Xác định methanol, ethanol và các sản phẩm chuyển hóa của chúng trong rượu và huyết tương người

Trong các phác đồ điều trị ngộ độc metanol, etanol được sử dụng như một loại thuốc giải độc nhằm hạn chế sự chuyển hóa của metanol thành axit fomic, sau đó các chất độc này sẽ loại bỏ ra

TRƯỜNG ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Chuyên ngành: Hóa Phân Tích

LỜI CÁM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin được thể hiện lòng biết ơn trân trọng nhất tới PGS.TS Tạ Thị Thảo và TS Phạm Quang Trung đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới ban lãnh đạo và toàn thể nhân viên Trung tâm Chống Độc – Bệnh viện Bạch Mai, đặc biệt là các anh chị và các bạn đồng nghiệp tại Phòng xét nghiệm – Trung tâm Chống độc đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi được học tập cũng như làm nghiên cứu trong suốt thời gian qua

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô giáo giảng dạy tại khoa Hoá Học, trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội, đặc biệt là các thầy cô trong bộ môn Hoá Phân tích đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cám ơn khoa Hóa Pháp – Viện Pháp y Quốc gia đã giúp

đỡ cho tôi hoàn thành luận văn

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn các anh chị, bạn bè của tập thể lớp cao học hoá K27, đặc biệt là những người bạn trong nhóm hoá phân tích K27 đã giúp đỡ, chia sẻ những khó khăn trong suốt quá trình tôi học tập và thực hiện đề tài

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn động viên, chia sẻ trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Hà Nội, ngày tháng năm 201

Học viên

Nguyễn Thị Ngân

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG 8

DANH MỤC HÌNH 10

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 12

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về metanol và etanol 3

1.1.1 Giới thiệu chung về metanol và etanol 3

1.1.2 Chuyển hóa metanol và etanol trong cơ thể, cơ chế gây độc 5

1.1.2.1 Chuyển hóa metanol và etanol trong cơ thể 5

1.1.2.2 Cơ chế bệnh sinh ngộ độc metanol 7

1.1.3 Liều gây độc 9

1.1.4 Triệu chứng ngộ độc metanol 10

1.2 Các phương pháp phân tích metanol, etanol và các sản phẩm chuyển hóa 11

1.2.1 Các phương pháp phân tích phòng thí nghiệm 11

1.2.2 Các phương pháp xác định nhanh metanol 13

1.2.3 Phương pháp 1H – NMR 19

1.2.3.1 Nguyên tắc của phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 19

1.2.3.2 Sơ đồ khối nguyên tắc hoạt động 20

1.2.3.3 Nguyên tắc khi định tính và định lượng bằng phổ 1H - NMR 20

1.2.3.4 Nghiên cứu loại tín hiệu của dung môi nước 21

1.2.3.5 Ưu nhược điểm của phương pháp so với sắc ký 23

1.2.3.6 Một số nghiên cứu định lượng bằng phổ 1H- NMR 23

1.3 Các kỹ thuật tủa protein trong xử lý mẫu sinh học 25

1.4 Tổng kết chung phần tổng quan 26

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

2.1 Trang thiết bị và hoá chất 28

2.1.1 Hoá chất 28

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ 31

2.2 Đối tượng phân tích 32

2.2.1 Chất phân tích 32

2.2.2 Mẫu nghiên cứu 32

2.2.2.1 Loại mẫu 32

2.2.2.2 Chuẩn bị mẫu phân tích 33

2.3 Phương pháp phân tích 33

2.3.1 Phương pháp phân tích quang phổ hấp thụ phân tử 33

2.3.2 Phương pháp thử nhanh metanol 34

2.3.3 Phương pháp định lượng metanol, etanol và các sản phẩm chuyển hóa bằng 1H – NMR 36

2.3.3.1 Quy trình đo mẫu triệt tiêu dung môi 36

2.3.3.2 Phương pháp định lượng theo công thức 36

2.3.3.3 Phương pháp định lượng theo đường chuẩn 37

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38

3.1 Nghiên cứu xác định nhanh methanol bằng phương pháp (UV - Vis) 38

3.1.1 Khảo sát các điều kiện để thử nhanh metanol bằng phương pháp quang 38 3.1.1.1 Lựa chọn thuốc thử tạo phức màu 38

3.1.1.2 Lựa chọn chất oxy hóa 39

3.1.1.3 Xác định bước sóng hấp thụ cực đại 40

3.1.1.4 Ảnh hưởng của lượng dung dịch axit chromotropic 0,1% lên độ hấp thụ quang 41

3.1.1.5 Xác định thời gian oxi hóa metanol 42

3.1.1.6 Xác định thời gian tạo phức màu 42

3.1.2 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn xác định metanol bằng phương pháp đo quang trong phòng thí nghiệm 43

3.2 Nghiên cứu chế tạo test kit thử nhanh metanol trong rượu 45

3.2.1 Ảnh hưởng của nồng độ etanol 45

3.2.2 Ảnh hưởng của lượng chất oxy hóa KMnO4 – H3PO4 46

3.2.3 Xây dựng thành phần kit thử metanol trong rượu 47

3.2.3.1 Ảnh hưởng của các chất độn 47

3.2.3.2 Thành phần thuốc thử trong kit thử methanol trong rượu 48

3.2.4 Ảnh hưởng của thứ tự thêm thuốc thử đến độ hấp thụ quang cuả kít thử metanol trong rượu 48

3.2.5 Khảo sát thời gian ổn định màu của phức khi sử dụng kit thử 49

3.2.6 Ảnh hưởng của hàm lượng fomandehit trong rượu 50

3.2.7 Quy trình và khoảng hoạt động kít thử nhanh metanol trong rượu 51

3.2.6.1 Chế tạo bộ kít thử metanol trong rượu 51

3.2.6.2 Quy trình thử metanol trong rượu 51

3.2.6.3 Khoảng hoạt động và bảng màu của kit thử metanol trong rượu 52

3.2.7 Đánh giá độ chính xác khi dùng kit thử metanol trong rượu 55

3.3 Xây dựng test kit trong huyết tương 56

3.3.1 Ảnh hưởng của protein trong huyết tương 56

3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của lượng KMnO4 30g/l khi lượng protein thay đổi 57

3.3.3 Khảo sát thời gian ổn định màu của phức khi sử dụng kit thử metanol trong huyết tương người 58

3.3.4 Quy trình xác định và khoảng hoạt động xác định metanol trong huyết tương 59

3.3.5.1 Chế tạo bộ kít thử metanol trong huyết tương 59

3.3.5.2 Quy trình thử metanol trong huyết tương 60

3.3.5.3 Khoảng tuyến tính và bảng màu của kit thử metanol trong huyết tương 60

3.3.6 Đánh giá độ chính xác khi dùng kit thử metanol trong huyết tương 62

3.4 Nghiên cứu định lượng etanol, metanol và các chất chuyển hóa bằng 1H– NMR 64

3.4.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của dung môi 64

3.4.2 Nghiên cứu định lượng các chất 65

3.4.2.1 Nhận dạng các chất qua phổ H1 – NMR 65

3.4.3.2 Đường chuẩn và khoảng tuyến tính xác định 5 chất bằng 1H - NMR 67

3.4.4 Nghiên cứu định lượng etanol và metanol và các chất chuyển hóa trong

huyết tương người 71

3.4.4.1 Nhận dạng các chất trong huyết tương không xử lý mẫu qua phổ H1 – NMR 71

3.4.4.2 Khảo sát phương pháp xử lý mẫu 72

3.4.4.3 Xây dựng đường chuẩn các chất trên nền mẫu huyết tương 73

3.4.4.4 Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp định lượng trong mẫu huyết tương 78

3.5 Áp dụng phân tích mẫu thực tế 79

3.5.1 Mẫu rượu 79

3.5.2 Mẫu huyết tương người 80

KẾT LUẬN 82

TÀI LIỆU THAM KHẢO 84

PHỤ LỤC 1 90

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3 1: Độ hấp thụ quang của phức màu khi thời gian oxi hóa metanol thay đổi

42

Bảng 3 2 : Sự phụ thuộc của độ hấp thụ quang vào nồng độ metanol 44

Bảng 3 3: Ảnh hưởng của thể tích KMnO4 khi thay đổi nồng độ etanol 46

Bảng 3 4: Độ hấp thụ quang của chất khi thêm các chất độn trong nền etanol 47

Bảng 3 5: Ảnh hưởng của thứ tự thêm thuốc thử đến độ hấp thụ quang xác định 49

Bảng 3 6: Độ hấp thụ quang của metanol trong nền mẫu rượu 53

Bảng 3 7: Độ hấp thụ quang của mẫu trắng khi xác định metanol trong rượu 54

Bảng 3 8: Độ chụm của phương pháp xác định metanol trong mẫu etanol 55

Bảng 3 9: Đánh giá độ tái lặp xác định metanol trong nền etanol 20% 55

Bảng 3 10: Độ đúng của phương pháp kit thử xác định nhanh methanol trong rượu 56

Bảng 3 11: Ảnh hưởng của thể tích KMnO4 30 g/l khi thay đổi lượng huyết tương 58

Bảng 3 12: Độ hấp thụ quang của metanol trong nền mẫu huyết tương 60

Bảng 3 13: Độ lặp lại của phương pháp xác định metanol trong mẫu huyết tương 62 Bảng 3 14: Đánh giá độ tái lặp xác định metanol trong mẫu huyết tương 63

Bảng 3 15: Độ đúng của kit thử xác định nhanh methanol trong huyết tương 63

Bảng 3 16: Độ dịch chuyển hóa học của các chất 67

Bảng 3 17: Tỉ lệ diện tích pic của các chất tại các nồng độ khác nhau 67

Bảng 3 18: Phương trình hồi quy xác định các chất bằng 1H – NMR 68

Bảng 3 19: LOD và LOQ của các chất 69

Bảng 3 20:Nồng độ của các chất tính theo công thức 69

Bảng 3 21: Phương trình tuyến tính nồng độ thực và nồng độ tính theo công thức 70 Bảng 3 22: Độ dịch chuyển hóa học tương ứng của các chất trong nền huyết tương 73

Bảng 3 23: Tỉ lệ diện tích pic tại các nồng độ khác nhau trong nền huyết tương 74Bảng 3 24: Phương trình hồi quy xác định các chất bằng 1H – NMR trong nền huyết tương 75Bảng 3 25: LOD và LOQ của các chất trong huyết tương 75Bảng 3 26:Nồng độ của các chất trong nền huyết tương tính theo công thức 76Bảng 3 27: Phương trình tuyến tính nồng độ thực và nồng độ tính theo công thức 77Bảng 3 28: Hiệu suất thu hồi của các chất trong nền mẫu huyết tương 78Bảng 3 29: Kết quả phân tích mẫu rượu của bệnh nhân 79Bảng 3 30:Kết quả phân tích mẫu huyết tương của bệnh nhân 81

DANH MỤC HÌNH

Hình 1 1: Chuyển hóa metanol trong cơ thể người 5

Hình 1 2: Chuyển hóa etanol trong cơ thể người 7

Hình 1 3: Quá trình nhận biết etanol và metanol 13

Hình 1 4: Sơ đồ khối của máy NMR 20

Hình 1 5: Sơ đồ chương trình xung ZGPR 22

Hình 1 6: Sơ đồ chương trình xung NOESYPR1D 23

Hình 3 1: Sự thay đổi màu sắc của các dung dịch khi thêm thuốc thử 38

Hình 3 2: Ảnh hưởng của chất oxy hóa tới màu của dung dịch 39

Hình 3 3: Độ hấp thụ quang dung dịch phức màu tại các nồng độ metanol khác nhau 40

Hình 3 4: Độ hấp thụ quang phụ thuộc vào thể tích thuốc thử axit chromotropic 0,1% 41

Hình 3 5: Ảnh hưởng của thời gian oxi hóa đến độ hấp thụ quang phức màu 42

Hình 3 6:Ảnh hưởng của thời gian tới độ hấp thụ quang 43

Hình 3 7: Đường chuẩn xác định metanol với thuốc thử axit chromotropic 0,1% 44

Hình 3 8: Ảnh hưởng của nồng độ etanol 45

Hình 3 9: Màu của methanol trong nền etanol 20% khi thay đổi chất độn 48

Hình 3 10: Độ ổn định màu của phức theo thời gian 50

Hình 3 11: Ảnh hưởng của nồng độ HCHO tới màu của dung dịch 50

Hình 3 12: Kít thử methanol trong rượu 51

Hình 3 13: Quy trình xác định metanol trong rượu 52

Hình 3 14: Đường chuẩn metanol trong nền mẫu rượu 20% 53

Hình 3 15: Bảng màu bán định lượng metanol trong rượu 54

Hình 3 16: Độ ổn định của phức màu trong huyết tương theo thời gian 59

Hình 3 17: Kít thử metanol trong huyết tương 59

Hình 3 18: Q uy trình xác định metanol trong mẫu huyết tương 60

Hình 3 19: Đường chuẩn metanol trong nền mẫu huyết tương 61

Hình 3 20: Bảng màu bán định lượng metanol trong huyết tương 61

Hình 3 21: Giản đồ 1H-NMR của etanol và metanol với dung môi H2O : D2O=9:1 64

Hình 3 22: Giản đồ 1H-NMR các chất trong nền huyết tương với dung môi H2O : D2O=9:1 65

Hình 3 23: Giản đồ 1H-NMR dùng TMS để hiệu chỉnh 66

Hình 3 24: Giản đồ 1H-NMR thu được của hỗn hợp các chất 66

Hình 3 25: Đường chuẩn xác định các chất bằng 1H – NMR 68

Hình 3 26: Đường tuyến tính giữa nồng độ thực và nồng độ tính theo công thức 70

Hình 3 27: Giản đồ 1H – NMR của huyết tương chưa qua xử lý mẫu 71

Hình 3 28: Giản đồ 1H – NMR của huyết tương trắng (xanh )và huyết tương thêm chuẩn (đỏ) khi xử lý bằng TCA 72

Hình 3 29: Đường chuẩn xác định các chất bằng 1H – NMR trong nền huyết tương 74

Hình 3 30: Đường tuyến tính giữa nồng độ thực và nồng độ tính theo công thức 77

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Tên viết tắt Tên tiếng anh Tên Tiếng việt

% RSD % Relative standard deviation % Độ lệch chuẩn tương đối

1H - NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởng từ hạt nhân proton

Dehydrogenase FID Free induction decay Sự phân rã cảm ứng tự

do

GC – MS Gas chromatography – Mass spectrometry Sắc ký khí khối phổ

HPLC High performance liquid Chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao

LOD Limit of Detection Giới hạn phát hiện

LOQ Limit of Quantification Giới hạn định lượng

NAD+ Nicotinamide Adenine Dinucleotide Nicotinamide Adenine Dinucleotide

NADH Nicotinamide Adenine Dinucleotide Nicotinamide Adenine Dinucleotide

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Metanol và Etanol là 2 ancol thường gặp nhất và được ứng dụng nhiều trong các ngành công nghiệp và đời sống Mặc dù có nhóm chức rượu nhưng metanol không dùng để uống như rượu etanol Phơi nhiễm metanol qua đường uống, đường hít hoặc thậm chí tiếp xúc qua da, nếu số lượng đủ lớn có thể gây ra ngộ độc nặng nề Trong đó ngộ độc qua đường tiêu hóa là hay gặp nhất [4]

Trên thế giới, báo cáo ca lâm sàng ngộ độc metanol đầu tiên từ năm 1855 bởi MacFarlan, với triệu trứng như thở nhanh sâu, toan chuyển hóa, rối loạn ý thức

từ lú lẫn đến hôn mê, suy thận cấp và tụt huyết áp [5] Sau đó, có rất nhiều báo cáo về ngộ độc được công bố [4],[ 10],[ 16] Tất cả đều để lại hậu quả nặng nề với tỉ lệ tử vong rất cao: 18 –56,3 % Nhiều trường hợp sống sót thì di chứng giảm hoặc mất thị lực và tử vong một thời gian sau do di chứng thần kinh tiến triển nặng lên

Ở Việt Nam, tại Trung tâm Chống độc – Bệnh viện Bạch Mai, trong năm

2014 đã tiếp nhận và điều trị 16 ca, năm 2015 số ca ngộ độc là 33 ca và năm 2016 lên tới 46 ca ngộ độc metanol và trong 6 tháng đầu năm 2017 số ca ngộ độc đã tăng lên tới 48 ca Đáng báo động là một số vụ ngộ độc tập thể có tính chất nghiêm trọng như tại Lai Châu vào tháng 2 năm 2017 với 40 người ngộ độc metanol sau khi uống rượu tại 1 đám cưới trong đó có 9 người đã tử vong do nồng độ metanol quá cao Tháng 3 năm 2017 tại Hà nội, 9 BN quê Gia Lai bị ngộ độc metanol do uống rượu không rõ nguồn gốc

Trong mẫu bệnh phẩm bệnh nhân uống có thể chứa etanol, metanol và các andehit và axit tương ứng Tuy nhiên, BN ngộ độc chủ yếu do bởi metanol khi vào

cơ thể chuyển hóa thành axit fomic Trong các phác đồ điều trị ngộ độc metanol, etanol được sử dụng như một loại thuốc giải độc nhằm hạn chế sự chuyển hóa của metanol thành axit fomic, sau đó các chất độc này sẽ loại bỏ ra khỏi cơ thể nhờ phương pháp lọc máu hấp phụ Do vậy, để tiên lượng mức độ nặng cũng như đưa ra phác đồ điều trị hợp lý cho bệnh nhân, cần phải xác định nhanh nồng độ của

đã có bộ kit thử nhanh phân tích metanol trong rượu của Bộ Công An nhưng chưa được ứng dụng xác định metanol trong huyết tương

Để định lượng metanol, etanol và các sản phẩm chuyển hóa của chúng, trong phòng thí nghiệm có thể sử dụng phương pháp GC-MS, GC-FID, điện thế, pp điện

di mao quản Các phương pháp này có độ nhạy tốt, tuy nhiên việc xử lý mẫu lại phức tạp và thời gian phân tích tương đối dài Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton [1H-NMR] là một trong những phương pháp tỏ ra rất tối ưu để giải quyết cho vấn đề này Đây là phương pháp phân tích hiện đại, mới được phát triển gần đây với độ đúng cao, có thể phân tích được đồng thời các chất và tiết kiệm thời gian phân tích

do quá trình xử lí mẫu rất đơn giản

Trước tình hình ngộ độc metanol ngày càng diễn biến phức tạp và có xu hướng gia tăng song cho đến nay tại Trung tâm Chống độc chưa có quy trình xác định nhanh metanol, etanol trong máu và rượu để kịp thời đáp ứng trong chẩn đoán

và điều trị bệnh Đề tài: “Xác định metanol, etanol và các sản phẩm chuyển hóa

của chúng trong rượu và huyết tương người” được tiến hành với mục tiêu:

1 Nghiên cứu chế tạo kit thử metanol trong rượu và máu để xác định nhanh bệnh nhân ngộ độc metanol

2 Nghiên cứu định lượng nhanh đồng thời metanol, etanol và một số sản phẩm chuyển hóa của chúng trong rượu và huyết tương bằng phương pháp 1H-NMR phục vụ tiên lượng BN và hỗ trợ điều trị

3

Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về metanol và etanol

1.1.1 Giới thiệu chung về metanol và etanol

Metanol hay còn gọi là rượu metylic có công thức cấu tạo CH3OH được người Hi Lạp cổ tình cờ phát hiện khi tiến hành thủy phân gỗ, tuy nhiên sản phẩm metanol lúc đó tồn tại dưới dạng tạp chất, lẫn với các chất khác Đến nay metanol được sản xuất trong công nghiệp bằng phản ứng hóa học với cơ chất sử dụng phổ biến là cacbon monooxit (CO), cacbon dioxit (CO2) và khí hydro (H2) [11]

Etanol hay còn được biết đến với nhiều tên gọi khác nhau như rượu, cồn etylic, là phân tử rượu đơn giản gồm nhóm ankyl với 2 nguyên tử carbon liên kết với nhóm hydroxyl Công thức cấu tạo C2H5OH, thường được viết tắt là EtOH Năm 1825, Michael Faraday đã tổng hợp được etanol từ etylen bằng cách hydrat hóa với xúc tác axit, tương tự như quy trình tổng hợp etanol công nghiệp ngày nay Ngoài ra, trong công nghiệp, etanol còn được tổng hợp từ CO2 và lipit

Metanol và etanol đều tồn tại trong tự nhiên Metanol được sinh ra trong quá trình chuyển hóa kỵ khí của một số loại vi khuẩn, tuy nhiên lượng này không nhiều

do metanol phản ứng với oxy chuyển hóa thành khí CO2 và H2O Etanol là một sản phẩm phụ của quá trình chuyển hóa đường nhờ men Etanol thường được tìm thấy trong quả chín Nó cũng có thể tạo ra trong quá trình nảy mầm của nhiều loại cây trồng do điều kiện khí hậu không thuận lợi

Metanol, etanol là 2 phân tử đầu tiên trong dãy đồng đẳng, có khối lượng phân tử lần lượt là 32 g/mol và 46,07 g/mol, nhiệt độ sôi là64,7oC và 78oC Cả metanol và etanol đều là hợp chất không màu, dễ bay hơi, dễ cháy và tan vô hạn trong nước Các đặc tính vật lý và hóa học của etanol chủ yếu do nhóm hydroxyl Các phản ứng hóa như phản ứng ete hóa, hay este hóa, phản ứng thế nhóm OH, phản tứng oxy hóa tạo aldehyd…

Với các đặc tính hóa lý của nó, metanol và etanol được sử dụng rất rộng rãi trong nhiều ngành nghề

4

Trong phòng thí nghiệm, metanol là một dung môi phổ biến được sử dụng rộng rãi và đặc biết hữu ích cho HPLC, quang phổ UV-Vis, LC-MS do bước sóng hấp thụ cực đại của metanol ngắn, độ hấp thụ quang thấp

Trong công nghiệp hóa chất, metanol, etanol đều được sử dụng làm nguyên liệu đầu vào để tổng hợp lên các hợp chất khác Nhờ khả năng tan vô hạn trong nước và có thể hòa tan được các chất hữu cơ có độ phân cực thấp mà nó được dùng như dung môi trong sơn, bút dánh dấu, bút mực, nước rửa răng hay chất khử mùi

Trong công nghiệp nhiên liệu, metanol và etanol đã và đang được nghiên cứu

sử dụng như một loại nguyên liệu thay thế hoặc là phụ gia nhiên liệu cho các loại phương tiện giao thông [4] Trong đó, etanol được xem là nhiên liệu sinh học tái sinh, do nó có thể được sản xuất từ các nguồn thức ăn chăn nuôi, hay từ các loại cây như gai dầu, mía, sắn, ngô

Trong ngành y tế, etanol được sử dụng phổ biến như chất sát trùng, nó còn được sử dụng như chất giải độc bằng cả đường tiêm và đường uống trong ngộ độc metanol và etylen glycol [2] Ngoài ra, etanol dùng để hòa tan nhiều loại thuốc không tan trong nước, hơn 700 chất lỏng dùng trong y khoa có chứa etanol bao gồm acetaminophen, mannitol, phenobarbital… [25]

Đặc biệt, etanol được con người sử dụng như một lọai đồ uống giải trí Từ thế kỷ thứ 9, con người đã biết chưng cất rượu [3],[ 22] Tới nay, có hàng nghìn loại rượu được sản xuất trên thế giới để phục vụ cho nhu cầu của con người Metanol mặc dù là rượu nhưng không uống được do độc tính cao Metanol có mùi tương tự etanol và có vị ngọt hơn nên dễ uống hơn Một số người đã pha metanol cùng với nước hoặc rượu etanol để bán như rượu etanol nguyên chất Đây có lẽ là nguyên nhân gây ngộ độc thường gặp ở Việt Nam

Trong tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7043:2013 quy định hàm lượng metanol trong rượu chưng cất không vượt quá 2000 mg/l / 1000 etanol và với rượu pha chế hàm lượng metanol không vượt quá 100 mg/l / 1000 etanol

5

1.1.2 Chuyển hóa metanol và etanol trong cơ thể, cơ chế gây độc

1.1.2.1 Chuyển hóa metanol và etanol trong cơ thể

 Metanol Khi vào cơ thể, metanol hấp thu nhanh và hoàn toàn qua đường tiêu hóa với nồng độ đỉnh trong huyết tương 30-90 phút sau khi uống Một phần được thải nguyên dạng qua đường hô hấp nhưng không đáng kể

Trong cơ thể người, metanol được chuyển hóa tại gan thành fomandehit nhờ

xúc tác của men metalloenzyme ancol dehydrogenase, thường gọi là ancol dehydrogenase (ADH) Phản ứng này cần có mặt của NAD+ và sinh ra NADH bằng cách chuyển sang một electron [62] Fomandehit chỉ tồn tại trong thời gian rất ngắn, chưa đến 1 phút và ngay lập tức chuyển hóa thành axit fomic nhờ xúc tác của men

formandehyde dehydrogenase Sau đó axit fomic cần kết hợp với tetrahydrofolate

hay còn gọi là axit folinic để chuyển hóa hoàn toàn thành khí cacbonic và nước Thời gian bán thải tự nhiên của metanol trong cơ thể người trung bình từ 8 – 28 giờ [28]

Hình 1 1: Chuyển hóa metanol trong cơ thể người

Các phương pháp xác định nhanh metanol trong dịch sinh học cho thấy nồng

độ metanol thấp nhất có thể xác định được trong máu là 5 mg/l [25], trong nước bọt

là huyết thanh (2,3 mg/l) [54] Sử dụng biosensor đo thế có thể nhận biết nồng độ fomat 2,3 mg/l [32] Phương pháp sắc ký khí có thể xác định được đồng thời cả axit fomic và axit axetic trong mẫu máu toàn phần với nồng độ có thể nhận biết 1 mg/l [46]

 Etanol Khi vào cơ thể, khoảng 20% etanol được hấp thu ở dạ dày và 80% hấp thu ở ruột non Rượu được hấp thu từ ruột sẽ theo tĩnh mạch cửa đến gan Tại đây, 90% etanol được chuyển hóa, một phần nhỏ được bài tiết nguyên dạng qua mồ hôi, hơi thở và nước tiểu

Cũng giống như metanol, trong cơ thể người etanol cũng được chuyển hóa thành axetandehit tại gan nhờ enzym ADH Ngoài ra, Etanol còn được chuyển hóa

thành axetandehit theo còn đường chuyển hóa khác đó là kết hợp với Cytochrome P450 2E1 (CYP2E1), phản ứng này cần điều kiện hiếu khí, môi trường giàu O2, mặt khác cũng cần có mặt NADPH sinh ra NADP và 2 OH Sau đó nhờ xúc tác của men

andehite dehydrogenase, axetadehid được chuyển hóa thành axit axetic Sản phẩm

cuối cùng của dãy chuyển hóa này là CO2 và nước

7

Hình 1 2: Chuyển hóa etanol trong cơ thể người

Tốc độ chuyển hóa của etanol nhanh hơn tốc độ chuyển hóa của metanol gấp

7 lần do đó nếu cùng tồn tại etanol và metanol trong máu, enzym ADH sẽ được ưu tiên sử dụng để chuyển hóa etanol trước, sau đó mới chuyển hóa đến metanol [24]

Etanol và các chất chuyển hóa tuy có ảnh hưởng tới cơ thể người nhưng không gây độc như metanol và chất chuyển hóa của nó Trong đó, axit fomic được cho là gây độc mạnh với cơ thể người, nó gây ra các triệu chứng ngộ độc ảnh hưởng trực tiếp tới các cơ quan trong cơ thể như mắt, não,… Do đó, chúng tôi chỉ xét tới

cơ chế gây ngộ độc ở metanol và các chất chuyển hóa

1.1.2.2 Cơ chế bệnh sinh ngộ độc metanol

Bản thân metanol không có độc tính, fomandehit mặc dù độc với cơ thể nhưng chỉ tồn tại trong thời gian rất ngắn, độc tính của metanol chủ yếu do sản phẩm chuyển hóa gần cuối cùng là axit fomic

Axit fomic gây toan chuyển hóa, làm pH của máu thấp hơn 7,35 Axit fomic

có tính chất axit yếu, kết hợp với axit lactic được hình thành từ pyruvate nhờ sự có

mặt của NADH trong chu trình Kreb, gây tình trang toan hóa máu Theo Smith và cộng sự, khoảng 50% mức độ toan hóa máu trong ngộ độc metanol là do axit fomic,

còn lại hầu như là do axit lactic gây ra [20] Tình trang toan hóa máu dẫn đến hiện tượng axit fomic chủ yếu tồn tại ở dạng không phân ly, có thể dễ dàng ngấm vào mô

và tạng đích như võng mạc, ti thể và hàng rào máu não

8

Axit fomic có ái tính cao tại vị trí số 6 của phân tử sắt trong nhân Hem của

phân tử cytochrom oxydase, đặc biệt là cytochrom aa3 một enzym có chức năng

oxy hóa khử trong chuỗi vận chuyển điện tử và ức chế hoạt động của enzym này Kết quả là làm gián đoạn quá trình chuyển hóa trong hô hấp tế bào, nói cách khác là

ức chế hô hấp tế bào và gây độc tế bào

Khi pH máu càng giảm, axit fomic càng tồn tại nhiều ở trạng thái không phân ly và càng có khả năng ngấm vào mô đích Thêm nữa, mặt trong của màng ty thể chỉ cho phép dạng không phân ly di chuyển qua do đó trong tình trạng toan hóa máu sự ức chế hô hấp diễn ra thuận lợi, càng toan sự ức chế càng mạnh và dẫn đến quá trình thương tổn tế bào do không sinh được ATP (Adenosin Triphosphat) cho

Ngoài ra, axit fomic còn gây ảnh hưởng tới hệ thần kinh trung ương Cơ chế gây tổn thương của axit fomic lên hệ thần kinh trung ương cũng tương tự đối với thị

9

thần kinh là do hiện tượng ức chế hoạt động cytochrom oxydase trong ty thể của tế

bào thần kinh dẫn đến ức chế hoạt động của hệ Na – K – ATPase Khi có hiện tượng ức chế hô hấp tế bào, đây sẽ là khu vực chịu ảnh hưởng nặng nề nhất [4]

Ở những bệnh nhân ngộ độc metanol, các tổn thương não ghi nhận được ngoài phù não và hoại tử hạch nền chảy máu ở nhân bèo sẫm và tổn thương chất trắng dưới vỏ do ngộ độc với cơ chế tương tự tổn thương thị thần kinh Tổn thương chất trắng dưới vỏ thường xảy ra ở những bệnh nhân đến muộn hoặc điều trị ban đầu không phù hợp [7]

1.1.3 Liều gây độc

Hầu hết các chuyên gia đều thống nhất bắt đầu điều trị giải độc khi nồng độ metanol máu từ 20 mg/dL vì đây là nồng độ bắt đầu có tổn thương thị lực và toan chuyển hóa [4] Có thể tính toán lượng metanol uống dẫn tới liều độc căn cứ vào công thức tính toán dược động học như sau:

Trong đó: [C] là nồng độ metanol trong trong máu,

D là lượng metanol uống

F là sinh khả dụng đường uống (100%)

Vd là thể tích phân bố (của methanaol là 0,6 L/Kg)

Từ đó có thể tính toán rằng: nếu uống một thể tích tương đương 0,25 ml/kg dung dịch metanol nồng độ 100% về mặt lý thuyết có thể gây ra nồng độ 20 mg/dL trong máu và bắt đầu có thể gây độc tính trên người

Theo hướng dẫn của Hội các nhà Chống độc Mỹ năm 2002, nồng độ metanol máu có thể gây tử vong ở người nếu không được điều trị tích cực là trên 50 mg/dL [4] Tuy nhiên với bệnh nhân được giải độc và điều trị đúng cách có thể cứu sống ở nồng độ cao hơn rất nhiều [13],[8]

10

1.1.4 Triệu chứng ngộ độc metanol

Biểu hiện lâm sàng ngộ độc metanol là tổn thương đa cơ quan và đều do một nguyên nhân chung là axit fomic được sinh ra mà không được chuyển hóa thành cacbonic và nước gây ra toan chuyển hóa và độc tính trực tiếp trên mô [5]

Hai yếu tố ảnh hưởng nhiều nhất đến biểu hiện lâm sàng là thời gian từ khi ngộ độc đến khi nhập viện và tình trạng uống kèm theo etanol hay không [15] Sau khi uống metanol từ 0,5 – 4 giờ là pha yên tĩnh của ngộ độc, một số trường hợp uống kèm etanol triệu chứng thường chỉ xuất hiện sau 12 – 24 giờ Bệnh nhân có thể lơ mơ kiểu ngộ độc etanol do vậy trong giai đoạn này bệnh nhân không biểu hiện triệu chứng cũng không thể loại trừ ngộ độc metanol

Sau giai đoạn yên lặng bệnh nhân bắt đầu có các biểu hiện ban đầu như đau đầu, chóng mặt hoặc các biểu hiện trên tiêu hóa như buồn nôn, nôn và đau bụng

Tổn thương thị giác có thể biểu hiện trên lâm sàng như nhìn mờ, ám điểm trung tâm, thị lực hình ống, nhìn đôi và sợ ánh sáng Khám mắt có thể thấy đồng tử giãn và giảm hoặc mất phản xạ với ánh sáng, đôi khi thấy rung giật nhãn cầu tuy nhiên đây không phải triệu chứng phổ biến Soi đáy mắt có thể thấy hình ảnh phù nề võng mạc và phù gai thị, xung huyết đĩa thị cho đến viêm teo thị giác Dấu hiệu đồng tử giãn - cố định là dấu hiệu tiên lượng xấu [35]

Biểu hiện về thần kinh có thể là rối loạn ý thức từ mức nhẹ như rối loạn tập trung, sững sờ và hôn mê Rối loạn vận động kiểu ngoại tháp với biểu hiện xoắn vặn, động tác chậm và cứng, khuôn mặt cứng như mặt nạ Co giật có thể xuất hiện trong các trường hợp nặng Biểu hiện ngoại tháp kiểu parkinson xảy ra ở những người đến muộn Các di chứng thần kinh khác có thể gặp như: giảm nhận thức, viêm tủy cắt ngang, liệt kiểu hành não [4]

Suy tuần hoàn biểu hiện mạch ban đầu thường nhanh, huyết áp thấp Nặng có thể thấy mạch chậm và huyết áp tụt không đáp ứng với vận mạch và nặng nhất là ngừng tuần hoàn Nhiều trường hợp bệnh nhân ngừng tuần hoàn tại bệnh viện do trơ với thuốc vận mạch do toan chuyển hóa nặng không hồi phục

11

Trên tiêu hóa có thể gặp buồn nôn, nôn, đau bụng Có thể gặp xuất huyết tiêu hóa với biểu hiện nôn ra máu, đi ngoài phân đen và viêm tụy cấp với bụng chướng

và đau, xét nghiệm tăng men tụy như amylase, lipase, tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán

là CT scan ổ bụng Biểu hiện ở tiêu hóa không phản ánh được mức độ nặng của bệnh

Thận – tiết niệu: có thể gặp suy thận với biểu hiện thiểu niệu, vô niệu, phù Myoglobin niệu là một biến chứng hiếm gặp nhưng nếu có là dấu hiệu nặng của bệnh

1.2 Các phương pháp phân tích metanol, etanol và các sản phẩm chuyển hóa

1.2.1 Các phương pháp phân tích phòng thí nghiệm

Các kỹ thuật phòng xét nghiệm được sử dụng để định tính và định lượng metanol, etanol và các sản phẩm chuyển hóa của chúng Trước hết phải kể đến các phương pháp quang

Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử (UV-Vis) thường được sử dụng để định lượng metanol, etanol, fomandehit và andehit Như đã nói ở trên, nguyên tắc của phương pháp quang là sử dụng thuốc thử thích hợp tác dụng với chất phân tích cho sản phẩm là dung dịch có màu, dung dịch này được đem đo độ hấp thụ quang tại bước sóng thích hợp, Độ hấp thụ quang của chất tỷ lệ thuận với nồng độ chất phân tích Với fomandehit và axetandehit có thể tìm được thuốc thử để định lượng trực tiếp [26],[ 45],[ 63],[ 64],[ 67], với việc định lượng metanol và etanol cần có bước oxy hóa trước có thể sử dụng các chất oxy hóa như KMnO4, KIO4, NaIO4, các men sinh học, sau đó tìm thuốc thử để nhận biết các sản phẩm trung gian thu được [12],[ 21],[ 23],[ 44],[ 51] Trong trường hợp thuốc thử được chọn cho phản ứng màu với nhiều chất cần sử dụng thuật toán đa biến để định lượng [45]

Phương pháp quang phổ Raman [43] [61] được sử dụng để định lượng trực tiếp đồng thời etanol và metanol trong mẫu rượu Vạch phổ của metanol, etanol lần lượt xuất hiện tại 1019 cm-1 và 879 cm-1 Giới hạn định lượng của phương pháp là 0,05%

12

Ngoài các phương pháp quang, phương pháp điện hóa cũng hay được sử

dụng để phân tích đông thời metanol và etanol Sousa và các cộng sự [57] sử dụng

phương pháp vol – ampe vòng với điện cực làm việc Pt –Au xác định đồng thời metanol và etanol trong nhiên liệu etanol Theo đó, etanol được phát hiện chọn lọc tại +0,9V, giới hạn phát hiện 0,028%, metanol phát hiện tại +1,2V, giới hạn phát hiện 0,045% Để tách metanol và etanol ra khỏi dầu diesel sinh học, Shihov và các cộng sự sử dụng 1 module thấm hơi (VPM) với 1 màng polymer poly (phenylene isophtalamide) (PA) chứa dung môi dư Sau khi bốc hơi vào khoang VPM, metanol

và etanol được vận chuyển thông qua màng PA tới buồng trộn được trang bị một detector đo thế Giới hạn phát hiện với cả 2 chất là 0,02% [59]

Phương pháp sắc ký khí(GC) kết hợp với detector ion hóa ngọn lửa FID cũng được sử dụng để phân tích đồng thời metanol và etanol Với mẫu khí [56], các ancol này được tách ra từ mẫu khí bằng hệ 3 tấm lọc florisil nối tiếp, sau đó chúng được rửa giải bằng nước trước khi bơm vào cột DB WAX Phương pháp này có thời gian phân tích ngắn 5 phút, giới hạn phát hiện thấp có thể phân tích cỡ ppb Với trầm

tích ở biển, chúng được tách ra nhờ kỹ thuật vi chiết pha rắn sử dụng sợi polydimethylsiloxane, giới hạn phát hiện của phương pháp đạt 5,2 µM với metanol,

Carboxen-với etanol là 0,4 µM nếu sử dụng kỹ thuật xử lý mẫu P&T(rửa và bẫy) giới hạn phát hiện giảm xuống 100 lần [39]

Phương pháp GC kết nối với detector khối phổ MS cũng hay được sử dụng trong phân tích metanol, etanol và các sản phẩm chuyển hóa của chúng Với mẫu trầm tích biển, có thể nhận biết metanol và etanol bằng cách bơm trực tiếp vào hệ thống với giới hạn phát hiện lần lượt là 7,4 và 3,1 µM [39] Trong mẫu rượu, Wang

và các cộng sự [50] đã sử dụng cột CP-Wax 58 CB, 30 m x 0.53 mm để định lượng metanol koảng tuyến tính rộng 0,002 mg/ml – 20mg/ml Savary và nhóm nghiên cứu của mình [29] đã sử dụng kỹ thuật headspace vi chiết pha rắn, sợi chiết là Carboxen-PDMS để tách metanol và axit axetic ra khỏi nền mẫu Mảnh ion được chọn để phân tích metanol là m/z 29 và axit axetic là m/z 43

13

Kage và các cộng sự [58] nghiên cứu phân tích đồng thời fomat và axetat

trong máu toàn phần và nước tiểu của người Mẫu màu toàn phần không cần phải

loại protein, fomat và axetat được ankyl hóa với pentafluorobenzyl bromide trong

hỗn hợp aceton và đệm phosphat (pH 6.8) Giới hạn thấp nhất có thể phát hiện được

là 0,02 mM Mảnh ion chọn để phân tích axetat là m/z 240 và fomat là m/z 226 Có axetat, fomat trong máu có thể khẳng định được bệnh nhân có sử dụng etanol, metanol

Các phương pháp phòng thí nghiệm phân tích metanol, etanol và các chất chuyển hóa đểu cho giới hạn phát hiện thấp Tuy nhiên, các thiết bị này đòi hỏi trang thiết bị phức tạp, đắt tiền và thường chỉ có ở những phòng thí nghiệm hiện đại

1.2.2 Các phương pháp xác định nhanh metanol

Nguyên tắc của các test thử xác định nhanh etanol và metanol bằng phương pháp quang dựa trên khả năng tạo phức màu dễ nhận biết của các chất cần xác định

và thuốc thử thích hợp Tuy nhiên, cả etanol và metanol đều không có thuốc thử thích hợp để xác định trực tiếp, chúng cần được chuyển thành dạng andehit sau đó, các andehit sẽ phản ứng với thuốc thử tạo phức màu đặc trưng Quá trình này được thể hiện trong hình 1.3

Hình 1 3: Quá trình nhận biết etanol và metanol

Quá trình xác định nhanh metanol và etanol gồm 2 giai đoạn, giai đoạn 1 là quá trình oxy hóa các ancol, quá trình 2 là phản ứng nhận biết với thuốc thử Trước tiên, metanol và etanol bị oxy hóa thành các andehit nhờ các tác nhân oxy hóa

Chất oxi hóa Thuốc thử

(1) (2)

Ngoài ra, men ancol oxidase cũng được sử dụng xúc tác cho phản ứng oxy

hóa metanol và etanol trong môi trường giàu O2 (tác nhân oxy hóa) Phản ứng xảy

ra ngay nhiệt độ phòng, trong môi trường đệm phosphat pH 7.5, sản phẩm thu được

là hydro peroxit và các andehit tương ứng [12],[ 21],[23],[23] Đây cũng là phản ứng hay được sử dụng, chuyển hóa hoàn toàn các ancol thành andehit

(3) (4)

Ngoài việc sử dụng các phản ứng có xúc tác là các men sinh học trên thì cũng có thể sử dụng các chất oxi hoác vô cơ khác như KMnO4 để oxy hóa ancol [51] [12] KMnO4 tác dụng với metanol trong môi trường axit, quá trình oxy hóa

Mn7+ nhận 5 electron tạo thành Mn2+ Để phản ứng được xảy ra hoàn toàn cần cho

dư lượng KMnO4 vào dung dịch mẫu thử, phản ứng tại nhiệt độ phòng trong 10 phút Sau đó dung dịch natri pyrosulfit được thêm vào để phản ứng hết với lượng thuốc tím còn dư, để đảm bảo dung dịch thu được trong suốt không màu

(5)

15

Natri periodat (NaIO4) cũng được Shin và các cộng sự [12] sử dụng để phản

ứng với các ancol Phản ứng được thực hiện trong phòng tối ít ánh sáng trong 10 phút Kết quả cho thấy metanol gần như không phản ứng với NaIO4, Etanol có phản ứng tuy nhiên hiệu suất phản ứng thấp NaIO4 phản ứng mạnh với các ancol có 2 nhóm chức OH liền kề như etylenglycol

Việc sử dụng các men sinh học trong các phản ứng có rất nhiều ưu điểm: các phản ứng rất đặc hiệu, chọn lọc với một số chất nhất định, các phản ứng xảy ra ngay lập tức với hiệu xuất rất cao gần như hoàn toàn Kết quả là giảm được thời gian phân tích và độ thu hồi cao Tuy nhiên, các men sinh học này thường rất đắt và đòi hỏi điều kiện bảo quản phải nghiêm ngặt, do đó việc sử dụng rộng rãi các loại xúc tác này thường hạn chế Trong khi đó, KMnO4 hay còn gọi là thuốc tím, là chất oxy hóa rất phổ biến, giá thành thấp, dễ bảo quản, hơn nữa KMnO4 phản ứng với Metanol và Etanol cho hiệu suất phản ứng cao Do đó, có thể sử dụng KMnO4 làm chất oxy hóa để xác định metanol và etanol

Sau khi các phản ứng oxy hóa khử xảy ra, các chất trung gian thu được sẽ phản ứng với các thuốc thử thích hợp thu được các sản phẩm là hợp chất mang màu Các nghiên cứu tập trung vào các thuốc thử có thể phản ứng với các andehit được tạo thành

Trong nghiên cứu của Shin và các cộng sự [12], nhóm tác giả đã sử dụng

3-methylbenzothiazolon hydrazin (MBTH) làm thuốc thử để nhận biết các ancol trong nước bọt, cho sản phẩm có màu xanh lam Với việc sử dụng men ADH, MBTH có thể nhận biết được etanol với giới hạn phát hiện được là 0,5 mg/dl và ethylen glycol với nồng độ > 200mg/dl Etanol và metanol có thể nhận biết khi sử dụng men ancol oxidase, phương pháp này nhạy với metanol hơn với LOD là 1mg/dl Nếu sử dụng natri periodat làm tác nhân oxy hóa, MBTH nhạy với etylen glycol hơn so với etanol, metanol gần như không phát hiện được Etanol, metanol, etylen glycol, và

16

dietylen glycol đều có thể được nhận biết nếu sử dụng kali permanganat làm chất oxy hóa Kết quả cho thấy, độ nhạy của phương pháp với các chất theo thứ tự: metanol > etylen glycol > dietylen glycol > etanol Tuy nhiên, việc sử dụng MBTH không thể khẳng định được có metanol trong mẫu khi có mặt của etanol

Trong môi trường bazơ, phloroglucinol phản ứng với fomandehit cho sản phẩm có màu da cam dễ nhận biết [67] Tuy nhiên, sản phẩm màu không bền, theo thời gian dung dịch bị mất màu do có sự tương tác với phloroglucinol còn dư trong dung dịch Ngoài ra, khi có mặt axetandehit với nồng độ > 3,5mg/dl trong mẫu, cũng ảnh hưởng tới cường độ màu của dung dịch

Thuốc thử purpald cũng được sử dụng để nhận biết các andehit [45] Trong môi trường pH 10-11, pulpald phản ứng với hầu hết các andehit thu được sản phẩm

có màu tím đặc trưng Do đó không nhận biết được các andehit với nhau Để có thể nhận biết được metanol bằng thuốc thử purpald khi có mặt của etanol cần lựa chọn tác nhân oxy hóa phù hợp sao cho etanol không bị chuyển về dạng andehit mà chỉ

có metanol Có thể sử dụng men fomandehit dehydrogenas cho phản ứng này

Axit chromatropic được khuyến cáo sử dụng để xác định fomandehit [27] [1] Sản phẩm phức màu tím đặc trưng được hình thành khi axit chromotropic phản ứng với fomandehit trong môi trường axit H2SO4 [26],[ 45],[ 51],[63] Phản ứng xảy ra ngay sau khi thêm thuốc thử vào, khác với thuốc thử purpal cần 5 phút để hiện màu Phương pháp này rất nhạy với fomandehit, với giới hạn phát hiện là 1mg/l

(7)

17

Trong nghiên cứu của Bayder và các cộng sự [21] đã xác định được metanol

trong máu chuột bằng cách sử dụng thuốc thử p-iodonitrotetrazolium hydrochloride (p-INT) Thay vì sử dụng thuốc thử để nhận biết fomandehit như các nghiên cứu khác, nhóm tác giả lại nghiên cứu nhận biết chất trung gian NADH của phản ứng giữa Metanol và NAD+ với xúc tác men formandehite dehydrogenase Quá trình

nhận biết dựa trên phản ứng giữa NADH và p-INT cho sản phẩm có màu hồng

đậm-đỏ dưới xúc tác của enzym diaphorase Phương pháp này không bị ảnh hưởng khi

có mặt của etanol, do men formandehite dehydrogenase chỉ xúc tác cho phản ứng

oxy hóa metanol thành andehit Phương pháp này cũng được sử dụng để làm test

thử nhanh etanol trong mẫu nước bọt, với việc sử dụng men ADH thay cho

formandehite dehydrogenase Test kit với tên thương phẩm AlcoRange@

(QEDAISOTM Enzymatics, Horsham, PA) với độ nhạy 100 mg/l test kit không bị dương tính chéo với metanol hay isopropanol hay etylen glycol[9]

Test kít ALCO-Screen (Craig Medical Distribution, Inc., Vista, CA) xác

định metanol và etanol được xây dựng dựa trên phản ứng của chúng với oxy dưới

xúc tác của men ancol oxidase sinh ra hydrogen peroxid, chất này phản ứng với 1

thuốc nhuộm đặc hiệu sinh ra hợp chất có màu xanh dưới tác dụng của men peroxidase Test kit này được ứng dụng để xác định metanol và etanol trong nước bọt và máu Ưu điểm của phương pháp là nhanh, đơn giản, dễ thực hiện, giới hạn phát hiện thấp 30 mg/l Tuy nhiên phương pháp này không thể phân biệt được etanol và metanol đo cùng đáp ứng [40],[ 44]

(8)

18

Ngoài các phương pháp so màu, các loại sensor điện hóa cũng được nghiên cứu để xác định nhanh metanol Một số loại polymer cũng được sử dụng để làm vật liệu cảm biến hơi metanol như Poly(2-dodecanoylsulfanyl-p-phenylenevinylene) (12COS-PPV) [48] khoảng tuyến tính 0,05% - 4%, cảm biến polypyrolo – polyvinyl

ancol (PPy - PVA) được Lin và các cộng sự [30] nghiên cứu cải tiến nhạy hơn 9 lần

so với cảm biến PPy thường, độ nhạy đạt được là 15mg/l Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp là việc chế tạo sensor tương đối khó, độ bền của cảm biến giảm do thêm PVA (<10h)

Phthalocyanine (Pc) được gắn thành nhánh hay nhóm chức của chuỗi polysiloxanes, sau đó 1 lớp mỏng hợp chất được phủ lên bề mặt của vật liệu đế Nồng độ metanol đo được trong khoảng 5-200mg/l, tần số 6-10GHz [28]

Tzang và các cộng sự [32] lại sử dụng điện cực glassy cacbon biến tính để

định lượng fomat, với 1 lớp màng 3,4-dihyroxybenzandehit (3,4-DHB) phủ bên ngoài điện cực và 1 màng nylon chứa enzym đặc hiệu được gắn vào đầu điện cực Nguyên lý của phương pháp là fomat chuyển hóa thành CO2 nhờ xúc tác của enzym

formate dehydrogenase, phản ứng sinh ra NAD+, điện cực glassy cacbon biến tính 3,4-DHB đo thế oxy hóa khử của phản ứng khử NAD+ thành dạng NADH Phương pháp rất nhanh và đặc hiệu cho việc xác định fomat, nhưng việc chế tạo điện cực không kinh tế do sử dụng các enzym

Cũng trên nền điện cực glassy cacbon, Park và các cộng sự [34] lại sử dụng

hạt nano platin để bọc điện cực, sau đó 1 lớp silicone epoxy 300nm được bọc bên ngoài điện cực, sau 12 tiếng điện cực được sử dụng để định lượng metanol Đầu tiên, metanol hấp phụ trên bề mặt điện cực, lớp silicon có tác dụng làm giảm ảnh hưởng của sự hấp phụ CO(được tạo thành trong quá trình phản ứng) lên bề mặt điện cực và làm nhiễm bẩn bề mặt Pic oxi hóa của metanol xuất hiện ở +0,5V, giới hạn phát hiện 3,2 mg/l

19

1.2.3 Phương pháp 1 H – NMR

1.2.3.1 Nguyên tắc của phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân

Hạt nhân của mỗi đồng vị của một nguyên tử được đặc trưng bởi số lượng tử spin L.Số lượng tử spin L phụ thuộc vào số protonvà số notron

Bảng 1 1: Tương quan giữa số lượng tử L và số hạt proton, notron

Khi đặt hạt nhân từ có L= 1/2 vào trong từ trường sẽ xảy ra sự chia thành 2 mức năng lượng khác nhau có hiệu số chênh lệch là :

Vì ∆E= Hv nên ta có (ct 3)

20

Kết luận: Để có được phổ cộng hưởng từ hạt nhân ta cần đặt mẫu nghiên cứu vào một từ trường mạnh, có cường độ Bo và tác dụng lên mẫu một sóng vô tuyến có tần số ν thỏa mãn phương trình trên

1.2.3.2 Sơ đồ khối nguyên tắc hoạt động

Sơ đồ khối về nguyên tắc hoạt động của máy NMR được thể hiện trên hình 1.2 Mẫu hợp chấy hữu cơ được hòa tan trong dung môi thích hợp (CDCl3, khoảng 0,5 ml), dung dịch này được đặt vào ống thủy tinh có đường kính 5mm dài 20 cm Ống này được đặt thẳng đứng , giữa 2 cực nam châm, sao cho từ trường đi qua ống,

và quay quanh trục với vận tốc khoảng 30 vòng/giây Từ trường của nam châm (B0)

sẽ khiến cho các hạt nhân 1H hoặc 13C định hướng song song cùng chiều hoặc song song ngược chiều với hướng từ trường của nam châm Sau đó mẫu chất được chiếu

xạ bởi năng lượng của sóng radio Dưới tác dụng của tần số bức xạ không đổi, mỗi hạt nhân sẽ cộng hưởng tại 1 lực từ trường khác nhau, khi thay đổi từ trường áp dụng Bộ phận ghi nhận tín hiệu ghi lại sự hấp thu năng lượng sóng radio của mẫu

21

dụng các mẫu chuẩn có thêm các chất tiêu chuẩn tham chiếu (Ví dụ Tetramethylsilan) Từ đó có thể xác định chính xác độ dịch chuyển hóa học của các pic trong phổ 1H – NMR

Dựa vào hình dáng pic, độ bội của pic và độ dịch chuyển hóa học có thể định tính được hợp chất có trong mẫu thông qua phổ 1H – NMR

Nguyên lý cơ bản nhất để định lượng một chất bằng 1H - NMR [6],[ 14] là :

cường độ pic trong phổ NMR tỉ lệ thuận với số nguyên tử tham gia cộng hưởng:

(ct 4)Trong đó, Ks là hằng số bị ảnh hưởng bới các yếu tố :

1 Xung kích thích (pulse excitation)

2 Thời gian lặp (Repetition time)

3 Broad-band decoupling

1.2.3.4 Nghiên cứu loại tín hiệu của dung môi nước

Do độ phân giải của phổ được giới hạn ở 65536 điểm, nên khi pic của dung môi cao sẽ làm giảm độ phân giải của các tín hiệu nồng độ thấp Để làm nổi bật các pic có nồng độ thấp, chúng ta có thể triệt tiêu một phần hoặc hoàn toàn pic của nước bằng cách sử dụng các xung chọn lọc cường độ thấp, liên tục có tần số trùng với tần

số cộng hưởng của nước (tần số O1) hoặc triệt tiêu các gradient tín hiệu Phương pháp triệt tiêu dung môi thông thường có thể làm mất đi một số thông tin, đặc biệt là tương tác của nhóm OH Bởi vậy, xung NOESY được sử dụng kết hợp với xung bão hoà có thể khắc phục được nhược điểm này

Hai phép đo triệt tiêu dung môi được sử dụng gồm có:

 Chương trình đo triệt tiêu dung môi bằng xung bão hoà

Chương trình đo triệt tiêu dung môi thông thường sử dụng một xung yếu nhưng liên tục có tần số trùng với tần số của dung môi trước khi dùng xung chính

để làm thay đổi hướng của momen spin Xung này sẽ làm cho tín hiệu của dung môi

22

bị bão hoà và bị triệt tiêu phần lớn trên tín hiệu thu về Phương pháp này có nhược điểm là triệt tiêu không triệt để pic nước trong khi lại triệt tiêu hoàn toàn các tương tác (nếu có) của nhóm OH

Hình 1 5: Sơ đồ chương trình xung ZGPR

Trong đó, d1 là khoảng thời gian trước khi xung chính bắt đầu phát (pre-scan delay), p1 là xung chính tác động làm lệch vị trí của moment spin hạt nhân, p19 là xung bão hoà dung môi, cường độ thấp (khoảng 25 Hz)

- Thông số của chương trình đo :

Chương trình xung (Pulse Prog) : ZGPR Số lần quét (NS) : 01 Time domaine (TD) : 65k (65536 điểm) d1 : 4s

Độ rộng phổ (SW) : 20 ppm Thời gian đo (Acquisition time) : 3,27 s Tần số xung bão hoà dung môi (O1) : khoảng 4,7 ppm (được xác định từ phổ

1H-NMR bình thường của mẫu đo)

 Chương trình đo triệt tiêu dung môi sử dụng chương trình xung NOESY Chương trình đo triệt tiêu dung môi sử dụng dạng 1D của phép đo NOESY Chương trình sử dụng một xung yếu, liên tục trùng với tần số cộng hưởng của nước trước khi có xung chính NOESY và trong thời gian pha trộn (mixing time), giống như phép đo zgpr Phương pháp NOESY cho phép một phần tương tác của nhóm

OH xuất hiện trên phổ

23

149

B7170_00_01

This experiment is performed by using the 1-D version of the noesyphpr sequence applying a low-power continuous wave irradiation on the water resonance during the pre-scan and the during the mixing time period of the NOESY sequence, see Figure 7.21

Figure 7.22

1 Follow the instructions in paragraphs 6.2.2 through 6.2.6 step 9 in this chapter

2 Select the ‘AcquPars’ tab by clicking on it

3 Make the following changes:

1 Process and phase correct the spectrum

Hình 1 6: Sơ đồ chương trình xung NOESYPR1D

- Thông số của chương trình xung : Chương trình xung (Pulse Prog) : NOESYGPPR1D Thời gian pha trộn (d8) : 0,1 s

Tần số xung bão hoà (O1) : khoảng 4,7 ppm

1.2.3.5 Ưu nhược điểm của phương pháp so với sắc ký

Phương pháp NMR cho phép đo nhanh với mỗi mẫu chỉ mất từ 12-15 phút, việc chuẩn bị mẫu đơn giản, sử dụng rất ít dung môi Mỗi mẫu đo chỉ cần 1 mL (gồm cả dung môi), dung môi rất rẻ khi sử dụng hỗn hợp gồm 90% H20 và 10%

D2O Thiết bị NMR không mất thời gian để khởi động (như sắc ký) Ngoài xác định methanol thì tất cả các thành phần khác trong mẫu đều có thể được xác định trong một lần đo

Từ những ưu nhược điểm kể trên, cộng với việc giá thành của thiết bị đang trở nên hợp lý hơn thì NMR, trong nhiều trường hợp, có thể thay thế cho phương pháp sắc ký Nhiều nước và các tổ chức quốc tế đang xây dựng các bộ tiêu chuẩn để

có thể chuẩn hoá và ứng dụng NMR trong phân tích, thay thể một phần phương pháp sắc ký truyền thống

1.2.3.6 Một số nghiên cứu định lượng bằng phổ 1 H- NMR

Axit fomic cho phổ 1H-NMR với độ dịch chuyển hóa học tại 8,2-8,4 mg/l

Berregi và các cộng sự [42]sử dụng 1H-NMR 1,3,5-Benzenetricarboxylic axit làm chất nội chuẩn phân tích axit fomic trong nước ép táo tại pH 2,74 với giới hạn phát

24

hiện được là 1,49mg/l Compo và các cộng sự [38], phân tích format trong mẫu

coffee sử dụng 3-(Trimethylsilyl)-2,2,3,3- tetradeuteropropionic axit làm chất nội chuẩn phương pháp có thể định tính được format ở nồng độ 0,45mg/g

Để kiểm soát chất lượng của các chế phẩm thuốc truyền thống của Trung Quốc, chữa bệnh đột quỵ, 9 loại axit salvianolic và mannito được định lượng đồng thời bằng phương pháp 1H-NMR [31] với thời gian phân tích ngắn 14 phút Ngoài

ra, định lượng axit salvianolic B giúp theo dõi quá trình phân hủy của sal B trong điều kiện thiếu oxy [55]

Stachydrin được định lượng trực tiếp từ tín hiệu đo bằng 1H-NMR thông qua cách tính theo công thức Tín hiệu của stachydrin được xác định trên phổ 1H-NMR

có độ địch chuyển hóa học tại 3,03ppm Chât nội chuẩn là maletic axit với độ địch chuyển hóa học là 6,18ppm [47]

Các hợp chất phenethyamin là những chất phổ biến được tìm thấy trong các thực phẩm hỗ trợ giảm cân và dinh dưỡng thể thao Nhiều hợp chất phenethyamin nằm trong danh sách cấm của Cơ quan Chống Doping thế giới 1H-NMR được sử dụng để xác định hàm lượng đồng thời của 8 hợp chất phenethyamin trong 32 sản phẩm bỏ sung dinh dưỡng bán ở thị trường Mỹ [66].Giới hạn phát hiện của phương pháp với các chất thấp 2,7- 4,3 µg/ml Khoảng tuyến tính rộng 1,8 – 3000 µg/ml

Phương pháp 1H-NMR được sử dụng để xác định hàm lượng taurin có trong

đồ uống tại pH 11 [41] Việc định lượng các chất được thực hiện bằng phương pháp đường chuẩn và PULCON Kết quả phân tích được so sánh với phương pháp LC – UV/Vis cho độ thu hồi và sai số nằm trong giới hạn cho phép

Ngoài ra, phương pháp 1H-NMR còn được sử dụng để xác định các axit béo

tự do trong dược phẩm [60], định lượng nhanh các thành phần chính của dầu café xanh sử dụng phổ 1H và 13C [33]

Bên cạnh đó, phương pháp NMR còn có thể sử dụng để xác định nguồn gốc của mật ong thông qua tín hiệu của một số hợp chất hidrocacbon như axit fomic, etanol, phenylalanin, tyrosin [37], [53]

25

Hiện tại, trên thế giới chưa có công trình nghiên cứu công bố quy trình phân tích metanol bằng phương pháp 1H – NMR

1.3 Các kỹ thuật tủa protein trong xử lý mẫu sinh học

Các mẫu sinh học (máu, huyết tương, huyết thanh) thường có chứa tỉ lệ lớn các protein và các chất nội sinh làm cản trở gây ảnh hưởng tới khả năng phát hiện chất phân tích Do đó, mẫu cần phải được chiết tách, xử lý để loại bỏ các tạp chất Đặc biệt trong phân tích định tính metanol, do protein có chứa các axit amin gây ảnh hưởng tới phản ứng oxy hóa metanol thành fomandehit, làm sai lệch kết quả phân tích Phương pháp tủa protein dựa trên sự biến tính làm mất cấu trúc bâc 2 và bậc 3 của các protein có trong nền mẫu sinh học Các tác nhân gây tủa protein trong dịch sinh học gồm nhiệt độ, môi trường axit mạnh hay bazơ, các dung môi hữu cơ, các muối vô cơ [17] Ngoài ra, cũng có thể kết tủa protein bằng các polyme không ion hoặc các ion kim loại hoặc loại bỏ protein và các phân tử có khối lượng lớn bằng phương pháp siêu lọc [18]

Tủa protein bằng dung môi hữu cơ: Độ hòa tan của protein trong dung dịch phụ thuộc vào nhiều yếu tố, một trong số đó là hằng số điện môi của dung dịch Những phân tử dung môi có hằng số điện môi lớn như nước có thể ổn định tương tác giữa chúng với các phân tử protein và tạo điều kiện thuận lợi cho sự hòa tan của protein trong dung dịch Ngược lại, các dung môi với hằng số điện môi nhỏ như acetonitril, khi có mặt trong mẫu chúng ngăn cản sự phân tán của các phân tử protein tronng môi trường làm giảm độ hòa tan của các protein và xảy ra kết tủa

Tủa protein bằng muối vô cơ, một số muối như (NH4)2SO4, NaCl… vừa làm trung hòa điện vừa loại bỏ lớp vỏ hydrat của phân tử protein gây ra hiện tượng keo

tụ

Kết tủa protein bằng cách thay đổi pH: mỗi protein sẽ có một điểm đẳng điện (pI) Ở giá trị pH = pI, phân tử protein trung hòa điện sẽ không chuyển dịch trong điện trường, phân tử protein sẽ kém bền nhất và dễ bị kết tủa, các tác nhân gây tủa protein do thay đổi pH thường là các axit như tricloroaxetic axit (TCA) ở nồng độ

tương tự cũng được Haudenschild và các cộng sự công bố năm 2014 [36]

Jiang và các cộng sự [49], so sánh 5 phương pháp sử dụng để kết tủa protein

Tác giả đã sử dụng TCA 60%, aceton, (NH4)2SO4, chloroform/ metanol và phương pháp siêu lọc để loại bỏ protein Kết quả đo điện di gel 2 chiều cho thấy, sự kết tủa với TCA và acetone và phương pháp siêu lọc hiệu quả tương đương với nhau tại cùng nồng độ mẫu và có thể khử muối Việc sử dụng (NH4)2SO4 từng phần hiệu quả

để bỏ albumin, chiếm hơn 50% protein huyết tương

Tương tự như nghiên cứu trên, Nejadi và các cộng sự [52], cũng đã so sánh 3

phương pháp thông thường loại bỏ protein là sử dụng aceton, TCA/ rửa aceton và TCA/Aceton Kết quả cho thấy, sử dụng aceton kết tủa thì ổn định và đơn giản hơn

2 phương pháp còn lại

1.4 Tổng kết chung phần tổng quan

Để đáp ứng việc chẩn đoán nhanh và đưa ra phác đồ điều trị cho các bệnh nhân ngộ độc metanol việc xây dựng kit thử xác định nhanh metanol trong huyết tương là rất cần thiết để kịp thời điều trị cho bệnh nhân ngay tại tuyến cơ sở Việc xác định nhanh metanol trong rượu và huyết tương từ lâu đã được quan tâm và có nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới đã được công bố Tuy nhiên các phương pháp được sử dụng để xác định nhanh metanol tương đối đắt tiền và không phổ biến

do sử dụng các loại men sinh học Tại Việt Nam, chưa có công trình khoa học nào công bố quy trình xác định nhanh metanol trong huyết tương Do vậy, mục tiêu của

đề tài là xây dựng kit thử xác định nhanh metanol trong huyết tương bằng phương pháp so màu và áp dụng phương pháp vào phân tích trên mẫu huyết tương của các bệnh nhân

27

Việc xác định nhanh metanol trong huyết tương có ý nghĩa trong việc chẩn đoán và đưa ra phác đồ điều trị sớm Tuy nhiên, để theo dõi hiệu quả của quá trình điều trị ngộ độc metanol cần phải phân tích định lượng được metanol, etanol và sản phẩm chuyển hóa của chúng do sử dụng etanol làm chất giải độc Các phương pháp định lượng metanol, etanol và các sản phẩm chuyển hóa của chúng trong mẫu sinh học được nghiên cứu bằng rất nhiều phương pháp khác nhau (GC –FID, GC-MS, UV-Vis) Phương pháp 1H – NMR là một phương pháp mới và vẫn ít được sử dụng

ở Việt Nam để phân tích định lượng các chất Đây là phương pháp phân tích hiện đại có độ đúng cao và có thể phân tích đồng thời nhiều chất Hơn nữa, thời gian phân tích ngắn, phương pháp xử lý mẫu đơn giản, giá thành thấp nếu sử dụng dung môi nước Phương pháp này hoàn toàn phù hợp để phân tích đồng thời metanol, etanol và các sản phẩm chuyển hóa trong nền huyết tương Hiện này, cũng chưa có công trình khoa học nào sử dụng phương pháp 1H – NMR để định lượng đồng thời metanol, etanol và sản phẩm chuyển hóa của chúng Nghiên cứu này hy vọng sẽ đóng góp thêm vào việc mở rộng khả năng ứng dụng của phương pháp 1H – NMR trong lĩnh vực phân tích

28

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Trang thiết bị và hoá chất

2.1.1 Hoá chất

Tất cả các loại hóa chất sử dụng đều ở dạng tinh khiết phân tích (LC) Các dung dịch chuẩn được pha bằng nước deion

Các dung dịch chuẩn gốc:

 Metanol(CH3OH), MW = 32,04 g/mol, d=0,79kg/l, LC, Merck, 99,99%

Dung dịch chuẩn gốc metanol 7900 mg/l: lấy 1,00 ml dung dịch metanol 99,99% (m = v.d = 790 mg) cho vào bình định mức 100 ml, sau đó thêm nước deion đến vạch định mức

Lấy 1,00 ml dung dịch gốc CH3OH pha loãng thành 10,00 ml ta được dung dịch làm việc hàng ngày 790 mg/l Dung dịch sau khi pha loãng được dùng trong ngày

 Etanol(CH3CH2OH), MW = 46,07 g/mol, d=0,79kg/l, LC, Merck, 99,99% Dung dịch chuẩn gốc etanol 7900mg/l: lấy 1,00 ml dung dịch etanol 99,99% (m

= v.d = 790mg) cho vào bình định mức 100 ml, sau đó thêm nước deion đến vạch định mức

Lấy 1,00 ml dung dịch gốc CH3CH2OH pha loãng thành 10,00 ml ta được dung dịch làm việc hàng ngày 790 mg/l Dung dịch sau khi pha loãng được dùng trong ngày

 Fomandehit (HCHO), MW = 30,03 g/mol, d=0,815kg/l , PA, Merck, 38% Dung dịch chuẩn gốc fomandehit 3097 mg/l: lấy 1,00 ml dung dịch fomandehit 38% (m = v.d.38%= 309,7mg) cho vào bình định mức 100 ml, sau đó thêm nước deion đến vạch định mức

Lấy 1,00 ml dung dịch gốc HCHO pha loãng thành 10,00 ml ta được dung dịch làm việc hàng ngày 309,7 mg/l Dung dịch sau khi pha loãng được dùng trong ngày