Ảnh hưởng của một số yếu tố lên quá trình sinh trưởng và phát triển của lan thạch hộc tía (dendrobium officinale kimura et migo) nuôi cấy in vitro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ LÊN QUÁ TRÌNH SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA LAN T

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ LÊN QUÁ TRÌNH SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA LAN THẠCH HỘC TÍA

(Dendrobium officinale Kimura et Migo) NUÔI CẤY IN VITRO

Giảng viên hướng dẫn : TS Vũ Quốc Luận

TS Phạm Thị Minh Thu Sinh viên thực hiện : Nguyễn Thị Thanh Thúy

Mã số sinh viên : 56132069

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ LÊN QUÁ TRÌNH SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA LAN THẠCH HỘC TÍA

(Dendrobium officinale Kimura et Migo) NUÔI CẤY IN VITRO

Giảng viên hướng dẫn : TS Vũ Quốc Luận

TS Phạm Thị Minh Thu Sinh viên thực hiện : Nguyễn Thị Thanh Thúy

Mã số sinh viên : 56132069

Khánh Hòa, tháng 07/2018

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG

PHIẾU THEO DÕI TIẾN ĐỘ VÀ ĐÁNH GIÁ ĐỀ TÀI / KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

(Dùng cho CBHD và nộp cùng báo cáo ĐA/KLTN của sinh viên)

Tên đề tài: ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ LÊN QUÁ TRÌNH SINH TRƯỞNG

VÀ PHÁT TRIỂN CỦA LAN THẠCH HỘC TÍA (Dendrobium officinale Kimura et Migo) NUÔI CẤY IN VITRO

Giảng viên hướng dẫn: TS Vũ Quốc Luận, Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên Sinh viên được hướng dẫn: Nguyễn Thị Thanh Thúy MSSV: 56132069

Nhận xét chung (sau khi sinh viên hoàn thành ĐA/KL): Sinh viên đã hoàn thành công việc được giao và tuân thủ theo các quy định

Khánh Hòa, ngày 04 tháng 07 năm 2018

Cán bộ hướng dẫn

(Đã ký)

Vũ Quốc Luận

Kiểm tra giữa tiến độ của Trưởng BM Ngày kiềm tra:

2.5.2018

Đánh giá công việc hoàn thành:50%

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đề tài: “Ảnh hưởng của một số yếu tố lên quá trình sinh

trưởng và phát triển lan Thạch hộc tía (Denrobium officinale Kimura et Migo) nuôi cấy in vitro” là một công trình nghiên cứu độc lập, số liệu và kết quả nghiên cứu trong

luận văn này là trung thực Mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận này đã được cảm ơn

và các thông tin trích dẫn cho luận văn đã được ghi nguồn gốc rõ ràng và được phép công

bố

Nha Trang, ngày 04 tháng 07 năm 2018

Người cam đoan Nguyễn Thị Thanh Thúy

LỜI CẢM ƠN

Trên thực tế, không có sự thành công nào mà không gắn liền với sự hỗ trợ, giúp

đỡ, dù nhiều hay ít, dù trực tiếp hay gián tiếp của người khác Bằng tất cả tấm lòng, tôi xin chân thành kính gửi lời tri ân của mình đến những người đã dìu dắt tôi trên con đường học tập

Đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu, quý thầy cô ở Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, Bộ môn Công nghệ Sinh học, trường Đại học Nha Trang đã truyền đạt những kiến thức cơ bản cho tôi trong lĩnh vực Công nghệ sinh học, làm nền tảng cho việc thực hiện khóa luận tốt nghiệp

Tôi xin trân trọng gửi lời biết ơn sâu sắc đến Thầy GS.TS Dương Tấn Nhựt Thầy

đã tận tình chỉ bảo cho mọi người, trong đó có tôi Thầy là người luôn say mê với khoa học, luôn tận tụy với sinh viên Đôi khi Thầy khó tính, nhưng chỉ vì muốn sinh viên học tập tốt hơn để trở thành những người có ích Ở Thầy, tôi đã học hỏi được không những là tri thức mà còn có kinh nghiệm sống, Thầy dạy tôi phải biết đương đầu với khó khăn, với Thầy những điều bình thường không phải chỉ nhìn mà còn phải quan sát và dùng tư duy

để khám phá ra được những điều mới mẻ và thú vị Tất cả những kiến thức ấy sẽ cùng tôi trong suốt cuộc đời của mình

Tôi xin chân thành cảm ơn Thầy Vũ Quốc Luận Thầy đã cùng với tri thức và tâm huyết của mình để chỉ dạy, giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện đề tài

Tôi cũng xin gửi lời đến Cô Phạm Thị Minh Thu Cảm ơn Cô đã luôn tận tình giúp

đỡ cũng như động viên tôi trong suốt quá trình học tập và làm đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn đến các anh, chị ở Phòng Sinh học Phân tử và Chọn tạo Giống cây trồng, Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên, nơi tôi gắn bó trong thời gian thực hiện đề tài Thời gian không quá gọi là dài, nhưng đủ đề tôi biết ơn sự giúp đỡ, động viên trong những ngày đầu bỡ ngỡ và trong quá trình thực hiện đề tài

Tôi cũng xin gửi lời đến tập thể lớp 56CNSH-2 và những người bạn, những người

đã cùng tôi trải qua những cảm xúc của 4 năm đại học, luôn đồng hành trong mọi khó khăn cũng như là những lúc vui vẻ, hạnh phúc

Cuối cùng, con xin bày tỏ lòng biết ơn đến Ba, Mẹ, em trai đã luôn bên cạnh, là chỗ dựa vật chất lẫn tinh thần trong suốt thời gian qua Luôn động viên, quan tâm, lo lắng mỗi lần con chán nản hay gặp khó khăn

Xin chân thành cảm ơn và chúc tất cả mọi người luôn hạnh phúc

Nha Trang, tháng 07 năm 2018

Sinh viên Nguyễn Thị Thanh Thúy

TÓM TẮT

Đề tài nghiên cứu “Ảnh hưởng của một số yếu tố lên quá trình sinh trưởng và

phát triển lan Thạch hộc tía (Denrobium officinale Kimura et Migo) nuôi cấy in vitro” được tiến hành tại phòng Sinh học phân tử và Chọn tạo Giống cây trồng thuộc Viện

Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên Nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng của môi trường khoáng, cytokinin, chất hữu cơ, auxin kết hợp với điều kiện nuôi cấy lên sự sinh trưởng

và phát triển của chồi lan Thạch hộc tía Từ đó, tìm ra môi trường tốt nhất cho quá trình nhân giống loài lan quý này, với mục đích chính là tạo ra số lượng lớn cây lan Thạch hộc tía có chất lượng tốt

Trong nghiên cứu này, các chồi đơn lan Thạch hộc tía in vitro có chiều cao khoảng 1

cm được cấy lên các môi trường khoáng khác nhau (VW, KS, NN, B5, MS, SH) có bổ sung 30 g/l sucrose, 9 g/l agar, 1 g/l AC, pH = 5,8 Kết quả cho thấy môi trường SH là tốt nhất cho sự sinh trưởng và phát triển chồi lan Thạch hộc tía, với các chỉ tiêu sinh trưởng đạt cao nhất: số chồi mới là 2,53 chồi, chiều cao chồi là 3,07 cm, khối lượng tươi là

Trong thí nghiệm tiếp theo, môi trường SH có 0,5 mg/l NAA được bổ sung thêm

BA, KIN, TDZ riêng lẻ ở các nồng độ khác nhau (0,5; 1,0; 1,5 mg/l) nhằm gia tăng sự sinh trưởng và phát triển của chồi lan Thạch hộc tía Kết quả cho thấy, các chồi ở nghiệm thức 1,5 mg/l BA là vượt trội so với các nghiệm thức khác Các chồi ở nồng độ này có số chồi mới được tạo ra là 3,53 chồi, chiều cao chồi lên tới 3,53 cm, khối lượng tươi là

hữu cơ cũng có ảnh hưởng lên quá trình sinh trưởng và nhân nhanh chồi lan Thạch hộc tía Ở các nồng độ khác nhau của nước dừa (50, 100, 150 ml/l), chuối (50, 100, 150 g/l), khoai tây (50, 100, 150 g/l), peptone (0,5; 1,0; 1,5 g/l) được bổ sung riêng lẻ, các chồi trên môi trường bổ sung 150 ml/l nước dừa phát triển đồng đều về số chồi (3,90 chồi) và chiều cao chồi (3,07 cm)

Để kéo dài rễ, phân đốt thân và tạo cây hoàn chỉnh của lan Thạch hộc tía, sự kết hợp điều kiện thoáng khí với auxin (IBA, NAA) Kết quả thu được, môi trường SH bổ sung 1,0 mg/l NAA ở điều kiện thoáng khí phát sinh rễ tốt nhất với số rễ là 3,57 rễ và chiều dài

rễ là 3,53 cm Các chồi ở điều kiện thoáng khí có sự phân đốt rõ ràng, giả hành lớn hơn so với các chồi ở nuôi cấy không thoáng khí sau 3 tháng nuôi cấy

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN iv

LỜI CẢM ƠN v

TÓM TẮT vii

MỤC LỤC xi

DANH MỤC HÌNH xi

DANH MỤC BẢNG xii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT xiii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan về lan Thạch hộc tía (Dendrobium officinale Kimura et Migo) 3

1.1.1 Phân loại thực vật 3

1.1.2 Phân bố 3

1.1.3 Đặc điểm hình thái 4

1.1.4 Đặc điểm sinh thái 5

1.1.5 Giá trị sử dụng 6

1.2 Tình hình nghiên cứu về chi lan Dendrobium 7

1.2.1 Tình hình nghiên cứu về chi lan Dendrobium ở Việt Nam 7

1.2.2 Tình hình nghiên cứu về chi lan Dendrobium trên thế giới 8

1.3 Tình hình nghiên cứu về lan Thạch hộc tía (Dendrobium officinale Kimura et Migo) 9

1.4 Phương pháp nuôi cấy chồi và tạo cây hoàn chỉnh in vitro 10

1.5 Vai trò của chất điều hòa sinh trưởng 11

1.5.1 Auxin 11

1.5.2 Cytokinin 11

1.6 Vai trò của các chất hữu cơ 13

1.6.1 Nước dừa 13

1.6.2 Bột khoai tây 14

1.6.3 Bột chuối 14

1.6.4 Peptone 15

1.7 Than hoạt tính (Active Charcoal - AC) 15

1.8 Điều kiện thoáng khí 16

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Vật liệu nghiên cứu 18

2.1.1 Nguồn mẫu 18

2.1.2 Thiết bị - dụng cụ - hóa chất 18

2.1.3 Môi trường nuôi cấy 18

2.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 19

2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của môi trường khoáng khác nhau lên quá trình sinh trưởng và phát triển chồi lan Thạch hộc tía in vitro 19

2.2.2 Ảnh hưởng của cytokinin và chất hữu cơ lên khả năng nhân nhanh chồi lan Thạch hộc tía in vitro 19

2.2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của cytokinin kết hợp với 0,5 mg/l NAA lên quá trình sinh trưởng và nhân nhanh chồi lan Thạch hộc tía in vitro 19

2.2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của các chất hữu cơ bổ sung lên khả năng nhân nhanh chồi lan Thạch hộc tía in vitro 20

2.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của IBA, NAA kết hợp với điều kiện nuôi cấy lên quá trình tạo cây hoàn chỉnh loài lan Thạch hộc tía in vitro 21

2.3 Điều kiện nuôi cấy 22

2.4 Phương pháp xử lí số liệu 22

2.5 Địa điểm và thời gian tiến hành thí nghiệm 23

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24

3.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của môi trường khoáng khác nhau lên quá trình sinh trưởng và phát triển chồi lan Thạch hộc tía in vitro 24

3.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của cytokinin và chất hữu cơ lên khả năng nhân nhanh chồi lan Thạch hộc tía in vitro 26

3.2.1 Ảnh hưởng của cytokinin kết hợp với auxin lên quá trình sinh trưởng và nhân nhanh chồi lan Thạch hộc tía in vitro 26

3.2.2 Ảnh hưởng của các chất hữu cơ bổ sung lên quá trình sinh trưởng và nhân nhanh chồi lan Thạch hộc tía in vitro 30

3.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của IBA, NAA kết hợp với điều kiện nuôi cấy lên quá trình hình thành rễ Thạch hộc tía in vitro 35

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39

TÀI LIỆU THAM KHẢO 41

PHỤ LỤC A 49

PHỤ LỤC B 50

DANH MỤC HÌNH

Trang Hình 1.1 Hình thái lan Thạch hộc tía ngoài tự nhiên 7 Hình 3.1 Ảnh hưởng của các môi trường khoáng khác nhau lên chồi lan

Thạch hộc tía in vitro sau 3 tháng 24

Hình 3.2 Ảnh hưởng của BA lên sự sinh trưởng và phát triển của chồi lan

Thạch hộc tía in vitro sau 3 tháng 26

Hình 3.3 Ảnh hưởng của KIN lên chồi lan Thạch hộc tía in vitro sau 3

Hình 3.8 Ảnh hưởng của peptone lên chồi lan Thạch hộc tía in vitro sau 3 tháng 33

Hình 3.9 Ảnh hưởng của IBA, NAA lên chồi lan Thạch hộc tía trong điều kiện nuôi cấy không thoáng khí 36

Hình 3.10. Ảnh hưởng của IBA, NAA lên chồi lan Thạch hộc tía trong điều kiện nuôi cấy thoáng khí 37

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của môi trường khoáng khác nhau lên quá trình sinh

trưởng và phát triển chồi lan Thạch hộc tía in vitro 23

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của cytokinin kết hợp với auxin lên quá trình sinh

trưởng và nhân nhanh chồi lan Thạch hộc tía in vitro 25

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của chất hữu cơ lên quá trình sinh trưởng và nhân nhanh

chồi lan Thạch hộc tía in vitro 34

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của IBA, NAA và kết với điều kiện nuôi cấy lên quá trình hình

thành rễ lên thạch hộc tía in vitro 35

IAA : Acid 3-indoleacetic

IBA : Acid 3-indolebutyric

KIN : Kinetin

NAA : Acid α-naphtaleneacetic

NN : Nitsch and Nitsch, 1969

NXB : Nhà xuất bản

TDZ : Thidiazuron

VW : Vacin and Went, 1949

MỞ ĐẦU

Theo “Dược điển nước cộng hòa Trung Hoa” xuất bản năm 2005 đã ghi nhận, Thạch

hộc tía là một loài lan quý được đánh giá là tuyệt phẩm trong chi Dendrobium Thạch hộc

tía là loài cây có nguy cơ tuyệt chủng, được ghi vào sách đỏ thế giới, là dược liệu quý hiếm được pháp luật bảo hộ nghiêm ngặt Loài lan này được mệnh danh là “vàng thực vật” bởi giá trị dược liệu cao kéo theo giá trị kinh tế cũng cao Trong tự nhiên, Thạch hộc tía rất khó sinh sản, mọc chậm, khó trồng Vì vậy, những vấn đề liên quan đến nhân nhanh loài lan quý hiếm này đang được các nhà nghiên cứu quan tâm

Hiện nay, để thu được cây con với số lượng lớn người ta tiến hành nhân giống Thạch hộc tía bằng rất nhiều phương pháp khác nhau Tuy nhiên, trong những năm gần đây phương pháp nuôi cấy mô thực vật đã trở nên phổ biến và mang lại hiệu quả nhân giống cao hơn các phương pháp nhân giống truyền thống Phương pháp này cho số lượng cây giống thu được lớn và đồng đều trong thời gian ngắn nên đem lại hiệu quả kinh tế cao

Cho đến nay, có rất ít các công bố về các điều kiện tác động khác nhau ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của lan Thạch hộc tía; và chưa có nghiên cứu nào khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy (thoáng khí) lên quá trình nhân giống loài lan này

Do vậy, đề tài “Ảnh hưởng của một số yếu tố lên quá trình sinh trưởng và phát triển

của lan Thạch hộc tía (Dendrobium officinale Kimura et Migo) nuôi cấy in vitro”

được thực hiện nhằm tìm ra môi trường và điều kiện nuôi cấy tối ưu cho sự sinh trưởng, phát triển và nhân nhanh giống lan Thạch hộc tía trong thời gian ngắn cho chất lượng tốt với chi phí thấp

Nội dung nghiên cứu:

Khảo sát ảnh hưởng của các môi trường khoáng khác nhau lên sự sinh trưởng và

phát triển của chồi lan Thạch hộc tía in vitro

Khảo sát ảnh hưởng của loại và nồng độ cytokinin và chất hữu cơ lên sự sinh

trưởng, phát triển và nhân nhanh chồi lan Thạch hộc tía in vitro

Khảo sát ảnh hưởng của auxin kết hợp với điều kiện nuôi cấy lên quá trình ra rễ và

tạo cây hoàn chình lan Thạch hộc tía in vitro

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về lan Thạch hộc tía (Dendrobium officinale Kimura et Migo)

Chi lan Dendrobium được đặt tên vào năm 1979 Chữ Dendrobium có nguồn gốc từ

Hy Lạp Dendro có nghĩa là cây gỗ, cây lớn; bio là sự sống, vì tất cả các loài của chi

Dendrobium đều là khí sinh sống bám trên thân gỗ

Dendrobium tên tiếng Việt còn gọi là Hoàng thảo, là chi lớn nhất trong họ Lan

Theo Takhajan (1966), chi Hoàng thảo trên thế giới có khoảng 1.400 loài, chủ yếu phân

bố ở lục địa Đông Nam Á và các đảo thuộc Philippine, Malaysia, Indonesia, Đông Bắc Australia Ở Việt Nam có khoảng 107 loài thuộc chi lan này được phát hiện phân bố chủ yếu ở vùng núi từ Bắc vào Nam và trên một số đảo ven biển (Đào Thanh Vân, Đặng Thị

Tố Nga, 2008)

Lan Dendrobium officinale Kimura et Migo (Thạch hộc thiết bì) được biết đến từ rất

lâu như là một giống lan quý để sử dụng làm thuốc và thực phẩm chức năng đang được thương mại hóa rộng rãi trên thế giới Thạch hộc thiết bì có tên khác là Thạch hộc tía, Thạch hộc rỉ sắt thường sinh trưởng ở các vách đá, khe đá, hoặc phụ sinh trên cây cổ thụ,

ở vùng núi đá cao, nhiệt đới, á nhiệt đới, độ cao từ 800 - 1.000 m Vỏ thân và biểu bì phiến lá có màu rỉ sắt hoặc đốm tím nên đặt tên là “Thạch hộc rỉ sắt”

1.1.1 Phân loại thực vật

1.1.2 Phân bố

Phân bố tự nhiên chủ yếu ở vùng rừng có độ cao 1.000 - 3.400 m so với mực nước biển, phụ sinh vào cây gỗ hoặc vách đá có mọc rêu dưới tán rừng Thường tập trung sống

ở phần dốc núi râm mát, độ ẩm cao hoặc vách núi đá Lan Thạch hộc tía phân bố ở Việt Nam, Lào, Trung Quốc, Myanmar và nhiều nước nhiệt đới và cận nhiệt đới khác

1.1.3 Đặc điểm hình thái

Thân: Chi lan Hoàng thảo gồm các cây thân thảo mọc cụm, thẳng đứng hoặc rủ thõng xuống, phân đốt, sống phụ sinh trên các cây gỗ hoặc số ít các loài sống bám trên đá, trong rừng ẩm Chi này thuộc nhóm đa thân với nhiều giả hành, vừa có thân thật, vừa có giả hành Giả hành tuy là thân nhưng lại chứa diệp lục, dự trữ nước và nhiều chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển giả hành mới Đa số các củ giả hành có màu xanh nên

nó có thể cùng với lá làm nhiệm vụ quang hợp (Trần Hợp, 1998) Thân của các đại diện chi Hoàng thảo đều phân đốt, hình trụ, hình con suốt, hình chùy, có chiều dài từ 2 - 3

cm đến 120 cm Lát cắt ngang thân có thể là hình tròn, bầu dục, đôi khi hình 4 cạnh kích thước thay đổi từ 0,3 - 1,5 cm Phần gốc, nơi xuất phát của rễ thường nhỏ, mảnh nhưng cũng có thể phình to (Dương Đức Huyến, 2007) Thạch hộc tía có thân hơi dẹp, có rãnh dọc, phía trên hơi dày hơn, có đốt dài 2,5 - 3,0 cm, có vân dọc Thân lan Thạch hộc tía có màu tía, thân các Thạch hộc khác có màu xanh

Rễ: Rễ của các đại diện chi Hoàng thảo nói chung và Thạch hộc tía nói riêng là rễ khí sinh, mảnh, hình trụ, màu xanh và chuyển thành nâu khi già, chúng thường ôm lấy giá thể hoặc buông thõng xuống Ở một số loài được bao bọc bởi lớp mô hút ẩm dày bao gồm

cả những lớp tế bào chết chứa đầy không khí do đó có ánh lên màu xám bạc Chiều dài rễ

từ 1 - 3 cm; rễ thường mọc từ phần gốc của thân hoặc từ mấu thân ở một vài loài

Lá: Lá mọc thành hai dãy so le nhau, không có cuống mà chỉ có bẹ ôm thân, ít khi không có bẹ Lá thường hình mác, bầu dục, đôi khi hình kiếm, hình thuôn hoặc ít khi lá hình thoi dài (Averyanov, 2004) Thạch hộc tía có lá mọc so le thành dây đều hai bên thân, thuôn dài, hầu như không cuống, đầu lá hơi cuộn hình móng, có 5 gân dọc, dài 12

cm, rộng 2 - 3 cm

Cụm hoa: Chi Hoàng thảo nói chung và Thạch hộc tía nói riêng thường là nhiều hoa, đôi khi ít hoa hoặc hoa đơn độc Cụm hoa dài thường rủ thỏng xuống, nhiều loài có cụm hoa đẹp có giá trị làm cảnh (Trần Hợp, 1998)

Hoa: Hoa lưỡng tính, đối xứng hai bên Màu sắc đa dạng, sặc sỡ, đa số có hương thơm Bao hoa chia thành hai vòng, vòng ngoài gồm một lá đài giữa và hai lá đài bên, vòng trong gồm có hai cánh hoa và một cánh môi (Dương Đức Huyến, 2007) Hoa của Thạch hộc tía to, màu vàng, mọc thành chùm trên những cuống dài, mang 2 - 4 cánh hoa

có cánh môi hình bầu dục, nhọn, dài 4 - 5 cm cuốn thành phễu trong hoa, ở họng hoa có những điểm màu tía Mùa hoa vào tháng 2 - 4 hàng năm

Quả: Thường hình chùy hoặc hình con suốt, chứa rất nhiều hạt nằm xen lẫn những sợi lông mảnh Hạt rất nhỏ, hầu như không có trọng lượng, bao quanh hạt là lớp màng dạng mắt võng, trong suốt, chứa đầy không khí, dễ dàng bay cùng hạt trong không khí nhờ gió (Dương Đức Huyến, 2007) Riêng đối với Thạch hộc tía, quả nang hơi hình thoi, khi khô tự mở Hạt rất nhiều và nhỏ như bụi phấn Mùa quả vào tháng 4 - 6 hàng năm

1.1.4 Đặc điểm sinh thái

Nhiệt độ: Nhiệt độ ảnh hưởng nhiều đến sự tăng trưởng, phát triển của lan

Dendrobium thông qua con đường quang hợp và hoạt động trao đổi chất

Lan Dendrobium thuộc loại cây ưa nóng, sinh trưởng tốt ở nhiệt độ 24 - 33°C Dưới 12°C

và trên 37°C đều làm chậm và ảnh hưởng đến sự ra hoa của cây Đặc biệt với loài Thạch hộc tía, nhiệt độ từ 12 - 18°C cây sinh trưởng và phát triển tốt

Độ ẩm: Độ ẩm thích hợp giúp cho cây phát triển nhanh hơn, hoa tươi và lâu tàn Chi

Dendrobium cũng như đa số các giống lan khác chỉ phát triển tốt trong điều kiện không

khí ẩm nhưng thoáng khí, vào ban ngày cây cần độ ẩm khoảng từ 40 - 60%, vào ban đêm

độ ẩm từ 60 - 90% giúp cây phát triển tốt hơn Trong điều kiện môi trường tự nhiên, Thạch hộc tía sống ở độ ẩm 70% Loại giá thể quá ẩm và úng sẽ là điều kiện bất lợi cho

sự sinh trưởng của chi Dendrobium vì có thể làm thối toàn bộ rễ và biểu hiện là cây con

mọc từ phần ngọn của thân

1.1.5 Giá trị sử dụng

Ngoài tác dụng làm cảnh, một số loài trong chi Dendrobium cũng là một vị thuốc dân gian cổ truyền như D nobile, D moniliforme, D officinale, D chrysanthum (Đỗ Huy Bích et al., 2004)

Dendrobium officinale đứng đầu trong sách Thần Nông, công trình dược học đầu

tiên của Trung Hoa cổ đại về các cây thuốc quý, được coi là loại đứng đầu trong chín loại tiên dược trong kinh điển Đạo gia từ 1000 năm trước Theo Dược điển Trung Quốc thì

trong D officinale có dendrobium polysaccharides (23%), alkaloid (0,02 - 0,04%), amino

acid (135 mg/g cây khô), nhiều kim loại như sắt (292 mcg/g), kẽm (12 mcg/g), mangan (52mcg/g), đồng (3,6 mcg/g) (Nguyễn Thanh Thuận, 2015)

Những nghiên cứu khoa học ghi nhận các chiết xuất từ D officinale và các

polysaccharide trong cây giúp cải thiện và tăng cường sức đề kháng của tế bào khi thử trên chuột Nghiên cứu của Liu (2011) cho thấy, khi cho chuột uống dịch chiết và các

polysaccharide thô từ D officinale giúp tăng cường đáng kể khả năng miễn dịch tế bào và

miễn dịch không đặc hiệu ở chuột, tăng sản sinh interferon-gamma ở lách

Dịch chiết từ D officinale có hoạt tính làm hạ đường huyết khi thử trên chuột bị gây

tăng đường trong máu bằng adrenaline và streptozotocin bằng cách tác động kích thích sự bài tiết insuline từ tế bào β, đồng thời ngăn sự bài tiết glucagon từ tế bào α, ngoài ra còn làm giảm sự phân hủy của glycogen trong cơ thể, tăng tổng hợp glycogene trong gan (Wu

et al., 2004)

Ngoài ra, D officinale còn là một trong 5 loại dược thảo có chứa chrysotoxene, erianine và confusarine là những chất có hoạt tính diệt bào khi thử (in vivo và in vitro) trên nhiều dòng tế bào ung thư khác nhau (Yao et al., 2012)

Hình 1.1 Hình thái lan Thạch hộc tía ngoài tự nhiên

a Rễ lan Thạch hộc tía sống bám trên thân gỗ; b Rễ lan Thạch hộc tía sống bám trên đá; c Cụm hoa Thạch hộc tía mọc ở kẽ lá; d Cụm hoa Thạch hộc tía ngoài tự nhiên; e Thân, lá Thạch hộc tía; f Hoa Thạch hộc tía; g Quả Thạch hộc tía

1.2 Tình hình nghiên cứu về chi lan Dendrobium

1.2.1 Tình hình nghiên cứu về chi lan Dendrobium ở Việt Nam

800 chi được mô tả và 25.000 loài Hoa lan được đánh giá cao vì hoa đẹp, lâu tàn và sự đa

dạng đáng kinh ngạc về kích thước, hình dạng và màu sắc Chi Dendrobium là một nhóm

rất đa dạng được đại diện bởi hơn 1.100 loài trên thế giới và phân bố từ Đông Nam Á đến

New Guinea và Australia (Puchooa, 2004; Xu et al., 2006 )

Từ năm 1985 đến nay đã có vô số các viện nghiên cứu và các trường đại học như Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh Vật, Viện Sinh học Nhiệt đới, Viện Nghiên cứu Khoa

học Tây Nguyên, Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam, Đại học Lâm Nghiệp đã tập trung

nghiên cứu, điều tra, phân loại lưu giữ một số họ Phong lan Đối với chi lan Dendrobium,

Phan Kế Long và đồng tác giả (2007) đã nghiên cứu đặc điểm di truyền của loài

Dendrobium chapaense Aver (Orchidaceae) và quan hệ họ hàng với một số loài trong

chi Dendrobium ở Việt Nam Năm 2012, Vũ Thanh Sắc và đồng tác giả đã nhân giống in

vitro lan Hoàng thảo Trầm trắng (Dendrobium anosmum var alba) trên môi trường dinh

dưỡng bổ sung chất điều hòa sinh trưởng, chất hữu cơ và than hoạt tính (AC) thu được

cụm chồi phù hợp cho sự nhân nhanh và sinh trưởng cây con in vitro Cùng thời điểm

đấy, Nguyễn Thị Sơn và đồng tác giả đã công bố về việc nhân giống loài lan Hoàng thảo

Long nhãn (Dendrobium fimbriatum Hook) Ngoài ra, một loài trong chi lan Hoàng thảo (Dendrobium nobile Lindl) đã được nhân giống in vitro (Nguyễn Thị Lài et al., 2012)

Dendrobium nobile Lindl trồng trên hệ thống khí thủy canh ngoài vườn ươm cho khả

năng thích ứng đạt cao nhất, với tỷ lệ sống 100% sau 1 tháng trồng ở các vụ xuân, xuân -

hè, và vụ hè (Trần Thế Mai et al., 2012)

1.2.2 Tình hình nghiên cứu về chi lan Dendrobium trên thế giới

Dendrobium có một vị trí đặc biệt trong họ Phong lan Điều này được chứng minh

bằng số lượng và sự đa dạng của các ứng dụng công nghệ sinh học Trên thế giới đã có rất

nhiều công bố khoa học về chi lan Dendrobium

Năm 2005, Martin và đồng tác giả đã thực hiện quy trình nhân giống in vitro quy mô lớn cho giống lai Dendrobium Sonia 17 và 28, hai giống hoa thương mại được đánh giá

cao thông qua sự nhân lên vô tính nhanh chóng bằng cách tạo ra các cơ quan giống như protocorm (PLBs) và sự chuyển đổi của nó thành chồi Tỷ lệ sống sót của các cây con của

hai giống lai sau khi nhân giống đạt hơn 80% (Martin et al., 2005)

Chồi nách của lan Dendrobium nobile var Emma trắng được tăng sinh bằng phương

pháp phytotechnology (O753) có bổ sung BAP và KIN cũng như nước dừa với tỷ lệ khác nhau cho số lượng chồi tối đa, cũng như khối lượng tươi và khô cao thu được ở 2 mg/l BAP, trong khi 1,5 mg/l của KIN thể hiện chiều dài chồi cao nhất (4,18 cm) Nồng độ cao

hơn của BAP, KIN (3,0 mg/l) và nước dừa (300 ml) gây vàng, hoại tử lá và tăng trưởng

kém (Asghar et al., 2011)

Năm 2013, Hossain tiến hành nhân nhanh giống lan Hạc vĩ (Dendrobium aphyllum) bằng hạt và cho ra hoa in vitro Trước đó, cũng có rất nhiều nhà khoa học nghiên cứu và đánh giá khả năng phát triển của hạt giống Dendrobium đã được bảo quản lạnh trước đó (Gadiano et al., 2014); gần đây nhất Xu và đồng tác giả (2014) đã tìm ra được hai loài lan mới thuộc chi lan này Dendrobium là chi lan được sử dụng thường xuyên nhất để nghiên cứu quá trình ra hoa trong ống nghiệm Để rút ngắn chu kỳ sinh sản của Dendrobium, kết quả nghiên cứu của Wang và đồng tác giả (2014) cho thấy, cây in vitro có hạt giống bình

thường trong cây chiếm 30% tổng số hoa khi được thụ phấn so với cây trồng ngoài tự

nhiên, thời gian trưởng thành của quả in vitro giảm đáng kể (120 ngày còn 60 ngày) Bên

cạnh đó, sự nảy mầm của hạt giống và phát triển cây giống diễn ra bình thường

Biến đổi gen cũng là một trong những thành tựu đáng ghi nhận của các loài lan Dendrobium Điển hình, bằng phương pháp chuyển gen, Teixeira (2016) đã biến đổi

thành công màu sắc hoa Dendrobium

1.3 Tình hình nghiên cứu về lan Thạch hộc tía (Dendrobium officinale Kimura et

Migo)

Dendrobium officinale Kimura et Migo (Thạch hộc tía) là một trong những loài lan

quý hiếm, các tác dụng dược liệu khác nhau được sử dụng làm thuốc và thực phẩm chức năng chữa bệnh tiểu đường và các bệnh nan y đang được thương mại hóa rộng rãi trên thế giới, đặc biệt là trong y học cổ truyền Trung Quốc và các nước khác ở phía Nam và Đông Nam Á Trong những năm gần đây, lợi ích thu được dựa trên tính dược lý dân gian và

những khám phá về thành phần hoạt tính sinh học của Dendrobium officinale đã tăng lên

đáng kể Công nghệ nhân giống phát triển nhanh chóng với nhiều thành tựu lớn trong nhân giống các loài lan, các nghiên cứu đã có những bức tiến nhất định Nguyễn Thị Sơn

và đồng tác giả (2014) đã nhân giống vô tính thông qua đoạn thân mang hai mắt ngủ trên môi trường MS có chứa 20 g/l sucrose, 10% nước dừa, 0,5 mg/l BA, 0,5 mg/l NAA và 6 g/l agar, đây là môi trường thích hợp để chiều cao chồi, số lượng chồi và số lá tốt nhất, lá

có màu xanh đậm, mập Cùng thời điểm này, Qian và đồng tác giả đã tạo được mô sẹo và tái sinh chồi lan Thạch hộc tía từ đỉnh chồi trên môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/l BA

và 0,5 mg/l NAA Dịch chiết nước của lan Thạch hộc tía được thí nghiệm trên mô hình động vật (chuột) có thể gây ra các tác dụng bảo vệ tim mạch tiềm năng chống lại thiếu máu cục bộ cơ tim, bảo vệ gan chống lại những tổn thương gây độc hại; những hiệu ứng

này có thể liên quan đến hoạt động chống oxy hóa và chống viêm (Dou et al., 2016; Han

et al., 2016)

1.4 Phương pháp nuôi cấy chồi và tạo cây hoàn chỉnh in vitro

Một phương thức nhân giống hiệu quả trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật là nuôi cấy chồi (chồi đỉnh và chồi bên) Sau khi vô trùng, mẫu sẽ được nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng chứa đầy đủ khoáng vô cơ, hữu cơ hoặc bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thích hợp Từ một chồi sau thời gian nuôi cấy nhất định sẽ phát sinh thành nhiều chồi Chồi tiếp tục vươn thân, ra lá và rễ để trở thành cây hoàn chỉnh

Vào năm 1946, Lon và Ball đã khởi đầu nuôi cấy mô và cơ quan tách rời bằng thí

nghiệm nuôi cấy đỉnh chồi măng tây Asparagus officinalis Sau đó, vào năm 1977,

Welander đã nhân giống từ mẫu cấy là chồi đỉnh trên môi trường Welander (1974) có bổ sung 0,1 mg/l NAA và 0,05 mg/l BA (Welander, 1974)

Trong phương pháp nhân chồi bên, chồi bên thường được tách ra từ nách lá phát triển dưới ảnh hưởng của cytokinin với nồng độ cao Vai trò của cytokinin lúc này là hạn chế tính ưu thế ngọn để các chồi bên có thể phát triển Các chồi bên này được tiếp tục chuyển sang môi trường có cytokinin thì các chồi bên mới tiếp tục được tạo ra, sau đó, các chồi này được chuyển sang môi trường ra rễ và được đưa ra ngoài vườm ươm khi đã

có rễ hoàn chỉnh Phương pháp này có ý nghĩa rất quan trọng trong thực tế vì nó đơn giản hơn so với các phương pháp nhân giống khác, tốc độ nhân giống cao, sản phẩm ổn định

về mặt di truyền và cây con tăng trưởng rất tốt, có lẽ do được trẻ hóa Phương pháp nhân giống bằng chồi bên đầu tiên được áp dụng cho cây cẩm chướng, sau đó là cây đồng tiền

Hiện nay, phương pháp nhân giống in vitro được áp dụng cho nhiều loài thực vật và phổ

biến ở các cây ăn trái (Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thủy Tiên, 2002)

1.5 Vai trò của chất điều hòa sinh trưởng

1.5.1 Auxin

Went (1926, 1928) đã khám phá ra auxin và phát hiện sau đó là IAA vào năm 1934 (Went, Thimann, 1937; Haagen-Smit, 1951) Từ đó, IAA đã mở đường cho những thành công ban đầu trong nuôi cấy mô (Gautheret, 1983, 1985)

Auxin gồm có hai loại là auxin có nguồn gốc nội sinh được tổng hợp bởi thực vật và auxin tổng hợp do con người tạo ra Các loại auxin thông dụng thường dùng là: IAA, IBA, NAA và 2,4-D

Auxin can thiệp vào nhiều hiện tượng sinh lý, hoạt động của nó tùy thuộc vào nồng

độ và sự kết hợp của chúng với các chất điều hòa sinh trưởng khác Auxin tác động lên sự kéo dài tế bào Hệ quả này tạo sự tiếp nối cho sự gia tăng tính đàn hồi của thành tế bào và

sự xâm nhập của nước vào trong tế bào; sự đề kháng của thành tế bào giảm đi và tế bào được kéo dài ra Auxin còn làm thay đổi tính thẩm thấu của màng tế bào, sự thay đổi này

chia tế bào một cách đặc biệt trong quá trình hình thành mô sẹo và sự hình thành rễ bất định; ức chế sự phát triển của chồi nách và sự hình thành phôi soma trong môi trường nuôi cấy mô sẹo

Tất cả các cây trồng đều tổng hợp auxin tùy theo từng giai đoạn phát triển của chúng Auxin được tổng hợp ở các lá non, trong các chồi đang hoạt động, ở phát hoa và ở trên các quả còn non Tác động thúc đẩy hay ức chế sự nở hoa của auxin lên cây thuốc lá phụ thuộc vào nồng độ Nồng độ vừa phải của IAA (3,0 - 10,3 M) làm giảm tỉ lệ chồi sinh dưỡng, trong khi đó ở các nồng độ cao ức chế toàn bộ sự hình thành chồi (Wardell và Skoog, 1969)

1.5.2 Cytokinin

Cytokinin là hợp chất của adenine được thay thế, chất này được biết đến qua hai nhóm nội sinh là: Zeatin và IPA Miller tìm thấy KIN (6-furfurylaminopurin) trong DNA của tinh trùng cá trích thanh trùng được lưu trữ lạnh trong thời gian dài và định danh

Được gọi là KIN bởi nó có khả năng kích thích sự phân chia tế bào hay sự phân bào trong

mô thuốc lá Cytokinin đầu tiên được phân lập từ hạt bắp non, được gọi là zeatin hydroxy-3-methyl-trans-2-butenyl-amino) purine) Cytokinin được tìm thấy ở hầu hết thực vật bậc cao, rêu, nấm ký sinh và không ký sinh Có hai loại cytokinin được sử dụng nhiều nhất cho môi trường nuôi cấy lan là KIN và BA (Lê Văn Hoàng, 2008) Ngoài ra, TDZ cũng là một chất điều hòa sinh trưởng mạnh được xếp vào nhóm cytokinin, nhưng

(6-(4-nó có thể thay thế đồng thời cả cytokinin và auxin để kích thích quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô

Vai trò chính của cytokinin trong cây là giúp phân chia tế bào, bởi cytokinin có khả năng kích thích sự tổng hợp enzyme RuBisCo (Ribulozo-1,5-biphotphate cacboxylase/oxygenase), làm tăng hoạt tính ARN - polymarase và thiết lập các

polyribosome nên làm tăng quá trình chuyển hóa acid nucleic và protein (Vũ Văn Vụ et

al., 2001)

Cytokinin giúp cho sự nảy mầm, mở rộng tế bào và cơ quan, kích thích sự mở rộng

tế bào ở trục hạ diệp được cắt từ cây củ cải, bí đỏ, cây lanh và nhiều cây song tử diệp khác Sự mở rộng của tế bào là do sự hấp thu nước gây ra, làm giảm thế năng thẩm thấu của tế bào được kích thích bởi sự biến đổi trở lại của lipid dự trữ trong trục hạ diệp thành đường khử (glucose và fructose)

Cytokinin có thể kích thích hoặc ức chế sự khởi đầu và phát triển của rễ tùy theo nồng độ và thời gian xử lý KIN có thể kích thích sự tăng trọng lượng khô và sự vươn dài của rễ cây đậu lupin con, trái lại hai yếu tố trên bị ức chế ở nồng độ KIN cao Khi KIN được xử lý lên rễ ở nồng độ thấp nó kích thích quang hợp và sinh trưởng Tuy nhiên, nếu

rễ tiếp xúc với KIN ở nồng độ cao trong hai ngày thì sự sinh trưởng và phát triển của rễ sẽ giảm rõ rệt

Cytokinin có khả năng kích thích chồi bên và đặc biệt vượt qua ảnh hưởng của ưu thế ngọn Ưu thế ngọn được điều khiển bởi sự cân bằng giữa mức độ cytokinin và auxin nội sinh Có hai giả thuyết về mối quan hệ của cytokinin lên ưu thế ngọn Giả thuyết thứ nhất cho rằng, cytokinin có thể ức chế enzyme IAA oxidase trong chồi bên, cho phép tích

lũy auxin và gây ra sự vươn dài của chồi bên Giả thuyết thứ hai thì cho rằng, cytokinin khởi đầu cho cơ chế liên quan đến sức chứa của chồi bên bằng cách kích thích vận chuyển dinh dưỡng, vitamin, chất khoáng và những chất sinh trưởng khác tác động lên sự sinh trưởng và phát triển (Nguyễn Minh Chơn, 2004) Điều này được chứng minh ở cây Bạch Đàn khi được nuôi cấy trên môi trường có bổ sung TDZ thì TDZ có khả năng kích thích

cây tạo chồi bên (Chen et al., 1995) Tuy nhiên, TDZ cũng gây khó khăn trong việc kéo

dài và tạo chồi tái sinh ở nồng độ rất cao Các chồi được nuôi cấy trên môi trường có bổ sung TDZ với nồng độ cao thường có hình thái ngắn (Meyer, Van, 1988; Te - Chato, Lim, 1999)

Cytokinin có thể giúp làm giảm quá trình lão hóa khi tách lá ra khỏi thân cây và hoạt động như là chất thay thế cho sự cần thiết của rễ để làm giảm lão hóa Cytokinin cũng có khả năng thay thế ảnh hưởng của ánh sáng và làm giảm sự lão hóa bằng cách duy trì nguyên vẹn màng tonoplast (màng bán thấm bao quanh không bào) KIN có khả năng kích thích sự vận chuyển của các chất hữu cơ trong lá đã cắt và giữ trong tối Khả năng của cytokinin kích thích sự vận chuyển dinh dưỡng và tạo ra sức chứa đã được biết trên nhiều loài

Ngoài ra, cytokinin còn có chức năng làm tăng diện tích phiến lá, làm tăng sự mở của khí khổng ở một số loài, tạo chồi bất định ở nồng độ cao (Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thủy Tiên, 2003)

1.6 Vai trò của các chất hữu cơ

Nước dừa đã được sử dụng để kích thích phân hóa và nhân nhanh chồi ở nhiều loài cây Nước dừa thường được lấy từ quả của các giống chọn lọc để sử dụng tươi hoặc qua

bảo quản Nước dừa được một số công ty hoá chất bán dưới dạng đóng chai sau chế biến

và bảo quản Thông thường, nước dừa được xử lý để loại trừ các protein, sau đó được lọc qua màng lọc để khử trùng trước khi bảo quản lạnh Tồn dư protein trong nước dừa không gây ảnh hưởng đến sinh trưởng của mô hoặc tế bào nuôi cấy, nhưng có thể dẫn tới kết tủa dung dịch khi bảo quản lạnh Chất cặn có thể được lọc bỏ hoặc để lắng dưới đáy bình rồi gạn bỏ phần cặn Nước dừa thường được sử dụng ở nồng độ từ 5 đến 20% (v/v) Chồi lan Vân hài sẽ sinh trưởng tốt trên môi trường SH bổ sung thêm 200 ml/l nước dừa (Vũ Quốc

Luận et al., 2014) Tuy nhiên, theo nghiên cứu của Abdullahil và đồng tác giả (2011)

nhận thấy khi hàm lượng nước dừa cao sẽ làm giảm sự tăng trưởng và gây ra sự bất thường về hình thái của chồi Do vậy, việc khảo sát hàm lượng nước dừa bổ sung vào môi trường nuôi cấy cho từng loài là cần thiết

1.6.2 Bột khoai tây

Khoai tây có chứa các vitamin, khoáng chất và một số các hợp chất như carotenoic

và phenol tự nhiên Acid chlorgenic cấu thành đến 90% của phenol trong khoai tây Trong một củ khoai tây còn vỏ có khối lượng trung bình 150 g, có chứa 27 mg vitamin C, 620

mg kali, 0,2 mg vitamin B6 và một lượng rất nhỏ thiamin, riboflavin, folate, niacin, magie, photpho, sắt và kẽm

Mohamed và đồng tác giả (2010) sử dụng bột khoai tây như một chất làm đông thay cho agar, khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy 50 hoặc 60 g/l bột khoai tây + 1 g/l agar đã

làm tăng số lượng chồi/mẫu cao nhất (6,8 chồi) trên đối tượng khoai tây (Solanum

tuberosum) Khi bổ sung 60 g/l bột khoai tây vào môi trường nuôi cấy đã làm pH môi

trường giảm đáng kể sau 4 tuần nuôi cấy (từ 5,31 xuống 4,0) so với môi trường đối chứng

có bổ sung 7 g/l agar (giảm xuống 4,93) Khoai tây cũng ảnh hưởng đến quá trình phát triển của lan Vân hài, khi tăng hàm lượng bột khoai tây từ 50 đến 200 g/l thì có sự gia tăng rõ rệt về các chỉ tiêu theo dõi và đạt cao nhất ở nghiệm thức có bổ sung 200 g/l bột khoai tây, khối lượng tươi đạt 1,65 g/chồi, số lá đạt 5,50 lá/chồi và chiều dài lá đạt 5,45

cm (Vũ Quốc Luận et al., 2014)

1.6.3 Bột chuối

Bột chuối có hàm lượng fructose, glucose và nitrate cao, khi được bổ sung vào môi trường nuôi cấy làm tăng hàm lượng đường cũng như hàm lượng khoáng của môi trường

(Aktar et al., 2008) Tác dụng kích thích hiệu quả của bột chuối là do khả năng ổn định

pH của môi trường nuôi cấy (Pierik et al., 1998) Chuối được bổ sung vào môi trường như

là một chất kháng acid và trung hòa nồng độ acid

Tương tác của các môi trường khác nhau và các chất phụ gia hữu cơ cho thấy, những ảnh hưởng đáng kể đến sự tăng trưởng và phát triển của protocorm-like bodis

(PLBs) và tái sinh cây Dendrobium trong điều kiện phòng thí nghiệm Các chồi dài nhất

được tìm thấy trong môi trường Knudson C (KS) với bột chuối Sabri và lá dài nhất đã

được tìm thấy trong cả hai môi trường KS và MS với bột chuối Sabri (Aktar et al., 2008)

1.6.4 Peptone

Peptone thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy ở rất nhiều đối tượng cây trồng, chúng được sử dụng như là một nguồn carbon và nitơ trong nuôi cấy mô thực vật

và thúc đẩy sự tăng trưởng của mẫu cấy (Chen et al., 2002) Vai trò của peptone là yếu tố

tăng cường sự sinh trưởng và phát triển của các mô thực vật Khi bổ sung peptone vào môi trường nuôi cấy, chức năng của peptone như một elicitor kích thích hình thành rễ tơ

của nhân sâm (Sivakumar et al., 2005) Nhut và đồng tác giả (2008) đã bổ sung peptone

vào môi trường nuôi cấy chồi cây bơ và thu được kết quả tốt nhất khi thêm vào môi trường 2 g/l peptone Peptone làm tăng chiều cao chồi và tỷ lệ sống của lan Hài hồng

(Nguyễn Thị Cúc et al., 2014)

1.7 Than hoạt tính (Active Charcoal - AC)

Bổ sung AC vào trong môi trường nuôi cấy sẽ có lợi ích và có tác dụng khử độc Khi bổ sung AC vào môi trường nuôi cấy sẽ kích thích sự tăng trưởng và biệt hóa Phong lan, Hành, Cà rốt, Cà chua, cây Thường xuân, nhưng lại có tác dụng ngược lại đối với Thuốc lá, Đậu nành, Trà mi AC nói chung ảnh hưởng trên 3 mặt: Hấp phụ các chất cặn, các hợp chất phenol, hấp phụ các chất điều hòa sinh trưởng hoặc làm đen môi trường Người ta cho rằng tác dụng ức chế sự tăng trưởng của mô cấy khi có sự hiện diện của AC trong môi trường là do nó hấp phụ chất điều hòa sinh trưởng có trong môi trường NAA,

KIN, IAA, BAP, IPA thường liên kết với AC trong môi trường nuôi cấy Khả năng kích thích sự tăng trưởng của AC có được nhờ khả năng kết hợp với các hợp chất phenol độc tiết ra trong thời gian nuôi cấy

AC thường được bổ sung vào môi trường với nồng độ 0,5 - 3% (w/v) Bổ sung AC vào môi trường nuôi cấy đã kích thích sinh trưởng và phân hóa ở các loài hoa lan, Cà rốt, cây Thường xuân và Cà chua Ngược lại, nó gây ức chế ở Thuốc lá, Đậu tương và các loài

thuộc chi Camellia Nói chung, AC được rửa acid và trung hòa trước khi bổ sung nó ở

nồng độ 0,5 - 3% vào môi trường nuôi cấy AC cũng giúp làm giảm độc tố bằng cách đào thải các hợp chất độc (như phenol) được tạo ra trong quá trình nuôi cấy và cho phép tế bào sinh trưởng mà không bị trở ngại gì

1.8 Điều kiện thoáng khí

Bình nuôi cấy được thiết kế để ngăn chặn vi khuẩn nhưng lại hạn chế sự trao đổi khí giữa bên trong và bên ngoài bình nuôi cấy, từ đó ảnh hưởng đến các thành phần khí bên trong bình nuôi cấy Thông thường, việc đậy kín bình nuôi cấy không những ngăn ngừa

sự xâm nhiễm của vi khuẩn mà còn ngăn ngừa sự thoát hơi nước quá mức của mẫu cấy và môi trường, đồng thời, cũng gây tích lũy các khí và hơi nước quá mức làm ảnh hưởng đến

sự phát triển của mô và quá trình quang hợp của mẫu cấy Để hạn chế những khuyết điểm trên, các nhà nghiên cứu đã tiến hành nuôi cấy trong điều kiện thoáng khí, cây có khả

năng hình thành rễ thứ cấp ngay trong giai đoạn in vitro, điều này cải thiện tỷ lệ sống sót

của cây khi đưa ra vườm ươm Việc cải thiện chế độ thoáng khí trong bình nuôi cấy có thể đạt được thông qua việc sử dụng màng lọc thoáng khí được gắn lên các lỗ của bình để

bên trong các hệ thống nuôi cấy, thành phần khí trong bình sẽ dần thay đổi bằng với thành phần khí bên ngoài bình (Dương Tấn Nhựt, 2011)

Sự tăng trưởng của cây con nuôi cấy in vitro không chỉ phụ thuộc vào thành phần

dinh dưỡng mà còn phụ thuộc vào thành phần khí bên trong bình nuôi cấy (Ziv, 1991) Ở cây hoa cẩm chướng, nuôi cấy bằng bình thoáng khí đã làm giảm hiện tượng thủy tinh thể (Hoenecke, 1992; Jo, 2002) Kết quả nghiên cứu của Park và đồng tác giả (2004) cho

thấy, một lượng lớn các cây khoai tây bị thủy tinh thể khi nuôi cấy trong các bình bịt kín

trường MS có bổ sung 1 g/l AC khi chuyển ra điều kiện ex vitro có tỷ lệ sống sót rất cao (95%) (Nguyễn Thị Kim Yến et al., 2013) Cây Cúc (Chrysanthemum) khi nuôi cấy trong

làm cho các cây trong hộp thoáng khí có sự tăng trưởng cao hơn so với các cây trong hộp nhựa không thoáng khí (Hoàng Thanh Tùng, 2018)

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Nguồn mẫu

Chồi cây lan Thạch hộc tía (D officinale Kimura et Migo) thu nhận được tại Phòng

Sinh học Phân tử và Chọn tạo Giống cây trồng (Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên) được cấy chuyền nhiều lần để tạo những chồi có kích thước đồng đều được sử dụng làm vật liệu trong nghiên cứu này

Hóa chất: các chất khoáng đa lượng, khoáng vi lượng, vitamin, NAA, IBA, BA, TDZ, KIN

Chất hữu cơ: peptone (Himedia Laboratories), khoai tây thương phẩm (Solanum

tuberosum), chuối (Musa Rastali), nước dừa (Cocos nucifera)

2.1.3 Môi trường nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy MS (Murashige, Skoog, 1962), SH (Schenk, Hildebrandt, 1972), VW (Vacin, Went, 1949), KS (Knudson C, 1965), NN (Nitsch, Nitsch, 1969), B5 (Gamborg, 1968) bổ sung 30 g/l đường, 9,0 g/l agar và 1,0 g/l AC

Các chất điều hòa sinh trưởng gồm có BA, TDZ, KIN, IBA và NAA; các chất hữu

cơ gồm có peptone, khoai tây, chuối và nước dừa

Môi trường được điều chỉnh về pH 5,8 sau đó rót vào các bình 250 ml với thể tích là

40 ml và được đem đi hấp khử trùng ở 121°C, 1 atm trong 30 phút

2.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của môi trường khoáng khác nhau lên quá trình sinh trưởng và phát triển chồi lan Thạch hộc tía in vitro

Mục đích thí nghiệm: Tìm ra môi trường khoáng thích hợp cho khả năng sinh trưởng

và phát triển của lan Thạch hộc tía

Cách thực hiện: Các chồi đơn (cao khoảng 1 cm) được tách ra và nuôi cấy trên các môi trường khoáng MS, SH, B5, NN, VW, KS có bổ sung 0,5 mg/l BA và 0,5 mg/l NAA gồm 6 nghiệm thức (NT) để khảo sát khả năng sinh trưởng và phát triển của chồi lan Thạch hộc tía

Chỉ tiêu theo dõi: Số chồi/mẫu, chiều cao chồi (cm), hình thái chồi, khối lượng

2.2.2 Ảnh hưởng của cytokinin và chất hữu cơ lên khả năng nhân nhanh chồi lan Thạch hộc tía in vitro

2.2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của cytokinin kết hợp với 0,5 mg/l NAA lên quá trình sinh trưởng và nhân nhanh chồi lan Thạch hộc tía in vitro

Mục đích thí nghiệm: Tìm ra loại và nồng độ cytokinin kết hợp với 0,5 mg/l NAA phù hợp cho sự sinh trưởng và nhân nhanh của chồi lan Thạch hộc tía

Cách thực hiện: Các chồi đơn (cao khoảng 1 cm) được tách ra và nuôi cấy trên môi

trường SH có bổ sung NAA 0,5 mg/l (kế thừa từ Vũ Quốc Luận et al., 2015) kết hợp với

BA, KIN, TDZ ở các nồng độ 0,5; 1,0; 1,5 mg/l Bao gồm các NT như sau:

Nghiệm thức Loại và nồng độ cytokinin

Chỉ tiêu theo dõi: Số chồi/mẫu, chiều cao chồi (cm), khối lượng tươi/cụm (mg), khối

), hình thái chồi thu sau 3 tháng

2.2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của các chất hữu cơ bổ sung lên khả năng nhân nhanh chồi lan Thạch hộc tía in vitro

Mục đích thí nghiệm: Tìm ra loại và nồng độ chất hữu cơ có ảnh hưởng tích cực đến

quá trình sinh trưởng, phát triển và nhân nhanh chồi lan Thạch hộc tía

Cách thực hiện: Các chồi đơn (cao khoảng 1 cm) được tách ra và nuôi cấy trên môi

trường SH (kế thừa từ Vũ Quốc Luận et al., 2015) có bổ sung 0,5 mg/l NAA, 0,5 mg/l BA (kế thừa từ Nguyễn Thị Sơn et al., 2014) kết hợp với khoai tây/chuối/nước dừa/peptone

theo từng nồng độ khác nhau, gồm 13 nghiệm thức để khảo sát nhân nhanh chồi lan Thạch hộc tía

Nghiệm thức Loại và nồng độ chất hữu cơ

Nước dừa (ml/l) Khoai tây (g/l) Chuối (g/l) Peptone (mg/l)

Chỉ tiêu theo dõi: Số chồi/mẫu, chiều cao chồi (cm), khối lượng tươi/cụm (mg), khối

), hình thái chồi thu sau 3 tháng

2.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của IBA, NAA kết hợp với điều kiện nuôi cấy lên quá trình tạo cây hoàn chỉnh loài lan Thạch hộc tía in vitro

Mục đích thí nghiệm: Tìm ra điều kiện tốt nhất khi nuôi cấy (thoáng khí hay không thoáng khí) khi kết hợp với loại và nồng độ auxin (IBA, NAA) khác nhau cho quá trình hình thành rễ của chồi lan Thạch hộc tía

Cách thực hiện: Các chồi đơn (cao khoảng 1 cm) được tách ra và nuôi cấy trên môi

trường SH (kế thừa từ Vũ Quốc Luận et al., 2015) có bổ sung bổ sung IBA, NAA ở các

nồng độ 0,5; 1,0; 1,5 mg/l, kết hợp với nuôi cấy thoáng khí, gồm 14 nghiệm thức để khảo sát quá trình hình thành rễ của chồi lan Thạch hộc tía

Nghiệm thức Điều kiện nuôi cấy Loại và nồng độ auxin

Chỉ tiêu theo dõi: chiều cao chồi (cm), số rễ/mẫu, chiều dài rễ (cm), khối lượng

2.3 Điều kiện nuôi cấy

Các chồi sau khi cấy được nuôi trong phòng nuôi ở nhiệt độ 25°C; độ ẩm 60% Ở điều kiện chiếu sáng 16/8 giờ dưới ánh sáng đèn huỳnh quang với cường độ 45

2.5 Địa điểm và thời gian tiến hành thí nghiệm

Các thí nghiệm được tiến hành tại Phòng Sinh học Phân tử và Chọn tạo Giống cây trồng, Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên (116 Xô Viết Nghệ Tĩnh, Phường 7, Thành phố Đà Lạt, Tỉnh Lâm Đồng)

Thời gian thực hiện thí nghiệm từ 03/2018 - 06/2018

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của môi trường khoáng khác nhau lên quá trình sinh

trưởng và phát triển chồi lan Thạch hộc tía in vitro

Các loại môi trường khoáng được sử dụng để khảo sát trong thí nghiệm có sự khác nhau về hàm lượng khoáng đa lượng và vi lượng, bao gồm các môi trường giàu dinh dưỡng như môi trường MS, SH, và môi trường nghèo dinh dưỡng như KS, VW Kết quả thu nhận sau 3 tháng nuôi cấy cho thấy, các chỉ tiêu có sự khác biệt đáng kể về mặt thống

kê giữa các nghiệm thức có hàm lượng khoáng khác nhau (Bảng 3.1)

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của môi trường khoáng khác nhau lên quá trình sinh trưởng và phát

triển chồi lan Thạch hộc tía in vitro.

Chiều cao chồi TB (cm)

Khối lượng tươi TB/cụm (mg)

Khối lượng khô TB/cụm (mg)

Giá trị SPAD (mg/cm2)

* Những mẫu tự khác nhau (a, b, c …) được nêu trong cùng 1 cột biểu diễn sự khác nhau có ý nghĩa với α = 0,05 trong phép thử

Duncan

Môi trường MS có tổng thành phần khoáng đa lượng rất cao (4,748 g/l) so với môi trường SH nhưng không tối ưu cho chồi lan Thạch hộc tía phát triển, trong khi môi trường

SH có tổng thành phần vitamin cao (110,5 mg/l) lại phù hợp nhất cho các chồi lan này

Cụ thể, các chồi được nuôi cấy trên môi trường SH có sự sinh trưởng, phát triển cao hơn các chồi trên môi trường còn lại thể hiện ở các chỉ tiêu số chồi mới TB/mẫu (2,53), chiều dài chồi TB (3,07 cm), khối lượng tươi/cụm (320,33 mg), khối lượng khô (29,33 mg) và

giá trị SPAD (39,00 mg/cm2) Sự sinh trưởng và phát triển thể hiện rõ ở hình thái chồi với thân to, khỏe, phát triển đều; lá xanh đậm, dài (Hình 3.1) Ở nghiệm thức nuôi cấy trên

kể so với môi trường SH, những chỉ tiêu còn lại có sự chênh lệch (Bảng 3.1) Kết quả thu được cũng phù hợp với nghiên cứu của Vũ Quốc Luận và đồng tác giả (2012) đã chỉ ra

SH là môi trường tốt nhất cho sự sinh trưởng và phát triển của chồi lan Vân hài Môi trường VW và KS không thích hợp cho sự sinh trưởng của lan Thạch hộc tía, trên môi trường này có chồi thấp, lá nhỏ, khối lượng tươi thấp (Bảng 3.1, Hình 3.1) Kết quả này cũng tương tự với nghiên cứu của Nguyễn Thị Sơn và đồng tác giả (2014) cho thấy giữa hai môi trường VW và MS, chồi lan Thạch hộc tía phát triển tốt trên môi trường MS, số chồi/cụm và hệ số nhân chồi là cao nhất Trên môi trường NN và B5, kết quả nghiên cứu cho thấy cây con sinh trưởng không có sự khác biệt

Hình 3.1 Ảnh hưởng của các môi trường khoáng khác nhau lên sự sinh trưởng và phát triển chồi

lan Thạch hộc tía in vitro sau 3 tháng

Như vậy, trong nghiên cứu này, môi trường SH có bổ sung 0,5 mg/l NAA và 0,5 mg/l BA là môi trường tốt nhất cho sự sinh trưởng và phát triển chồi lan Thạch hộc tía

3.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của cytokinin và chất hữu cơ lên khả năng nhân

nhanh chồi lan Thạch hộc tía in vitro

3.2.1 Ảnh hưởng của cytokinin kết hợp với auxin lên quá trình sinh trưởng và nhân nhanh chồi lan Thạch hộc tía in vitro

Các cytokinin BA, KIN, TDZ được bổ sung riêng lẻ ở các nồng độ khác nhau vào môi trường nuôi cấy đều có khả năng kích thích chồi sinh trưởng, phát triển thể hiện ở các chỉ tiêu chồi, lá, và trọng lượng của chồi Tuy nhiên, tùy thuộc vào loại và nồng độ của chất điều hòa sinh trưởng, quá trình sinh trưởng và phát triển của chồi lan Thạch hộc tía

có sự khác biệt ở các nghiệm thức (Bảng 3.2)

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của cytokinin kết hợp với auxin lên quá trình sinh trưởng và nhân

nhanh chồi lan Thạch hộc tía in vitro

Chất điều hòa sinh

trưởng (mg/l)

Số chồi mới TB/

mẫu

Chiều cao chồi

TB (cm)

Khối lượng tươi TB/cụm (gam)

Khối lượng khô TB/cụm (gam)

Giá trị SPAD (mg/cm 2 )

lá xanh, dày, dài