiết kiệm thời gian, nâng cao năng suất và hiệu suất của quá trình thủy phân và tạo

ra các sản phẩm có hoạt tính sinh học cao Bên cạnh đó, gelatin trong các ngành công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm, dược phẩm cũng đang được sản xuất từ nguồn phế liệu là xương, da và bong bóng cá (Biohaz, 2010; Mbatia, 2011) Đầu và xương cá ngừ chứa một lượng canxi và photpho đáng kể có thể tận dụng để bổ sung vào thức ăn chăn nuôi hoặc thực phẩm cho người Bột xương cá ngừ có tiềm năng trở thành một sản phẩm phụ giá trị gia tăng trong ngành công ngiệp chế biến cá ngừ

Phế liệu cá có thể là nguồn cung cấp lipid rất tốt cho sức khỏe khi sử dụng nó vào các sản phẩm dinh dưỡng cho người và động vật (Falch, 2006) Việc sử dụng dầu cá cho tiêu dùng của con người đang ngày càng tăng lên trong vài thập niên gần đây (Aidos, 2002) và các nghiên cứu về dinh dưỡng đã cho thấy rằng hầu hết con người không có

đủ các axit béo ω-3 trong khẩu phần ăn của họ (Horrock & Yeo, 1990; Simopolous, 2002) Như chúng ta đã biết, thiếu acid béo ω-3 dẫn đến ảnh hưởng khả năng nhận thức, khả năng nhìn Dầu cá là nguồn dinh dưỡng bổ sung phù hợp có thể bù đắp sự thiếu hụt dinh dưỡng này

Trước đây, các phế liệu cá ngừ thường bị thải ra môi trường hoặc chỉ được tận dụng làm thức ăn cho người và động vật một cách đơn giản và thô sơ Sau đó, người ta bắt đầu ứng dụng phương pháp thủy phân trong quá trình sản xuất bột cá để kết hợp với việc thu hồi dầu từ phế liệu cá ngừ Hiện nay, việc sử dụng các phương pháp ứng dụng công nghệ enzyme trong quá trình thủy phân để thu hồi protein từ đầu, xương cá, thịt vụn…để tạo ra các sản phẩm như thức ăn cho gia súc, bột nêm gia vị, bột đạm dinh dưỡng, nước mắm… đang được thế giới quan tâm Tuy nhiên, việc ứng dụng phương pháp này ở các doanh nghiệp trong nước còn rất hạn chế

Vì thế, cần có những kế hoạch thu hồi và sử dụng nguồn phế liệu một cách có hiệu quả, để cho các sản phẩm này không còn là phế liệu nữa mà trở thành nguồn nguyên

liệu thứ cấp, mang lại hiệu quả kinh tế cho các doanh nghiệp mà không bị lãng phí và gây ô nhiễm môi trường

Bảng 1 4: Thành phần hóa học của đầu một số cá béo

cá ngừ hay dịch thủy phân đầu cá ngừ để sản xuất sinh khối nấm men

1.3 Tổng quan về enzyme Protease

1.3.1 Giới thiệu chung về enzyme Protease

Các protease khá phổ biến ở động vật, thực vật và vi sinh vật Ở thực vật, từ quả

đu đủ có thể thu được papain, từ quả và đọt dứa có thể thu nhận bromelin, từ hạt đậu tương có thể thu nhận urease…, từ mô động vật (thu pesin từ dạ dày, thu trypsin, chymotrypsin từ tuỵ tạng), hoặc từ vi sinh vật (các chủng có khả năng sinh tổng hợp

proteaza như Bacillus, Aspergillus, Penecillium, Clostridium, Streptomyces…)

Hiện nay trên thị trường có rất nhiều loại protease, một số loại protease được sử dụng phổ biến hiện nay:

Protamex là protease của Bacillus (Bagsvaerd, Denmark) Enzyme có hoạt tính

endoprotease Điều kiện tối ưu của Protamex trong khoảng pH=5,5-7,5 ở nhiệt độ

35-65oC Protamex có hoạt tính 1,5 AU/g Enzyme này bị bất hoạt ở 85oC trong 10 phút và

ở pH thấp (Novozyme, 2001)

Alcalase 2,4L là protease của Bacillus incheniformis với hoạt tính endopeptidase

Alcalase là enzyme thương mại thuộc nhóm serine protease subtilisin A hoạt tính của Alcalase 2,4L là 2,4 AU/g, bị ức chế ở pH thấp, điều kiện hoạt động tốt nhất của Alcalase

là pH=8, nhiệt độ 50-600C (Liaset B và cộng sự, 2003)

Flavourzyme là peptidase mang cả hai hoạt tính endo- và exoprotease

(aminopeptidase), được sản xuất từ quá trình lên men chìm loài Aspergillus oryzae này

hoạt động thủy phân protein trong điều kiện trung tính hoặc axit yếu Điều kiện hoạt động tối ưu của Flavourzyme 500L là pH=5,0-7,0, nhiệt độ khoảng 50oC Flavourzyme 500L có hoạt tính 500 LAPU/g Flavourzyme có thể bị ức chế hoạt động ở 90oC trong

10 phút hoặc 120oC trong 5 giây Đây là một trong những enzyme khi thủy phân protein thu dịch đạm vị không đắng so với các loại enzyme thủy phân như Neutrase, Alcalase hay Protamex

Neutrase là endoprotease được chiết từ vi khuẩn được sử dụng để thủy phân protein Enzyme này chỉ cắt protein ở mức độ vừa phải hoặc tạo thành các đoạn peptide Điều kiện hoạt động tốt của Neutrase 0,8L là pH=5,5-7,5 ở nhiệt độ 45-55oC Neutrase có

hoạt tính 0,8 AU/g và bị ức chế khi pH<4 (Kamnerdpetch và cộng sự, 2007)

Bảng 1 5: Tổng hợp một số protease thương mại

Enzyme Nhiệt độ hoạt

động(°C)

Khoảng pH tối

ưu Nguồn Phân loại

1.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân protease

Tốc độ thủy phân bằng enzyme chịu ảnh hưởng của rất nhiều yếu tố (Tu, 1998),

cụ thể là:

Nồng độ enzyme: khi nồng độ enzyme thấp, lượng cơ chất lớn, vận tốc thủy phân

phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ enzyme Khi nồng độ enzyme tăng, tốc độ phản ứng thủy phân tăng đến một giá trị giới hạn v=vmax thì nếu nòng độ enzyme tiếp tục tăng, tốc

độ enzyme phản ứng thủy phân bởi enzyme tăng không đáng kể, thậm chí không tăng

Nồng độ cơ chất: có ảnh hưởng lớn đến tốc độ phản ứng thủy phân, khi càng tăng

nồng độ cơ chất, tốc độ phản ứng thủy phân càng tăng, nhưng khi tốc độ phản ứng đạt tới giới hạn v=vmax nếu tiếp tục tăng nồng độ cơ chất, vận tốc phản thủy phân hầu như không tăng

Chất kìm hãm: chất kìm hãm (hay chất ức chế) là những chất vô cơ hay hữu cơ

mà khi có sự hiện diện của chúng, enzyme có thể bị giảm hoặc mất hoạt tính Với mỗi loại enzyme có các chất kìm hãm khác nhau, vì vậy khi sử dụng enzyme Phải biết rõ các chât kìm hãm của nó để điều chỉnh phản ứng

Các chất hoạt hóa: là những chất khí có mặt trong phản ứng có tác dụng làm tăng

hoạt tính enzyme, các chất này có bản chất hóa học khác nhau, có thể là ion kim loại, anion hoặc các chất hữu cơ Tuy nhiên các chất hoạt hóa chỉ có tác dụng trong giới hạn nồng xác định Khi dùng quá nồng độ cho phép, hoạt độ enzyme sẽ giảm

Nhiệt độ: enzyme là protein có hoạt tính xúc tác nên kém bền với nhiệt, chúng chỉ

có hoạt tính trong khoảng nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ làm chúng biến tính Trong khoảng nhiệt độ đó, khi nhiệt độ tăng tốc độ phản ứng thủy phân tăng Vùng nhiệt độ tạo cho enzyme có nhiệt độ cao nhất gọi là vùng nhiệt độ thích hợp của enzyme, trong đó có một giá trị nhiệt độ mà ở đó, tốc độ enzyme đạt cực đại gọi là nhiệt độ tối thích Với đa

số enzyme, vùng nhiệt độ thích hợp trong khoảng 40-50oC Nhiệt độ làm cho enzyme mất hoàn toàn hoạt tính gọi là nhiệt độ tới hạn, đa số enzyme có nhiệt độ tới hạn khoảng

70oC, với các enzyme bền với nhiệt (bromelin, papin…), nhiệt độ tới hạn có thể cao hơn Nhiệt độ thích với một số enzyme có sự thay dổi khi thay đổi pH, nồng độ cơ chất…

pH có ảnh hưởng mạnh đến hoạt tính của enzyme vì pH ảnh hưởng đến tốc độ ion

hóa cơ chất, ion hóa enzymevaf đến độ bền của protein enzyme Đa số enzyme có khoảng pH thích hợp từ 5-9 Với nhiều protease, pH thích hợp ở vùng trung tính nhưng cũng có một số protease có pH trong vùng axit (pepsin, protease acid của vi sinh vật…)

hoặc nằm trong vùng kiềm (trypssin, subtilin…) Với từng enzyme, giá trị pH thích hợp thay đổi khi nhiệt độ loại cơ chất… thay đổi

Thời gian thủy phân: thời gian thủy phân cần thích hợp để enzyme phân cắt các

liên kết trong cơ chất, tạo thành các sản phẩm cần thiết của quá trình thủy phân nhằm đảm bảo hiệu suất thủy phân cao, chất lượng sản phẩm tốt Thời gian thủy phân dài ngắn khác nhau tùy thuộc vào loại enzyme, nồng độ cơ chất, pH, nhiệt độ, sự có mặt chất hoạt hóa và chất ức chế… Trong thực tế, thời gian thủy phân phải các định bằng thực nghiệm

và kinh nghiệm thực tế cho từng quá trình thủy phân

Lượng nước: nước vừa là môi trường phân tán enzyme và cơ chất lại vừa trực tiếp

tham gia phản ứng nên tỷ lệ nước có ảnh hưởng lớn đến tốc độ và chiều hướng và là một yếu tố điều chỉnh phản ứng thủy phân bởi enzyme

1.3.3 Các sản phẩm của quá trình thủy phân phế liệu thủy sản sử dụng protease

Quá trình thủy phân có thể được thực hiện bằng chính enzyme nội tại hoặc bổ sung enzyme từ ngoài vào Quá trình thủy phân bằng enzyme protease tạo ra nhiều các sản phẩm thủy phân như: dầu cá, dịch đạm thủy phân, bột đạm thủy phân, bột khoáng và

bột protein không tan (Phương, 2013)

Dịch đạm thủy phân: là sản phẩm lỏng của quá trình thủy phân Khi cô đặc thì

chúng sẽ trở thành dịch đạm cô đặc Đối với cá thì dịch có màu vàng nhạt , trong suốt

có mùi thơm đặc trưng, thoảng mùi cá Thành phần chủ yếu của dịch đạm thủy phân là các peptide và acid amin Ngoài ra trong dịch đạm thủy phân còn chứa một lượng nhỏ khoáng và lipid tùy thuộc vào nguồn nguyên liệu sử dụng cho quá trình thủy phân

Bột đạm thủy phân: Dịch đạm thủy phân đem đi cô đặc và sấy khô thì thu được

bột đạm thủy phân (bột đạm hòa tan) Bột đạm thủy phân có hàm lượng protein cao khoảng 70 %, lipid khoảng 0,5 % và tỷ lệ nitơ dễ hấp thụ cao, có giá trị dinh dưỡng cao Bột đạm có thể được sử dụng dưới dạng nguyên chất hoặc phối trộn với các thực phẩm khác Bột đạm thường có màu trắng ngà, vàng nhạt hay vàng nâu tùy thuộc vào nguyên liệu ban đầu, có mùi thơm đặc trưng, khi cho vào nước dễ tan, có khả năng tạo gel, dẻo

và dính

Dầu cá: là lớp trên cùng thu được sau khi ly tâm hỗn hợp sau thủy phân Hàm

lượng dầu thu được phụ thuộc vào nguyên liệu ban đầu Trong dầu cá có chứa hàm lượng DHA, EPA… rất cần thiết cho con người Dầu cá có rất nhiều acid béo quan trọng,

trọng trong việc phát triển mô thần kinh não EPA góp phần làm giảm tỷ lệ cholesterol trong máu và có tác dụng phòng ngừa bệnh tim mạch

Bột khoáng: hỗn hợp sau khi thủy phân được đem đi lọc tách xương và rửa sạch

Sau đó đem đi sấy khô và nghiền Trong bột khoáng có chứa các nguyên tố Ca, Mg, P… một lượng nhỏ protein, lipid chưa thủy phân triệt để

Sản phẩm khác: bột cặn thủy phân (protein không tan) là lớp dưới cùng thu được

sau ly tâm hỗn hợp thủy phân, được đem đi sấy khô và xay nghiền thu được bột cặn thủy phân chứa phần lớn là protein không tan

1.4 Sản xuất sinh khối nấm men

1.4.1 Tổng quan về nấm men Yarrowia lipolytica

1.4.1.1 Y Lipolytica, loài nấm men phi truyền thống

Y lipolytica là một loài nấm túi (Ascomycete) thuộc họ Saccharomycetaceae

Nó thường được tìm thấy trên các cơ chất từ động vật hay thực vật với nguồn carbon chủ yếu có thể là alkane, lipid hoặc protein Nấm men này được phân lập lần đầu tiên

từ bơ thực vật (margarine) Cũng có thể tìm thấy nó trong các sản phẩm giàu protein

và lipid như pho-mát hay xúc xích (Barth và cộng sự, 1997) Nấm men này chiếm ưu thế trong các loại pho-mát camembert hay pho-mát mốc xanh với mật độ lên tới 106-

107 khuẩn lạc/g (Ficker và cộng sự, 2005)

Ban đầu, Yarrowia được phân loại cùng loài với Candida Tuy nhiên, khác với

Candida, Y lipolytica được xếp vào nhóm không gây bệnh và được Cơ quan quản lý

Thực phẩm và Dược phẩm Mỹ (FDA) nhìn nhận nói chung là an toàn (GRAS), do đó

có thể sử dụng trong công nghiệp thực phẩm và dược phẩm

Y lipolytica là loài nấm men hiếu khí hoàn toàn, nhạy cảm với nhiệt độ vượt quá

32-34oC Đây cũng là loài nấm men lưỡng hình với khả năng hình thành các sợi nấm hoặc giả sợi trong những điều kiện nuôi cấy khác nhau như mức độ sục khí, nguồn dinh dưỡng, pH… (Kamnerdpetch và cộng sự, 2007)

Y lipolytica có khả năng chuyển hóa nhiều loại đường ngoại trừ saccharose do

khuyết thiếu enzyme invertase Nhưng mặt khác, nó lại có thể sử dụng nhiều dạng cơ chất kị nước như alkane, axit béo, các triglyceride hay thậm chí là acetate làm nguồn carbon duy nhất (Barth và cộng sự, 1997)

1.4.1.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng của Yarrowia lipolitica

❖ Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng

Nguồn cacbon: Y lipolytica là nấm men hiếu khí bắt buộc có khả năng phân hủy

một cách hiệu quả các chất kị nước như n-ankan, acid béo, chất béo và các loại dầu theo các con đường chuyển hóa đặc biệt (Fickers và cộng sự, 2005) Trình tự bộ gen của các

loài nấm này đã được xác định có mối quan hệ với nấm men truyền thoongd S cerevisiae

Tuy nhiên, cơ chế di truyền thì khác xa đáng kể Đặc biệt bộ gen có sự mở rộng của hệ protein và gen liên quan đến việc sử dụng chất kị nước (Thevenieau và cộng sự, 2008); (Wang và cộng sự, 1999)

Hình 1 4: Hình tll, M.Y lipolytica 0544

- Đường: Y lipolytica có khả năng phân hủy nhiều loại đường hexose như glucose,

fructose và mantose Vận chuyển các monosaccharid, glucose, fructose hay mantose

trong S cerevisiae là quá trình khuếch tán, tuy nhiên có thể khác nhau trong các loại nấm men khác nhau Đối với Y lipolytica hệ thống vận chuyển glucose hoạt động không

phụ thuộc vào nồng độ glucose trong môi trường (Does & Bisson, 1989); (Flores và cộng sự, 2000)

Các hexose nội bào đi vào chu trình đường phân sau giai đoạn photspho hóa Glucose, fructose và mantose được phosphoryl hóa bằng hexokinase Hầu hết các hexokinase bị ức chết bởi threlose-6P, một thành phần quan trọng trong thủy phân

glucose ở S cerevisiae Hexokinase ở Y lipolytica chưa bị ức chế bởi trehalose (Flores

và cộng sự, 2000)

Dạng đơn bào

Dạng sợi giả

Nồng độ glucose cao không ảnh hưởng đến tốc độ hô hấp, hàm lượng và tỷ lệ phân

tử của cytochrome hoặc tính chất của ti lạp thể trong Y lipolytica Tuy nhiên, sản xuất

Y lipolytica IMUFRJ 50682 dưới sự kiềm chế hay không kiềm chế glucose thì không

phụ thuộc vào chất cảm ứng Sucrose khổng thể được sử dụng bởi chủng Y lipolytica

hoang dã bởi vì thiếu enzyme chuyển hóa sucrose (Pereira-Meirelles và cộng sự, 1997)

- Acid hữu cơ

Rodrigues và Pais (Rodrigues, 1997) đã chỉ ra rằng Y lipolytica có khả năng sử

dụng các acid như acetic, lactic, propionic, malic, succinic, citric và acid oleic như nguồn cacbon và năng lượng duy nhất, trong nhiều trường hợp, khả năng này không phụ thuộc vào độ pH của môi trường Khi nấm men phát triển trong môi trường chứa nhiều đường và acid citric hoặc acid lactic thì có sự tăng trưởng diauxic và việc sử dụng hai loại acid này phải chịu sự kìm chế bởi glucose

Hầu hết các chủng Y lipolytica phát triển rất hiệu quả trên acetate như nguồn

cacbon duy nhất Nồng độ natri acetate lên đến 0,4 % được dung nạp tốt, nồng độ cao hơn làm giảm tốc độ tăng trưởng và nồng độ cao hơn 1,0 % thì ức chế sự phát triển của nấm men (Barth, 1979)

- Rượu

Theo Barth và Gaillardin (Barth, 1979), Y lipolytica sử dụng ethanol như nguồn

cacbon ở nồng độ lên đến 3 % Một số dehydrogenas NAD+ và NADP+ đã được nghiên

cứu Y lipolytica Có thể tồn tại hai loại dehydrogenas NAD+ khác nhau về mặt đặc hiệu Tổng hợp của hai enzyme đường như không bị kiềm chế bởi dương hoặc cảm ứng bằng ethanol (Barth & Gaillardin, 1997)

Glycerol cũng có thể được sử dụng làm nguồn cacbon trong điều kiện hiếu khí bởi nhiều loại nấm men (Amaral và cộng sự, 2009), được đồng hóa thông qua con đường glycerol-3-phosphate hoặc dihydroxyacetone Một số nấm men được cho là đồng hóa glycerol qua dihydroxyacetone bởi dihydroxyacetone kinase (Wang và cộng sự, 2001)

Papanikolaou đã sử dụng thành công trong việc sử dụng glycerol thô nuôi Y lipolytica

và sản xuất acid citric Môi trường glycerol ban đầu cao (40 gl-1) với nitơ hạn chế dẫn đến bài tiết acid citric lên đến 35 gl-1 (sản lượng 0,42-0,44 g acig/g glycerol tiêu thụ) Sản xuất lipid cũng được nghiên cứu cùng nguồn cacbon (Papanikolaou, 2002)

- Chất kị nước

Nấm men Y lipolytica thường được phân lập từ môi trường có chứa chất béo,

chẳng hạn như sản phẩm sữa, môi trường ô nhiễm và gia cầm sống và đặc biệt phù hợp với chất kị nước

Aguedo và cộng sự (Aguedo và cộng sự, 2003) đã nghiên cứu các tính chất bề mặt

của Y lipolytica W29 bằng các thử nghiệm MATS và quan sát thấy đặc tính ưa nước

của bề mặt của các tế bào phát triển trong đường hoặc dầu, với tính cho/nhận điện tử

trong sự có mặt của methyl ricinoleate Ngược lại, chủng Y lipolytica IMUFRJ 50682,

được phân lập từ vịnh Guanabara ở Rio de Janeiro, Brazil, cho thấy sự bám dính của tế bào rất cao đối với các dung môi không phân cực, một dấu hiệu tính kị nước cao (Amaral

và cộng sự, 2006), cho thấy sự hiểu biết về cơ chế của chất kị nước thay đổi từ chủng này đến chủng khác

Trong quá trình lên men hydrocacbon, pha dầu được phân tán dưới dạng giọt trong pha nước và sự tương tác bề mặt là xu hướng để tạo thành các giọt dầu Gutierrez và Erickson (Gutierrez, 1977) quan sát thấy sự giảm đường kính trung bình của các giọt dầu đồng thời với sự giảm tương tác bề mặt trong môi trường trong quá trình tăng trưởng

của Y lipolytica trong hexadecan do hiện tượng sản xuất tác nhân hoạt động bề mặt bởi

nấm men Trong thực tế, Cirigliano và Carman (Biryukova và cộng sự, 2006) đã phát hiện và cô lập một số chất nhũ hóa có khả năng ổn định hệ nhũ tương nước/dầu, trong

môi trường phát triển alcan của Y lipolytica Chất nhũ hóa sinh học này được gọi là Liposan bao gồm 83 % carbohydrate và 17 % protein Một chủng Y lipolytica khác cũng

có khả năng sản xuất chất nhũ hóa sinh học, với thành phần tương tự, chỉ có mặt của glucose như nguồn cacbon, cho thấy việc sản xuất các tác nhân hoạt động bề mặt là một đặc tính cấu thành của nấm men này (Amaral và cộng sự, 2000)

Nitơ: Ý nghĩa chủ yếu của nguồn nitơ là cung cấp cho tế bào nguyên liệu để hình

thành các nhóm amin (-NH2) và imin (-NH-) để tổng hợp nên protein và các hợp chất khác của nguyên chất.Nấm men đồng hóa được các hợp chất acid amin và nitơ vô cơ:

dễ đồng hóa hơn cả là ion NH4+ với lượng sử dụng lớn nhất là 20-35 mg nitơ/109 tế bào

Nguồn nitơ được coi là tốt nhất và được đồng hóa hoàn toàn là ure

Nấm men có thể tự tổng hợp các acid amin Tuy nhiên nếu cho các acid amin vào

hóa các acid amin bằng cách amin hóa (tách NH3 ra khỏi các chất), do đó các ngồn nitơ khác nhau sẽ có ảnh hưởng rất lớn tới hàm lượng acid amin trong tế bào nấm men Nguồn N cần thiết cho tổng hợp chính là các hợp chất hữu cơ hoặc vô cơ có sẵn trong môi trường Các hợp chất hữu cơ chứa nitơ của tế bào là các acid amin, các nucleotide purin, protein, pirimidin và một số vitamin Còn đối vơi nguồn nitơ vô cơ là các muối amoni của acid vô cơ cũng như hữu cơ (amoni phosphate, muối acetate, lactate, malate…), cao ngô, cao nấm men hay dịch thủy phân

❖ Ảnh hưởng của điều kiện nuôi

Oxy: Y lipolytica là nấm men hiếu khi bắt buộc Trong quá trình nuôi cấy liên tục

Y lipolytica N1, nhu cầu oxy cho sự tăng trưởng và tổng hợp acid citrid được tìm thấy

phụ thuộc vào nồng độ sát trong môi trường (Kamzolova và cộng sự, 2003) Việc bổ

sung các perfluorocarbons (PFCs) bào môi trường nuôi cấy Y lipolytica đã được báo

cáo như một phương pháp mới để tăng cường sự hấp thu oxy (Amaral và cộng sự, 2006b)

Khi tăng nồng độ PFC và tốc độ lắc thì Y lipolytica có tốc độ tăng trưởng cao hơn

Amaral và cộng sự (Amaral và cộng sự, 2006a) cũng quan sát thấy một phân vùng lạ của tế bào giữa các pha dung dịch và pha PFC hữu cơ, với sự ưa thích bất ngờ của các

tế bào với các dung môi hữu cơ Các phản ứng thích nghi của Y lipolytica với stress oxy

hóa gây ra bởi các chất oxy hóa hydrogen peroxide, menadion, và juglone đã được nghiên cứu bởi Biryukova và cộng sự (Biryukova và cộng sự, 2006) Sự thích ứng của các tế bào nấm men đối với các tác nhân oxy có liên quan đến sự gia tăng hoạt động của enzyme catalase tế bào, superoxide dismutase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, glutathione reductase, các enzyme chính liên quan đến bảo vệ tế bào để chống lại quá trình stress oxy hóa Lopes và cộng sự (Lopes và cộng sự, 2009) sử dụng lò phản ứng

sinh học áp lực để tăng khả năng hòa tan oxy trong môi trường nuối cấy Y lipolytica

Tăng oxy có khả năng gây ra cảm ứng của các enzyme chất chống oxy hóa như superoxide dismutase, liên quan đến các cơ chế phòng thủ của tế bào chống lại sự oxy hóa một cách hiệu quả và các tế bào có thể đối phó với tăng áp suất Khi áp suất dưới 6 bar thì khối lượng sinh khối và tốc độ phát triển tăng tương ứng 3,4 lần

Ảnh hưởng của nhiệt độ: Nhiệt độ có ảnh hưởng sâu sắc không những đối với sự

sinh sản của vi sinh vật mà còn đối với sự trao đổi chất của chúng (ảnh hưởng đến tốc

độ của các phản ứng hóa sinh) Nấm men là những vi sinh vật ưa mát (chúng có nhiệt

độ tối ưu là 25oC, nhưng cũng có thể thích nghi ở 0oC) nhưng có một số nấm men phát

triển được 45oC Nhiệt độ thường gây cho vi sinh vật những chiều hướng sau Đối với

nhiệt độ thất thường không làm chết vi sinh vật ngay mà nó tác động lên khả năng chuyển hóa các hợp chất, làm ức chế hoạt động các hệ enzyme, làm thay đổi khả năng trao đổi chất của chúng, vì thế làm mất khả năng sinh trưởng và sinh sản Nhiều trường hợp vi sinh vật sẽ bị chết Khả năng gây chết của chúng hết sức từ từ chứ không như nhiệt độ cao Nhiệt độ cao thường gây chết vi sinh vật một cách nhanh chống, do gây biến tính protein, làm cho các hệ enzyme không hoạt động được, vi sinh vật dễ dàng bị

tiêu diệt

Ảnh hưởng của pH: Phản ứng pH môi trường tác động trực tiếp lên vi sinh vật

Ion hydro nằm trong thành phần môi trường làm thay đổi trạng thái điện tích của màng

tế bào Mặt khác chúng cũng làm ức chế phần nào các enzyme có mặt trên thành tế bào

Sự phát triển của vi sinh vật có thể rất nghiêm ngặt ở môi trường acid hay môi trường kiềm Đối với các vi khuẩn thuận lợi nhất là chúng phát triển trong môi trường trung tính hoặc kiềm yếu Đối với nấm men và nấm mốc thì phát triển ở môi trường acid Nếu

nồng độ proton trong dung dịch vượt qua mức bình thường thì sinh vật bị ức chế Trong

điều kiện phòng thí nghiệm phần lớn chúng ta sử dụng những môi trường có pH đối với

vi khuẩn 7-7,6; đối với nấm men nấm mốc 3-6

1.4.1.3 Ứng dụng của Y lipolytica trong xử lí phế liệu công nghiệp

Đã có nhiều nghiên cứu sử dụng vi sinh vật nhằm xử lý những khu đất hay nước ô

nhiễm hydrocarbon bằng phương pháp sinh học được tiến hành Một chủng Y lipolytica

ưa lạnh (Y lipolytica RM7/11) phân lập từ đất trên núi Alpes có khả năng sinh trưởng

trong dải nhiệt độ rộng từ 0-30oC và phân hủy tới 68 % lượng dầu diesel chỉ sau 10 ngày (Margesin & Schinner 2001) Điểm đáng quan tâm là nghiên cứu này cho phép tạo ra

cảm biến sinh học (Alkasrawi, 1999) Các nhà nghiên cứu đã sử dụng các tế bào Y

lipolytica dạng cố định để phát hiện các alkane có mạch dài trung bình Hệ cảm biến

sinh học này vận hành tốt ngay cả khi nhiệt độ thấp (5oC) với độ nhạy tối ưu ở 15oC, và đáp ứng với mức nồng độ dodecane lên tới 100 mM Chủng mang ký hiệu NCIM 3589 (Bảng 1.6) cho thấy khả năng phân hủy dầu thô hết sức hiệu quả (đạt 78 % trong vòng

5 ngày) (Bankar và cộng sự, 2009)

Trong công nghiệp chế biến cá, chỉ non nửa lượng nguyên liệu được chế biến thành sản phẩm cho người Phần còn lại sinh ra lượng phế phẩm, phụ phẩm khổng lồ thường

được chế biến thành bột cá (Valdimarsson và cộng sự, 1998) Phế phẩm từ cá thường có hàm lượng lipid cao, điều này làm giảm giá trị thương phẩm của bột cá Trong báo cáo

của mình, Yano và cộng sự (2008) đã chỉ ra khả năng sử dụng Y lipolytica để xử lý hoặc

nâng cao giá trị cho phế phẩm từ cá Tiến hành lên men ở trạng thái rắn cho cá xắt nhỏ

với Y lipolytica giúp giảm bớt hàm lượng chất béo trong phế phẩm từ cá Sau khi ủ 96

giờ kết hợp với đảo trộn gián đoạn, lượng chất béo thô đã giảm tới 46 % trong khi lượng protein hao hụt không đến 1 % Với cùng thời gian lên men như vậy, sử dụng hỗn hợp

vi khuẩn chỉ làm giảm được 28,3 % lượng chất béo thô trong phế phẩm từ cá (Dao & Kim, 2011)

Bảng 1 6: Ví dụ sử dụng Y lipolytica để xử lý hay nâng cao giá trị cho phế phẩm

(theo Bankar và cộng sự, 2009)

Chủng Phế phẩm, phế thải Sản phẩm

ATCC 20255 Nước thải từ nhà máy chế biến oliu Lipase, protein đơn bào W29 Nước thải từ nhà máy chế biến oliu Lipase

ACA-DC 50109 Nước thải từ nhà máy chế biến oliu Axit citric

UCP 0988 Phế phẩm từ nhà máy tinh chế dầu thực vật Chất nhũ hóa

Những ứng dụng khác

Tế bào nấm men Y lipolytica hoặc các enzyme của nó còn được sử dụng trong

công nghiệp dược phẩm, đặc biệt trong các phản ứng nhằm chọn lọc các đồng phân đối quang (thủy phân, phản ứng oxi hóa-khử) hoặc phản ứng tái ester hóa (Guieysse và cộng

sự, 2004; Fickers và cộng sự, 2005) Những phương pháp truyền thống để thu nhận đồng phân đối quang tinh khiết như phương pháp tổng hợp hóa học bất đối xứng, sắc ký chọn lọc đồng phân đối quang, đều rất đắt đỏ, vì vậy khả năng sử dụng enzyme làm chất

xúc tác chọn lọc rất đáng chú ý Lipase ngoại bào (Lip2p) của Y lipolytica tỏ ra có hiệu

quả trong việc phân tách các axit 2-halogeno-carboxylic, chúng là những hợp chất trung

gian quan trọng để tạo ra một số loại thuốc giảm đau, prostaglandin, (Guieysse và

cộng sự, 2004) Enzyme này là chất xúc tác chọn lọc ưa đồng phân (S) trong phản ứng

chuyển vị ester của các ester axit 2-bromo-phenyl và 2-bromo-tolyl acetic ethyl, những tiền chất để tổng hợp ra thuốc giảm đau và thuốc đối kháng thụ thể angiotensin II dạng phi peptide (Guieysse và cộng sự, 2004)

Một enzyme esterase loại B1 thuộc họ enzyme carboxylesterase/lipase lấy từ

chủng Y lipolytica CL 180 phân lập từ biển đã được sử dụng để phân tách hỗn hợp đồng

phân đối quang của ester ofloxacin Sử dụng enzyme này cho phép thu nhận được hỗn

hợp chứa trên 52 % levofloxacin, đồng phân dạng (S) của ofloxacin có phổ kháng sinh với hoạt tính kháng khuẩn mạnh gấp 8-128 lần so với đồng phân dạng (R)

Y lipolytica còn tạo ra nhiều loại chất nhũ hóa khác nhau, những chất này chính là

yếu tố quyết định trong quá trình phân hủy và xử lý sinh học các chất tan trong dầu như hydrocarbon, dầu, dầu thô (Tridade và cộng sự, 2008)

Ngoài ra, loài nấm men này còn có tiềm năng đáng lưu ý với khả năng sản xuất các polyol như erythritol, mannitol và arabitol được sử dụng làm chất tạo ngọt trong công nghiệp thực phẩm (Tomaszewska và cộng sự, 2012)

1.4.2 Quy trình sản xuất sinh khối nấm men

1.4.2.1 Quy trình sản xuất sinh khối

Để góp phần đa dạng hóa các sản phẩm trên thị trường và tận dụng các phế phẩm nhằm bảo vệ môi trường, chúng ta đã tạo ra sản phẩm sinh khối nấm men có giá trị dinh dưỡng cao Quy trình sản xuất sinh khối như sau:

Tùy vào mục đích sản xuất mà lựa chọn chủng nấm men khác nhau Quy trình chung sản xuất sinh khối nấm men:

Quá trình nhân giống: là quá trình tăng thể tích dịch nấm men sau mỗi chu kì

cho tới khi đủ số lượng phục vụ cho sản xuất Có 2 giai đoạn nhân giống, nhân giống trong phòng thí nghiệm và nhân giống trong sản xuất tạo điều kiện cho giống thuần chủng sinh trưởng nhanh, không bị tạp nhiễm với các dụng cụ và thiết bị, phục vụ cho nuôi cấy vô khuẩn

Quá trình lên men: nhằm tăng sinh khối tế bào nấm men đến mức như mong

muốn Sinh khối nấm men có thể được thu nhận bằng nuôi cấy hiếu khí và nuôi cấy hiếu khí Trong điều kiện nuôi cấy hiếu khí sản phẩm chủ yếu là sinh khối, còn CO2 là sản phẩm thứ cấp trong điều kiện nuôi cấy kị khí thu được sinh khối ít hơn (chỉ được ¼ so

Hình 1 5: Quy trình chung sản xuất sinh khối nấm men

với hiếu khí) còn lại CO2 và một số sản phẩm trao đổi chất của tế bào nấm men Vì thế, trong sản xuất sinh khối nấm men, để đạt được hiệu suất thu hồi sinh khối cao cần phải tạo điều kiện hiếu khí để đảm bảo cho nấm men sinh trưởng và tăng sinh khối tốt đồng thời tránh tiêu hao nhiều chất dinh dưỡng cần thiết trong quá trình nuôi

Quá trình thu nhận sinh khối nấm men: thu nhận sinh khối nấm men tại thời

điểm sinh khối cao nhất Sinh khối nấm men sẽ được tách khỏi dịch nuôi cấy bằng phương pháp ly tâm tốc độ cao Làm khô sinh khối dễ dàng bảo quản

1.4.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sản xuất sinh khối nấm men

Nhiệt độ: Có ảnh hưởng lớn đến tốc độ tăng trưởng của nấm men Nhiệt độ thích

hợp nhất để nấm men phát triển tốt là 28-30oC Một số chủng phát triển ở nhiệt độ cao

hơn như S boulardii nhiệt độ tối ưu là 37oC (Chin, 2015) Đối với quá trình lên men S

cerevisiae khoảng nhiệt độ 25-30oC với mật độ tế bào tối đa 108 cfu/ml sau 6 ngày lên men và suy giảm theo thời gian lên men, ở 35oC S cerevisiae phát triển nhanh đạt được

mật độ tế bào tối đa sau 4 ngày lên men và sau đó bắt đầu pha suy vong Còn ở nhiệt độ 15-20oC sự sinh trưởng của S cerevisiae diễn ra chậm đạt được mật độ tế bào tối đa sau

8 đến ngày lên men, tuy nhiên sau đó không thấy có sự suy giảm (Poblet, 2002) Hầu hết trên 43oC hoặc dưới 20oC sự sinh sản của nấm men bị chậm hay dừng lại

Độ pH của môi trường: Độ pH tốt nhất cho sự sinh trưởng của nấm men dao động

từ 3 đến 7 Nấm men S cerevisiae là 4,5-5,5; pH=4 tốc độ tích lũy sinh khối giảm

pH=3,5 hay pH=3 sẽ làm sự sinh sản của nấm men bị ngừng lại Mức độ hấp thụ chất dinh dưỡng vào tế bào, hoạt động của hệ thống enzyme tham gia vào sự tổng hợp của protein, tạo vitamin đều tùy thuộc vào pH, pH ngoài 4,5-5,5, làm chất lượng nấm men

giảm đi Trong sản xuất sinh khối nấm men S boulardii pH môi trường ban đầu được

điều chỉnh 5,5 và không điều chỉnh trong suốt quá trình lên men, sự tăng trưởng tối đa

tế bào S boulardii khoảng 4 gl-1 sau 13 giờ lên men, thấp hơn gần 50% so với sự kiểm soát pH = 5,5 trong suốt quá trình lên men (Chin, 2015) Theo báo cáo của Muller và cộng sự, ông cho rằng pH của môi trường có ảnh hưởng đến khả năng hấp thụ glucose

trong giai đoan pha lag của S boulardii (T Sivakumar và cộng sự, 2014)

Nồng độ cơ chất: Tốc độ tăng trưởng của tế bào nấm men phụ thuộc vào sự hấp

thụ chất dinh dưỡng Môi trường nghèo dinh dưỡng tế bào nấm men phát triển chậm hoặc chết, giảm năng xuất sinh khối Chin và cộng sự của ông đã nghiên cứu sự ảnh

hưởng hưởng nồng độ glucose đến tạo sinh khối S boulardii S boulardii được nuôi cấy

ở các nồng độ glucose từ 0 đến 100 gl-1 Sinh khối cao nhất tại nồng độ glucose là 20 g

-1, khi tiếp tục tăng nồng độ glucose 100 gl-1 sinh khối S boulardii giảm dần

Nguồn nitơ: Nguồn nitơ có ảnh hưởng lớn đến tạo sinh khối nấm men Đã có báo

cáo cho rằng việc bổ sung các nguồn nitơ như amoniac, glutamine và asparagin lượng vừa đủ sẽ sản xuất sinh khối cao hơn so với bổ sung ure và proline (Chin, 2015)

Cường độ khuấy trộn lên tốc tăng trưởng của nấm men: Trong quá trình nuôi

cấy nấm men cần thiết giữ cho dịch men liên tục bão hòa oxy hòa tan Ngừng cung cấp oxy trong 15 phút sẽ gây nên tác dụng “âm” trên hoạt động sống của nấm men Lượng oxy cần cho vi sinh vật này là một thông số quan trọng Trong quá trình nuôi cấy liên

tục Y lipolytica N1, nhu cầu oxy cho sự tăng trưởng và tổng hợp acid citrid được tìm

thấy phụ thuộc vào nồng độ sắt trong môi trường (Kamzolova và cộng sự, 2003) Việc

bổ sung các perfluorocarbons (PFCs) bào môi trường nuôi cấy Y lipolytica đã được báo

cáo như một phương pháp mới để tăng cường sự hấp thu oxy (Amaral và cộng sự, 2006b)

1.4.3.3 Một số nghiên cứu sản xuất sinh khối nấm men từ phế liệu thực phẩm

S Zheng và cộng sự (2005) đã nghiên cứu sản xuất sinh khối men cô lập từ nước thải sản xuất dầu salad thành nguồn protein cho thức ăn chăn nuôi

J Ferrer và cộng sự (1996) đã nghiên cứu sản xuất sinh khối nấm men từ dịch thuỷ phân vỏ tôm Dịch thuỷ phân được triết xuất từ vỏ tôm bằng phương pháp thuỷ phân trong kiềm (pH 12, 2 h, 30oC) với tỷ lệ vỏ tôm/ kiềm 1/20 Dịch thuỷ phân sau đó được

mang nuôi nấm men Saccharomyces cerevisiae K1V-1116 trong điều kiện bình tam giác

(500 ml) hoặc nuôi cấy liện tục Môi trường nuôi được bổ sung thêm glucosamine Năng suất tạo sinh khối tốt nhất đạt 0,447 kg sinh khối khô/ kg glucosamine sử dụng

M.H Choi và cộng sự (1999) đã nghiên cứu khả năng nuôi cấy Pichia

guilliermondii A9 bằng cách sử dụng nước thải từ nhà máy Kimchi làm chất nền để sản

xuất protein đơn bào Kết quả nghiên cứu cho thấy sự tăng trưởng của Pichia

guilliermondii A9 trong nước thải không bị ức chế bởi nồng độ NaCl lên tới 10 % (w/v)

và khoảng 90 % BOD ược loại bỏ khỏi nước thải sau nuôi 24 h Năng suất tế bào tối đa

là 0,69 g tế bào khô trên lít Sinh khối chứa 40 % protein

S Chanda và cộng sự (1996) đã nghiên cứu sản xuất protein đơn bào bằng nấm men từ nước ép của phế liệu củ cải đường, mù tạt và súp lơ…Kết quả cho thấyĐối với

chủng Y lipolytica, sinh khối tạo ra dao động từ 1,5-7,5 g/l tuỳ thuộc vào loại rau sử

dụng và tỷ lệ thuận với hàm lượng lipid có trong dịch thuỷ phân rau Hiệu suất sử dụng

nitơ của Y lipolytica trên dịch thuỷ phân rau sau 96 h nuôi đạt 57-60 % Bên cạnh đó,

nhu cầu oxy hóa học (COD) và giá trị nhu cầu oxy sinh học (BOD) của các mẫu dịch thuỷ phân rau giảm đáng kể theo sự phát triển của nấm men, từ 75-98 %

M.M Rashad và cộng sự (1990) nghiên cứu sử dụng methanol và chất thải thủy

phân từ xoài bằng Pichia pinus Kết quả cho thấy, điều kiện nuôi tối ưu trên cả hai môi

trường là 30°C và pH 4,8-5,0 Năng suất tối đa thu được vào ngày thứ ba tăng trưởng (3,6 g/l trong môi trường methanol, 6,2 g/l trong môi trường chiết xuất vỏ xoài) Vào cuối giai đoạn logarit, các tế bào nấm men methanol chứa 52,2 % protein thô, 36,0 % protein thực và 14,2 % axit nucleic, trong khi các tế bào phát triển trên chiết xuất vỏ xoài chứa 62,0 % protein thô 2,0 %, 39,0 % protein và 12,9% axit nucleic Thành phần axit amin của protein, đặc biệt là các axit thiết yếu, có thể so sánh với các tiêu chuẩn của FAO α-Ketoglutaric và pyruvic acid được tìm thấy trong các tế bào từ nuôi trên cả hai môi trường, tuy nhiê, dihydroxyacetone được tìm thấy với số lượng cao trong môi trường methanol (976,9 μg%) trong khi axít acetoacetic chỉ được tìm thấy trong môi trường vỏ

xoài (244,4 μg%)