Phân lập và khảo sát một số đặc tính của các chủng vi khuẩn nội sinh ở cây hoàn ngọc (pseuderanthemum palatiferum) và cây neem (azadirachta indica)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & MÔI TRƯỜNG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Phân lập và khảo sát một số đặc tính của các chủng vi khuẩn nội sinh ở cây Hoàn Ng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & MÔI TRƯỜNG

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Phân lập và khảo sát một số đặc tính của các chủng vi khuẩn nội

sinh ở cây Hoàn Ngọc (Pseuderanthemum palatiferum) và cây Neem

(Azadirachta indica)

Giảng viên hướng dẫn : ThS Nguyễn Thị Kim Cúc

Sinh viên thực hiện : Lê Thái Thủy Tiên

Khánh Hòa - 2018

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Phân lập và khảo sát một số đặc tính của các chủng vi khuẩn nội

sinh ở cây Hoàn Ngọc (Pseuderanthemum palatiferum) và cây Neem

(Azadirachta indica)

Giảng viên hướng dẫn : ThS Nguyễn Thị Kim Cúc

Sinh viên thực hiện : Lê Thái Thủy Tiên

Khánh Hòa, tháng 7/2018

LỜI CẢM ƠN

Thực tập tốt nghiệp thật sự là cơ hội quan trọng để sinh viên nói chung, sinh viên chuyên ngành Công nghệ Sinh học nói riêng có thể tiếp cận thực tế nghề nghiệp, rèn luyện phương pháp nghiên cứu khoa học và hoàn thiện những kỹ năng thực hành cần thiết trước khi rời khỏi giảng đường đại học Những kiến thức đúc kết được sẽ là bước đệm vững chắc, hỗ trợ cho công việc thực tế sau này

Trong thời gian hoàn thành đồ án tốt nghiệp, ngoài những cố gắng của bản thân, tôi đã nhận được sự giúp đỡ của nhiều cơ quan và cá nhân Với tất cả sự chân thành và lòng biết ơn sâu sắc tôi xin được gửi lời cảm ơn tới:

Thạc sĩ Nguyễn Thị Kim Cúc – giáo viên hướng dẫn, những người đã định hướng và chỉ bảo tận tình trong suốt thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp Cám ơn cô

đã giúp cho em có định hướng tốt về cách tư duy khoa học và học hỏi được nhiều kinh nghiệm nghiên cứu quý giá

Chị Nguyễn Minh Nhật đã tạo mọi điều kiện cho tôi được học hỏi và thực hiện

đề tài tại Trung tâm Thí nghiệm - Thực hành, Trường Đại học Nha Trang Quý thầy cô giáo chuyên ngành Công nghệ Sinh học đã trang bị cho em những kiến thức cần thiết

để làm khóa luận này

Tôi xin được cảm ơn những người bạn thân yêu của lớp 56CNSH Tôi đã học hỏi được nhiều điều từ các bạn trong suốt những năm qua Tình cảm này tôi sẽ mãi luôn trân trọng

Cuối cùng, con xin được gửi lời tri ân sâu sắc nhất đến gia đình Cám ơn cha mẹ

và anh chị đã luôn bên cạnh động viên con lúc khó khăn và giúp con nên người

Tôi xin chân thành cám ơn!

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC BẢNG v

DANH MỤC HÌNH vi

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vii

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Sơ lược về cây Neem 3

1.1.1 Đặc điểm thực vật học 3

1.2.2 Nguồn gốc và phân bố 3

1.2.3 Đặc điểm hình thái 4

1.2.4 Tác dụng của cây Neem 5

1.2 Cây Hoàn Ngọc 7

1.2.1 Đặc điểm thực vật học 7

1.2.2 Nguồn gốc và phân bố 7

1.2.3 Đặc điểm hình thái 7

1.3.4 Tác dụng của cây Hoàn Ngọc 8

1.3 Sơ lược về vi khuẩn nội sinh 10

1.3.1 Nguồn gốc 10

1.3.2 Di chuyển 10

1.3.3 Tiếp cận 11

1.3.4 Xâm nhập 11

1.3.5 Sinh sản 11

1.3.6 Định cư 11

1.4 Vai trò của vi khuẩn nội sinh 12

1.5 Một số nhóm vi khuẩn nội sinh thường gặp 13

1.5.1 Vi khuẩn Bacillus 13

1.5.2 Vi khuẩn Klebsiella 14

1.5.3 Vi khuẩn Pseudomonas 14

1.5.4 Vi khuẩn Azotobacter 15

1.5.5 Vi khuẩn Azospirillum 15

1.6 Một số vi khuẩn gây bệnh thường gặp 15

1.6.1 Vi khuẩn Escherichia coli ATCC 25922 15

1.6.2 Vi khuẩn Staphylococcus aureus ATCC 6538 16

1.6.3 Vi khuẩn Bacillus subtilis 16

1.6.4 Vi khuẩn Vibrio 17

1.6.4.1 Vi khuẩn Vibrio harveyi 17

1.6.4.2 Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus 18

1.6.5 Nấm men Yarrowia lipolytica 19

1.7 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn nội sinh trong và ngoài nước 19

1.7.1 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn nội sinh ngoài nước 19

1.7.2 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn nội sinh trong nước 20

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 22

2.2 Vật liệu nghiên cứu 22

2.2.1 Mẫu vật 22

2.2.2 Chủng vi khuẩn kiểm định 22

2.3 Phương pháp nghiên cứu 23

2.3.1 Phương pháp thu và xử lý mẫu 24

2.3.2 Phương pháp phân lập các chủng vi khuẩn nội sinh 24

2.3.3 Phương pháp bảo quản các chủng vi khuẩn nội sinh 24

2.3.4 uan sát hình thái khuẩn l c 24

2.3.5 Nhuộm Gram 25

2.3.6 Xác định khả năng di động 25

2.3.7 Khảo sát một số đặc tính sinh học của các chủng vi khuẩn nội sinh 26

2.3.7.1 Khảo sát khả năng kháng khuẩn 26

2.3.7.2 Thử nghiệm khả năng sinh enzyme ngo i bào 27

2.3.8 Các thử nghiệm sinh hóa 28

2.3.8.1 Thử nghiệm catalase 28

2.3.8.2 Thử nghiệm oxidase 29

2.3.8.3 Thử ngiệm citrate 29

2.3.8.4 Khả năng làm dịch hóa Gelatin 29

2.3.8.5 Các thử nghiệm lên men đường 30

2.3.8.6 Thử nghiệm khả năng oxi hóa – lên men 30

2.3.8.7 Khả năng phát triển ở 10% NaCl 31

2.3.8.8 Thử nghiệm CAMP 31

2.3.8.9 Khả năng sinh bào tử 32

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33

3.1 Phân lập vi khuẩn nội sinh từ cây Neem và cây Hoàn Ngọc 33

3.1.1 Đặc điểm khuẩn l c của các chủng vi khuẩn nội sinh 34

3.1.2 Đặc điểm tế bào của các chủng vi khuẩn nội sinh 37

3.2 Một số đặc điểm sinh hóa của các chủng vi khuẩn nội sinh 39

3.3 Khả năng kháng khuẩn, kháng nấm của vi khuẩn nội sinh 42

3.3.1 Khả năng kháng khuẩn và kháng nấm của các chủng vi khuẩn nội sinh từ cây Neem 42

3.3.2 Khả năng kháng khuẩn và kháng nấm của các chủng vi khuẩn nội sinh phân lập từ cây Hoàn Ngọc 46

3.4 Khả năng sinh enzyme ngoại bào của vi khuẩn nội sinh 47

4.1 Kết luận 49

4.2 Kiến nghị 49

TÀI LIỆU THAM KHẢO 50

PHỤ LỤC 57

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Một số công dụng dược liệu trong bộ phận của cây Neem 5

Bảng 2.1 Bảng đánh giá mức độ của đường kính vòng kháng khuẩn 27

Bảng 3.1 Phân lập vi khuẩn nội sinh từ cây Neem và cây Hoàn Ngọc 34

Bảng 3.2 Các đặc điểm khuẩn lạc của các vi khuẩn nội sinh 35

Bảng 3.3 Đặc điểm tế bào và tính di động của các chủng vi khuẩn nội sinh 37

Bảng 3.4 Các đặc điểm sinh hóa của các chủng vi khuẩn nội sinh 40

Bảng 3.5 Đặc điểm khuẩn lạc trên môi trường thạch máu 41

Bảng 3.6 Khả năng kháng khuẩn và kháng nấm của vi khuẩn nội sinh từ cây Neem 45

Bảng 3.7 Khả năng kháng khuẩn và kháng nấm của các chủng vi khuẩn nội sinh phân lập từ cây Hoàn Ngọc 46

Bảng 3.8 Khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng vi khuẩn nội sinh 47

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cây Neem (cây sầu đâu) 4

Hình 1.2 Lá cây Hoàn Ngọc (a), rễ cây Hoàn Ngọc (b) 8

Hình 1.3 Vai trò của vi sinh vật nội sinh đối với cây chủ 12

Hình 2.1 Sơ đồ tổng quát phương pháp nghiên cứu 23

Hình 2.2 Sơ đồ khảo sát khả năng kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn 26

Hình 2.3 Vùng kháng khuẩn của các vi khuẩn nội sinh phân lập được trên đĩa peptri 27

Hình 2.4 Sơ đồ thử nghiệm hoạt tính sinh enzyme ngoại bào 27

Hình 2.5 Vùng phân giải cơ chất của các chủng vi khuẩn nội sinh phân lập được 28

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

CFU Colony Forming Unit

OD Optical Density

TSA Tryptic Soya Agar

TSB Tryptic Soya broth

ĐẶT VẤN ĐỀ

Các cây dược liệu mọc tự nhiên hiện nay đã được người dân ta sử dụng từ lâu đời

từ thời chưa có sự xuất hiện của kháng sinh nhưng nó đã đem lại hiệu quả rất tốt trong chữa trị các bệnh về cảm cúm, sốt, cầm máu, Với điều kiện thiên nhiên nhiều ưu đãi, Việt Nam có một hệ sinh thái phong phú và đa dạng, có nhiều tiềm năng để phát triển nguồn dược liệu Trong đó, có nhiều cây dược liệu có tính kháng khuẩn đã được y học dân tộc dùng làm thuốc Hiện nay cùng với sự phát triển của y học, các bài thuốc từ thực vật được sử dụng để chữa bệnh ngày càng nhiều Các loài thực vật này có trong

tự nhiên, dễ kiếm, lại ít có những tác dụng phụ cho con người, do đó đã thu hút sự quan tâm của các nhà nghiên cứu hóa sinh và y dược học trong nước cũng như trên thế giới (Võ Thị Mai Hương, 2009)

Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) có khoảng 80% dân số thế giới

từ các nước phát triển dựa chủ yếu vào các loại thuốc truyền thống (chủ yếu có nguồn gốc từ thực vật) để chăm sóc sức khỏe Trong 119 loại hợp chất hóa học, ít nhất 90 loại có nguồn gốc từ thực vật, đây là các loại thuốc đang được sử dụng ngày càng nhiều ở nhiều quốc gia Hiện nay có rất nhiều chất chiết xuất từ cây có tác dụng chữa bệnh, vấn đề đặt ra là các chất có hoạt tính sinh học trong cây là do các chất kháng sinh tự nhiên trong cây sinh ra hay là kết quả của mối liên hệ tương sinh với các vi sinh vật nội sinh có ích trong mô thực vật

Vi sinh vật nội sinh trong mô thực vật là những vi sinh vật liên kết và sống trong các mô sống của thực vật mà không gây hại cho cây chủ (Hallmann, 1997) Một số nghiên cứu đã chứng minh vi khuẩn nội sinh có khả năng kiểm soát sinh học với các loại nấm, vi khuẩn và tuyến trùng trên cây Do đó khi vi sinh vật nội sinh sống trong cây đem lại cho cây trồng nhiều điều kiện thuận lợi giúp cây trồng phát triển tốt Từ những lợi ích và tiềm năng to lớn của vi sinh vật nội sinh, việc tìm kiếm và đánh giá đặc điểm của vi sinh vật nội sinh trong cây dược liệu là một hướng đi đúng đắn trong công cuộc tìm ra các chủng có khả năng chống lại các vi khuẩn gây bệnh Cây Neem

và cây Hoàn Ngọc là 2 cây dược liệu quý có chứa nhiều hợp chất sinh học có tiềm năng, được sử dụng phổ biến trong ngành công nghiệp dược, công nghiệp thực phẩm

và mỹ phẩm Hai loại cây này mọc hoang dại không cần sử dụng phân bón hay thuốc trừ sâu sinh học nên vi khuẩn nội sinh rất đa dạng, phong phú

Do đó, được sự cho phép của Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, trường Đại học Nha Trang, dưới sự định hướng của ThS Nguyễn Thị Kim Cúc, tôi đã thực

hiện đề tài tốt nghiệp với tiêu đề “Phân lập và khảo sát một số đặc tính của các

chủng vi khuẩn nội sinh ở cây Hoàn Ngọc (Pseuderanthemum palatiferum) và cây Neem (Azadirachta indica)”

Nội dung đề tài:

1 Phân lập, làm thuần và giữ các chủng vi khuẩn nội sinh từ cây Hoàn Ngọc và cây Neem

2 Xác định một số đặc điểm sinh học của các chủng phân lập

3 Khảo sát một số đặc tính của các chủng phân lập

Ý nghĩa của đề tài:

Ý nghĩa khoa học: Kết quả của đề tài là cơ sở khoa học cho các nghiên cứu

tiếp theo về phân lập vi khuẩn nội sinh từ các cây dược liệu dân gian có khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh trên người, trên động vật nuôi, trên động vật thủy sản

Ý nghĩa thực tiễn: Các chủng vi khuẩn nội sinh có khả năng kháng khuẩn tốt và

khả năng sinh enzyme ngoại bào cao thu được trong đề tài này là tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo để đánh giá khả năng ứng dụng của các chủng vi khuẩn này trong nuôi trồng thuỷ sản

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Sơ lược về cây Neem

1.1.1 Đặc điểm thực vật học

Cây Neem có tên khoa học là Azadirachta indica A Juss, thuộc họ xoan

(Meliaceae) Tên khác: xoan Ấn Độ, xoan chịu hạn, sầu đâu, cây nim, xoan ăn gỏi, xoan trắng Tên nước ngoài: Neem tree, margosa, Indian lilac (Anh); nimb (Hindi); niembau (Đức); kohumba, nimba (Singapore) Năm 1830, cây Neem được nhà khoa

học Andriew Henri Laurent de Jussieu mô tả và định danh là Azadirachta indica,

thuộc hệ thống phân loại như sau:

Có ba cây tương tự với cây Azadirachta indica A Juss đó là: Melia azadirachta L., Melia indica và Antelaca azadirachta Người ta thường hay lẫn lộn giữa cây Neem

và cây Melia azadirachta L nhiều nhất bởi hình dáng bên ngoài hơi giống nhau Nhưng thực ra chúng dễ phân biệt dựa vào đặc điểm của lá: Azadirachta indica A Juss

có lá kép lông chim một lần, trong khi đó Melia azadirachta L có lá kép lông chim hai lần (Biswas và cs, 2002)

1.2.2 Nguồn gốc và phân bố

Neem là loại cây đặc trưng tại vùng biển lục địa Indo – Pakistan Ngày nay nó được tìm thấy ở Nam Á như Ấn Độ, Bangladesh, thượng Burma và tại các vùng hoang mạc ở Sri Lanka, Thái Lan, Nam Malaysia Ngoài ra nó còn được tìm thấy ở Phillipines, đảo Fiji, đảo Mauritius và trải rộng tới các đảo khác ở nam Thái Bình Dương Ở Trung Đông nó được tìm thấy ở YeMen và Saudi Arabia Tại Châu Phi cây Neem tồn tại ở Ghana, Nigieria, Sudan và các nước Đông Phi Ở Châu Mỹ nó được tìm thấy ở các đảo vùng Caribe và vùng Trung Mỹ (Schmutterer, 1990)

Cây Neem được di thực vào Việt Nam năm 1981 do giáo sư Lâm Công Định, nhà lâm học Việt Nam, nhân dịp tham dự hội thảo lâm nghiệp quốc tế về “Vai trò của rừng trong sự phát triển cộng đồng nông thôn” tại Senegal Châu Phi Ông đã đem hạt giống cây Neem về trồng tại Phan Thiết, sau đó trồng rộng ra ở Ninh Thuận, Bình Thuận Ông là người đặt tên cho loài cây này là xoan chịu hạn để phân biệt với xoan

địa phương (Melia azadirachta) được trồng phổ biến tại Việt Nam (Lâm Công Định,

1991)

Cây Neem thích hợp ở những vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Đặc biệt cây sinh trưởng tốt ở những vùng đất xấu, khô nóng, độ cao khoảng 1000 m, tính từ mực nước biển Rễ cái mọc sâu, có thể dài gấp hai lần chiều cao của cây (Lâm Công Định, 1991)

1.2.3 Đặc điểm hình thái

Neem là cây thân gỗ xanh quanh năm, cao trung bình từ 13 đến 20 m, ở điều kiện thích hợp có thể cao tới 40 m, chịu hạn tốt Lá 1 lần kép, hình lông chim, bìa lá có răng cưa, dài khoảng 20 – 40 cm, cuống lá ngắn Hoa lưỡng tính, màu trắng, dài khoảng 5 –

6 mm, rộng khoảng 8 – 11 mm, đài có lông, có mùi thơm Trái hình bầu dục, màu oliu,

vỏ mỏng, thịt đắng màu vàng nhạt, dày khoảng 0,3 – 0,5 cm, dài khoảng 2 cm (Hình 1.1) Rễ gồm rễ cọc ngắn, nhiều rễ bên mọc khá dài Cây bắt đầu ra hoa, quả sau 3 – 5

năm trồng Tuổi thọ trung bình của cây Neem khoảng 200 năm (Hashmat và cs, 2012)

Hình 1.1 Cây Neem (cây sầu đâu) (Nguồn: http://agarwood.org.vn )

1.2.4 Tác dụng của cây Neem

Hơn 5000 năm trước, người Ấn Độ đã biết sử dụng Neem để chữa những căn bệnh thông thường như mụn nhọt, vết thương, viêm da, dạ dày Tất cả các phần của cây đều được sử dụng từ lá, vỏ, thân, trái, dịch chiết, dầu cho đến rễ

Neem được người Ấn Độ sử dụng đầu tiên để hỗ trợ sức khỏe từ 4500 năm trước đây Neem là một thảo dược có thể giúp tăng cường sức khỏe một cách tổng thể, sử dụng Neem không có bất cứ tác dụng phụ nào (Conrick, 2001) Các bộ phận trên cây Neem đều có công dụng dược liệu đối với sức khỏe của con người thể hiện ở bảng 1.1

Bảng 1.1 Một số công dụng dược liệu trong bộ phận của cây Neem (Biwas và cs, 2002)

Bộ phận

cây Neem Công dụng

Lá Trị phong, vấn đề về mắt, chảy máu cam, diệt sâu bọ, chán ăn, loét da

Vỏ cây Giảm đau, chữa sốt

Hoa Ức chế sự tiết mật, loại bỏ đờm, diệt sâu bọ

Quả Chữa bệnh trĩ, giun trong ruột, rối loạn đường tiết niệu, chảy máu cam, tiêu đàm, bệnh tiểu đường, vết thương và bệnh phong Cành cây Làm giảm ho, hen suyễn, bệnh trĩ, khối u, giun trong ruột, tiểu đường Chất keo Chữa hiệu quả bệnh ngoài da như vảy nến, các vết thương và vết loét Bột hạt Neem Chữa phong và giun trong ruột

Tinh dầu Chữa phong và giun trong ruột

Hỗn hợp rễ,

vỏ, lá, hoa, trái Bệnh về máu, rối loạn mật, ngứa, loét da, bỏng và bệnh phong

Những nghiên cứu về thành phần hóa học trên các sản phẩm từ cây Neem được

tiến hành rộng rãi ở giữa thế kỷ XX Kể từ báo cáo của Siddiqui và cs vào năm 1992

về sự phân lập nimbin, hợp chất đắng đầu tiên được tách ra từ dầu Neem, hơn 135 hợp chất có hoạt tính sinh học đã được phân lập từ các bộ phận khác nhau của cây Neem Các hợp chất đã được chia thành hai loại chính: isoprenoid, nonisoprenoids và các hợp chất khác Các isoprenoid bao gồm diterpenoid và triterpenoids chứa protomeliacin, limonoid, azadirone và các dẫn xuất của nó, gedunin và dẫn xuất, các hợp chất loại

vilasinin và csecomeliacin như nimbin, salanin và azadirachtin Các nonisoprenoids bao gồm protein (amino acid), carbonhydrate (polysaccharides) và các hợp chất chứa lưu huỳnh, polyphenolic như flavonoid (rutin, quercetin, kaempferol, quercitrin, myricetin, ), glycosides, dihydrochalcone, coumarin và tanin, hợp chất béo, Các chất hóa học được tìm thấy nhiều trong cây Neem và được công nhận tác dụng dược lý khác nhau được liệt kê trong bảng 1.2

Bảng 1.2 Một số hợp chất có trong cây Neem và tác dụng của chúng (Biswas và cs, 2002)

Nimbidin

Tinh dầu hạt, vỏ, lá cây

Chống viêm, trị viêm khớp, giảm sốt, hạ đường huyết, chống loét dạ dày, kháng nấm, kháng khuẩn và thuốc lợi tiểu Sodium nimbidate Chống viêm

Quercetin Kháng động vật đơn bào, chống oxy hóa Salanin Giảm sưng tấy và diệt côn trùng

Nimbin Tinh dầu hạt Diệt tinh trùng

Nimbolide Tinh dầu hạt Kháng khuẩn và trị sốt rét

Gedunin Tinh dầu hạt Kháng nấm, giãn mạch máu, trị sốt rét Azadirachtin Hạt Trị sốt rét

Mahmoodin Tinh dầu hạt Kháng khuẩn

Gallic acid,

epicatechin,catechin Vỏ cây Chống viêm và điều hòa miễn dịch Margolone, Margolonone và

isomargolonone Vỏ cây Kháng khuẩn

Cyclic trisulphide và cyclic

tetrasulphide Lá cây Kháng nấm

Polysaccharides

Polysaccharides Gia, Gib

Polysaccharides GIIa, GIIIa

Vỏ cây Chống viêm, kháng khối u, chống ung thư

NB-II peptidoglycan Vỏ cây Điều hòa miễn dịch

1.2 Cây Hoàn Ngọc

1.2.1 Đặc điểm thực vật học

Tên khoa học: Pseuderanthemum palatiferum, thuộc họ ô rô Tên thông thường:

xuân hoa, hoàn ngọc, tú linh, nhật nguyệt, thần tượng linh, lan điền, cây con khỉ… Cây Hoàn Ngọc được nhà khoa học Radlk và Lindau (1883) mô tả và định danh là

Pseuderanthemum palatiferum, thuộc hệ thống phân loại như sau:

1.2.3 Đặc điểm hình thái

Cây bụi nhỏ, cao đến 1 m hoặc hơn, sống nhiều năm Thân và cành mảnh, nhẵn, đường kính phần gốc thân khoảng 7 - 10 mm đường kính cành khoảng 2 - 4 mm, thân non hơi vuông, có màu đỏ tía, đốt dài 6 – 8 cm, các mấu hơi phình to Lá nguyên nhẵn,

mọc đối, mặt trên lá màu lục thẫm, mặt dưới màu xanh nhạt, phiến lá hình thoi hẹp,

dài 7 – 12 cm, rộng 1,5 - 2,5 cm, có 5 - 6 đôi gân bên nổi rõ ở mặt dưới, mép lá không

có răng Cuống lá dài khoảng 2 – 3 cm Các lá non ở ngọn có màu tía Cụm hoa dạng bông dài 2 – 3 cm, ở đầu cành (hình 1.2)

Hình 1.2 Lá cây Hoàn Ngọc (a), Rễ cây Hoàn Ngọc (b) (Nguồn: http://ydvn.net )

1.2.4 Tác dụng của cây Hoàn Ngọc

Cây Hoàn Ngọc được lưu truyền trong dân gian Nó có tác dụng tốt đối với sức khỏe của con người Đối với con người nó giúp trị các bệnh về đường tiêu hóa, lá Hoàn Ngọc có thể dùng cầm máu, trị cảm cúm và nó còn giúp phát hiện sớm về bệnh ung thư thời kỳ mới phát Đối với động vật nó có tác dụng chữa bệnh tiêu chảy trên heo, lá dùng để chữa bệnh động kinh, giúp kích thích tiêu hóa và làm tăng trưởng Trong khi đó cây Hoàn Ngọc còn có các hợp chất có tác dụng dược lý

Bằng các phản ứng định tính hoá học, đã sơ bộ xác định trong lá cây Hoàn Ngọc

có chứa: acid hữu cơ, carotenoid, coumarin, đường tự do, phytosterol, flavonoid, saponin Ngoài ra lá Hoàn Ngọc còn chứa đầy đủ các amino acid thiết yếu với hàm lượng tổng số khá cao (751 – 1365 mg%) Đặc biệt hàm lượng isoleucin và leucin rất cao (25 – 150 mg% và 46 – 85 mg%) Đó là các amino acid giữ vai trò quan trọng trong sinh tổng hợp protein cơ bắp và chống mỏi mệt cơ thể, thiếu chúng cơ thể sụt cân nhanh Lá Hoàn Ngọc còn giàu valin (29 – 1001 mg%), thiếu amino acid này, sự phối hợp các chuyển động của bắp thịt bị rối loạn và yếu đi Valin còn ảnh hưởng đến hoạt động của tuyến tụy, một tuyến tiêu hóa quan trọng Bên cạnh đó cây Hoàn Ngọc còn có các thành phần hóa học: stigmasterol, lupeol, lupenone, betulin, acid pomolic (PA)

Stigmasterol: là sterol thực vật, phân lập từ nhiều loài thực vật

Chất Lupeol: Chất lupeol được đánh giá là tác nhân có tiềm năng để điều trị căn bệnh ung thư tuyến tụy Các nhà khoa học thuộc khoa y Đại học Hồng Kông dùng lupeol trong thử nghiệm trên chuột đã nhận được những kết quả hết sức bất ngờ:

b) a)

Lupeol làm giảm số lượng tế bào ung thư cổ và đầu của chuột thí nghiệm, ngoài ra nó còn phong tỏa quá trình trao đổi chất xung quanh khối u, hầu như không gây những phản ứng phụ tối thiểu đối với các tổ chức tế bào lành ở xung quanh nội tạng, trong đó

có gan và thận

Lupenone: Lupenone có khả năng kháng rất cao đối với loại HSV- 1 và HSV – 2, một loại virus đơn type – 1 gây những mụn nước mỏng có khuynh hướng tái phát ở cùng một vùng trên da hoặc lợi, miệng, hàm hay kết mạc Loại virus này cũng có thể khiến trẻ sơ sinh bị nhiễm bệnh viêm màng não hay nhiễm khuẩn nội tạng

Betulin - một chất triterpene tự nhiên: Khoa học hiện đại đã đánh giá vai trò vô cùng to lớn của betulin trong vai trò của dược chất chống bệnh sốt rét, chống viêm nhiễm và hơn nữa là nguồn nguyên liệu quý để tạo ra biệt dược chống bệnh HIV Các nhà khoa học của Mỹ ở đại học Minnesota và Nga ở đại học Irkutsk đã phát hiện ra cơ chế ức chế sự họat động của HIV và độc tính của nó đối với nhiều dòng tế bào ung thư

khác nhau Theo đó, betulin có khả năng ức chế HIV thâm nhập vào tế bào T bằng

cách phong tỏa gp41 - một protein tối thiểu cần thiết của HIV giúp cho virus truyền bệnh vào tế bào lành Ngoài ra, độc tố cao của betulin có khả năng giết chết nhiều loại

tế bào ung thư do kích thích cơ chế phá hủy tế bào bệnh Betulin được chuyển hóa thành acid betulinic là một hợp chất quý hiếm có khả năng ức chế khối u và ức chế HIV rất hiệu quả so với một số thuốc khác hiện đang được dùng để điều trị các bệnh trên Trong điều trị bệnh gan, betulinic được sử dụng như một loại thuốc cần có nhằm bảo vệ tế bào gan bình thường khỏi bị tổn thương bởi các tác nhân khác nhau Cũng như vậy, các bệnh nhân được chỉ định áp dụng liệu pháp hóa hay phóng xạ trị liệu được khuyến khích dùng thuốc chứa betuline Các sản phẩm thức ăn chức năng chứa betuline có khả năng tăng cường hệ miễn dịch cho cư dân sống trong môi trường ô nhiễm và kéo dài tuổi thọ trong môi trường bình thường

Trong các nghiên cứu cơ bản các nhà khoa học phát hiện ra acid pomolic (PA) có thể giải được MDR (khối u kháng các loại thuốc điều trị khác nhau) thông qua cơ chế

áp đảo các protein Bcl - 2 hoặc Bcl - xl có chức năng kháng cơ chế phá hủy tế bào bị bệnh trong phương pháp điều trị một số bệnh ung thư (Phạm Xuân Sinh, 2007)

1.3 Sơ lược về vi khuẩn nội sinh

Vi khuẩn nội sinh là vi khuẩn sống toàn bộ hay một phần thời gian chu kì sống của chúng trong mô thực vật, không làm tổn thương mô mà những loại vi khuẩn này

có lợi ích đối với cây (Kobayashi và cs, 2000; Bandara và cs, 2006)

Vi khuẩn nội sinh có mặt trong nhiều loại cây trồng và thực vật hoang dại, chúng xâm nhập vào mô thực vật xuyên qua vùng rễ theo nhiều cách Có thể chúng bám ở bề mặt rễ và tìm cách chui vào rễ chính hay rễ bên, thông qua lông hút, giữa các tế bào

nhu mô rễ hay biểu bì rễ để sống như: Azotobacter, Bacillus, Gluconacetobacter, Pseudomonas, Azoarcus, Burkholderia, Campylobacter, Derxia, Paenibacillus

(Elmerich, 2007) Tuy nhiên nó cũng có thể xâm nhập vào các mô xuyên qua khí khổng hay các vị trí tổn thương của lá Sau khi xâm nhập vào cây chủ, các vi khuẩn nội sinh có thể tập trung tại vị trí xâm nhập hay phát tán khắp nơi trong cây đến các tế

bào bên trong, đi vào các khoảng trống gian bào hay vào trong hệ mạch (Zinniel và cs,

2002)

Mật độ của quần thể vi khuẩn nội sinh rất biến thiên, phụ thuộc chủ yếu vào loài

vi khuẩn và kiểu di truyền của cây chủ, nhưng cũng phụ thuộc vào giai đoạn phát triển

của cây chủ và các điều kiện môi trường (Pillay và cs, 1997; Tan và cs, 2003)

1.3.1 Nguồn gốc

Qua những kết quả thu được từ thân, lá, hạt, rễ cho rằng nguồn của vi khuẩn nội

sinh là đất vùng rễ (Mano và cs, 2008) Kết hợp nhiều kết quả phân lập vi khuẩn nội

sinh từ rễ cây lúa mì, bông vải, bắp ngọt, bắp đá và cải canola đều kết luận vi khuẩn nội sinh xuất phát từ đất Vai trò của hạt như là một nguồn của vi khuẩn nội sinh vẫn là

một điều còn tranh luận (Hallmann và cs, 1997)

1.3.2 Di chuyển

Theo Hallmann (2001), thường vi khuẩn nội sinh được thu hút hay di chuyển từ môi trường bên ngoài đến cây chủ bằng cơ chế hóa hướng động hay ngẫu nhiên hoặc cả hai cơ chế Rễ cây tiết ra bên ngoài một số hợp chất như là dưỡng chất để vi khuẩn nội sinh

tìm đến và quần tụ trên bề mặt rễ, ví dụ vi khuẩn có ích Pseudomonas fluorescens và Azospirillum brasilense hướng đến rễ lúa mì do rễ tổng hợp và phóng thích dưỡng chất

(Bashan, 1986)

1.3.3 Tiếp cận

Một hợp chất trung gian để gắn chặt vi khuẩn nội sinh vào bề mặt rễ là lectin Đây là hợp chất rất đặc biệt thường gặp trong các trường hợp vi khuẩn cộng sinh và giả thiết này cũng được các nhà khoa học đề cập đến vi khuẩn nội sinh Duiff (1997)

chứng minh Pseudomonas fluorescens hiện diện trên bề mặt rễ do hợp chất

lipopolysaccharides

1.3.4 Xâm nhập

Theo Hallmann (2001), có nhiều con đường để vi khuẩn nội sinh xâm nhập vào bên trong mô thực vật như: Các lỗ tự nhiên như thủy khổng (hydathodes), lỗ khí khổng (stomata), lỗ rễ (bì khổng = lenticels), lỗ từ sự ma sát với đất hay vết bệnh, vị trí hình thành rễ ngang (lateral roots), vi lỗ (micropores), vết thương do tác động vật lý (wounds)

Tuy nhiên con đường quan trọng và có khả năng nhất là vi khuẩn nội sinh xâm nhập vào bên trong mô thực vật theo vết thương và vi lỗ hiện diện khi bắt đầu sự hình thành lông hút, đây là lớp tế bào non rất dễ xâm nhập Vết bệnh cũng có thể là vị trí cho vi khuẩn xâm nhập vào bên trong, ví dụ như trường hợp vết bệnh từ tuyến trùng

(Hallmann và cs, 1997)

Ngoài ra vi khuẩn có thể tiết ra enzyme cellulase để phá hủy lớp tế bào biểu bì

của rễ non để xâm nhập vào bên trong như vi khuẩn Gluconacetobacter diazotrophicus

1.3.5 Sinh sản

Vi khuẩn nội sinh tập trung hay tiếp cận các vị trí mà chúng có khả năng xâm nhập vào bên trong mô thực vật nhưng mật độ tương đối thấp chỉ từ 1.000 đến 1.000.000 tế bào/g mô thực vật (Hallmann, 2001) và chúng bắt buộc phải sinh sản một

số lượng tương đối lớn trước khi xâm nhập vào bên trong mô thực vật Hurek (1994)

cho rằng sự phân cắt hay sinh sản Azoarcus sp được tìm thấy bên ngoài và cả bên

trong nhu mô rễ lúa và cỏ Kallar

1.3.6 Định cư

Sau khi xâm nhập vào trong nhu mô thực vật, vi khuẩn nội sinh di chuyển đến các bó mạch gỗ để theo nước từ rễ lên các phần khác trên thân của cây Vi khuẩn nội

sinh cũng có thể tập trung sinh sống và phát triển trong các tế bào nhu mô lá, tế bào diệp lục Ở đây chúng có thể phát triển lâu dài hay có thể tiếp tục sinh sản và di

chuyển đến các bộ phận khác của cây (Nguyễn Hữu Hiệp và cs, 2014)

1.4 Vai trò của vi khuẩn nội sinh

Vi khuẩn nội sinh sống trong cây và đem lại lợi ích cho cây, giúp cho cây sinh

trưởng phát triển tốt chống lại dịch bệnh Khả năng kiểm soát bệnh dịch của VSV nội

sinh dựa trên một số cơ chế đối kháng như sinh các chất kháng khuẩn (Kumar và cs, 2011) và các enzyme phân hủy thành tế bào của nấm bệnh (Shimizu và cs, 2011); cạnh

tranh về dinh dưỡng và nơi cư trú; kích thích tính chống chịu hệ thống của cây chủ

(Malfanova và cs, 2013)

Sự khu trú của VSV nội sinh trong cây chủ có thể gây ra một số biến đổi của thành tế bào như tích tụ callose, pectin, cellulose và các hợp chất có phenol, dẫn tới hình thành một hàng rào cấu trúc tại vị trí bị tác nhân gây bệnh tấn công (hình 1.3) Ngoài ra, cây có vi khuẩn nội sinh khi bị tác nhân gây bệnh tấn công thường có phản ứng tăng cường sinh tổng hợp các protein phòng vệ như peroxidase, chitinase và β-1,3-glucanase, có tác dụng ngăn chặn sự lan truyền của mầm bệnh Hơn nữa, nhiều loài vi khuẩn nội sinh thường thể hiện sự kết hợp nhiều cơ chế kháng bệnh, vì một số hợp chất kháng tác nhân gây bệnh cũng đồng thời kích thích đáp ứng miễn dịch, thậm

chí kích hoạt hệ thống miễn dịch của cây chủ (Mini và cs, 2012; Ongena và cs, 2011; Shimizu và cs, 2011)

Hình 1.3 Vai trò của vi sinh vật nội sinh đối với cây chủ (Phan Thị Hồng Thảo, 2017)

Một số vi khuẩn nội sinh có khả năng kiểm soát sinh học, vì chúng tạo ra các hợp chất kháng VSV giúp cho cây trồng hạn chế dịch bệnh Các chất kháng sinh là các sản phẩm tự nhiên được xác định, như phân tử hữu cơ có trọng lượng phân tử thấp, với nồng độ thấp có khả năng chống lại VSV (Demain, 1981) Thường vi khuẩn nội sinh

là nguồn cung cấp các chất kháng sinh này Các sản phẩm tự nhiên của vi khuẩn nội sinh có khả năng tiêu diệt các yếu tố gây bệnh như vi khuẩn và nấm Trong nghiên cứu

của tác giả cho biết ecomycin là sản phẩm được tạo ra từ Pseudomonas viridiflava Vi

khuẩn được phân lập từ lá của các loài cỏ Ecomycin có chứa nhóm lipopeptid mới, ngoài ra còn có các amino acid phổ biến như alanine, serine, threonine và glycine và

các amino acid đặc biệt Ecomycin hoạt động chống lại nấm gây bệnh Cryptococcus neoformans (Miller cs., 1998)

Vi khuẩn Bacillus licheniformis và Bacillus pumilus nội sinh trong rễ cây hoa chuông (Platycodin grandiflorum) có khả năng kháng nấm rất mạnh chống lại nấm Phytophthora capsici và Pythium ultimum (Asraful và cs, 2010)

Vi khuẩn nội sinh còn có khả năng sinh ra các enzyme ngoại bào quan trọng như cellulase, protease, xylanase để phân giải các hợp chất khó phân giải bên ngoài môi trường đang được ứng dụng để sản xuất các loại enzyme thương mại Bên cạnh đó vi khuẩn nội sinh còn tham gia vào các quá trình cố định đạm, cố định nitơ, phân giải lân nên nó làm giảm một lượng đáng kể phân bón hóa học, tổng hợp IAA Ngoài ra vi khuẩn nội sinh còn có khả năng bảo vệ môi trường, chúng có thể chuyển hóa các chất độc hại trong môi trường, thuốc trừ sâu, diệt cỏ làm giảm ô nhiễm môi trường đất

Ví dụ trong nghiên cứu của Barac (2004) cho thấy rằng Burkholderia cepacia G4

có khả năng tồn tại trong môi trường có hàm lượng toluen cao vì chúng có khả năng chuyển hóa toluen

1.5 Một số nhóm vi khuẩn nội sinh thường gặp

1.5.1 Vi khuẩn Bacillus

Vi khuẩn Bacillus là những vi khuẩn Gram dương, có nội bào tử hình ovan có khuynh hướng phình ra ở một đầu Bacillus được phân biệt với các loài vi khuẩn sinh

nội bào tử khác bằng hình dạng tế bào hình que, sinh trưởng dưới điều kiện hiếu khí

hoặc kỵ khí không bắt buộc Tế bào Bacillus có thể tồn tại ở dạng đơn hoặc chuỗi và chuyển động bằng tiêm mao Nhờ khả năng sinh bào tử nên vi khuẩn Bacillus có thể

tồn tại trong thời gian rất dài dưới các điều kiện khác nhau và rất phổ biến trong tự nhiên nên có thể phân lập từ rất nhiều nguồn khác nhau như đất, nước, trầm tích biển, thức ăn, sữa, nhưng chủ yếu là từ đất nơi mà đóng vai trò quan trọng trong chu kỳ C

và N (Nguyễn Hữu Hiệp, 2014)

Tất cả các loài thuộc chi Bacillus đều có khả năng dị dưỡng và hoại sinh nhờ sử

dụng các hợp chất hữu cơ đa dạng như đường, amino acid, acid hữu cơ, Một vài loài

có thể lên men amino acid tạo thành glycerol và butanediol, hầu hết đều là loài ưa nhiệt trung bình với nhiệt độ tối ưu là 30o

C – 45oC, nhưng cũng có nhiều loài ưa nhiệt với nhiệt độ tối ưu là 650

1.5.2 Vi khuẩn Klebsiella

Vi khuẩn Klebsiella thuộc Gram âm, dạng hình que, ít chuyển động, có khả năng

kết nang thành bào xác, kỵ khí không bắt buộc, sống tự do trong đất hoặc có khả năng

xâm nhập và nội sinh trong cây trồng K oxytoca có khả năng tổng hợp IAA từ tiền

chất tryptophan là 30µg/mg trọng lượng khô, mức độ biểu hiện hoạt tính của nitrogenase trong phản ứng khử acetylene là khá cao (Nguyễn Hữu Hiệp, 2014)

1.5.3 Vi khuẩn Pseudomonas

Pseudomonas là vi khuẩn xuất hiện ở mọi nơi trong môi trường Sự biến dưỡng

dễ thay đổi và linh động của chúng làm cho chúng có thể sống ở nhiều môi trường khác nhau như nước, đất, trên cây và trong các động vật Trong số những loài

Pseudomonas này, có những loài tiêu biểu có thể được sử dụng trong công nghệ sinh học Đặc điểm hình thái học chung cho Pseudomonas là vi khuẩn Gram âm, tế bào

hình que, di động nhờ roi ở đầu và không có bào tử Các đặc điểm sinh lý là dị dưỡng, không lên men, linh hoạt về dinh dưỡng, không quang hợp hoặc cố định nitơ Một số

chủng Pseudomonas (Pseudomonas putida, P fluorescens, P syringae) có ảnh hưởng

quan trọng trong sự sinh trưởng và phát triển thực vật như tổng hợp kích thích tố tăng trưởng thực vật như: auxin, cytokinin, kích thích sự phát triển của bộ rễ cây làm gia

tăng khả năng hấp thu chất dinh dưỡng trong đất (Glickmann và cs, 1998; Suzuki và

cs, 2003; Xie và cs, 1996)

1.5.4 Vi khuẩn Azotobacter

Năm 1966, Döbereiner phân lập được loài Azotobacter paspali từ các cây cỏ đang sinh trưởng trước phòng thí nghiệm Sự khám phá ra vi khuẩn Azotobacter paspali là một bước quan trọng trong nghiên cứu về sự cố định đạm cộng sinh

(Döbereiner, 1974)

1.5.5 Vi khuẩn Azospirillum

Azospirillum là vi khuẩn Gram âm, có khả năng chuyển động, có dạng hình que ngắn, cong hoặc hình chữ S (A lipoferum) Đây là vi khuẩn có khả năng tổng hợp

IAA, khả năng cố định đạm, hòa tan lân và một số chất dinh dưỡng khác

Năm 1923, Beijerinck phân lập được nhóm vi khuẩn giống như xoắn khuẩn và đã được Becking (1963) phát hiện lại Đến năm 1976, Döbereiner và Day mô tả về sự liên hợp của những vi khuẩn này với các cây cỏ và nhiều loại ngũ cốc khác nhau Sau đó

các vi khuẩn này được phân thành giống mới và được gọi là Azospirillum (Tarrand và

cs, 1978) Các loài Azospirillum biểu hiện sự phân bố sinh thái vô cùng rộng lớn và được gắn liền với sự đa dạng to lớn của cây trồng (Van và cs, 1980)

Trong những năm 1984 – 1985, người ta đã phát hiện nhiều loài của giống

Azospirillum trong vùng rễ của cỏ Kallar (Leptochloa fusca) (Reinhol và cs, 1986)

Trong đó các vi khuẩn xâm nhập vào bên trong nhu mô rễ có khả năng cố định đạm,

hòa tan lân ở dạng khoáng khó tan và các chất dinh dưỡng khác (Seshadri và cs,

2000), sản xuất kích thích tố thực vật hay kiểm soát các VSV gây bệnh cho cây trồng (Rangarajan, 2003)

1.6 Một số vi khuẩn gây bệnh thường gặp

1.6.1 Vi khuẩn Escherichia coli ATCC 25922

Escherichia coli ATCC 25922 là một trực khuẩn hình que ngắn, hai đầu tròn, kích

thước 2 × 0,6 µm đến 3 × 0,6 µm Trong cơ thể động vật, chúng có hình trực khuẩn,

đứng riêng lẻ, đôi khi xếp thành chuỗi ngắn Phần lớn E coli di động do có lông ở

xung quanh thân nhưng có một số chủng không di động Vi khuẩn này không hình

thành nha bào, có thể có giáp mô Vi khuẩn E coli bắt màu Gram âm, có thể bắt màu

đều hoặc sẫm ở hai đầu (Nguyễn Như Thanh và cs, 2001)

E coli là vi khuẩn chiếm nhiều nhất trong số các vi khuẩn hiếu khí sống ở đường tiêu hóa Tuy là vi khuẩn cộng sinh với người nhưng E coli có thể gây bệnh cơ hội

Chúng có thể gây viêm đường tiêu hóa, tiết niệu, sinh dục, đường hô hấp, viêm phế quản, viêm phổi, viêm tai giữa, viêm xoang, viêm màng não mũ ở trẻ sơ sinh và nhiễm khuẩn huyết Nhưng nhiễm khuẩn quan trọng nhất là viêm dạ dày ruột ở trẻ em (Nguyễn Văn Thanh, 2006)

1.6.2 Vi khuẩn Staphylococcus aureus ATCC 6538

S aureus ATCC 6538 là vi khuẩn hiếu khí hay kị khí tùy ý Chúng là những cầu

khuẩn Gram dương có kích thước từ 0,8 – 1,0 µm, thường tụ thành chùm hay thành từng chuỗi ngắn hoặc nằm riêng lẻ Đây là vi khuẩn không di động, không sinh bào tử, thành vi khuẩn phần lớn là peptidolycan (Nguyễn Văn Thanh, 2006)

Môi trường chủ yếu của S aureus là da, những tuyến da, các màng nhầy của động vật máu nóng S aureus là một tác nhân gây nhiễm trùng cơ hội, khi gặp được

điều kiện thuận lợi trên cơ địa suy giảm miễn dịch thì sẽ gây ra nhiều loại nhiễm trùng, thường gặp trong đường hô hấp và có khả năng gây nhiều bệnh khác nhau như nhiễm khuẩn ngoài da, nhiễm khuẩn huyết, viêm tai, viêm xoang, viêm họng, viêm phổi, viêm màng não, nhiễm độc thức ăn và viêm ruột cấp, nhiễm khuẩn bệnh viện do tụ cầu, hội chứng da phồng rộp,…(Nguyễn Văn Thanh, 2006)

Ngoài ra, S aureus có thể gặp ở chó, mèo, ngựa và gây bệnh phù chân ở gà

Chúng tồn tại nhiều trên mặt đất và có thể gây viêm ở những vùng da bị thương

Nghiêm trọng hơn, S aureus gây ra triệu chứng lột da kiểu Staphylococcal ở

trẻ sơ sinh (Abeck và Mempel, 1998)

1.6.3 Vi khuẩn Bacillus subtilis

B subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, bắt màu tím Gram dương, kích thước

0,5 – 0,8 µm x 1,5 – 3 µm, đứng đơn lẻ hay tạo thành chuỗi ngắn Vi khuẩn có khả năng di động, có 8 – 12 tiên mao, sinh bào tử hình bầu dục nhỏ hơn tế bào vi khuẩn và

nằm giữa tế bào Bào tử B subtilis phát triển bằng cách nảy mầm do sự nứt của vỏ,

không kháng acid, có khả năng chịu nhiệt, chịu khô, tia tử ngoại,… (Tô Minh Châu, 2000)

Một số nghiên cứu cho thấy B subtilis cũng liên quan đến vài trường hợp ngộ độc thực phẩm B subtilis sản xuất độc tố ngoại bào là subtilisin, mặc dù subtilisin có

độc tính thấp nhưng trong thành phần protein của nó có khả năng gây dị ứng đối với những người tiếp xúc trong thời gian dài gây những bệnh như viêm da, viêm đường hô

hấp,… B subtilis có tính độc rất thấp đối với người vì nó sản xuất enzyme ngoại bào

và các tác nhân gây độc không đủ để có thể gây hại cho người Ngoại trừ những trường hợp có đột biến trong tế bào vi khuẩn hay hệ thống miễn dịch của người đang

quá suy yếu Trong một số trường hợp, người ta vẫn phát hiện B subtilis ở những bệnh

nhân bị ung thư phổi, hoại thư bạch cầu, áp xe khi lắp bộ phận giả,… Tuy nhiên, tỷ lệ

các trường hợp này là rất hiếm, chỉ có 2 trong 24 trường hợp nhiễm Bacillus (trong

1034 ca nhiễm khuẩn) là do B subtilis

B subtilis được phát hiện trong một số trường hợp bò và cừu sẩy thai Tuy nhiên,

B subtilis vẫn không được cho là nguyên nhân gây bệnh B subtilis nhiễm vào và gây

tử vong cho muỗi Anophelis aulicifacies gây sốt rét ở Ấn Độ và được sử dụng như tác

nhân kiểm soát sinh học trong nghiên cứu về bệnh này

1.6.4 Vi khuẩn Vibrio

Đặc điểm chung của các loài thuộc Vibrio đều là vi khuẩn Gram âm, hình que

thẳng hoặc hơi uốn cong, kích thước 0,3 – 0,5 × 1,4 – 2,6 µm, không sinh bào tử và có khả năng di động Chúng có khả năng gây ngộ độc thực phẩm ở người Hiện nay nhóm

vi khuẩn Vibrio trên thủy sản đặc biệt là trên tôm được xem như là tác nhân gây bệnh

đáng quan tâm, làm ảnh hưởng đến sản lượng nuôi tôm hàng năm Chúng có khả năng gây bệnh hàng loạt trên động vật thủy sản: bệnh đốm trắng, bệnh đầu vàng, bệnh hoại

tử gan, bệnh tôm phát sáng, bệnh còi (Nguyễn Thu Tâm, 2014)

1.6.4.1 Vi khuẩn Vibrio harveyi

Đặc điểm chung của V harveyi là vi khuẩn Gram âm, hình que thẳng hoặc hơi uốn cong, kích thước 0,5 x 1,4 - 2,6 µm Mặc dù V harveyi thường được tìm thấy

trong môi trường sống tự nhiên và thường được báo cáo là có trong hệ tiêu hóa của cá

và động vật có vỏ đá vôi khoẻ mạnh, một số báo cáo mô tả V harveyi là tác nhân gây

bệnh nhiễm trùng viêm dạ dày ruột ở một số loài cá (Austin, 1993) Liu và cs (2009)

đã mô tả sự bùng phát dịch bệnh với tỉ lệ tử vong nghiêm trọng ở cá chẽm nuôi

(Rachycentron canadum L.) có biểu hiện ruột sưng có chứa dịch màu vàng trong suốt Tất cả cá chết đều có biểu hiện viêm dạ dày ruột và V harveyi được cho là tác nhân

gây bệnh

Vi khuẩn V harveyi gây bệnh phát sáng trên tôm sú Trong ao nuôi, tôm bị bệnh

thường bơi lội không định hướng, một số con dạt vào bờ Ao nuôi xảy ra dịch bệnh phát sáng có hiện tượng tôm chết ở đáy ao và số lượng tôm chết nhiều hay ít phụ thuộc vào mức độ cảm nhiễm của dịch bệnh Tôm nhiễm bệnh có đặc điểm chung là vỏ và thân có màu bẩn, cơ có màu đục, gan teo, khả năng bắt mồi giảm, ruột rỗng, tôm phản

xạ chậm chạp Hiện tượng phát sáng dễ nhận biết khi quan sát tôm trong bóng tối Các yếu tố môi trường như nhiệt độ, độ mặn, pH, sự tích tụ các chất hữu cơ sẽ ảnh hưởng đến sự sinh sản, lây lan và mức độ cảm nhiễm của loại vi khuẩn này

1.6.4.2 Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus

V parahaemolyticus là vi khuẩn Gram âm, hình dấu phẩy, không sinh bào tử, có

tiêm mao ở một đầu, di động, kỵ khí tùy tiện và ưa môi trường kiềm mặn Đặc trưng của loài là khả năng phát triển trong điều kiện pH rất cao (8,5 - 9,5) và bị tiêu diệt nhanh ở môi trường acid (Nguyễn Văn Duy, 2012)

V parahaemolyticus có khả năng gây ngộ độc thực phẩm và viêm dạ dày ruột,

vết thương nhiễm trùng và nhiễm trùng huyết ở người Nhiễm trùng huyết là mối đe dọa nghiêm trọng vì sinh vật gây bệnh lây lan nhanh hoặc sự hiện diện và tồn tại lâu dài của các độc tố do chúng sản xuất ra lưu thông trong máu Dấu hiệu đặc trưng là sốt hoặc hạ huyết áp và khả năng phân tách các VSV từ máu Trong trường hợp nhiễm trùng huyết, các triệu chứng có thể bao gồm sưng, đau đớn tứ chi với xuất huyết Tử vong cũng có thể xảy ra tiếp theo khi có sự xuất hiện của nhiễm trùng huyết Thời gian

ủ bệnh có thể từ 2 giờ đến 10 ngày (Barker, 1974)

Một số chủng V parahaemolyticus là nguyên chính gây bệnh hoại tử gan tụy cấp

(hội chứng chết sớm (EMS)) trên tôm, chúng có khả năng ký sinh trong đường ruột và tiết ra độc tố khiến gan sưng hoặc teo lại, gây chết hàng loạt từ 90 – 100% ao nuôi (Nguyễn Thị Chính, 2016)

1.6.5 Nấm men Yarrowia lipolytica

Nấm men Yarrowia lipolytica thuộc về nhóm các nấm men có khả năng chuyển hóa chất béo, hay còn gọi là nấm men ưa béo Y lipolytica được phân lập lần đầu tiên

từ bơ thực vật ở Hà Lan năm 1928, lúc đầu có tên gọi là Torula lipolytica, sau đó đổi thành Candida lipolytica và đến nay là Y lipolytica Nó thuộc nhóm VSV hiếu khí bắt

buộc, có khả năng tạo rất nhiều sản phẩm khác nhau và đã được đánh giá là nhóm nấm

men không có khả năng gây bệnh (Nguyễn Thị Hoài Trâm và cs, 2014)

1.7 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn nội sinh trong và ngoài nước

1.7.1 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn nội sinh ngoài nước

Trên thế giới, có nhiều công trình nghiên cứu về VSV nội sinh phân lập từ cây dược liệu nói chung và cây Neem nói riêng đã được công bố và ứng dụng vào thực

tiễn Vào năm 2003, Kennedia nigriscan, một loại cây leo ở Úc dân gian thường sử

dụng sáp nhựa để điều trị vết thương, sát trùng, đã được Strobel và cộng sự phân lập

được chủng Streptomyces sp NRRL 30562 mới ứng dụng sản xuất kháng sinh

Các nghiên cứu về cây Neem trên thế giới, vào năm 2007, Chandrashekhara và

cs đã phân lập được 7 chủng vi khuẩn nội sinh từ cây Neem tại Ấn Độ trong đó có 2

chủng Gram (+) và 5 chủng Gram () Năm 2009, Verma và cs đã phân lập được 55

chủng xạ khuẩn nội sinh từ cây Neem có khả năng ức chế được 54,4% hoạt động của

vi khuẩn và nấm bệnh Năm 2015, Arun và cs đã phân lập được 2 chủng vi khuẩn nội sinh, 2 chủng nấm nội sinh từ cây Neem (Azadirachta indica), 2 chủng vi khuẩn nội sinh và 2 chủng nấm nội sinh từ chiêu liệu (Terminalia arjuna), 2 chủng nấm nội sinh

từ dừa cạn (Catharanthus roseus) Nhưng trong đó chỉ có chủng NRL2 là chủng có khả năng kháng S aureus mạnh nhất

Năm 2011, Roy và cs đã khảo sát hợp chất tiết ra từ 4 chủng vi khuẩn nội sinh dừa cạn kháng được vi khuẩn, vi nấm gây bệnh Năm 2012, Bahing và cs phân lập được 28 chủng từ cây húng chanh (Plectranthus tenuiflorus) trong đó có 8 chủng đã được định danh Bacillus sp., B megaterium, B pumilus, B licheniformis, Micrococcus luteus, Paenibacillus sp., Pseudomonas sp và Acinetobacter calcoaceticus các chủng

này có khả năng sinh ra enzyme ngoại bào rất mạnh và có khả năng kháng khuẩn

mạnh Năm 2014, Madhurama Gangwar và cs đã phân lập được 12 chủng vi khuẩn nội

sinh từ 3 cây thuốc ở Ấn Độ là nha đam (Aloe vera), bạc hà (Mentha arvensis) và húng quế (Ocimum sanctum) thúc đẩy tăng trưởng thực vật và hoạt động kháng khuẩn

Bên cạnh đó còn có các nghiên cứu về xạ khuẩn và nấm nội sinh vào năm 2011,

Kafur và cs đã phân lập được 38 chủng xạ khuẩn nội sinh trong cây dừa cạn có khả

năng ức chế 43,4% hoạt động của vi khuẩn và nấm bệnh Các nghiên cứu về nấm nội sinh ngày càng được nghiên cứu nhiều điển hình vào năm 2012, Pavithra đã nghiên cứu 40 chủng nấm nội sinh trong cây húng quế có hoạt tính kháng được 77,5% nấm bệnh

1.7.2 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn nội sinh trong nước

Ở Việt Nam, các nghiên cứu về VSV nội sinh mới chỉ bắt đầu ở quy mô thí nghiệm Các nghiên cứu về nấm nội sinh, nghiên cứu của Nguyễn Sỹ Giao (1971) về ứng dụng một số chủng nấm cộng sinh trong nuôi trồng cây non phục vụ cho nghề trồng rừng, quy mô nghiên cứu dừng lại ở bầu cây ươm Lê Thị Xuân và Lê Mai Hương (1997) thăm dò khả năng tạo chất taxol từ cây thông đỏ ở Việt Nam, đã tách

được từ lớp lõi của cây thông đỏ phân lập được chủng nấm Mucor circinolloides var

tieghem và tách chiết được một chất gần giống với 10- deacetil baceatin III ở cây chủ

Lê Mai Hương và cs (2005) cũng đã phân lập được chủng nấm nội sinh Aspergillus awamori trên cây sảng (Sterculia lanceolata Cav) và trên cây thuốc tại một số vùng

trong nước và nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của chủng nói trên Bên cạnh đó có các nghiên cứu về vi khuẩn nội sinh của tác giả Phạm Quang Thu

và cs (2008), phân lập được các chủng vi khuẩn nội sinh đều có khả năng kháng nấm Colletotrichum gloeosporioide gây bệnh trên cây keo lai với hiệu lực cao

Nguyễn Hữu Hiệp và cs (2014), đã phân lập được 17 chủng vi khuẩn nội sinh từ cây rau diếp cá trong đó có 7 dòng có khả năng kháng Aeromonas hydrophila, 9 dòng

có khả năng kháng Escherichia coli và 7 dòng có khả năng kháng được cả 2 loài vi

khuẩn gây bệnh Cao Ngọc Điệp và Phan Thị Nhã (2011), từ cây dứa đã phân lập được

45 dòng vi khuẩn nội sinh có 15 đặc tính tốt như cố định đạm, hòa tan lân, tổng hợp

IAA Trong đó, dòng Burkholderia tropica đã được thử nghiệm vào sản suất phân bón

sinh học cho cây chủ Lương Thị Hồng Hiệp và Cao Ngọc Điệp (2011) đã phân lập

được 37 dòng vi khuẩn nội sinh trên cây cúc Xuyến chi, chủ yếu là Bacillus sp và Acinetobacter antiviralis Nguyễn Văn Minh và cs (2014) đã sàng lọc được 21 chủng

thuringiensis T9 và T6 có khả năng ức chế nấm Corynespora cassiicola gây bệnh rụng

lá cao su

Riêng nghiên cứu vi khuẩn nội sinh trên cây Neem ở Việt Nam có nhóm nghiên

cứu của tác giả Dương Nhật Linh và cs (2015) đã phân lập được 52 chủng vi khuẩn

nội sinh trên cây Neem trong đó có 11 chủng kháng 4 chủng vi khuẩn gây bệnh

Salmonella typhi, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Staphylococcus aureu, 7

chủng mang enzyme kháng thuốc và 4 chủng vi nấm

Gần đây, Nguyễn Hải Vân và Nguyễn Hải Minh (2017) đã phân lập được 32 chủng vi khuẩn nội sinh từ các vùng sinh thái khác nhau trong đó chỉ có 6 chủng có hoạt tính sinh học tốt để bổ sung vào dịch dinh dưỡng sau xử lý phế thải chăn nuôi làm chế phẩm dinh dưỡng vi sinh đa chức năng Các chủng phân lập được được định danh

Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Aeromonas caviae, Pseudomonas putida, Pantoea rodasii, Bacillus subtilis

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

 Thời gian nghiên cứu: từ ngày 29/02/2018 - 07/06/2018

 Địa điểm nghiên cứu: Trung tâm Thí nghiệm và Thực hành, Trường Đại học

Các chủng vi khuẩn kiểm định B subtilis, S aureus ATCC 6538, E coli ATCC

25922 được lấy từ bộ sưu tập phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học, trường Đại học

Nha Trang Các chủng này được nuôi cấy lắc trên môi trường TSB với tốc độ 160 vòng/phút trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng

Các chủng vi khuẩn V parahaemolyticus X9, V harveyi, Vibrio sp MCRV,

Vibrio sp MCRX được lấy từ bộ sưu tập chủng của trung tâm nghiên cứu giống và

dịch bệnh thủy sản, trường Đại học Nha Trang Các chủng này được nuôi cấy lắc trên môi trường TSB + 2% NaCl với tốc độ 160 vòng/phút trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng

2.3 Phương pháp nghiên cứu

Các phương pháp nghiên cứu thực hiện trong đề tài được thể hiện trong sơ đồ tổng quát (hình 2.1)

Hình 2.1 Sơ đồ tổng quát phương pháp nghiên cứu

Thử Nghiệm OxidaseHóa lỏng gelatin

Thử nghiệm citrate

Thử nghiệm lên men đường

Khả năng chịu nồng độ muối cao

Thử nghiệm oxi hóa – lên men (OF)Thử nghiệm CAMP

Khảo sát khả năng sinh bào tử

Thu mẫu

Xử lý mẫu

Phân lập vi khuẩn nội sinh

Khảo sát một số đặc tính sinh học của các chủng vi khuẩn nội sinh

Các thử nghiệm sinh hóaNhuộm Gram

2.3.1 Phương pháp thu và xử lý mẫu (Shweta, 2013)

Mẫu được rửa sạch dưới vòi nước để loại bỏ đất, cát bám bên ngoài Cắt nhỏ mẫu

có kích thước 2 – 3 cm bằng dao đã vô trùng Ngâm mẫu trong nước cất vô trùng trong

vòng 2-5 phút Ngâm mẫu trong ethanol 75% trong 2-5 phút Rửa với NaClO trong 2

phút Ngâm mẫu trong ethanol 75% trong 30 giây Rửa sạch 3 lần với nước cất vô trùng Để xác định quá trình khử trùng có thành công: Lấy 100 µl nước cất rửa lần thứ

3 cấy trên môi trường TSA Ủ 1-3 ngày

2.3.2 Phương pháp phân lập các chủng vi khuẩn nội sinh (Arun và cs, 2015)

Sau khi khử trùng mẫu xong ta cắt mẫu có kích thước 2- 3 mm đem đặt trên môi trường TSA (cắt mẫu phải có tính đại diện), ủ ở nhiệt độ phòng Để ngăn ngừa khả năng nhiễm khuẩn, nhiễm nấm

Các đĩa peptri có chứa mẫu được đặt ở nhiệt độ phòng trong 6-7 ngày và theo dõi mỗi ngày để kiểm tra sự xuất hiện của vi khuẩn nội sinh từ các phân đoạn thân, lá, rễ Cấy ria các mẫu đã xuất hiện sinh khối vi khuẩn xung quanh mẫu cắt để thu được khuẩn lạc đơn

Tiếp theo làm thuần vi khuẩn bằng cách lấy khuẩn lạc đơn hòa với nước muối sinh lý vô trùng, cấy trang lên đĩa môi trường TSA Ủ mẫu ở nhiệt độ phòng cho đến khi xuất hiện khuẩn lạc Nếu thấy các dạng khuẩn lạc đồng đều về hình dạng, màu sắc thì giống phân lập đã thuần

2.3.3 Phương pháp bảo quản các chủng vi khuẩn nội sinh

Chọn khuẩn lạc riêng rẽ cấy chuyền sang ống thạch nghiêng môi trường TSA Nuôi cấy và ủ mẫu ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ, sau đó bảo quản ở 40

C Các chủng được cấy chuyền định kỳ 1 tháng/1 lần trong suốt thời gian thực hiện đề tài

2.3.4 uan sát hình thái khuẩn l c

Quan sát một số chỉ tiêu của chủng nghiên cứu trên môi trường TSA

- Khả năng phát triển của khuẩn lạc (kích thước)

- Bề mặt khuẩn lạc

- Màu sắc khuẩn lạc

2.3.5 Nhuộm Gram (Christian Gram,1884)

Quy trình thực hiện

 Nhỏ một giọt nước muối sinh lý vô trùng lên lame kính

 Dùng que cấy lấy một ít sinh khối trên khuẩn lạc trải đều trên giọt nước muối sinh lý, cố định trên ngọn lửa đèn cồn (hơ lướt qua đến khi mẫu khô lại)

 Nhỏ dung dịch Crystal violet lên vết bôi, chờ 1-2 phút rồi rửa bằng nước cất

 Nhỏ tiếp dung dịch lugol khoảng 1 phút, tiếp tục rửa bằng nước cất

 Tẩy màu bằng dung dịch cồn acetol, nhỏ từ từ dung dịch cồn acetol lên lame kính cho đến khi giọt nước chảy xuống không còn màu tím, rồi rửa lại lame kính bằng nước cất

 Nhỏ lên dung dịch Fushin để khoảng 2 phút rồi rửa lại bằng nước cất

 Để cho lame kính khô rồi quan sát hình dạng, kích thước và Gram của vi khuẩn dưới vật kính 100X có giọt dầu

Kết quả: Nếu vi khuẩn bắt màu tím thì đó là vi khuẩn Gram dương, vi khuẩn bắt

màu hồng là vi khuẩn Gram âm

2.3.6 Xác định khả năng di động (Trần Linh Thước, 2007)

Nguyên lý

VSV di động chủ yếu nhờ các tiêm mao (flagella) có nhiều vi khuẩn hình que, một số vi khuẩn hình cầu Khả năng di động là một trong những căn cứ có thể dùng để phân biệt VSV Khả năng này có thể được quan sát dựa vào sự tăng trưởng và di động của VSV vào bên trong môi trường thạch mềm

Quy trình tiến hành

Dùng que cấy thẳng lấy sinh khối từ khuẩn lạc thuần sau khi ủ ở nhiệt độ thích hợp 18 – 24 giờ trên môi trường TSA + 0,5% agar Chủng được cấy bằng cách đâm sâu xuyên vào giữa môi trường trong ống nghiệm đến độ sâu khoảng 2 cm chứa môi trường thạch mềm Thực hiện song song với việc ủ 1 ống nghệm không cấy VSV để làm đối chứng Ủ ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ

Kết quả: Thử nghiệm (+) là khi VSV mọc lan khỏi đường cấy và làm đục môi

trường xung quanh, (-) là khi VSV chỉ mọc dọc theo đường cấy trong khi môi trường xung quanh vẫn trong

2.3.7 Khảo sát một số đặc tính sinh học của các chủng vi khuẩn nội sinh

2.3.7.1 Khảo sát khả năng kháng khuẩn

Chuẩn bị các vi khuẩn kiểm định

Sau khi được cấy hoạt hóa trên đĩa thạch TSA, ủ ở nhiệt độ 370

C trong thời gian 24-48 giờ, lấy 3 – 5 khuẩn lạc có đường kính ≥ 1 mm để pha thành dịch treo trong dung dịch TSB Phân tán đều bằng máy vortex Ủ dịch treo ở 37oC để vi khuẩn tăng sinh Lượng vi khuẩn trong dịch treo được xác định lượng bằng quang phổ kế ở bước sóng 625 nm Điều chỉnh dịch treo có giá trị OD = 0,08 – 0,12 (giá trị này tương đương với nồng độ vi khuẩn 1–2x108

CFU/ml) Tiếp tục pha loãng dịch treo trong dung dịch TSB để đạt nồng độ 106 CFU/ml

Quy trình thực hiện theo sơ đồ sau:

Hình 2.2 Sơ đồ khảo sát khả năng kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn

Đường kính vòng phân giải được tính như sau: H = D – d

Trong đó H: đường kính vòng phân giải (mm)

D: đường kính vòng phân giải (bao gồm đường kính lỗ) (mm)

Hút 100µl dịch vi khuẩn

kiểm định

Cấy trang lên đĩa chứa môi

trường TSA, TSA+2%NaCl

Hình 2.3 Vùng kháng khuẩn của các vi khuẩn nội sinh phân lập được trên đĩa peptri

Bảng 2.1 Bảng đánh giá mức độ của đường kính vòng kháng khuẩn (Manuanza, 1994)

Mức độ tác động Đường kính vòng vô khuẩn (mm)

Mạnh (+++) ≥ 10

Vừa (++) 5 - 10

Yếu (+) ≤ 5

Không tác động Không cho vòng vô khuẩn

2.3.7.2 Thử nghiệm khả năng sinh enzyme ngo i bào (Trần Bảo Trâm và cs, 2016)

Quy trình thực hiện theo sơ đồ sau:

Hình 2.4 Sơ đồ thử nghiệm ho t tính sinh enzyme ngo i bào

Đĩa petri

Môi trường chứa cơ chất

Lỗ chứa dịch ly tâm Vòng phân giải

Dịch vi khuẩn nội sinh nuôi cấy sau 24 giờ

Ly tâm 10000 vòng/phút, trong 15 phút ở 40C

Lấy dịch sau ly tâm bỏ phần cặn

Cho 100µl vào giếng thạch đã được đục sẵn trong đĩa môi trường TSA có chứa 1% tinh bột, 1% CMC, 1% skimmilk

Sau 24 giờ đọc kết quả

Đường kính vòng phân giải được tính như sau:

H = D – d

Trong đó H: đường kính vòng phân giải (mm)

D: đường kính vòng phân giải (bao gồm đường kính lỗ) (mm)

d: Đường kính giếng (mm)

Hình 2.5 Vùng phân giải cơ chất của các chủng vi khuẩn nội sinh phân lập được

2.3.8 Các thử nghiệm sinh hóa

2.3.8.1 Thử nghiệm catalase (Trần Linh Thước, 2007)

Nguyên lý

Thí nghiệm được tiến hành nhằm xác định sự có mặt của enzyme catalase trong dịch nuôi cấy Các VSV hiếu khí và khị khí tùy tiện chứa chuỗi truyền điện tử có cytochrome đều có catalase, có khả năng biến dưỡng năng lượng theo phương pháp hô hấp với oxy là chất điện tử cuối cùng trong chuỗi truyền điện tạo ra H2O2 Catalase sẽ thủy phân hydrogen peroside (H2O2), thành H2O và O2, ngăn cản sự tích tụ phân tử có độc tính cao này trong tế bào Sự thủy phân H2O2 sẽ giải phóng O2 được ghi nhận qua hiện tượng sủi bọt khí

Quy trình thực hiện

Chuẩn bị dung dịch H2O2 nồng độ 3 - 10%, nhỏ một giọt lên phiến kính Dùng đầu que cấy lấy một ít khuẩn lạc thuần sau khi ủ ở nhiệt độ thích hợp 18 – 24 giờ trên môi trường TSA trộn vào giọt H2O2 trên phiến kính

Đĩa petri

Môi trường chứa cơ chất

Lỗ chứa dịch ly tâm thô

Vòng phân giải

2.3.8.2 Thử nghiệm oxidase (Trần Linh Thước, 2007)

Nguyên tắc:

Các loại vi khuẩn hiếu khí tuyệt đối có enzyme oxidase (cytochrome oxidase)

Có thể phát hiện oxidase bằng cách sử dụng thuốc thử là giấy tẩm N – Dimethel – paraphenyldiamine Trong điều kiện có sự hiện diện của enzyme oxidase trong tế bào thì thuốc thử này bị oxi hóa thành một chất indolphenol có màu xanh dương

Quy trình thực hiện

Dùng que cấy lấy một ít khuẩn lạc thuần sau khi ủ ở nhiệt độ phòng trong 18 –

24 giờ, phết lên giấy tẩm thuốc thử Đọc kết quả trong vòng 30 giây – 1 phút

Kết quả: Nếu xuất hiện màu xanh dương là dương tính, màu vàng là âm tính

2.3.8.3 Thử ngiệm citrate (Trần Linh Thước, 2007)

Nguyên lý

Một số VSV có khả năng sử dụng citrate làm nguồn cacbon duy nhất để thu lấy năng lượng và vật chất Sản phẩm biến dưỡng citrate làm thay đổi pH của môi trường Mọi VSV có khả năng sử dụng citrate làm nguồn cacbon duy nhất đều có khả năng sử dụng muối ammonium làm nguồn đạm duy nhất Sự phân giải muối ammonium làm nguồn đạm trong môi trường sẽ giải phóng NH3 ra môi trường làm kiềm hóa môi trường, sự thay đổi pH được nhận diện bằng chỉ thị màu bromothymol blue có khoảng đổi pH từ 6 – 7,6 tương ứng với khoảng màu từ vàng  xanh lục  xanh dương

Quy trình thực hiện

Thử nghiệm sử dụng môi trường SCA môi trường này chứa sodium citrate làm nguồn cacbon duy nhất, chỉ thị bromothymol blue, pH = 6,9 Lấy một ít khuẩn lạc thuần sau khi ủ ở nhiệt độ thích hợp 18 – 24 giờ trên môi trường TSA ta tiến hành cấy ria các khuẩn lạc thuần vào các ống thạch nghiêng Ủ nhiệt độ phòng trong 24 - 48 giờ hoặc kéo dài đến 4 ngày khi cần thiết

Kết quả: Nếu xuất hiện màu xanh dương là dương tính, màu xanh lục là âm tính

2.3.8.4 Khả năng làm dịch hóa Gelatin (Trần Linh Thước, 2007)

Nguyên tắc

Một số VSV có thể tổng hợp nhóm enzyme gelatinase ngoại bào xúc tác sự thủy phân của gelatin thành polypeptide và amino acid Để nhận biết khả năng làm tan

gelatin của VSV, cơ chất này được bổ sung làm đông đặc môi trường nuôi cấy Sau khi cấy chủng, VSV có khả năng tiết ra enzyme gelatinase sẽ làm môi trường hóa lỏng

Quy trình thực hiện

Các chủng vi khuẩn sau khi nuôi cấy lắc trên môi trường TSB với tốc độ 160 vòng/phút trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng Hút 0,1 ml cho vào các ống môi trường có chứa gelatin, giữ 2 ống không cấy làm đối chúng, ủ ở nhiệt độ phòng Sau 24 giờ đem cất vào tủ 4oC, sau 2 giờ đem ra đọc kết quả

Kết quả: Nếu bề mặt môi trường gelatin không lõm xuống, gelatin vẫn ở trạng

thái ổn định là phản ứng âm tính (không sinh gelatinase) Nếu một phần hay toàn bộ gelatin hóa lỏng thì là phản ứng dương tính Nếu so với đối chứng âm thấy vi khuẩn đã mọc, gelatin chưa hoá lỏng nhưng bề mặt lõm xuống thì cũng coi là dương tính (mức

Quy trình thực hiện

Cấy một ít khuẩn lạc thuần sau khi ủ ở nhiệt độ thích hợp 18 – 24 giờ trên môi trường TSA vào môi trường lên men đường cần khảo sát, ủ ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ

Kết quả: Ống (+): màu vàng Ống (-): màu hồng đến đỏ

2.3.8.6 Thử nghiệm khả năng oxi hóa – lên men (Trần Linh Thước, 2007)

Nguyên tắc:

VSV đang thử nghiệm biến dưỡng carbohydrate theo phương thức oxi hóa hay lên men Thử nghiệm này được thự hiện bằng cách nuôi cấy chủng thử nghiệm trong môi trường Hugh – Leifson chứa glucose là nguồn cacbon duy nhất và chỉ thị pH là

bromothumol blue Các sản phẩm này có tính acid của quá trình lên men sẽ làm thay đổi màu chỉ thị pH

chủng Bacillus có khả năng phát triển ở điều kiện 10% NaCl, do đó, thử nghiệm này

Quy trình thực hiện

Cấy khuẩn lạc thuần sau khi ủ ở nhiệt độ thích hợp 18 – 24 giờ trên môi trường TSA Cấy khuẩn lạc lên trên đĩa môi trường thạch máu Ủ ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ, quan sát đặc điểm khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch máu