Xác định amlodipin besilat và perindopril tert butylamin bằng phương pháp điện di mao quản

Phương pháp điện di mao quản tích hợp detector đo độ dẫn không tiếp xúc CE-C4D được biết đến là một phương pháp phân tích mới tại Việt Nam, với trang bị nhỏ gọn, có thể tự động hóa và tr

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

TRẦN NGỌC HẰNG

XÁC ĐỊNH AMLODIPIN BESILAT VÀ PERINDOPRIL TERT-BUTYLAMIN

BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2018

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

TRẦN NGỌC HẰNG

XÁC ĐỊNH AMLODIPIN BESILAT VÀ PERINDOPRIL TERT-BUTYLAMIN

BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN

Chuyên ngành: Hóa phân tích

Mã số: 60440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS LÊ ĐÌNH CHI PGS.TS PHẠM THỊ NGỌC MAI

Hà Nội – 2018

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên tôi xin chân thành cảm ơn TS Lê Đình Chi và PGS.TS Phạm Thị Ngọc Mai đã giao đề tài, nhiệt tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Thị Ánh Hường đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu

Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn tới công ty 3S Analysis đã thiết kế lắp đặt và

hỗ trợ các trang thiết bị trong quá trình thực hiện nghiên cứu này

Tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy cô trong Bộ môn Hóa Phân tích nói riêng

và trong khoa Hóa học nói chung đã dạy dỗ, chỉ bảo và động viên tôi trong thời gian học tập tại trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn gia đình, các bạn học viên và sinh viên bộ môn Hóa phân tích đã giúp đỡ tôi trong thời gian học tập và nghiên cứu này

Hà Nội, ngày 30 tháng 01 năm 2018

Học viên

Trần Ngọc Hằng

i

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH MỤC CÁC BẢNG iv

DANH MỤC CÁC HÌNH vi

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Giới thiệu chung 3

1.1.1 Thông tin chung về amlodipin besilat và perindopril tert-butylamin 3

1.1.2 Tính chất vật lý, vai trò và tác dụng phụ 4

1.2 Các phương pháp xác định 7

1.2.1 Phương pháp sắc ký 7

1.2.2 Phương pháp quang phổ 9

1.2.3 Phương pháp điện hóa 10

1.2.4 Các phương pháp điện di mao quản (CE) 11

1.3 Phương pháp điện di mao quản 13

1.3.1 Độ điện di, tốc độ điện di và thời gian điện di 14

1.3.2 Mao quản 15

1.3.3 Dòng điện di thẩm thấu (EOF) 16

1.3.4 Dung dịch đệm pH và pha động trong phương pháp điện di mao quản 19

1.3.5 Kỹ thuật bơm mẫu trong phương pháp điện di mao quản 19

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 21

2.1 Đối tượng, mục tiêu và nội dung nghiên cứu 21

2.1.1 Đối tượng và mục tiêu nghiên cứu 21

2.1.2 Nội dung nghiên cứu 21

2.2 Phương pháp nghiên cứu 22

2.2.1 Phương pháp khảo sát xác định các điều kiện thích hợp 22

ii

2.2.2 Phương pháp xử lý mẫu 23

2.3 Hóa chất và thiết bị 25

2.3.1 Hóa chất 25

2.3.2 Thiết bị dụng cụ 26

2.4 Các thông số đánh giá độ tin cậy của phương pháp phân tích 28

2.4.1 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp phân tích 28

2.4.2 Độ chụm (độ lặp lại) của phương pháp 29

2.4.3 Độ đúng (độ thu hồi) của phương pháp 29

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

3.1 Nghiên cứu khảo sát tối ưu điều kiện xác định amlodipin bessilat và perindopril tert-butylamin bằng phương pháp điện di mao quản CE-C4D 31

3.1.1 Khảo sát ảnh hưởng của hệ đệm 31

3.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian bơm mẫu và chiều cao bơm mẫu 38

3.2 Xây dựng đường chuẩn cho các chất phân tích và đánh giá phương pháp phân tích 41

3.2.1 Xây dựng đường chuẩn 41

3.2.2 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp43 3.2.3 Đánh giá độ chụm (độ lặp lại) và độ đúng (độ thu hồi) 44

3.3 Phân tích mẫu thuốc 47

3.3.1 Mẫu dược phẩm Coveram chứa Amlodipin besilat và Perindopril tert-butylamin 48

3.3.2 Mẫu thuốc Coversyl 49

3.3.3 Mẫu dược phẩm Ambelin và Amlodipin 51

3.4 Xây dựng quy trình chiết pha lỏng Amlodipin besilat trong mẫu nước tiểu nhằm xác định bằng phương pháp CE – C4D 53

3.4.1 Khảo sát lựa chọn dung môi 53

iii

3.4.2 Khảo sát lựa chọn pH chiết 55 3.4.3 Khảo sát ảnh hưởng của thể tích dung môi 56 3.4.4 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian lắc 58 3.4.5 Đánh giá phương pháp phân tích Amlodipin besilat trong mẫu nước tiểu bằng phương pháp CE – C4D kết hợp xử lý mẫu phân tích bằng chiết lỏng – lỏng59 3.4.6 Phân tích mẫu nước tiểu thực tế 61 KẾT LUẬN 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

iv

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Thông tin chung về amlodipin besilat và perindopril tert-butylamin 3 Bảng 1.2 Các chất thường dung làm pha động trong CE và giá trị pK của chúng 19 Bảng 2.1 Thông tin và đặc điểm của từng loại mẫu dược phẩm 23 Bảng 3.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng pH đến diện tích pic (Spic) và thời gian di

chuyển (tdc) của Am, Per 32 Bảng 3.2 Kết quả khảo sát sự phụ thuộc diện tích pic của Am và Per vào thành phần

hệ đệm điện di 35 Bảng 3.3 Kết quả khảo sát sự phụ thuộc của diện tích pic (Spic) và thời gian di

chuyển (tdc) của Am và Per vào nồng độ dung dịch đệm điện di 37 Bảng 3.4 Kết quả sự phụ thuộc diện tích pic (Spic) và thời gian di chuyển (tdc) của

Am và Per vào thời gian bơm mẫu 39 Bảng 3.5 Kết quả sự phụ thuộc diện tích pic (Spic) và thời gian di chuyển (tdc) của

Am và Per vào chiều cao bơm mẫu 39 Bảng 3.6 Điều kiện tối ưu cho phân tích hỗn hợp Am và Per bằng phương pháp CE

– C4D 41 Bảng 3.7 Sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ Am và Per 42 Bảng 3.8: Phương trình đường chuẩn của Am và Per 43 Bảng 3.9 Giới hạn phát hiện Am và Per bằng phương pháp điện di mao quản CE-

C4D 44 Bảng 3.10 Giá trị khoảng tuyến tính, LOD và LOQ của chất phân tích Am và Per 44 Bảng 3.11 Kết quả xác định độ lặp lại của phương pháp CE-C4D trong định lượng

Am 45 Bảng 3.12 Kết quả xác định độ lặp lại của phương pháp CE-C4D trong định lượng Per

45 Bảng 3.13 Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp dựa trên thêm chuẩn Am 47

v

Bảng 3.14 Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp dựa trên thêm chuẩn Per 47

Bảng 3.15 Kết quả xác định nồng độ Am và Per trong mẫu thuốc Coveram 49

Bảng 3.16 Kết quả xác định nồng độ Per trong mẫu dược phẩm Coversyl 50

Bảng 3.17 Kết quả xác định nồng độ Am trong mẫu dược phẩm Amlodipin 52

Bảng 3.18 Kết quả xác định nồng độ Am trong mẫu dược phẩm Ambelin 53

Bảng 3.19 Độ lặp lại của phương páp CE – C4D xác định Am kết hợp xử lý mẫu nước tiểu bằng chiết lỏng – lỏng 60

Bảng 3.20 Độ thu hồi của phương pháp CE – C4D xác định Am kết hợp xử lý mẫu nước tiểu bằng chiết lỏng – lỏng 61

Bảng 3.21 Hàm lượng Am trong mẫu nước tiểu M1, M2 và M3 63

vi

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Sơ đồ phân tích hệ điện di mao quản 14

Hình 1.2: Mặt cắt ngang của mao quản 15

Hình 1.3: Lớp điện tích kép trên bề mặt mao quản 16

Hình 1.4: Ảnh hưởng của dòng EOF đến tốc độ của các ion trong quá trình điện di 16 Hình 1.5: Nguyên lý hoạt động của cảm biến đo độ dẫn không tiếp xúc 18

Hình 1.6: Các kĩ thuật bơm mẫu trong phương pháp điện di mao quản 20

Hình 2.1: Ảnh chụp thiết bị CEC4D triển khai tại Việt Nam 27

Hình 3.1a Điện di đồ khảo sát sự ảnh hưởng của pH đến sự phân tách của Am 33

Hình 3.1b Điện di đồ khảo sát sự ảnh hưởng của pH đến sự phân tách của Per 33

Hình 3.2 Điện di đồ khảo sát sự ảnh hưởng của thành phần hệ đệm đến sự phân tách của Am, Per 36

Hình 3.3 Điện di đồ khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung dịch đệm điện di đến quá trình phân tách các chất Am và Per 37

Hình 3.4 Điện di đồ khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian bơm mẫu 39

Hình 3.5 Điện di đồ khảo sát sự ảnh hưởng của chiều cao bơm mẫu 40

Hình 3.6 Đường chuẩn của Am theo diện tích 42

Hình 3.7 Đường chuẩn của Per theo diện tích 43

Hình 3.8 Điện di đồ xác định Am và Per sau khi thêm chuẩn Am và Per ở các nồng độ khác nhau 48

Hình 3.9 Điện di đồ xác định Per sau khi thêm chuẩn Per ở các nồng độ khác nhau. 50

Hình 3.10 Điện di đồ xác định Am trong mẫu dược phẩm Amlodipin sau khi thêm chuẩn Am ở các nồng độ khác nhau 51

Hình 3.11 Điện di đồ xác định Am trong mẫu dược phẩm Ambelin sau khi thêm chuẩn Am ở các nồng độ khác nhau 52

vii

Hình 3.12 Điện di đồ xác định Am trong mẫu nước tiểu với các dung môi chiết khác

nhau 54

Hình 3.13 Hiệu suất thu hồi xác định Am với các dung môi chiết khác nhau 54

Hình 3.14 Điện di đồ xác định Am tại các pH chiết khác nhau 55

Hình 3.15 Biểu đồ sự phụ thuộc của hiệu suất thu hồi vào pH 56

Hình 3.16 Điện di đồ xác định Am với các thể tích dung môi chiết khác nhau 57

Hình 3.17 Biểu đồ thể hiện sự phụ thuộc của hiệu suất thu hồi vào thể tích dung môi chiết 57

Hình 3.18 Điện di đồ xác định Am tại thời gian lắc khác nhau 58

Hình 3.19 Biểu đồ thể hiện sự phụ thuộc của hiệu suất chiết vào thời gian lắc 59

Hình 3.20 Điện di đồ phân tích mẫu nước tiểu thực tế M1sau 10h uống thuốc 61

Hình 3.21 Điện di đồ phân tích mẫu nước tiểu thực tế M1 sau 12h uống thuốc 62

Hình 3.22 Điện di đồ phân tích mẫu nước tiểu thực tế M1 sau 14h uống thuốc 62

AOAC Hiệp hội các nhà hóa học phân tích

C4D Detector độ dẫn kết nối kiểu tụ điện

Leff Chiều dài hiệu dụng của mao quản

MEKC Điện di mao quản điện động học Mixen

1

MỞ ĐẦU

Cùng với sự phát triển nhanh chóng của xã hội hiện đại, chất lượng cuộc sống

và sức khỏe con người được quan tâm nhiều hơn Tỉ lệ những người mắc bệnh tăng huyết áp, suy tim, đau tim ngày càng cao do các thói quen sinh hoạt, chế độ ăn uốngkhông hợp lí hoặc do yếu tố di truyền và tuổi tác Theo số liệu thống kê của Tổ chức

Y tế Thế giới, tăng huyết áp ảnh hưởng đến sức khỏe của hơn 1 tỷ người trên toàn thế giới và là yếu tố nguy cơ tim mạch quan trọng nhất liên quan đến bệnh mạch vành, suy tim, bệnh mạch máu não và bệnh thận mãn tính Năm 2015, trong số 17,7 triệu người

tử vong do các bệnh tim mạch, chiếm 31% tổng số ca tử vong toàn cầu, ước tính tăng huyết áp là nguyên nhân trực tiếp gây tử vong của 7,1 triệu người [17] Nếu điều trị tốt bệnh tăng huyết áp có thể làm giảm đến 50% nguy cơ mắc suy tim ở người bệnh Năm

2015 Hội tim mạch học Việt Nam đã nghiên cứu và thống kê được 5.454 trường hợp trong tổng số 44 triệu người ở 8 tỉnh thành của Việt Nam mắc bệnh cao huyết áp, tương đương với 47,3% dân số

Amlodipin besilat kết hợp perindopril tert-butylamin là một trong những thuốc được sử dụng phổ biến trong việc điều trị, kiểm soát, phòng chống và cải thiện những bệnh, hội chứng như cao huyết áp, mãn cơn đau thắt ngực ổn định, suy tim, đau tim Tuy nhiên hiện nay nhiều doanh nghiệp sản xuất thuốc vì lợi ích kinh tế đã sản xuất ra những sản phẩm kém chất lượng, không đạt hàm lượng hay không có hoạt chất như trên bao bì làm ảnh hưởng đến khả năng điều trị bệnh cũng như sức khỏe của con người Vì vậy, việc nghiên cứu xây dựng một quy trình định lượng amlodipin besilat

và perindopril tert-butylamin đơn giản, dễ thực hiện và có độ chính xác cao là hết sức cần thiết

Phương pháp điện di mao quản tích hợp detector đo độ dẫn không tiếp xúc

(CE-C4D) được biết đến là một phương pháp phân tích mới tại Việt Nam, với trang bị nhỏ gọn, có thể tự động hóa và triển khai tại hiện trường với lượng nhỏ mẫu và hóa chất,

2

chi phí phân tích thấp Phương pháp cho thấy tiềm năng sử dụng với các ứng dụng thiết thực tại Việt Nam, trong đó có việc phân tích hàm lượng các chất trong mẫu dược

phẩm Vì vậy, chúng tôi đã lựa chọn đề tài “Xác định amlodipin besilat và

perindopril tert-butylamin bằng phương pháp điện di mao quản”, hy vọng sẽ góp

một phần nhỏ bé vào việc phát triển các quy trình phân tích kiểm tra hàm lượng các chất trong dươ ̣c phẩm và mẫu sinh học

3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung

Amlodipin besilat là muối besilat của amlodipin, một dẫn xuất của dihydropyridin tổng hợp Amlodipin nằm trong một nhóm thuốc gọi là thuốc chẹn kênh canxi có tác dụng chẹn canxi qua màng tế bào, chống cao huyết áp và điều trị đau thắt ngực [9, 14, 20, 32]

Perindopril tert-butylamin là muối tert-butylmin của perindopril, là một thuốc

ức chế men chuyển angiotensine (ACE) [20, 27, 30]

1.1.1 Thông tin chung về amlodipin besilat và perindopril tert-butylamin

Một số thông tin chung về amlodipin besilat và perindopril tert-butylamin như công thức phân tử, cấu tạo phân tử và khối lượng phân tử được đưa ra trong bảng 1.1

Bảng 1.1 Thông tin chung về amlodipin besilat và perindopril tert-butylamin [7, 8,

14, 20, 21, 27]

Tên chất Amlodipin besilat Perindopril tert-butylamin

Tên hóa học

2-[(2-Aminoethoxy) methyl]-4-(2–chlorophenyl)-1,4–dihydro–6–methyl–3,5–

pyridinedicarboxylic acid 3–

ethyl 5–methyl ester

(2S, 3αS, 7αS)-1-[(S)-N - [(S)-1-carboxy-butyl] alanyl]

indolinecarboxylic acid, 1-ethylester, kết hợp với tert-

hexahydro-2-butylamine (1: 1)

Công thức phân tử C26H31CIN2O8S C23H33N3O5

- Cơ chế hoạt động: Amlodipin besilat ức chế sự xâm nhập của ion canxi đi qua màng vào tế bào cơ tim và các mô cơ trơn của thành mạch máu bằng cách ngăn chặn những kênh canxi chậm của màng tế bào Ức chế sự gia tăng canxi ban đầu làm giảm

5

hoạt động co bóp của các tế bào động cơ trơn do đó ngăn ngừa sự co mạch và cơ tim co lại Điều này dẫn đến sự giãn nở các động mạch vành chính cả vùng bình thường lẫn vùng thiếu máu, giảm sự co bóp cơ tim, tăng lưu lượng máu và cung cấp oxy đến mô

cơ tim và giảm tổng kháng ngoại vi, kéo theo hạ huyết áp và chống đau thắt ngực [9]

- Amlodipin besilat được hấp thụ tốt sau khi uống nên sự phân phối thuốc rất rộng trong cơ thể, tuy nhiên thuốc hấp thu chậm và gần như hoàn toàn ở đường tiêu hóa, sự hấp thu không bị ảnh hưởng bởi thức ăn Nồng độ đỉnh trong huyết tương đạt được từ 6-12 giờ sau khi uống, sinh khả dụng từ 64 – 80%, thể tích phân khối khoảng

20 l/kg Trong gan thuốc được chuyển hóa chủ yếu thành những chất chuyển hóa bất hoạt, 10% thuốc chưa chuyển hóa và 60% chất chuyển hóa được bài tiết theo nước tiểu Thuốc thải trừ theo hai pha, thời gian bán thải cuối cùng trung bình là 35 – 50 giờ Thuốc không có tác dụng chuyển hóa có hại, không ảnh hưởng đến lipid huyết tương

Ở những người bệnh cao huyết áp liều một lần/ngày làm giảm huyết áp tới mức độ có ý nghĩa lâm sàng hơn 24 giờ ở tư thế nằm lẫn đứng

- Tác dụng phụ: Trong những nghiên cứu lâm sàng có kiểm chứng thu nhận từ người bệnh cho thấy những tác dụng phụ thường gặp nhất của amlodipin besilat là phù,

nề, sưng bàn tay, bàn chân, mắt cá chân, nhức đầu, mệt mỏi, buồn nôn, đau bụng hồi hộp, choáng váng Ngoài ra còn có các tác dụng phụ khác là thay đổi hoạt động tiêu hóa, đau khớp, suy nhược, khó tiêu, tăng sản lợi, nổi mẩn, loạn thị giác [9]

tert-đó làm giãn tĩnh mạch, khôi phục tính đàn hồi của động mạch lớn, giảm áp lực đổ đầy vào thất trái và phải, tăng lưu lượng máu đến cơ

- Perindopril dùng theo đường uống, được hấp thu nhanh, tỉ lệ hấp thu chiếm 65-70 % liều dùng Thức ăn có thể làm thay đổi lượng perindoprilat hình thành sau khi chuyển hóa từ perindopril Đỉnh hấp thu của perindoprilat trong huyết tương đạt được sau 3 đến 4 giờ Thời gian bán hủy của perindoprilat khoảng 24 giờ Các nồng độ của perindoprilat trong huyết tương tăng đáng kể ở bệnh nhân có thanh thải creatinine dưới

60 ml/phút

- Tác dụng phụ về phương diện lâm sàng khi sử dụng perindopril tert-butylamin:

Ho khan, phù mạch, nhức đầu, suy nhược, buồn nôn, thay đổi vị giác chóng mặt, rối loạn tính khí, rối loạn giấc ngủ, phát ban ngoài da, đau bao tử…Về phương diện sinh học: tăng vừa phải ure, creatinin và kali huyết, thiếu máu [27]

1.1.2.3 Kết hợp amlodipin besilat và perindopril tert-butylamin

Perindopril tert-butylamin là một chất ức chế men chuyển angiotensin Amlodipin besilat là một chất đối kháng canxi Perindopril và amlodipin hoạt động kết

Trong công trình nghiên cứu của tác giả A.Zarghi và các cộng sự [8] đã sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) để định lượng amlodipin trong huyết tương Amlodipin sau khi được tách ra khỏi nền mẫu được làm khô bằng khí nitơ, cặn được hòa tan trong 100 µl pha động là hỗn hợp của dung dịch natri dihydrogen phosphat 0,01 M và acetonitril (63:37, v/v) điều chỉnh tới pH 3,5 và bơm 50 µl vào thiết bị phân tích, sử dụng cột Nucleosil C8 (125 x 4,6 mm) với tốc độ dòng chảy là 1,5 ml/phút, bước sóng được đặt ở 239 nm Bằng cách này các tác giả đã xây dựng đường chuẩn với khoảng tuyến tính trong phạm vi nồng độ 0,5-16 ng/ml Giới hạn phát hiện của phương pháp là 0,2 ng/ml Phương pháp đơn giản và đạt hiệu suất thu hồi cao 97 %

Trong một bài báo khác, tác giả Prameela Rani và các cộng sự [28] đã phát triển phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC) để xác định hàm lượng perindopril tert-butylamin trong viên nén với detector DAD Quá trình tách chất được thực hiện trên cột YMC-Pack C18 (250 mm × 4,6 mm, kích thước hạt là 5 mm) ở nhiệt

độ cột là 50oC Pha động là hỗn hợp của đệm acetonitril và kali photphat (0,05 M)

8

(37:63, v/v) (pH= 2,5) pH của pha động đã được điều chỉnh với acid ortophosphoric Hỗn hợp acetonitril-nước (40 : 60, v/v) được sử dụng làm dung môi Thể tích bơm mẫu vào là 50 μl, tốc độ dòng chảy là 1,7 ml/phút, detector 215 nm Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng tương ứng là 2 μg/ml và 7 mg/ml Hiệu suất thu hồi nằm trong khoảng từ 99 – 100,5%, độ chính xác (RSD) là 0,865% Phương pháp đã được chứng minh là phù hợp việc xác định đồng thời perindopril tert-butylamin cũng như các tạp chất của nó trong dược phẩm

Trong công trình nghiên cứu của mình tác giả Barole và cộng sự [13] đã phát triển một phương pháp sắc ký lỏng bản mỏng hiệu năng cao đơn giản (HPTLC) để tách

và phân tích định lượng amlodipin besilat và perindopril erbumin với số lượng lớn trong dược phẩm Sau khi hòa tan trong methanol, mẫu và các dung dịch chuẩn được chạy trên các bản silica gel sạch với dung môi axit axetic (8,5: 1,5: 0,1ml v/v/v) làm pha động Các mẫu thu được quét ở bước sóng 238 nm Các giá trị Rf cho amlodipin besilat và perindopril erbumin lần lượt là 0,20 ± 0,02 và 0,89 ± 0,02 Các đồ thị đường chuẩn cho khoảng tuyến tính từ 500 – 2500 ng/vết cho amlodipin besilat và 6000-

18000 ng/vết cho perindopril erbumin Các hệ số tương quan (R2) lần lượt là 0,995 và 0,995 Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ cho amlodipin besilat là 10,31 và 32,10 ng/vết và đối với perindopril erbumin lần lượt là 179 và 544 ng/vết Phương pháp này phù hợp để định lượng các hợp chất theo các yêu cầu của tiêu chuẩn quy định dược phẩm

Tác giả Mohit và cộng sự [21] đã xác định đồng thời cả perindopril và indapamid ở dạng dược phẩm bằng phương pháp HPTLC Phương pháp này dựa trên việc tách hai thuốc trên các bản mỏng được phủ silica gel 60F Sử dụng pha động là dichloromethan: methanol: acid acetic băng với tỷ lệ 9,5: 0,5: 0,1 v/v/v Cả hai loại thuốc đều hấp thụ tốt ở 215 nm Phương pháp có khoảng tuyến tính trong khoảng nồng

Tác giả Nina Alizadeh, Fatimeh Hemati [27] đã phát triển hai phương pháp quang phổ đơn giản, nhanh chóng và độ nhạy cao để xác định amlodipin besilat ở dạng tinh khiết và trong dược phẩm Phương pháp này dựa trên khả năng tạo phức màu giữa chất phân tích với thuốc thử 7,7,8,8 tetracyanoquinodimethane (TCNQ) và tetracyanoethylene (TCNE) Các phản ứng này cho các sản phẩm phức màu có nồng độ hấp thụ tối đa là 745 nm và 396 nm tương với TCNQ và TCNE Khoảng nồng độ làm việc của amlodipin besilat trong phạm vi từ 20-110 µg/ml; 5-35 µg/ml và độ lệch tiêu chuẩn tương đối (RSD) khi sử dụng TCNQ và TCNE lần lượt là 0,94 % và 0,73 % Nafisur Rahman và các cộng sự [23] đã sử dụng phương pháp quang phổ để xác định perindopril trong dược phẩm Phương pháp dựa trên phản ứng của nhóm thuốc amin với 2,4 dinitrofluorobenzene trong dimethylsulfoxide (DMSO) tạo thành sản phẩm màu vàng, hấp thụ tối đa ở 410 nm và được đo ở nhiệt độ phòng (30 ± 1°C) Theo định luật Beer, khoảng tuyến tính nằm trong khoảng nồng độ từ 2,5 – 25 g/ml với

hệ số hấp thụ mol là 6,71.10-3 l/mol/cm Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp tương ứng là 0,17 và 0,52 μg/ml Các thông số hoạt hóa như Ea, ΔH*, ΔS* và ΔG* cho phản ứng này là 27,31 kJ/mol; 24,69 kJ/mol; -138,84 kJ/mol và 61,50 kJ/mol Phương pháp đã được thực hiện thành công để xác định perindopril ở dạng thương mại với sai số chấp nhận được trong phạm vi ±2%

10

Trong một nghiên cứu khác, Nafisur Rahman và các cộng sự [22] cũng xác định perindopril bằng phương pháp quang phổ động học Nghiên cứu này dựa trên phản ứng của thuốc với dung dịch kali penmanganat trong môi trường kiềm ở nhiệt độ phòng (30

± 1oC) Theo dõi phản ứng bằng cách đo độ tăng độ hấp thụ quang theo thời gian ở bước sóng 603 nm với phương pháp tốc độ ban đầu, thời gian cố định 8 phút và thời gian cân bằng 90 phút Tất cả các đường chuẩn đều tuyến tính trong khoảng nồng độ từ

5 – 500 mg/ml Các giới hạn phát hiện cho phương pháp tốc độ ban đầu, thời gian cố định và thời gian cân bằng tương ứng là 0,752, 0,882 và 1,091 mg/ml So sánh kết quả phân tích của phương pháp đề xuất và các phương pháp tham khảo cho thấy không có

sự khác biệt đáng kể về độ chính xác

Tác giả MahaA.Hegazy và các cộng sự [20] đã kết hợp các thuật toán đa biến với phép đo quang phổ để xác định đồng thời perindopril arginin và amlodipin besilat Các phương pháp sử dụng trong nghiên cứu bao gồm phương pháp hệ số hấp thụ (AFM - absorptivity factor method) và phương pháp hiệu chỉnh hấp thụ (ACM - absorption correction method) Trong cả hai phương pháp, amlodipin được xác định trực tiếp ở bước sóng 360 nm với nồng độ từ 8 – 28 μg/ml, còn perindopril được xác định bằng phương pháp AFM và phương pháp ACM ở bước sóng 222 nm và 208 nm tương ứng, với nồng độ trong khoảng từ 10 – 70 μg/ml

1.2.3 Phương pháp điện hóa

Tác giả Azza Abdel Kader Gazy [11] đã nghiên cứu tính chất hấp phụ và điện hóa của amlodipin besilat trên điện cực cacbon thủy tinh (glassy carbon electrode -GCE) với dung dịch đệm Britton-Robinson bằng cách sử dụng phương pháp von-ampe vòng và von-ampe sóng vuông Các nghiên cứu về phương pháp von-ampe vòng cho thấy sự oxy hóa amlodipin besilat trên bề mặt điện cực cacbon thủy tinh là bất thuận nghịch và bị kiểm soát bởi sự hấp phụ trên điện cực Các điều kiện đo và các thông số thiết bị đã được tối ưu hóa cho việc xác định thuốc bằng phương pháp đo von-ampe

1.2.4 Các phương pháp điện di mao quản (CE)

Gần đây, phương pháp CE được sử dụng rộng rãi do tính chất ưu việt về hiệu quả tách cao, thời gian tách ngắn, lượng mẫu tiêu tốn ít Phương pháp đã được ứng dụng để tách và xác định amlodipin besilat và perindopril tert-butylamin trong nhiều đối tượng mẫu khác nhau

Sự có mặt amlodipin besilat trong mẫu huyết tương ở chuột đã được Yanfen Wei và các cộng sự [32] nghiên cứu và phát triển bằng cách sử dụng một bộ cảm biến điện quang mới (ECL - electrochemiluminescence) dựa trên hỗn hợp graphene oxide-đồng sunfua (rGO-CuS) kết hợp với điện di mao quản (CE) để phát hiện amlodipin besilat (AML) ở chuột Trong nghiên cứu này, hỗn hợp rGO-CuS được tổng hợp bằng phương pháp thủy nhiệt và được sử dụng để cải tiến điện cực Cảm biến ECL được kết hợp với CE để cải thiện tính chọn lọc và các thông số CE-ECL ảnh hưởng đến sự phân tách và phát hiện được tối ưu Điều kiện điện di thực hiện với mao quản silica đường kính 75 μm, chiều dài hiệu dụng 40 cm, dung dịch đệm photphat tại pH= 8, điện thế 15

kV, thời gian bơm mẫu 10s, thời gian điện di 252s Với các điều kiện tối ưu trên xác định được khoảng nồng độ tuyến tính của amlodipin besilat từ 0,008 – 5 μg/ml, giới hạn phát hiện là 2,8 ng/ml (S / N = 3) với phương trình hồi quy y = 1988x + 76.53 (R2

= 0.9988) và giá trị RSD từ 2,5-2,9% Nghiên cứu cho thấy phương pháp này có độ nhạy cao, độ chọn lọc tốt, phạm vi tuyến tính rộng, giới hạn phát hiện thấp và khả năng lặp lại tốt và có tiềm năng rất lớn trong lĩnh vực phân tích dược phẩm

12

Samia M El-Gizawy và cộng sự [31] đã phát triển điện di mao quản (CE) sử dụng detector diode-array để xác định 2 đồng phân S và R-perindopril tert-butylamin Tất cả các yếu tố ảnh hưởng đến sự phân tách đã được nghiên cứu và tối ưu hóa Trong nghiên cứu này các tác giả đã sử dụng đệm phosphat (100 mM, pH= 7,0) và 2-hydroxylpropyl-b-cyclodextrin (10 mM) với thế áp vào hai đầu mao quản là 15 kV, thời gian bơm mẫu là 10 s Nồng độ tuyến tính trong khoảng từ 25 – 800 mg/ml với giới hạn phát hiện và 14,7 mg/ml Phương pháp có độ chính xác khá tốt với giá trị RSD

< 2,0% và hiệu suất thu hồi trung bình trong các mẫu là 95,29% Phương pháp được đề xuất đã được áp dụng cho việc xác định S-perindopril trong các viên dược phẩm thương mại có chứa perindopril

Từ các công trình nghiên cứu ở trên cho thấy rằng có rất nhiều phương pháp xác định amlodipin besilat và perindopril tert-butylamin trong mẫu dược phẩm và mẫu sinh học, mỗi phương pháp nghiên cứu với các điều kiện khác nhau đều có các ưu, nhược điểm khác nhau Tuy nhiên lại có rất ít phương pháp xác định đồng thời cả 2 chất amlodipin besilat và perindopril tert-butylamin Phương pháp phổ biến nhất được sử dụng là phương pháp sắc kí lỏng nhưng với điều kiện thực hiện phải sử dụng một lượng dung môi hữu cơ tương đối lớn và giá thành phân tích khá cao.Ở Việt Nam, phương pháp điện di mao quản tích hợp detector độ dẫn không tiếp xúc kết nối theo kiểu tụ điện (CE-C4D) là một phương pháp khá mới với các ưu điểm của detector vạn năng với thời gian phân tích nhanh, giá thành rẻ, thiết bị nhỏ gọn di chuyển dễ dàng, đặc biệt chưa có nghiên cứu nào sử dụng phương pháp này phân tích đồng thời cả hai chất Vì vậy trong luận văn này sẽ tập trung vào nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích đồng thời 2 hợp chất amlodipin besilat và perindopril tert-butylamin bằng phương pháp CE-C4D

13

1.3 Phương pháp điện di mao quản

Điện di mao quản là một kỹ thuật tách các chất dựa trên sự di chuyển khác nhau của các phân tử chất (chủ yếu là các ion mang điện tích) trong dung dịch chất điện ly

có chất đệm pH và trong tác dụng của điện trường (E) nhất định do thế (V) đặt vào hai đầu mao quản sinh ra Cấu tạo của hệ điện di được cho trong hình 1.1 [1]

Tùy theo cơ chế, bản chất, và đặc điểm của sự tách (sự điện di) xảy ra trong ốngmao quản mà có thể phân chia thành các loại hay các kiểu điện di với các tên gọi riêng khác nhau Cụ thể như sau:

1 Điện di mao quản (Capillary Electrophoresis: CE),

2 Điện di mao quản vùng (Capillary Zone Electrophoresis: CZE),

3 Sắc ký điện di mao quản điện động học Mixen (Micellary Capillary Kinetic Chromatography: MEKC hay MCEKC),

Electro-4 Sắc ký điện di mao quản gel (Capillary Gel Electrophoresis Chromatography: Gel-CEC),

5 Sắc ký điện di mao quản hội tụ đẳng điện (Capillary Iso-electric Focusing Chromatography: CIEFC),

6 Sắc ký điện di mao quản đẳng tốc độ (CapillaryIso-Tacho-Phoresis Chromatography: CITPC)

14

Hình 1.1: Sơ đồ phân tích hệ điện di mao quản

1.3.1 Độ điện di, tốc độ điện di và thời gian điện di

Trong điện di, tốc độ di chuyển của các hạt tích điện (v) tỉ lệ thuận với cường độ điện trường (E):

Trong đó: v: tốc độ di chuyển của ion μ: là độ diện di

E: là điện trường ngoài Trong điều kiện tốc độ của dòng ổn định, lực tác động lên các tiểu phân tích điện từ phía điện trường ngoài và lực ma sát sẽ cân bằng:

q.E= fe.v (1.2) Trong đó: q: là điện tích hạt nhân

15

fe: là lực ma sát, fe = 6.π.η.r (η: là độ nhớt của dung dịch, r là bán kính ion)

Từ các công thức trên có thể suy ra công thức tính độ linh động của ion như sau:

μ = v/E = q/(6.π.η.r) (1.3) Như vậy độ linh động điện di tỉ lệ thuận với điện tích của ion chất phân tích và

tỷ lệ nghịch với độ nhớt η của dung dịch pha động điện di và độ lớn ( bán kính hydrat r) của ion chất phân tích Nghĩa là, trong một điện trường E nhất định, phần tử nào có điện tích lớn và kích thước nhỏ sẽ di chuyển nhanh Nếu các ion có cùng điện tích, ion nào có kích thước nhỏ sẽ di chuyển nhanh hơn Nếu các ion có cùng bán kính, ion nào

có điện tích lớn hơn sẽ di chuyển nhanh hơn

1.3.2 Mao quản

Mao quản chính là cột tách, một trong các yếu tố quyết định sự điện di hỗn hợp của các chất mẫu Mao quản được chế tạo chủ yếu là silica được gọi là mao quản silica Trong một số trường hợp người ta cũng dùng mao quản teflon, khi mao quản silica không phù hợp, ví dụ mẫu có ion F- và tách ở pH thấp [4] Mao quản trong CE thường

có đường kính trong (ID) từ 25 đến 150 µm và có thành dày từ 80-120 µm Còn chiều dài của mao quản là tùy thuộc vào hỗn hợp chất mẫu cần tách

Hình 1.2: Mặt cắt ngang của mao quản

16

Lớp điện kép trên thành mao quản

Trong quá trình điện di, lớp điện kép và thế của chúng (thế Zêta) xuất hiện ở sát thành mao quản, nó phụ thuộc vào lực ion của dung dịch pha động điện di

Hình 1.3: Lớp điện tích kép trên bề mặt mao quản

1.3.3 Dòng điện di thẩm thấu (EOF)

Dòng EOF là một loại của dòng chảy khối của chất lỏng trong mao quản Nó có quan hệ mật thiết với lớp điện tích trên thành mao quản Dòng EOF đóng vai trò quan trọng trong việc xác định thời gian tồn tại của chất tan ở trong ống mao quản

Dòng EOF di chuyển từ cực dương sang cực âm, dưới tác dụng của điện trường, các cation di chuyển cùng chiều với dòng EOF do đó di chuyển nhanh hơn, ngược lại các anion di chuyển ngược chiều với dòng EOF do đó di chuyển chậm hơn còn các phần tử trung hòa không chịu tác động của điện trường nên di chuyển cùng tốc độ với dòng EOF

Hình 1.4: Ảnh hưởng của dòng EOF đến tốc độ của các ion trong quá trình điện di

Do vậy, để có được hiệu quả tách cao cần thiết phải tìm được điều kiện tối ưu và/hoặc sử dụng các biện pháp kiểm tra và k hống chế (như thêm các chất hoạt hóa,

Cảm biến đo độ dẫn không tiếp xúc (C4D) với thiết kế hai điện cực đồng trục xuất hiện lần đầu trên thế giới vào năm 1998 Dựa trên thiết kế này, năm 2002 nhóm nghiên cứu của GS Peter Hauser (khoa Hóa, trường đại học Basel, Thụy Sỹ) đã phát triển thành công dòng sản phẩm C4D với nguồn điện thế kích thích xoay chiều cao (HV-C4D, 200V) Hãng điện tử eDAQ của Úc sau đó đã phối hợp cùng nhóm nghiên cứu của GS Peter Hauser để phát triển dòng sản phẩm C4D thương phẩm dựa trên nghiên cứu này

- Nguyên lý hoạt động C 4 D

Nguyên lý hoạt động của C4D được minh họa trong hình 1.5

18

Hình 1.5: Nguyên lý hoạt động của cảm biến đo độ dẫn không tiếp xúc

Hai điện cực hình ống được đặt nối tiếp đồng trục bên ngoài mao quản có chứa dung dịch cần đo Hai điện cực hình ống tạo với dung dịch bên trong mao quản hai tụ điện C Khoảng dung dịch nằm giữa hai điện cực đóng vai trò như một điện trở R

Nguồn điện xoay chiều (V) với tần số (f) được áp vào điện cực thứ nhất Tại điện cực thứ hai, tín hiệu đo được ở dạng cường độ dòng điện (I) Theo đó, dòng điện thu được tại điện cực thứ 2 sẽ phụ thuộc vào độ lớn của điện thế V và tần số f

Tín hiệu đầu ra thu được ở dạng cường độ dòng điện (xoay chiều), sau đó sẽ được chuyển đổi và khuếch đại thành tín hiệu dạng vôn thế (xoay chiều), thông qua việc sử dụng một điện trở khuếch đại (Rfeedback) Vôn thế xoay chiều sau đó được chuyển đổi thành vôn thế 1 chiều, lọc nhiễu và khuếch đại, sau cùng chuyển đổi thành tín hiệu số hóa trước khi được hiển thị và lưu trữ trên máy tính

Như vậy, detector đo độ dẫn không tiếp xúc ngoài ưu điểm là phân tích đa năng còn có ưu điểm là không nhất thiết phải có sự tiếp xúc trực tiếp của các điện cực với

19

dung dịch đo nhờ lợi dụng tính chất kết nối tụ điện với dung dịch bên trong mao quản hoặc ống phản ứng Đây là một cách rất thông minh loại trừ ảnh hưởng của điện thế cao trong quá trình phân tách điện di đến hệ điện tử của detector và không làm nhiễm bẩn dung dịch phân tích

1.3.4 Dung dịch đệm pH và pha động trong phương pháp điện di mao quản

Dung dịch đệm quyết định độ linh động điện di của các chất phân tích Do yếu

tố pH, loại dung dịch đệm mà trong đó, các ion và phân tử axit hay bazơ trong thành phần của dung dịch đệm góp phần tạo nên lực ion của chúng Hơn nữa, chúng cũng ảnh hưởng đến độ tan, tốc độ phản ứng của các chất [2]

Bảng 1.2 Các chất thường dung làm pha động trong CE và giá trị pK của chúng [4]

1.3.5 Kỹ thuật bơm mẫu trong phương pháp điện di mao quản

Trong điện di mao quản có ba phương pháp thường dùng nạp mẫu phân tích vào trong mao quản, bao gồm:

- Phương pháp thủy động lực học dùng áp suất

- Phương pháp thủy động lực học theo kiểu xiphông

20

- Phương pháp điện động học

Hình 1.6: Các kĩ thuật bơm mẫu trong phương pháp điện di mao quản

21

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM

2.1 Đối tượng, mục tiêu và nội dung nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng và mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu của luận văn là nghiên cứu xác định amlodipin besilat (Am) và perindopril tert-butylamin (Per) trong mẫu dược phẩm và phân tích Am trong mẫu nước tiểu bằng phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc theo kiểu kết nối tụ điện (CE – C4D)

2.1.2 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu khảo sát tối ưu các điều kiện tách amlodipin besilat và perindopril tert-butylamin bằng phương pháp điện di mao quản CE-C4D

 Điều kiện phân tích của thiết bị: Cố định một số điều kiện như chiều dài mao quản, đường kính mao quản và thế tách

 Khảo sát ảnh hưởng của thành phần hệ đệm, nồng độ đệm và pH của dung dịch đệm

 Khảo sát thời gian bơm mẫu

 Khảo sát chiều cao bơm mẫu

- Thẩm định phương pháp phân tích

 Xác định khoảng tuyến tính, xây dựng đường chuẩn

 Xác định giới hạn phát hiện LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

 Đánh giá độ đúng của phương pháp phân tích

 Đánh giá độ chụm của phương pháp phân tích

22

- Nghiên cứu khảo sát các điều kiện tối ưu cho việc xử lý mẫu nước tiểu bằng kỹ thuật chiết lỏng – lỏng sau đó tiến hành đo bằng phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc (CE – C4D), gồm:

 Khảo sát dung môi chiết

 Khảo sát pH của môi trường chiết

 Khảo sát thể tích dung môi chiết

 Khảo sát đệm

 Khảo sát thời gian lắc chiết

- Áp dụng quy trình phân tích mẫu thực tế: mẫu dược phẩm và mẫu nước tiểu của người bệnh uống thuốc

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp khảo sát xác định các điều kiện thích hợp

Khảo sát điều kiện phân tích tối ưu được thực hiện trên thiết bị CE-C4D với mao quản có chiều dài 55 cm, đường kính trong 50 µm, thế áp vào hai đầu mao quản -15

kV Các điều kiện này giữ nguyên trong tất cả các thí nghiệm Các điều kiện cần khảo sát gồm: dung dịch đệm điện di, chiều cao và thời gian bơm mẫu Việc khảo sát được thực hiện theo phương pháp đơn biến, thay đổi một thành phần trong khi cố định các thành phần còn lại để thu được điều kiện tối ưu nhất

2.2.1.1 Khảo sát dung dịch đệm điện di

Với hỗn hợp chất phân tích amlodipin besilat và perindopril tert-butylamin, dung dịch đệm điện di được khảo sát bằng cách thay đổi thành phần hệ đệm, pH và nồng độ đệm tại thế tách -15 kV, bơm mẫu ở độ cao 20 cm trong 30 s

Việc khảo sát pH được thực hiện trong khoảng pH từ 4, 5, 6, 7, 8 đến 9 Điều chỉnh pH bằng máy đo pH trên cơ sở giữ nguyên nồng độ hợp phần bazơ và thêm hợp phần acid cho đến khi đạt được giá trị pH cần khảo sát

23

Thành phần hệ điện di thay đổi với 3 hệ đệm Tris/ace, Tris/asc, Arg/ace Trong

đó giữ nguyên nồng độ hợp phần bazơ (Tris, Arg) 10mM và dùng hợp phần acid (Ace, Asc) điều chỉnh đến pH 8

Nồng độ đệm điện di được khảo sát ở các mức nồng độ 7 mM, 10 mM và 15

mM với hệ đệm Tris/ace ở pH = 8

2.2.1.2 Khảo sát thời gian bơm mẫu

Khảo sát thời gian bơm mẫu bằng cách giữ nguyên các điều kiện khảo sát được tối ưu thu được ở các thí nghiệm khác và thay đổi thời gian bơm 10 s, 20 s, 30 s và 50 s

2.2.1.3 Khảo sát chiều cao bơm mẫu

Chiều cao bơm mẫu được thực hiện ở các mức 15 cm, 20 cm, 25 cm, 28 cm với các điều kiện đã tối ưu khảo sát ở trên

2.2.2 Phương pháp xử lý mẫu

2.2.2.1 Phương pháp xử lý mẫu thuốc

Các mẫu dược phẩm được mua ở các cửa hàng thuốc ở Hà Nội và được bảo quản trong quá trình phân tích Thông tin về các mẫu dược phẩm phân tích được nêu

trong bảng 2.1

Bảng 2.1 Thông tin và đặc điểm của từng loại mẫu dược phẩm

Coveram Dạng viên, 30

viên/lọ

Servier Ireland Industries Ltd (số lô:

Ambelin Dạng viên, 10

viên/ vỉ

Công ty TNHH liên doanh HASAN – DEMAPHARM (số lô:

00416, hạn dùng:

11/2019)

Mỗi viên thuốc chưa chứa 5mg amlodipin besilat trong 1 viên nén, còn lại tá dược

Amlodipin Dạng viên, 10

viên/ vỉ

Công ty CP Dược Trung Ương VIDIPHA(số lô:

721116 , hạn dùng:

11/2019)

Mỗi viên thuốc chưa chứa 5mg amlodipin besilat trong 1 viên nén, còn lại là tá dược

2.2.2.2 Phương pháp xử lý mẫu nước tiểu

Mẫu nước tiểu được lấy từ 3 người bệnh có tiền sử bệnh huyết áp mãn tính và đang sử dụng thuốc có chứa hoạt chất amlopidin ở 3 thời điểm liên tiếp 10h, 12h, 14h sau khi sử dụng thuốc

Vì các mẫu nước tiểu thường có nền mẫu phức tạp và hàm lượng thuốc trong nước tiểu thường nhỏ nên cần được xử lý bằng phương pháp chiết lỏng – lỏng để làm giàu mẫu và loại bỏ 1 phần các tạp chất trước khi bơm mẫu vào thiết bị CE

Phương pháp chiết lỏng lỏng là kĩ thuật chiết cho chất phân tích tan ưu tiên vào một trong hai pha lỏng không trộn lẫn, còn tạp chất và các chất cần tách khác ở lại trong pha kia, từ đó tách chất phân tích ra khỏi nền hoặc các tạp chất ra khỏi chất phân tích [3]

2.3.1.2 Hóa chất dung môi

Hóa chất loại tinh khiết phân tích: L- Arginine (C6H14N4O2) (Fluka, hàm lượng

> 99,5%); L- Histidine (C6H9N3O2) (Fluka, hàm lượng 99,5%); Tris, axit axetic

Lấy 5ml nước tiểu vào ống nghiệm

Kiềm hóa mẫu về pH 9 bằng dung dịch NH3 ( kiểm tra bằng giấy quỳ)

Chiết mẫu bằng 3ml n-butyl aceat lắc trong 20 phút

Ly tâm cho tách lớp

Hút lớp n-butyl acetat ( lớp trên) đuổi dung môi bằng khí N2, được cặn chiết

Cặn chiết hòa tan vào 100µl metanol, tiến hành phân tích trên thiết bị CE

26

(CH3COOH), axit clohydric (HCl), axit ascobic (C6H8O6), natri hydroxyd (NaOH), methanol (CH3OH), (PA, Merck, Đức)

Nước đêion: Bộ lọc nước của hãng Scientech (Mỹ)

2.3.1.3 Chuẩn bị các dung dịch hóa chất

Pha dung dịch chuẩn gốc

Amlodipin besilat và perindopril tert-butylamin được pha trong dung môi là methanol:

Cân chính xác 25,00 mg (amlodipin besilat và perindopril tert-butylamin) mỗi loại chuyển vào bình định mức 25,00 ml Thêm 5,00 ml methanol và đem rung siêu âm trong 30 phút, sau đó định mức tới vạch bằng nước đề-ion thu được dung dịch gốc có nồng độ 1000,00 ppm Dung dịch được bảo quản trong tủ lạnh từ 2- 8ºC, tránh ánh sáng và có thể sử dụng trong vòng 3 tháng

Từ dung dịch chuẩn trên ta có thể pha các dung dịch chuẩn làm việc có các nồng độ khác nhau như dung dịch chuẩn: 200,00; 150,00; 100,00; 60,00; 50,00; 40,00; 20,00; 10,00; 5,10 ppm…Các dung dịch làm việc được pha hàng ngày

27

tay, lần đầu tiên trên thế giới sử dụng nguồn thế cao mini của hãng Spellman với điện thế cực đại lên đến 20kV – (Các thiết bị này sẽ được công bố trên các tạp chí quốc tế trong thời gian sắp tới) Detector đo độ dẫn không tiếp xúc kết nối theo kiểu tụ điện (C4D) được thiết kế ở dạng thu nhỏ, với nguồn kích thích 200V, với hai điện cực hình ống đồng trục có chiều dài 4mm, và đường kính 400 µm đặt cách nhau 1mm Tấm chắn Faraday (nối đất) được sử dụng để ngăn cách hai điện cực

 Máy rung siêu âm, có gia nhiệt của hãng BRANSONIC 521

 Bộ lọc nước đêion của hãng Scientech (Mỹ)

28

 Máy đo pH của hãng HANNA với điện cực thủy tinh và các dung dịch pH chuẩn để hiệu chỉnh điểm chuẩn của máy đo pH

 Cân phân tích của hãng Scientech (Mỹ), độ chính xác 0,0001 g

 Tủ lạnh Sanaky VH-2899W dùng bảo quản mẫu

 Máy ly tâm LCEN-200

Dụng cụ

 Dụng cụ thủy tinh: bình định mức, ống nghiệm, cốc thủy tinh

 Pipet pasteur với các cỡ khác nhau: 20; 200 và 1000 µl và đầu tip tương ứng

 Các bình định mức nhựa polypropylen (PP) 25 và 100 ml được sử dụng để pha các dung dịch gốc của các chất phân tích và các dung dịch đệm

 Các lọ Falcon 15 ml và lọ polypropylen (PP) để đựng các dung dịch chuẩn

 Đầu lọc có đường kính lỗ lọc 0,45 µm

 Các xy lanh lọc để lọc mẫu

 Mao quản đường kính trong 50 µm, chiều dài 55 cm

 Các dụng cụ thông thường khác của phòng thí nghiệm

2.4 Các thông số đánh giá độ tin cậy của phương pháp phân tích

2.4.1 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp phân tích

- Giới hạn phát hiện (LOD): Là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích còn cho tín hiệu phân tích khác có nghĩa so với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu nền

Đối với các quá trình sắc ký, LOD là nồng độ nhỏ nhất mà cho tín hiệu/nhiễu (S/N) bằng 3 [4]

- Giới hạn định lượng (LOQ): Là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích định lượng được với tín hiệu phân tích khác có ý nghĩa định lượng với

29

tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu của nền Thông thường, với các quá trình sắc ký giá trị LOQ được xác định theo tỉ số tín hiệu/nhiễu (S/N) bằng 10 [4]

2.4.2 Độ chụm (độ lặp lại) của phương pháp

Độ lặp lại đặc trưng cho mức độ gần nhau giữa các giá trị riêng lẻ xi tiến hành trên các mẫu thử giống hệt nhau, được tiến hành bằng một phương pháp phân tích, trong cùng điều kiện thí nghiệm (cùng người phân tích, cùng trang thiết bị, phòng thí nghiệm, trong các khoảng thời gian ngắn) [6]

Độ lặp lại của phương pháp được xác định qua độ lệch chuẩn (SD) và độ lệch chuẩn tương đối (RSD%)

Công thức tính độ lêch chuẩn (SD) và độ lệch chuẩn tương đối (RSD%) như sau [19]:

S

SD RSD

- Si là diện tích của pic điện di thứ i

- Stb là diện tích trung bình của n lần chạy

- n là số lần chạy lặp (n =6)

2.4.3 Độ đúng (độ thu hồi) của phương pháp

Độ đúng chỉ mức độ gần nhau giữa giá trị trung bình của dãy lớn các kết quả thí nghiệm và các giá trị quy chiếu được chấp nhận Do đó, thước đo độ đúng thường đánh giá qua sai số tương đối hay bằng cách xác định độ thu hồi [5, 6]