hoa phan tich cong cung trong hoa hoc

- Nhấp chuột vào ô Configuge System- Chờ phần mềm khởi động đến khi xuất hiện màn hình thao tác - Vào File\New\Project - Nhấp chuột vào ô Next để tiếp tục - Chọn thông tin trong New proj

Bộ phận loại khí (Degaser): dùng để loại bỏ khí hòa tan trong pha động trước khipump vào cột

Hệ thông bơm mẫu (Injector): Injector là loại 6 điểm, khi valve ở vị trí load thì phađộng đi từ vị trí 1 qua vị trí 6 hay nói cách khác là pha động qua bơm đi vào cột.Khi valve ở vị trí inject thì pha động đi qua vị trí 1, 2, 5, 6 đồng thời đẩy mẫu đivào cột phân tích

Cột (Column): Cột pha đảo chứa pha tĩnh là các hạt silica đã được alkyl hóa cóchức năng lưu giữ các chất thích hơp nhờ đó sẽ có chất ra trước, ra sau

Đầu dò (Detector): Photodiode Array chức năng nhận tính hiệu khi các chất ra khỏicột

Bộ phận ghi nhận và xữ lý dữ liệu (Data processor) để nhận dữ liệu từ đầu dò vàlưu giữ ở máy chủ

Các bước vận hành HPLC:

1. Các bước vận hành

- Bật công tắc ở vị trí on cho pump 1525, máy HPLC, detector 2996, máy

vi tính

- Nhấp chuột vào biểu tượng Empower trên màn hình máy vi tính

- Nhập User name là “system” và password là “manager” Nhấn enter hoặc

<OK> để đăng nhập vào hệ thống

- Chờ phần mềm khởi động đến khi xuất hiện bảng chọn Empower pro

Để tạo một Configuge mới:

- Nhấp chuột vào ô Configuge System

- Chờ phần mềm khởi động đến khi xuất hiện màn hình thao tác

- Vào File\New\Project

- Nhấp chuột vào ô Next để tiếp tục

- Chọn thông tin trong New project Wizard - Tablespace thích hợp sau đónhấn Next

- Trong New Project Wizard – Option chọn Photo Diode Array, sau đónhấn Next để tiếp tục

- Trong New Project Wizard – Access Control chọn thông tin phù hợp, sau

- Theo các bước trên đã hoàn thành viện tạo một Project mới, tuy nhiên để

có thể chạy được mẫu (Run sample), hay định lượng định tính, Project đócần phải có Instrument Method và Develop Method

- Để thực hiện được, sau khi tạo Project, trở về màn hình chính

- Nhấp vào Run Sample

- Chọn Project và hệ thống thích hợp

- Nhấp vào <OK>

- Vào Edit thiết lập các thông số:

- Đặt các thông số cho bộ điều khiển nhiệt độ

- Đặt các thông số cho đầu dò 2996 (đối với chế độ UV-Vis thông thườngquét bước sóng cố định – 2D)

- Giá trị lambda tùy thuộc vào phương pháp đo (có thể chọn từ 190nm –800nm)

- Đặt các thông số cho đầu dò 2996 (chế độ quét khoảng bước sóng – 3D)

- Giá trị lambda quét tùy vào phương pháp đo (có thể chọn 190nm –800nm)

- Đặt các thông số cho pump 1525 (chế độ đẳng dòng Isocratic)

- Các giá trị cài đặt tùy thuộc vào phương pháp của bài thí nghiệm

- Đặt các thông số cho pump 1525 (chế độ Gradient dung môi)

- Các giá trị tùy thuộc vào phương pháp tại phòng thí nghiệm

- Lưu Instrument method vừa tạo

- Vào File\Save

- Đặt tên cần lưu vào ô Name để lưu Instrument vào project

- Tại màn hình như lúc trước tạo Instrument Method

- Vào File\New\Method Set

- Chọn Instrument tương ứng trong ô Instrument Method

- Vào File\Save\<Tên Method Set>

- Nhấn Save

- Trong ô Instrument Method, chọn Instrument cần sử dụng

- Nhấp Monitor

- Chờ đến khi Base Line ổn định

- Nhấp vào biểu tượng Abort để chuẩn bị tiêm mẫu

- Chọn màn hình của Single

- Inject trên pump 1525 đang ở vị trí Load

- Load tối thiểu 3 lần thể tích loop (VD: Samle loop 20µL thì phải Loadmẫu ít nhất 60 µL)

- Sau đó nhấn Prepare tiêm mẫu vào và để nguyên vị trí kim tiêm trongInjector (quá trình tiêm chú ý bọt khí trong kim tiêm), lúc này valveInjector đang ở vị trí Load

- Bấm vào biểu tượng Inject đồng thời gạt valve từ vị trí Load sang vị tríInject (gạt valve sang phải)

- Chờ góc dưới màn hình xuất hiện dòng Injection running, di chuyểnvalve từ vị trí Inject sang vị trí Load (phải sang trái)

- Rữa kim tiêm

- Load dung môi rửa Loop Lưu ý: vị trí valve phải ở Load khi rửa

- Sau khi chạy xong mẫu, để xữ lý kết quả, ta thực hiện các thao tác:

- Trong giao diện Empower Pro, vào Browse Project

- Vào channels

- Chọn tất cả các mẫu cần tính toán

- Vào biểu tượng sắc ký đồ để Extract từ dạng 3D sang 2D

- Nhập bước sóng Extract

- Nhấp vào biểu tượng Extract

- Vào File\Save\Chromatogram để lưu mẫu sắc ký đồ cần Extract Tương

tự cho đến hết bảng mẫu

- TRỞ LẠI MÀN HÌNH CHANNELS

- Chọn sắc ký đồ dạng 2D của chuẩn có hàm lượng thấp nhất của đườngchuẩn

- Vào biểu tượng Review

- Click chuột chọn vào ô Use processing Method Wizard Tiếp tục theohướng dẫn ở các màn hình tiếp theo

- Có thể thay đổi Threshold để cắt diện tích chính xác

- Có thể thay đổi giá trị Start và End để cắt tất cả các Peak mong muốn

<Next>

- Có thể đặt giá trị Minimum Area hoặc Minimum Hight để loại nhữngpeck tạp không mong muốn <Next> để tiếp tục

- Đặt đơn vị tính vào ô

- <Next> để tiếp tục

- Đặt tên Processing Method

- <Finish> để tiếp tục

- Vào biểu tượng Processing method để đặt nồng độ chuẩn

- Vào Default Amount để đặt các mức nồng độ chuẩn

- Vào File\Save để hoàn thành việc tạo Processing Method

- Trong channels, chọn tất cả các mẫu cần phân tích Click chuột phải.Chọn Process…

- Chọn đúng Processing Method sử dụng để tính toán Click OK

- Vào Curver để chọn đường chuẩn cần in

- Click chuột phải Chọn Print…

- Chọn máy in Click OK

- Vào Results để chọn các mẫu cần in

- Click chuột phải Chọn Print…

- Chọn đúng Processing Method sử dụng lúc Process kết quả

- Chọn kiểu Reporting (default hoặc theo reporting tự tạo)

- Click OK

- Click OK để tiếp tục

- Click NEXT để tiếp tục

- Click FINISH để tiếp tục

- Click FINISH

Buổi chiều tìm hiểu về máy GC:

1. Cấu tạo máy GC

1.1 Nguồn cung cấp khí mang: có thể sử dụng bình chứa khí hoặc các thiết bị sinh

khí (thiết bị tách khí N2 từ không khí, thiết bị cung cấp khí H2 từ nước cất,…)

1.2 Lò cột: dùng để điều khiển nhiệt độ cột phân tích.

1.3 Bộ phận tiêm mẫu:

− Bộ phận tiêm mẫu dùng để đưa mẫu vào cột phân tích theo với thể tích bơm có thểthay đổi Khi đưa mẫu vào cột, có thể sử dụng chế độ chia dòng (split) và khôngchia dòng (splitless).

− Có 2 cách đưa mẫu vào cột: bằng tiêm mẫu thủ công và tiêm mẫu tự động(Autosamper – có hoặc không có bộ phận hóa hơi – headspace)

1.4 Cột phân tích

Có 2 loại cột: cột nhồi và cột mao quản

− Cột nhồi (packed column): pha tĩnh được nhồi vào trong cột, cột có đường kính 4mm và chiều dài 2-3m

2-− Cột mao quản (capillary): pha tĩnh được phủ mặt trong (bề dày 0.2-0.5m), cột cóđường kính trong 0.1-0.5mm và chiều dài 30-100m

1.5 Đầu dò

Đầu dò dùng phát hiện tín hiệu để định tính và định lượng các chất cần phântích Có nhiều loại đầu dò khác nhau tùy theo mục đích phân tích như đầu dò ionhóa ngọn lửa (FID – Flame Ioniation Detector), đầu dò dẫn nhiệt (TCD – ThermalConductivity Detector), đầu dò cộng kết điện tử (ECD – Electron captureDetector), đầu dò quang hóa ngọn lửa (FPD – Flame Photometric Detector), đầu dòNPD (NPD – Nitrogen Phospho Detector), đầu dò khối phổ (MS – MassSpectrometry)

1.6 Bộ phận khuếch đại tín hiệu do đầu dò phát hiện

1.7 In dữ liệu

Sau khi phân tích xong, dữ liệu sẽ được in ra qua máy in kết nối với máytính có cài phần mềm điều khiển

2 Các bước vận hành

2.1 Mở máy: Lần lượt như sau:

Chọn “Login” để vào màn hình chính của thiết bị.

Mở máy vi tính, click vào biểu tượng Total Chrom Navigator trên Desktop Xuất

hiện giao diện

2.1 Thao tác trên máy GC:

Từ màn hình chính, cài đặt các thông số như sau:

− Vào PSSI: để cài

• Nhiệt độ cho Injector: thường chọn 150 - 200.

• Carrier Gas (Nitrogen): thường chọn 2ml/min.

• Split (Ratio): thường chọn 25:1

− Vào oven: để cài chương trình nhiệt độ cho buồng đốt: thường dao động trong

khoảng 40 - 220

Vào A-FID: để cài

• Nhiệt độ cho detector FID: thường chọn 200-200

• Gas flow (ml/min): bao gồm Air và Hydrogen, tiến hành như sau:

− Vào Tool\Configuration\A-FID\

Air: 450m/min

H2: 45.0ml/min

Chọn OK\Close\

− Khi nhiệt độ FID nằm trong khoảng 150-220, Khí Air và H 2 ổn định, có thể tiến

hành đánh lửa bằng cách click vào biểu tượng Ignite, khi đó khí Air giảm về 0 sau

đó tăng lên dần và ổn định lại đồng thời nghe 1 tiếng bụp, và tín hiệu điện xuất

hiện gần 1mV, là đánh lửa thành công.

2.3 Chuẩn bị mẫu đo:

− Yêu cầu chung đối với chất cần lập đường chuẩn và chất nội chuẩn: phải có nhiệt

độ sôi dưới 250 và không bị phân hủy, là chất có độ tinh khiết cao ( khoảng trên

99%), peak phải rõ ràng, thời gian xuất hiện peak không quá ngắn ( trên 2.5 phút)

− Chọn chất nội chuẩn thích hợp cho chất cần lập đường chuẩn (mẫu) như sau: Phảitan tốt trong dung môi dùng để pha mẫu, không phản ứng với mẫu và có thời gianxuất hiện peak gần với thời gian xuất hiện peak của mẫu đo ( cách nhau khoảng 1-

2 phút là tốt nhất)

− Peak xuất hiện dung môi phải cách xa peak mẫu và nội chuẩn

− Pha mẫu với dung môi thích hợp theo nồng độ lần lượt là 1%, 2%, 3%, 4%, 5%

về thể tích và nồng độ xác định của chất nội chuẩn (1% về thể tích) Tùy theo độcao của peak xuất hiện mà chọn số lượng mẫu cũng như nồng độ thích hợp ( thôngthường chon khoảng 5 nồng độ khác nhau)

Chú ý: Nồng độ mẫu pha cần phải chính xác

2.4 Thao tác trên phần mềm Total Chrom Navigator:

− Chọn phương pháp đo: Chọn biểu tượng Method trên màn hình chính, sau đó chọn

Method thích hợp nhất cho mẫu cần đo

Có 2 cách để setup các điều kiện đo lên máy GC:

1. Chọn trực tiếp Biểu tượng setup trên màn hình chính và thực hiện các thao

tác trong bước kế tiếp

2. Từ cửa sổ Method Editor, chọn Setup và thực hiện các thao tác trong bước

kế

Trong cửa sổ Setup, thực hiện như sau:

Setup type: Method

Method: Mở đường dẫn đến method cần sử dụng

Raw file path: Mở đường dẫn đến vị trí cần lưu file raw

Result file path: Mở đường dẫn đến vị trí cần lưu file result

Base file name: Nhập tên mẫu cần đo, hoặc loại mẫu, kèm theo ngày tháng,… Chọn Vial list: mở của sổ Sequence cho phép nhập thông tin mẫu, GEN, số lượng

mẫu,…: nhập lần lượt theo thứ tự mẫu tăng dần theo nồng độ

Processing: chọn suppress processing

− Sau khi nhập xong, chọn OK.

− Chương trình sẽ kết nối với máy GC, khi kết nối thành công, ở góc phía trái trênmàn hình của máy GC sẽ xuất hiện chữ “External”, nếu không thành công, vẫnxuất hiện chữ “Method 5”

Chú ý: Cần nhớ chính xác tên file name và nơi chứa mẫu để dễ dàng cho việc

Calobration

2.5 Đo mẫu:

− Sau khi cài đặt điều kiện đo mẫu, thực hiện inject mẫu như sau:

− Dùng ống tiêm (loại 1l) rút khoảng 0.5l (tùy theo phương pháp và nồng độ mẫu),tránh để có bọt khí sexlamf sai lệch kết quả đo

− Đặt kim vào vị trí Inject, sau đó chọn biểu tượng Run trên màn hình máy GC

Màn hình Run xuất hiện, nhấn START, máy sẽ đếm ngược từ 5sec vè 0sec và nghe

- Từ màn hình Total Chrom Navigator , nhấn nút Batch và mở các file cần

xử lý kết quả ( theo đúng đường dẫn đã cài đặt trong bước 5), click vào biểu

tượng Star , sau đó đóng lại.

- Cửa sổ Reprocess Result xuất hiện cùng với đồ thị của mẫu cần xem Máy

sẽ tự phân tích kết quả, có thể thao tác để sủa kết quả phân tích

- Muốn xem kết quả phân tích vào Display\Peak Report, màn hình sẽ xuất hiện bảng “TEST QUANTITATION REPORT” thể hiện toàn bộ kết quả

của toàn bộ peak có trên đồ thị

- Nhấn vào biểu tượng “  ” hoặc chữ : “RETURN” để quay về màn hình

chính của cửa sổ Reprocess Result.

- Sau khi xử lý có thể lưu lại kết quả bằng cách

vào File\Save: lưu chồng với kết quả máy đã phân tích hoặc

vào File\Save As: lưu với tên mới.

Chú ý: cần ghi lại thời gian xuất hiện của peak chính trong phổ để nhập trong phần

tạo Calibration curve

2.7 Calibration

- Từ của sổ Total Chrom Navigator Clarus 500, chọn biểu tượng Method, sau

đó chọn Method thích hợp cho mẫu cần tạo đường chuẩn, khi đó sẽ xuất

hiện cửa sổ Method Editor.

- Việc tạo Calibration curve sẽ thực hiện trong cửa sổ này.

- Trên thanh Menu chọn Components\New Component, màn hình sẽ xuất

hiện bảng Components

- Trên bảng này chọn Indentification Trên thẻ này cần nhập những thông tin

sau:

Trong khung

+ Component Type: click chọn Peak.

+ Name: nhập tên chất nội chuẩn.

+ Retention time: nhập thời gian xuất hiện Peak.

+ Absolute window: 3.00s

+ Relative window: 3%

- Click chọn “Find tallest peak in widow”

- Click chọn “This component is an internal satndard”

- Sau khi nhập xong thông tin về chất nội chuẩn, chọn New component để

+ Component Type: click chọn Peak.

+ Name: nhập tên chất nội chuẩn.

+ Retention time: nhập thời gian xuất hiện Peak.

+ Absolute window: 3.00s

+ Relative window: 3%

- Click chọn “Find tallest peak in widow”

- Click chọn “This component is a retention reference”

- Click chọn “ Internal standard” và chọn ten chất nội chuẩn vừa nhập.

- Sau khi nhập xong thông tin về chất cần xác định, chọn New component để

- Sau khi nhập xong chọn Apply để xác nhận thông tin vừa nhập.

- Tiếp theo, trên bảng Component, chọn thẻ Calibration, lần lượt nhập thông

tin cho từng chất theo thứ tự từ trên xuống trong khung xuất hiện tên chất.muốn chọn chất nào thìclick vào tên chất đó, đối với mỗi chất lần lượt nhậpcác thông tin trên thẻ như sau:

+ Calibration Type: Use Curve

+ Respone: Area

+ Curve fit type: 1 st Order

+ Saling: None

+ Purity (%): nhập độ tinh khiết thực cả chất

Trong khung dưới cùng cần nhập như sau:

No

123+ Cột Level: nhập ký hiệu theo nồng độ mẫu tăng dần.

+ Cột Amt: nhập chính xác nồng độ mẫu cho từng chất từ thấp đến cao

+ Cột Area (: sau khi Calibration mày sẽ tự Update số liệu đo được vào

- Màn hình xuất hiện bảng Manual Calibration, lần luột thực hiện theo trình tự

các level từ level 1 đến level cuối tương ứng với level(*) Ứng với mỗi level

ta thực hiện theo các bước sau:

- Level: chọn theo thứ tự một từ trên xuống tương ứng với level (*) và

nồng độ trong bảng trên

- Type: chọn Replace

- Selected File: click vào biểu tượng  để mở đường dẫn đến file kết quả

mẫu đã đo trong bước 6 và bước 7 Chọn filename tương ứng với nồng

độ mẫu và level(*) để thu được kết quả đúng

- Click Add để xác nhậ dữ liệu trong filename đó đúng với level đã chọn Lần

lượt thực hiện cho đến hết các level đã setup tron bảng trên level(*)

- Sau khi nhập xong tất cả các level, click OK Máy sẽ tự động lấy số liệu từ

các file tương ứng để lập đường cong chuẩn

Chú ý: phải thực hiện đúng thứ tự nồng độ mẫu tăng dần và đúng các level.

2.9 Xem kết quả sau khi Calibrated:

- Khi đó màn hình chính của cửa sổ Method Editor sẽ chia làm ba khu vực, như

- Giữa màn hình tương ứng là các thông tin về mẫu

- Muốn xem đường cong chuẩn của chất nào thì click vào tên chất đó (trong listbên trái màn hình) thì đường cong chuẩn và các thông tin về chất đó sẽ hiển thịtương ứng trên màn hình

2.10 Lưu phương pháp với đường cong chuẩn vừa tạo:

- Vào File\Save As

- Xuất hiện bảng Docmentation để nhập những thông tin cần thiết Chọn OK.

- Nhập tên file cho phương pháp vừa tạo và chọn vị trí lưu thích hợp

- Chọn Save để lưu.

2.11 In kết quả để lưu trữ:

- Muốn xem kết quả trước khi in vào File\Print Review report

- Muốn thay đổi mẫu báo cáo in vào File\New Report Format…, sau đó chọn

mẫu báo cáo muốn in

- Muốn in kết quả phân tích vào File\Print.

Chú ý: sau mỗi lần đo cần in một bản để lưu trữ

2.12 Tắt máy

- Cần lấy lại thao tác trên máy GC để thực hiện việc tắt máy, như sau:

- Trên màn hình Total Chrom Navigator, vào Run Release Control hoặc

- Trên máy GC vào Tools\Release\OK

- Khi đó trên góc trái màn hình GC xuất hiện chữ “Method 5” thay vì “External”

- Sau đó tiến hành tắt các thông số sau:

+ Vào PSSI: để tăt

• Nhiệt độ cho Injector: Heater off

+ Vào Oven: cài oven ở nhiệt độ 200oC trong khoảng 10 phút, sau đó để oven trở

về nhiệt độ phòng

+ Vào A-FID: để tắt

• Nhiệt độ cho detector FID: Heater off

• Gas flow (ml/min): bao gồm Air và Hydrogen, tiến hành như sau:

- Tắt công tắt trên máy GC

- Khoá các van khí Hydrogen, Nitrogen và xả khí trong Air pressure

- Tắt chương trình Total Chrom Navigator và Shut down máy vi tính.

Chú ý: Cần kiếm tra áp suất trong các bình khí để thay mới kịp thời.

Sau khi tắt máy, cần vệ sinh thiết bị

Tìm hiểu phương pháp định lượng Paracetamol và Cafein trong Panandol Extra500mg bằng HPLC chuẩn bị cho buổi tiếp theo làm

- Sắc ký bản mỏng là kỹ thuật phân bố rắn – lỏng, trong đó pha lỏng di độngđược cho đi trên một lớp mỏng chất hấp phụ được tráng lên một nền phẳngbằng vật liệu như thủy tinh, nhôm hoặc plastic Do chất hấp phụ được trángtrên một lớp mỏng nên có tên gọi chung là tấm bảng mỏng ( thin layer)

3.1 Chuẩn bị mẫu thuốc Panadol extra

- Cân viên thuốc, sau đó cạo sạch vỏ và cân lại:

- Khối lượng viên thuốc: 0.6953g

- Khối lượng viên thuốc sau khi cạo vỏ: 0.6821g

- Sau đó nghiền nhỏ cho đến khi viên thuốc thành bột mịn

- Pha bột thuốc với nước deion với nồng độ 1% bằng cách cân 0.5001g bộtthuốc, sau đó hòa tan vào 50mL nước deion, sau đó lọc với giấy lọc và sửdụng dung dịch sau lọc để đo TLC

3.2 Các bước triển khai sắc ký bản mỏng TLC.

Khảo sát các tỉ lệ của pha động Methanol với H2O như sau: tỉ lệ (3:7); (6:4); (5:5); (4:6); (7:3); (9:1); (8:2); (3.5:6.5)

Bước 1: Chuẩn bị bình triển khai

Chuẩn bị đồng thời các bình triển khai với các tỉ lệ của Methanol/H2O: tỉ lệ (3:7); (6:4); (5:5); (4:6); (7:3); (9:1); (8:2); (3.5:6.5), với thể tích tổng của pha động là 5mL

Cắt giấy lọc và ép vào mặt trong của beaker 50mL, sau đó đậy parafin và chờđến khi dung môi thấm ướt giấy lọc

Bước 2: Chuẩn bị bản mỏng

Cắt bản mỏng với diện tích 1cm x 4cm, dùng bút chì kẻ vạch thứ nhất từ dướilên 1cm, vạch thứ 2 cách đầu bản mỏng 0.5cm, chấm 2 chấm nhỏ bằng bút chìtrên vạch thứ nhất đánh dấu vị trí chấm mẫu.

Bước 3: Triển khai sắc ký

Chuẩn bị ống vi quản bằng cách dùng đèn cồn đốt ở giữa ống và kéo dãn chođến đứt, sau đó cắt cho bằng lại để lấy đầu nhỏ để thuận tiện cho việc chấm bảnmỏng

Sử dụng ống vi quản chấm mẫu vào bản mỏng, chú ý chấm thẳng và nhạt, chấmkhoảng 3 lần, sau đó để bản mỏng khô tự nhiên và để vào bình triển khai Bịtparafin lại Khi hệ dung môi giải ly thấm ướt đến mức đánh dấu ở mức trên thìlấy bảng mỏng ra Để yên cho bản khô tự nhiên rồi đem hiện màu

Bước 4: Phát hiện chất phân tích

Đem bảng mỏng đã triển khai vào buồng đèn UV để quan sát, quan sát các vệtđen và nhận xét hiệu suất tách, dùng viết chì khoanh lại để tiện ghi nhớ điểmphân tách

Nhận xét kết quả thu được

4. Kết quả và thảo luận

3,3 2,8 0,35 0,2 0,4 3,15 2,6 0,3 0,2 0,45 3,2 2,7 0,4 0,15 0,5

3 2,5 0,4 0,2 0,5 2,9 2,4 0,4 0,15 0,5b=3,7

a2 là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết cafein

b là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi đo trên cùng đường đi của vết

d2 là đường kính vết cafein

k/c là khảng cách giữa 2 tâm của 2 vết

Tỉ lệ 7 : 3

Tỉ lệ 3,5 : 6,5

Tỉ lệ 6 : 4

Tỉ lệ 8 : 2

Tỉ lệ 9 : 1

Kết luận: Do khảo sát tỉ lệ dung môi chưa tốt nên sự tách chất chưa rõ ràng Vì vậy

tỉ lệ dung môi ảnh hưởng rất lớn đến sự tách chất

Câu hỏi và bài tập củng cố:

1. Nêu nguyên tắc chọn lựa dung môi trong sắc ký bảng mỏng ?

Dung môi dùng trong sắc kí bảng mỏng sẽ là một dung môi có tính phân cựckhác với pha tĩnh

Nếu một dung môi phân cực được dùng để hòa tan mẫu thử trên một pha tĩnhphân cực, vệt nhỏ mẫu thử sẽ lan tròn do mao dẫn, và các vệt khác nhau có thểtrộn lẫn vào nhau

Do đó, để hạn chế sự lan tròn của các vệt mẫu, dung môi được sử dụng để hòatan mẫu thử phải không phân cực, hoặc phân cực một phần, nếu pha tĩnh phâncực, và ngược lại

2. Tại sao khi triển khai sắc ký bản mỏng, phải cho hệ dung môi vào bình, đậy nắp bình lại và để yên cho dung môi thấm ướt hết giấy lọc?

Tránh không cho dung môi bay hơi, để dung môi đạt trạng thái bảo hòa hơi

Xem dung môi có đồng nhất hay không nếu có thì nó sẽ thấm ướt hết giấy lọc vàngược lại.

3. Hệ dung môi và tỉ lệ dung môi có ảnh hưởng như thế nào đến giá trị R f ?

Các hợp chất được tách ra dựa trên sự cạnh tranh của chất tan và pha động để cóđược chỗ liên kết với pha tĩnh

Thí dụ, nếu silica gel được dùng như pha tĩnh, nó được xem là phân cực Chotrước 2 hợp chất có tính phân cực khác nhau, chất nào có tính phân cực lớn hơn

sẽ có sự liên kết với silica gel lớn hơn và vì thế sẽ có khả năng đẩy pha động rakhỏi các chỗ liên kết

Do đó, hợp chất có tính phân cực nhỏ hơn sẽ di chuyển lên cao hơn trên bản sắc

ký kết quả là hệ số lưu R f sẽ lớn hơn.

Nếu pha động được thay bằng một dung môi phân cực hơn hoặc là một hỗn hợpcác dung môi, nó sẽ có khả năng để đẩy các chất tan ra khỏi chỗ liên kết vớisilica gel, và tất cả các hợp chất trên bản sắc ký sẽ dịch chuyển lên cao hơn.Trên thực tế, nếu chúng ta dùng một hỗn hợp ethyl axetat và heptane như là phađộng, tăng thêm ethyl acetate sẽ cho hệ số lưu Rf cao hơn cho tất cả các hợp chấttrên bản sắc ký

Thay đổi độ phân cực của pha động sẽ không làm các hợp chất có thứ tự dichuyển ngược lại trên bản sắc ký Nếu muốn có một thứ tự ngược lại trên bảnsắc ký, một pha tĩnh không phân cực sẽ được sử dụng, như là C18-chức nănghóa silica

Ngày 09/08/2018

CHUẨN BỊ VÀ CHẠY MÁY HPLC

Nhiệm vụ:

- Mô tả được cấu tạo của máy HPLC

- Thông thạo các bước vận hành máy HPLC

1. Đọc tài liệu cấu tạo máy HPLC:

Thiết bị HPLC (Hight perfomance liquid chromatography) gồm các bộ phận chính:

Hệ thống cung cấp pha động (Pump):

Bơm cao áp: mục đích của bơm cao áp là bơm dung môi pha động vào cột thực

hiện quá trình sắc ký

Bơm gồm các bộ phận: Đầu bơm có 2 valve điều tiết, mỗi valve có một lổ nhỏ vớimột bi Các valve này dảm bảo cho việc hút pha động từ thân bơm vào cột sắc kýđược hoàn toàn Bơm có áp suất tối đa là 4000psi, và nhiệm vụ của bơm là tạodòng dung môi đi vào cột ổn định liên tục nên bơm có cấu tạo gồm 2 piston làmviệc liên tục

Tốc độ bơm là hằng định theo thông số đã được cài đặt trước Hệ thống bơm cao

áp gồm hai bơm, một bơm là nhiệm vụ hút dung môi kênh 1, bơm còn lại hút dungmôi kênh 2 Tỉ lệ xác định tốc độ dòng là tỉ lệ A/B Bơm thường làm bằng vật liệu

có độ bền hóa học cao, không dễ bị nhiễm bẩn

Bộ phận loại khí (Degaser): Degaser trong HPLC dùng để loại bỏ khí hòa tan

trong pha động trước khi pump vào cột Đặc biệt, loại bỏ oxygen trong pha động

để ngăn chặn phản ứng xãy ra với pha động hoặc pha tĩnh Khi oxygen hòa tantrong dung môi sẽ gây bất lợi đến tốc độ dòng, mức độ ô nhiễm và sự ổn địnhđường nền Tuy nhiên, degaser không làm thay đổi nồng độ của pha động hoặc làmxáo trộn dung môi Những bột khí hình thành trong pha động ngăn cản dòng phađộng qua cột liên tục Áp suất bị nén lại càng lúc càng cao trong cột, làm cho ápsuất của cột tăng lên khi đó cần một áp suất thật cao để đẩy những bọt khí trongpha động ra khỏi cột Do trong HPLC sử dụng pha tĩnh là cột nhồi silica gel phađảo chỉ có thể chịu đựng áp suất ở một giới hạn, khi áp suất quá cao sẽ làm nhữnghạt silica gel trong pha tĩnh bị bứt ra và đẩy ra khỏi cột và kết quả là làm cho cột bịhỏng.

Hệ thông bơm mẫu (Injector):

Injector là loại 6 điểm, khi valve ở vị trí load thì pha động đi từ vị trí 1 qua vị trí 6hay nói cách khác là pha động qua bơm đi vào cột

Khi valve ở vị trí inject thì pha động đi qua vị trí 1, 2, 5, 6 đồng thời đẩy mẫu đivào cột phân tích

Cột (Column): Cột pha đảo chứa pha tĩnh là các hạt silica đã được alkyl hóa

Đầu dò (Detector): Photodiode Array

Detector quang 2996 là detector Uv-Vis với:

Dãy diode gồm 512 con diode sắp xếp thành 1 dãy, mỗi con diode hoạt động nhưmột tụ điện, bởi giữ một lượng điện tích nhất định, những con diode này sẽ bị mấtđiện khi bị ánh sáng chiếu vào, thậm chí là nó vẫn bị mấy điện khi không có ánhsáng chiếu vào Lượng điện mất gọi là dark current.

Đầu dò 2996 sẽ đo lượng dòng điện cần thiết nạp vào mỗi con diode và ghi nhậndòng điện nạp trên mỗi con diode Lượng điện nạp vào này sẽ tỉ lệ với ánh sángtruyền qua flow cell

Bộ phận ghi nhận và xữ lý dữ liệu (Data processor)

1. So sánh sự giống nhau và khác nhau của sắc ký lõng và sắc ký lõng cao áp

2. Vai trò của degaser trong máy HPLC?

2. Bộ phận loại khí (Degaser): Degaser trong HPLC dùng để loại bỏ khí hòa

tan trong pha động trước khi pump vào cột Đặc biệt, loại bỏ oxygen trongpha động để ngăn chặn phản ứng xãy ra với pha động hoặc pha tĩnh Khioxygen hòa tan trong dung môi sẽ gây bất lợi đến tốc độ dòng, mức độ ônhiễm và sự ổn định đường nền Tuy nhiên, degaser không làm thay đổinồng độ của pha động hoặc làm xáo trộn dung môi Những bột khí hìnhthành trong pha động ngăn cản dòng pha động qua cột liên tục Áp suất bịnén lại càng lúc càng cao trong cột, làm cho áp suất của cột tăng lên khi đócần một áp suất thật cao để đẩy những bọt khí trong pha động ra khỏi cột

Do trong HPLC sử dụng pha tĩnh là cột nhồi silica gel pha đảo chỉ có thểchịu đựng áp suất ở một giới hạn, khi áp suất quá cao sẽ làm những hạt silicagel trong pha tĩnh bị bứt ra và đẩy ra khỏi cột và kết quả là làm cho cột bịhỏng

3. Các bước vận hành

- Bật công tắc ở vị trí on cho pump 1525, máy HPLC, detector 2996, máy

vi tính

- Nhấp chuột vào biểu tượng Empower trên màn hình máy vi tính

- Nhập User name là “system” và password là “manager” Nhấn enter hoặc

<OK> để đăng nhập vào hệ thống

- Chờ phần mềm khởi động đến khi xuất hiện bảng chọn Empower pro

Để tạo một Configuge mới:

- Nhấp chuột vào ô Configuge System

- Chờ phần mềm khởi động đến khi xuất hiện màn hình thao tác

- Vào File\New\Project

- Nhấp chuột vào ô Next để tiếp tục

- Chọn thông tin trong New project Wizard - Tablespace thích hợp sau đónhấn Next

- Trong New Project Wizard – Option chọn Photo Diode Array, sau đónhấn Next để tiếp tục

- Trong New Project Wizard – Access Control chọn thông tin phù hợp, sau

- Theo các bước trên đã hoàn thành viện tạo một Project mới, tuy nhiên để

có thể chạy được mẫu (Run sample), hay định lượng định tính, Project đócần phải có Instrument Method và Develop Method

- Để thực hiện được, sau khi tạo Project, trở về màn hình chính

- Nhấp vào Run Sample

- Chọn Project và hệ thống thích hợp

- Nhấp vào <OK>

- Vào Edit thiết lập các thông số:

- Đặt các thông số cho bộ điều khiển nhiệt độ

- Đặt các thông số cho đầu dò 2996 (đối với chế độ UV-Vis thông thườngquét bước sóng cố định – 2D)

- Giá trị lambda tùy thuộc vào phương pháp đo (có thể chọn từ 190nm –800nm)

- Đặt các thông số cho đầu dò 2996 (chế độ quét khoảng bước sóng – 3D)

- Giá trị lambda quét tùy vào phương pháp đo (có thể chọn 190nm –800nm)

- Đặt các thông số cho pump 1525 (chế độ đẳng dòng Isocratic)