Nghiên cứu xây dựng qui trình real time PCR phát hiện vi khuẩn rickettsia gây bệnh ở người

Dựa vào các tác nhân gây bệnh khác nhau cùng với các cơ chế lan truyền, phân bố địa lý, sự hạn chế trong việc chẩn đoán, tình hình dịch tễ học và đánh giá về mức độ nghiêm trọng của bệnh

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Nguyễn Thị Thu Hằng

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUI TRÌNH REAL-TIME PCR

PHÁT HIỆN VI KHUẨN RICKETTSIA GÂY BỆNH Ở NGƯỜI

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2018

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Nguyễn Thị Thu Hằng

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUI TRÌNH REAL-TIME PCR

PHÁT HIỆN VI KHUẨN RICKETTSIA GÂY BỆNH Ở NGƯỜI

Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm

Mã số : 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS.BS BÙI TIẾN SỸ

TS LÊ HỒNG ĐIỆP

Hà Nội - 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi là Nguyễn Thị Thu Hằng, học viên cao học khóa 2015-2017 trường

ĐH Khoa học Tự nhiên – ĐH Quốc gia Hà Nội, chuyên ngành Sinh học thực nghiệm, xin cam đoan

Đây là luận văn do tôi trực tiếp thực hiện tại khoa Sinh học phân tử, Bệnh viện TƯQĐ 108 dưới sự hướng dẫn của thầy TS.BS Bùi Tiến Sỹ và TS Lê Hồng Điệp

Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đã được công bố tại Việt Nam

Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trung thực

và khách quan, đã được xác nhận và chấp nhận của cơ sở nơi nghiên cứu

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này

Học viên

Nguyễn Thị Thu Hằng

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành bản luận văn này, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng, biết ơn sâu sắc tới TS.BS Bùi Tiến Sỹ và TS Lê Hồng Điệp đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình, truyền đạt những kiến thức và những kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian tôi thực hiện đề tài

Tôi xin trân trọng cảm ơn PGS.TS Lê Hữu Song, PGS.TS Phan Quốc Hoàn

đã tạo điều kiện để tôi thực hiện luận văn tại Khoa Sinh học phân tử - Bệnh viện Trung ương quân đội 108; cảm ơn các anh chị tại Khoa Sinh học phân tử - Bệnh viện Trung ương quân đội 108 đã giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian qua

Tôi xin trân trọng cảm ơn toàn thể các thầy , cô giáo trong Khoa Sinh học cũng như các thầy cô giáo của trường ĐH Khoa học Tự Nhiên đã giảng dạy và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi học tập và nghiên cứu

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân và bạn bè đã ủng hộ, giúp

đỡ tạo điều kiện để tôi có thể hoàn thành được luận văn này

Hà Nội, tháng năm 2018

Học viên

Nguyễn Thị Thu Hằng

MỤC LỤC

Chương 1 TỔNG QUAN 1

1.1 Giới thiệu về Rickettsiaceae 1

1.1.1 Lịch sử, phân loại và đặc điểm của Rickettsiaceae 1

1.1.2 Các bệnh do Rickettsiaceae gây ra 3

1.1.3 Các vector lây truyền 3

1.2 Đặc điểm dịch tễ học của bệnh do Rickettsiaceae 5

1.2.1 Spotted Fever Group 5

1.2.2 Typhus Group 6

1.2.3 Scrub Typhus Group 7

1.3 Đặc điểm lâm sàng, cơ chế gây bệnh do Rickettsiaceae 7

1.3.1 Spotted fever Group 8

1.3.2 Typhus Group: 11

1.3.3 Scrub Typhus Group 11

1.4 Điều trị 12

1.5 Các phương pháp pháp chẩn đoán Rickettsiaceae 12

1.5.1 Phương pháp Weil – Felix 12

1.5.2 Phương pháp nuôi cấy phân lập mầm bệnh 13

1.5.3 Phương pháp ELISA 14

1.5.4 Phương pháp kháng thể miễn dịch huỳnh quang gián tiếp 15

1.5.5 Phương pháp PCR, nested PCR 16

1.5.6 Phương pháp real-time PCR 18

1.6 Tình hình bệnh do Rickettsiaceae ở Việt Nam 20

Chương 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Nguyên liệu 22

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 22

2.1.2 Hóa chất 22

2.2.3 Thiết bị, máy móc: 23

2.2 Sơ đồ tiến hành thí nghiệm 23

2.3 Phương pháp nghiên cứu 24

2.3.1 Phương pháp thiết kế mồi, probe 24

2.3.2 Tách chiết ADN 24

2.3.3 Khuếch đại gen của vi khuẩn bằng phản ứng PCR 26

2.3.4 Phương pháp điện di trên gel agarose 26

2.3.5 Phương pháp giải trình tự xác định loài 27

2.3.6 Phương pháp nhân dòng 29

2.3.7 Đánh giá độ đặc hiệu của phản ứng real-time PCR 32

2.3.8 Đánh giá độ nhạy của kĩ thuật real-time PCR 33

2.4 Áp dụng hai kĩ thuật real-time PCR để chẩn đoán các mẫu bệnh phẩm nghi ngờ nhiễm O tsutsugamushi và Rickettsia 33

Chương 3 - KẾT QUẢ 34

3.1 Xây dựng kĩ thuật real-time PCR phát hiện vi khuẩn O tsutsugamushi và các loài Rickettsia 34

3.1.1 Thiết kế primer, probe đặc hiệu cho phản ứng PCR, real-time PCR 34

3.1.2 Thiết kế plasmid chuẩn dương cho phản ứng real-time PCR 36

3.1.3 Đánh giá độ đặc hiệu của kĩ thuật real-time PCR 41

3.1.4 Đánh giá độ nhạy của kĩ thuật Real-time PCR 43

3.2 Ứng dụng real-time PCR phát hiện Rickettsiaceae trên các mẫu bệnh phẩm nghi ngờ 46

3.2.1 Một số đặc điểm của bệnh nhân nghi ngờ nhiễm Rickettsiaceae 46

3.2.2 Xác định tỷ lệ nhiễm Rickettsiaceae bằng kỹ thuật real-time PCR 47

3.2.3 Một số đặc điểm của bệnh nhân nhiễm Rickettsiaceae 49

KẾT LUẬN 52

TÀI LIỆU THAM KHẢO 54

DANH MỤC VIẾT TẮT

ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

IFA Indirect Fluorescent Antibody

IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry

O tsutsugamushi Orientia tsutsugamushi

PCR Polymerase chain reaction

RMSF Rocky Mountain spotted fever

SFG Spotted fever group

STG Scrub typhus group

TSA Type-specific antigen

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1: Phân loại Rickettsiaceae 1

Hình 1.2: Hình ảnh Rickettsia trong tế bào vật chủ 2

Hình 1.3: Các vector lây truyền tác nhân gây bệnh Rickettsia 4

Hình 1.4: Chu kỳ nhiễm bệnh Sốt Mò 5

Hình 1.5: Phân bố các loài Rickettsiaceae gây bệnh 5

Hình 1.6: Phân bố các loài Rickettsia 6

Hình 1.7: Tình hình dịch tễ STG 2000-2014 7

Hình 1.8: Sự lây nhiễm của các vi khuẩn nhóm SFG trong các tế bào nội mô 8

Hình 1.9: Rickettsia rickettsii trong nhiễm trùng các tế bào nội mạch 9

Hình 1.10: Bệnh nhân nhiễm RMSF 10

Hình 1.11: Đặc điểm bệnh STG 11

Hình 1.12: Nguyên lý phương pháp ELISA 14

Hình 1.13: Biểu đồ đường biểu diễn tín hiệu cường độ huỳnh quang khuếch đại 18

Hình 2.1: Sơ đồ của vector cloning pTZ57R/T 29

Hình 3.1: Trình tự vùng bảo thủ trên gen gltA 35

Hình 3.2: Trình tự vùng bảo thủ trên gen 56 kDa 35

Hình 3.3: Sơ đồ phản ứng nested PCR, semi nested PCR, real-time PCR 37

Hình 3.4: Hình ảnh điện di sản phẩm phản ứng PCR vòng trong 38

Hình 3.5: Độ tương đồng của trình tự PCR O2 từ mẫu SM1604 với dữ liệu trên Genbank của O tsutsugamushi 39

Hình 3.6: Độ tương đồng của trình tự PCR R2 từ mẫu SM1608 với dữ liệu trên Genbank của Rickettsia 39

Hình 3.7: Kết quả kiểm tra plasmid pOri và pRick bằng PCR với cặp mồi M13 41

Hình 3.8: Độ đặc hiệu của kỹ thuật real-time PCR 42

Hình 3.9: Đường chuẩn tuyến tính, tín hiệu khuếch đại thu được của pOri 44

Hình 3.10: Đường chuẩn tuyến tính, tín hiệu khuếch đại thu được của pRick 44

Hình 3.11: Biểu đồ tỷ lệ dương tính với 50 phản ứng real-time PCR lặp lại 45

Hình 3.12: Đường biểu diễn tín hiệu khuếch đại phản ứng real-time PCR 45

Hình 3.13: Biểu đồ tỷ lệ bệnh nhân theo giới tính 47

Hình 3.14: Biểu đồ tỷ lệ bệnh nhân theo độ tuổi 47

Hình 3.15: Tín hiệu khuếch đại real-time PCR phát hiện O tsutsugamushi 48

Hình 3.16: Kết quả real-time PCR phát hiện O tsutsugamushi và Rickettsia trên bệnh phẩm nghi ngờ 48

Hình 3.17: Biểu đồ tỷ lệ bệnh nhân nhiễm Rickettsiaceae theo giới tính 50

Hình 3.18: Biểu đồ tỷ lệ bệnh nhân nhiễm Rickettsiaceae theo nhóm tuổi 50

Hình 3.19: Biểu đồ tỷ lệ bệnh nhân nhiễm Rickettsiaceae theo địa lý 51

Hình 3.20: Biểu đồ tỷ lệ bệnh nhân nhiễm Rickettsiaceae theo các tháng trong năm 51

DANH MỤC BẢNG, BIỂU

Bảng 2.1: Thành phần phản ứng PCR 26

Bảng 2.2: Thành phần phản ứng PCR giải trình tự 27

Bảng 2.3: Thành phần tinh sạch sản phẩm PCR giải trình tự 28

Bảng 2.4: Thành phần phản ứng ligation 30

Bảng 2.5: Thành phần và điều kiện phản ứng PCR sử dụng 32

Bảng 2.6: Thành phần phản ứng real-time PCR 32

Bảng 2.7: Thành phần phản ứng real-time PCR phát hiện vi khuẩn 33

Bảng 3.1: Danh mục các cặp mồi, probe được thiết kế 36

Bảng 3.2: Kết quả tạo plasmid chuẩn dương real-time PCR cho vi khuẩn 41

Bảng 3.3: Độ đặc hiệu của phản ứng real-time PCR 43

MỞ ĐẦU

Bệnh truyền nhiễm luôn nhận được sự quan tâm của nền y tế toàn cầu Những mầm bệnh trước đây đã được kiểm soát nhưng nay thường xuyên biến đổi kết hợp với các căn nguyên mới xuất hiện gây khó khăn cho kiểm soát dịch bệnh cũng như điều trị bệnh truyền nhiễm Theo CDC 4470 ca bệnh Spotted fever group được báo cáo ở Mỹ năm 2012, 18000 trường hợp Scrub typhus group (sốt mò) được báo cáo trong chiến tranh thế giới thứ II Trong thời gian gần đây, ước tính mỗi năm có khoảng 1 triệu trường hợp sốt mò và có tới 1 tỷ người sống trong các vùng lưu hành

bệnh có nguy cơ lây nhiễm thì Rickettsia là căn nguyên gây bệnh đáng được chú ý

Rickettsia được sử dụng như một thuật ngữ chung cho nhiều vi khuẩn nội bào bắt

buộc không thể nhận dạng bằng các phương pháp nuôi cấy truyền thống Dựa trên

đặc điểm hình thái, kháng nguyên, và chuyển hóa, Rickettsia được phân loại thành

các nhóm sau: Spotted Fever Group (SFG), Typhus Group (TG) và Scrub Typhus

Group (STG)

Dựa vào các tác nhân gây bệnh khác nhau cùng với các cơ chế lan truyền, phân bố địa lý, sự hạn chế trong việc chẩn đoán, tình hình dịch tễ học và đánh giá

về mức độ nghiêm trọng của bệnh do Rickettsiaceae gây ra trong khu vực Đông

Nam Á được xem là một thách thức khó khăn Hàng trăm trường hợp tử vong và hàng ngàn trường hợp nhiễm bệnh đã không được chẩn đoán Việc chẩn đoán bệnh

do Rickettsiaceae ở Việt Nam vẫn chủ yếu dựa vào lâm sàng và yếu tố dịch tễ Bệnh

do Rickettsiaceae có bệnh cảnh lâm sàng đa dạng dễ nhầm lẫn với nhiều bệnh

truyền nhiễm khác Thêm vào đó, bệnh có thể để lại những biến chứng thần kinh nặng nề và có thể gây tử vong cho bệnh nhân Do vậy, chẩn đoán xác định căn nguyên gây bệnh sớm và chính xác để điều trị sớm có ý nghĩa rất lớn

Các xét nghiệm chẩn đoán mầm bệnh đã được áp dụng như phương pháp huyết thanh học (phản ứng Weil – Felix), nhưng phương pháp này còn nhiều hạn chế, chỉ chẩn đoán được một vài loài nhất định và dễ xảy ra các phản ứng chéo gây sai lệch kết quả Phương pháp phân lập mầm bệnh bằng tiêm truyền mầm bệnh, phương pháp này nuôi cấy trực tiếp vi khuẩn trong tế bào động vật rất khó và nguy

hiểm cho người thực hiện thí nghiệm Các phương pháp gần đây như ELISA, IFA thao tác dễ, tiết kiệm chi phí, tuy nhiên các phương pháp này chẩn đoán được khi thời gian nhiễm vi khuẩn từ 15-26 ngày, hạn chế trong việc chẩn đoán sớm Từ đó đặt ra nhu cầu cần những phương pháp chẩn đoán mới, có độ nhạy, độ đặc hiệu cao,

thời gian trả lời kết quả sớm Phương pháp real-time PCR trong chẩn đoán

Rickettsiaceae gây bệnh ở người đã cho những kết quả khả quan Phương pháp này

sẽ giúp xác định sớm, chính xác mầm bệnh, định hướng thầy thuốc lâm sàng điều trị

đặc hiệu kịp thời, làm giảm tỷ lệ biến chứng và tử vong của bệnh do Rickettsiaceae

Chính vì những lý do trên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu xây dựng qui trình real-time PCR phát hiện vi khuẩn Rickettsia gây bệnh ở người.”

Với hai mục tiêu chính:

1 Xây dựng kĩ thuật real-time PCR phát hiện vi khuẩn O tsutsugamushi và các loài Rickettsia

2 Áp dụng kĩ thuật real-time PCR xác định các mầm bệnh gây sốt Rickettsiaceae

trên mẫu bệnh phẩm thu thập được tại Bệnh viện Trung ương quân đội 108 từ tháng 6/2016 - tháng 9/2017

1

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu về Rickettsiaceae

1.1.1 Lịch sử, phân loại và đặc điểm của Rickettsiaceae

Rickettsia được biết đến như là các căn nguyên gây bệnh ở động vật có xương

sống với các vectơ truyền bệnh thuộc nhóm động vật chân đốt Trước đây Rickettsia

được sử dụng như một thuật ngữ chung cho nhiều vi khuẩn không thể nhận dạng

bằng các phương pháp nuôi cấy truyền thống Rickettsia được đặt tên sau khi nhà

bệnh học Howard Taylor Ricketts phát hiện ra mầm bệnh sốt phát ban (1906) và ông bị chết vì nhiễm bệnh này trong thời gian nghiên cứu [20] Bằng sự phát triển

của các kỹ thuật phân tử gần đây, sự phân loại các loài Rickettsia có sự thay đổi lớn

Rickettsia tsutsugamushi đã được chứng minh đủ điều kiện để phân loại thành một

chi mới là Orientia [65] Dựa trên đặc điểm hình thái, kháng nguyên và chuyển hóa,

Rickettsia được phân loại thành hai nhóm bệnh: Spotted Fever Group (SFG) và

Typhus Group (TG); Orientia gây bệnh Scrub Typhus Group (STG) hay còn gọi là

bệnh sốt mò ở Việt Nam Theo nghiên cứu của Bechah và cộng sự (2008), chi

Rickettsia có 24 loài gây bệnh và Orientia chỉ có một loài duy nhất là Orientia tsutsugamushi (Rickettsia tsutsugamushi) Phân loại các loài Rickettsiaceae được

thể hiện như hình 1.1 [7]

Hình 1.1: Phân loại Rickettsiaceae

2

Hình 1.2: Hình ảnh Rickettsia trong tế bào vật chủ [71]

Các vi khuẩn trong chi Rickettsia là các loài sống nội bào bắt buộc có chiều

dài khoảng 0,8 - 2,0 µm, chiều rộng khoảng 0,3 - 0,5 µm, đa hình thái, hình dạng thay đổi qua các giai đoạn phát triển: cầu khuẩn đứng riêng rẽ hoặc thành từng đôi

có khi xếp thành chuỗi ngắn hoặc từng đám trong hoặc ngoài tế bào Tế bào chất của các vi khuẩn này chứa ribosome, các sợi ADN và được bao bọc bởi cấu trúc của

tế bào Gram âm điển hình với một lớp peptidoglycan và lipopolysaccharide ở

màng ngoài, nhưng không có tiên mao [53] Bộ gene của các loài thuộc

Rickettsia là một ADN đơn dạng vòng, có kích thước lên đến 1-1,4Mbp Có

khoảng 900 - 1500 gene tùy loài, trong đó có 704 protein và 39 RNA chung cho tất cả các loài [4, 45] Gen đầu tiên được sử dụng cho mục đích phát sinh loài

là 16S rDNA [55] Sau đó, nghiên cứu phát sinh loài dựa trên các trình tự gen

khác bao gồm gltA (gen mã hóa tổng hợp citrate) [57], gen mã hóa protein 17kDa [3] và nhóm gen kháng nguyên bề mặt tế bào (SCA): ompA, ompB,

sca4, sca1 và sca2 [18, 44, 56, 43] Phân tích phát sinh loài dựa trên trình tự

gen mã hóa protein 17kDa không cho nhiều giá trị ý nghĩa Ngược lại, dựa trên trình tự gen gltA có thể xây dựng mối quan hệ phát sinh loài

O tsutsugamushi là vi khuẩn có chiều rộng khoảng 0,5 µm và chiều dài từ 1,2

đến 3,0µm, lớn hơn so với các vi khuẩn nhóm SFG và TG [24] Hơn nữa cấu tạo tế

bào của O tsutsugamushi bị thiếu lớp peptidoglycan và lipopolysaccharide khác với các loài Rickettsia khác [2] O tsutsugamushi có kích thước hệ gen dao động từ 2,0

đến 2,7 Mb bao gồm 1967 trình tự mã hóa protein và khoảng 46,7% là các trình tự

lặp lại [41] O tsutsugamushi chứa nhiều biến thể kháng nguyên, bao gồm Gilliam,

3

Kato, Karp, Kawasaki, Kuroki và các loại khác Sự thay đổi kháng nguyên này phụ

thuộc phần lớn vào sự đa dạng của kháng nguyên đặc hiệu loài 56kDa (TSA) nằm

trên bề mặt của màng vi khuẩn [52] Với một khung đọc mở (ORF) là 1600 bp,

TSA 56kDa gồm có 516-541 amino axit và tham gia vào việc xâm nhập vào tế bào

chủ thông qua sự kết hợp của fibronektyin Có bốn domain biến thể trong vùng này, các domain biến thể (VD) I-IV, chịu trách nhiệm về mức độ biến đổi kháng nguyên lớn ở gen [37]

Họ vi khuẩn Rickettsiaceae sinh sản bằng hình thức chia đôi giống như vi

khuẩn Tuy nhiên tốc độ sinh sản chậm so với vi khuẩn và virut khác Trong nuôi cấy tế bào, thời gian 1 thế hệ là 8-10 giờ ở nhiệt độ 32-35oC [53] Dịch tễ học của

các bệnh ở người do Rickettsiaceae gây ra liên quan đến đặc điểm sinh học của vectơ truyền bệnh Bệnh do Rickettsiaceae rất khác nhau ở mức độ nghiêm trọng từ

bệnh nhẹ không cần điều trị đến việc nhiễm trùng đe dọa tính mạng

1.1.2 Các bệnh do Rickettsiaceae gây ra

Các bệnh gây ra bởi các sinh vật trong nhóm Rickettsiaceae được công nhận

và có thể được chia thành 3 nhóm bệnh sau: Spotted Fever Group (SFG), Typhus Group (TG) và Scrub Typhus Group (STG) [73]

- Nhóm bệnh SFG được chia theo từng bệnh như sau: Rocky Mountain spotted

fever (RMSF) do Rickettsia rickettsii gây bệnh; Rickettsialpox do Rickettsia akari

gây ra; Boutonneuse fever,…

- Nhóm bệnh TG có đặc điểm dịch tễ học giống nhau, do các loài vi khuẩn

Rickettsia prowazekii và Rickettsia typhi là căn nguyên gây bệnh chính:

Louse-borne typhus, Brill-Zinsser disease, Murine typhus,…

- Tác nhân gây bệnh sốt mò (STG) chỉ có một loài duy nhất là

O tsutsugamushi, có ba kiểu huyết thanh học chủ yếu là Karp, Gilliam, Kato

1.1.3 Các vector lây truyền

Vật chủ mà Rickettsiaceae kí sinh rất đa dạng, tất cả các loài đều có liên quan đến động vật chân đốt Một số loài Rickettsiaceae có thể lan truyền trong động

vật có xương sống, một số loài gây bệnh ở người và động vật, do chúng lây truyền

4

bởi các động vật chân đốt như bọ chét, chấy, chấy hoặc ve và hiện nay các loài

Rickettsiaceae đã được công bố gần như trên toàn thế giới [49] Cho đến nay ve, rận

và bọ chét trong giới Ixodidea, Phtiraptera, và Siphonaptera tương ứng được biết

đến như là các vector lây truyền tác nhân gây bệnh Rickettsia Năm 2012, Socolovschi và cộng sự cho rằng muỗi cũng là một trong số các vector lây truyền R

felis đáng chú ý [62] Mò Leptotrombidium là vector truyền bệnh của vi khuẩn

thuộc chi Orientia [25] Động vật chân đốt đồng thời cũng là ổ chứa và nơi nhân

lên của vi khuẩn chúng còn đóng vai trò quan trọng trong việc lây lan Tuy nhiên cách thức lây truyền từ động vật chân đốt sang người là khác nhau Vi khuẩn lây nhiễm vào vật chủ qua nước bọt, vết đốt của côn trùng như ve, bét, chấy rận hoặc

mò mạt Ngoài ra chúng còn được truyền qua phân qua vết xước ở da vật chủ [50]

Rickettsia và Orientia lây nhiễm sang các tế bào da như lớp nội mạc mạch máu (tế

bào bị nhiễm chính), nguyên bào sợi, tế bào nội mô bạch huyết và đại thực bào

Hình 1.3: Các vector lây truyền tác nhân gây bệnh Rickettsia [38]

Các loài Rickettsiaceae được duy trì trong tự nhiên bằng cách truyền trực tiếp

hay gián tiếp tới những con bọ không nhiễm bệnh thông qua đường ruột những con

bọ này khi đốt nhưng loài gặm nhấm hay động vật khác bị nhiễm Rickettsiaceae

(hình 1.4)

5

Hình 1.4: Chu kỳ nhiễm bệnh Sốt Mò

1.2 Đặc điểm dịch tễ học của bệnh do Rickettsiaceae

Bệnh sốt do Rickettsiaceae được tìm thấy ở mọi châu lục trừ Nam Cực [17]

Hình 1.5: Phân bố các loài Rickettsiaceae gây bệnh.[71]

1.2.1 Spotted Fever Group

Rocky Mountain spotted fever (RMSF) chủ yếu xảy ra ở lục địa Hoa Kỳ và

cũng xuất hiện ở một số nơi miền nam Canada, Trung Mỹ, Mexico, và một phần của Nam Mỹ Nó hiếm khi được xuất hiện ở nơi khác [14] RMSF lần đầu tiên được ghi nhận và giới hạn ở khu vực núi Rocky Báo cáo gần đây của CDC, tại Mỹ số ca nhiễm SFG tăng từ 424 trường hợp năm 1993 lên đến 4470 trường hợp vào năm

6

2012, và năm 2014 số ca nhiễm bệnh khoảng hơn 3500 trường hợp [76] Hơn 90% bệnh nhân bị nhiễm RMSF trong khoảng thời gian từ tháng 4 đến tháng 9 Những người thường xuyên tiếp xúc với chó và những người cư trú gần các khu rừng hoặc

những khu vực có cỏ sẽ có nguy cơ lây nhiễm cao Rickettsialpox có thể phân bố

rộng rãi hơn so với báo cáo trước đây Bệnh này đã được xác định tại các thành phố lớn ở Nga, Nam Phi và Hàn Quốc Tại Hoa Kỳ, thường gặp nhất ở vùng Đông Bắc, đặc biệt là ở thành phố New York Mặc dù dịch bệnh xảy ra định kỳ thường xuyên nhưng tỷ lệ xuất hiện bệnh đang giảm Các báo cáo gần đây cho thấy tỷ lệ mắc bệnh Boutonneuse fever tăng ở các nước Địa Trung Hải như Tây Ban Nha, Ý và Israel Cùng với African tick–bite fever của châu Phi, những ca mắc bệnh này đã được xác định tại Algeria, Malta, Síp, Slovenia, Croatia, Kenya, Somalia, Nam Phi, Ethiopia,

Ấn Độ và Pakistan, cũng như vùng cận Sahara thuộc Châu Phi, phía Đông Caribê ,

và xung quanh Biển Đen [15, 58]

1.2.2 Typhus Group

Louse-borne typhus, Brill-Zinsser disease xảy ra ở Châu Âu, Châu Á và Châu Phi Các nước châu Phi, đặc biệt là Ethiopia và Nigeria là những nơi xảy ra

hầu hết các trường hợp trong 2 thập kỷ qua Endemic murine typhus phổ biến ở các

thành phố lớn trên thế giới, nơi có nhiều chuột Đã có tường hợp mắc bệnh là những khách du lịch trở về từ các cảng và các khu nghỉ mát biển ở châu Á, châu Phi và châu Âu [5, 17]

Hình 1.6: Phân bố các loài Rickettsia [38]

7

1.2.3 Scrub Typhus Group

Các ca bệnh thường thấy ở vùng nông thôn khu vực Nam Á và Đông Nam Á, giới hạn ở khu vực địa lý bị ràng buộc bởi Nhật Bản, quần đảo Solomon và Pakistan Bệnh này chủ yếu ở các nước châu Á, bao gồm Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc, Ấn Độ, Thái Lan và Đài Loan,… Trong chiến tranh thế giới thứ II, y học Phương Tây đặc biệt quan tâm đến bệnh này bởi vì có khoảng 18000 ca nhiễm bệnh trong quân Đồng Minh đóng quân tại vùng nông thôn hoặc rừng rậm khu vực Thái Bình Dương Sốt mò cũng được báo cáo là bệnh nhiễm trùng đứng thứ hai hay thứ ba trong quân đội Hoa Kỳ khi đóng quân ở Việt Nam Trong thời gian gần đây, ước tính mỗi năm có khoảng 1 triệu trường hợp sốt mò và có tới 1 tỷ người sống

trong các vùng lưu hành bệnh có thể bị nhiễm O tsutsugamushi [5, 8, 61]

Hình 1.7: Tình hình dịch tễ STG 2000-2014 [28]

1.3 Đặc điểm lâm sàng, cơ chế gây bệnh do Rickettsiaceae

Các dấu hiệu và triệu chứng sớm của những bệnh nhiễm trùng này thường không đặc hiệu và có thể giống với các bệnh do virut lành tính khác gây ra, khiến việc chẩn đoán trở nên khó khăn hơn Một số tiêu chí hỗ trợ chẩn đoán sớm các

bệnh về Rickettsiaceae bao gồm (1) tiền sử bị cắn hoặc tiếp xúc với vết cắn, (2) đi

tố bám dính (adhesins) giống như các protein màng ngoài cho phép vi khuẩn có thể

thâm nhập vào trong tế bào vật chủ Khi vào bên trong, Rickettsiaceae nhân lên với

số lượng lớn trước khi phá vỡ tế bào vật chủ (đối với TG) hoặc chúng thoát ra khỏi

tế bào và phá vỡ tế bào bằng cách làm hỏng màng tế bào, tạo chiều nước đi vào (đối với SFG) [15]

Rickettsiaceae dựa vào tế bào chất của tế bào vật chủ để sinh trưởng Để tránh việc bị thực bào trong tế bào vật chủ, chúng tiết ra phospholipase D và hemolysin

C, phá vỡ màng phagosomal cho phép nhanh chóng thoát khỏi tế bào đó Ảnh hưởng nghiêm trọng nhất là làm tăng tính thấm thành mạch, gây hậu quả là phù nề, giảm lượng máu, giảm albumin máu, giảm áp suất thẩm thấu và hạ huyết áp

Hình 1.8: Sự lây nhiễm của các vi khuẩn nhóm SFG trong các tế bào nội mô [71]

1.3.1 Spotted fever Group

RMSF: Trong RMSF, các vi khuẩn nhân lên trong tế bào nội mô mạch máu

và sau đó chúng đi vào mạch máu sau khi lây nhiễm qua da Những tổn thương mạch máu có thể xảy ra và gây ảnh hưởng ở tất cả các cơ quan, tuy nhiên nhưng tổn thương này thường tìm thấy ở trên da và tuyến thượng thận Trong hệ thống thần kinh trung ương và tim, có hiện tượng đáp ứng gây tổn thương tế bào vật chủ kèm

9

thèo hiện tượng viêm mạch Sự hoại tử thành mạch dẫn đến việc sử dụng nhiều tiểu cầu, và đây là nguyên nhân gây giảm tiểu cầu Nhiều yếu tố dẫn đến việc đến giảm Albumin (ví dụ: suy thận, giảm sự hấp thu nước) và hạ Natri máu (ví dụ suy thận, thay đổi nồng độ dịch ngoại bào, sự trao đổi ion Na+, K+ qua thành tế bào)

Hình 1.9: Rickettsia rickettsii trong nhiễm trùng các tế bào nội mạch [67]

Sốt, nhức đầu, phát ban, không tỉnh táo và đau cơ là những triệu chứng điển hình Sự khởi phát bệnh có thể là dần dần hoặc đột ngột, bắt đầu từ khoảng 1 tuần (khoảng, 2-14 ngày) sau khi vết cắn từ bọ ve bị nhiễm bệnh Thường những cơn sốt kéo dài liên tục ở nhiệt độ 40-41oC [15] Hiện tượng phát ban xuất hiện vào ngày thứ 2 hoặc thứ 3 của bệnh, đầu tiên xuất hiện ở xung quanh cổ chân, hoặc

cổ tay, sau đó lan ra khắp các chi và toàn cơ thể Hiếm khi, những vết ban có thể

mờ đi hoặc chỉ tập trung ở một phần của cơ thể Điển hình, vết ban nhỏ (1-5mm), lan rộng, các vết ban có thể phát triển thành vết rát đỏ và ban đốm xuất huyết Tuy nhiên khoảng 20% trường hợp, bệnh nhân có thể không phát ban (không xuất hiện nốt đốm) Các triệu chứng có thể xuất hiện như viêm màng não và hôn

mê có thể kèm theo mê sảng, hay tìm thấy điểm mù ở vỏ não, bệnh động kinh, điếc trung tâm, mất điều hoà vận động,… Các bệnh liên quan đến tim mạch cũng thường xuyên xảy ra Hay biểu hiện liên quan đến phổi như áp xe phổi cho đến tràn dịch màng phổi hoặc phù phổi Ngoài ra đau cơ là biểu hiện đặc trưng thường xuất hiện ở bắp đùi hoặc bắp chân

10

Hình 1.10: Bệnh nhân nhiễm RMSF [75]

Rickettsialpox: Các vi khuẩn gây bệnh này cũng gây ra triệu chứng viêm

mạch như các loài Rickettsiaceae khác Sinh thiết cho thấy các dấu hiệu của xuất

huyết, hoại tử mao mạch, cũng như sự xâm nhập của các tế bào đơn nhân quanh mạch Sau giai đoạn ủ bệnh 9-14 ngày, một đốm đỏ phát triển tại chỗ bị đốt Các nốt sưng sau đó phát triển thành vết loét.Vết loét thường phân bố ở mặt, cổ, thân, và rất

dễ nhầm lẫn với vết ban của thuỷ đậu đặc biệt ở người lớn Sốt không thường xuyên (38-41°C) xảy ra và kéo dài chưa đầy một tuần Sốt kèm theo đau đầu, ớn lạnh, đổ

mồ hôi, đau cơ, chảy nước mũi, ho, đau họng, buồn nôn, nôn mửa, đau bụng Các vùng xung quanh vết loét có sự nổi hạch [15]

Boutonneuse fever: Đặc điểm của bệnh này liên quan đến cấu trúc thành

mạch của lớp hạ bì tương tự như cách thức nhận biết RMSF Tế bào nội mô của các mao mạch, tĩnh mạch và động mạch nhỏ trong các cơ quan khác nhau cũng có thể bị tổn thương khi bị lây nhiễm bệnh Thời kỳ ủ bệnh thường là 6 ngày (khoảng từ 1-16 ngày) Hoại tử da do viêm mạch tại vết cắn là triệu chứng đặc trưng Vết ban xuất hiện vào ngày thứ 3-5 của cơn sốt Nó lan rộng ra các chi, thân, cổ, bàn tay và gan bàn chân trong vòng 36 tiếng, thường không có ở mặt Tuy nhiên, 14-40% trong các trường hợp không tìm thấy vết ban Tổn thương này lành lại từ 10-20 ngày mà không để lại sẹo Khởi phát cấp tính của bệnh với sốt cao (trên 39°C), nhức đầu, khó chịu [59]

11

1.3.2 Typhus Group:

Các đặc điểm bệnh lý của loại bệnh này cũng tương tự như ở nhóm bệnh SFG Tuy nhiên nhóm bệnh TG này vi khuẩn nhân lên, lan rộng và tích lũy nhiều trong tế bào các cơ quan nội tạng cho đến khi đạt số lượng, chúng phá vỡ tế bào nội mô và lan truyền vào trong máu Bệnh đột ngột xảy ra 1-2 tuần sau khi bị rận nhiễm bệnh cắn Bệnh nhân bị sốt, nhức đầu và phát ban Vết phát ban xuất hiện vào ngày thứ 4-

7 của cơn sốt và lan rộng ra thân đến tay, chân, ít khi xuất hiện ở mặt, bàn tay và bàn chân Đầu tiên vết ban thường tập trung ở nách [11]

1.3.3 Scrub Typhus Group

Các vi khuẩn O tsutsugamushi sau khi xâm nhập vào tế bào vật chủ và nhân

lên trong tế bào chất Chúng thoát ra bằng cách nảy chồi từ màng tế bào vật chủ khi

nó xâm nhập vào tế bào liền kề Hiện tượng viêm quanh mạch ở các mạch máu nhỏ

cũng xảy ra như bệnh do các loài Rickettsia khác gây ra Thông thường có xuất hiện

hoại tử vùng da tổn thương ngay tại vết đốt, và nổi hạch ở các vùng xung quanh

Thời kỳ ủ bệnh khoảng 1-2 tuần.Vết loét thường xuất hiện 1-3 tuần sau khi tiếp xúc với sinh vật lây nhiễm Dưới 50% số bệnh nhân, vị trí của vết cắn phát triển thành vết hoại tử với sự gia tăng các hạch quanh như bệnh Rickettsialpox Đây cũng

là những triệu chứng đặc trưng [11]

Hình 1.11: Đặc điểm bệnh STG [75]

A, B: Hình ảnh vết loét do O tsutsugamushi gây bệnh;

C: Hình ảnh O tsutsugamushi nằm rải rác trong tế bào chất của đại thực bào nhiễm

bệnh ở chuột

12

1.4 Điều trị

Doxycycline được lựa chọn để điều trị cho tất cả các nhóm bệnh do

Rickettsiaceae Mặc dù các thuốc trong nhóm tetracycline thường không được dùng

cho phụ nữ mang thai và trẻ em, nhưng loại kháng sinh này được khuyến cáo dùng

cho các bệnh nhân khi có triệu chứng nghi ngờ nhiễm Rickettsiaceae bởi vì đây là

loại thuốc được cho là hiệu quả nhất Thuốc hấp thu tốt qua đường tiêu hoá, có thời gian bán thải kéo dài, và ít tác dụng phụ Liều thường dùng là viên 100mg uống hai lần trong một ngày, kéo dài từ 5 - 7 ngày Chloramphenicol cũng là một loại kháng sinh có hoạt tính điều trị bệnh này, được sử dụng bằng đường uống hoặc đường tiêm, liều khuyến cáo là 250-500mg, 6 tiếng một lần, cho đến khi hết sốt 2-3 ngày Tuy nhiên việc sử dụng chloramphenicol cho thấy có nguy cơ tái phát cao hơn Những vùng có sự giảm đáp ứng với tetracyclines, thử nghiệm lâm sàng ngẫu nhiên cho thấy một liều duy nhất của azithromycin (500 mg) có thể có hiệu quả như trong

7 ngày điều trị doxycycline, kháng sinh này được xem là an toàn ở phụ nữ mang thai Mặc dù vậy, nghiên cứu cũng chỉ ra điều trị bằng azithromycin có nhiều tác dụng phụ hơn [10, 29, 46]

Việc chẩn đoán nhanh và đưa ra các giải pháp điều trị thích hợp sẽ giúp bệnh nhân tiên lượng tốt Nhưng trong nhiều trường hợp không có các triệu chứng lâm sàng điển hình để nhận biết như phát ban,… Bên cạnh đó, phương pháp huyết thanh học thường chỉ chẩn đoán được khi nhiễm bệnh một vài tuần Để không làm chậm thời gian điều trị và có thể dẫn tới tiên lượng xấu, doxycycline được sử dụng điều trị ngay khi nghi ngờ

1.5 Các phương pháp pháp chẩn đoán Rickettsiaceae

Qua các nghiên cứu trước đây chẩn đoán Rickettsiaceae có các phương pháp

như: phương pháp Weil – Felix, phương pháp nuôi cấy tế bào trực tiếp, ELISA,

IFA, PCR, real-time PCR

1.5.1 Phương pháp Weil – Felix

Phương pháp Weil – Felix được báo cáo lần đầu tiên vào năm 1916 bởi

Edmund Weil và Arthur Felix áp dụng để chẩn đoán Rickettsiaceae trong một

khoảng thời gian dài trên toàn thế giới [12] Phương pháp này đơn giản dựa trên sự

13

phản ứng chéo xảy ra giữa các kháng thể được tạo ra trong giai đoạn nhiễm

Rickettsiaceae cấp tính với các kháng nguyên dòng OX (OX19, OX2, OXK) của

các loài Proteus Nhóm Typhus Rickettsia (Rickettsia prowazekii, R.typhi) phản ứng với P vulgaris OX19 và STG, O tsutsugamushi phản ứng với P mirabilis OXK Nhóm SFG (R rickettsii, R africae, R japonica, ) phản ứng với P vulgaris OX2

và OX19 ở các mức độ khác nhau tùy theo loài [72] Có 2 cách để thực hiện phương pháp này

Cách thứ nhất: Chuẩn bị một lam kính, nhỏ một giọt (50-100 μl) huyết thanh bệnh nhân lên bề mặt lam kính Bổ sung 1 giọt kháng nguyên muốn kiểm tra, trộn lẫn hỗn hợp trong 1 phút Kết quả dương tính khi có xuất hiện sự kết dính, tương ứng ngưỡng khảng 1:20

Cách thứ hai: Sử dụng 0,25% phenol làm chất pha loãng, pha loãng một dãy các ống 1ml có nồng độ huyết thanh bệnh nhân hơn kém nhau hai lần Một giọt dung dịch kháng nguyên được thêm vào mỗi ống, trộn đều và ủ ở nhiệt độ 50-55oC trong 4-6 giờ Các ống xuất hiện sựa kết tủa hay tạo hạt được cho là dương tính, với nồng độ ngưỡng phát hiện khoảng 1:320

Tuy nhiên hạn chế phương pháp này là độ nhạy và độ đặc hiệu thấp, một vài nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng độ nhạy vào khoảng 33% và độ đặc hiệu 46%[32] Chính vì thế phương pháp này bị thay thế bằng các phương pháp huyết thanh học khác, bao gồm xét nghiệm miễn dịch miễn dịch huỳnh quang (IFA), đó là tiêu chuẩn vàng Tuy nhiên, ở các cơ sở nhỏ hạn chế về mặt kĩ thuật thì đây vẫn là một

công cụ trong chẩn đoán và xác định các mầm bệnh gây sốt do Rickettsiaceae

1.5.2 Phương pháp nuôi cấy phân lập mầm bệnh

Rickettsiaceae là vi khuẩn ký sinh nội bào bắt buộc, sự phát triển của Rickettsiaceae phụ thuộc vào sự xâm nhập, tăng trưởng, và nhân bản trong tế bào

chất của tế bào chủ [73] Rickettsiaceae không thể nuôi cấy trong môi trường dinh

dưỡng nhân tạo và được nuôi cấy trong mô hoặc nuôi cấy phôi Phôi gà là môi trường thích hợp để nuôi cấy vi khuẩn này, sau đó nhuộm Giemsa hoặc Macchiavello để tìm mầm bệnh được bằng các phản ứng kháng nguyên – kháng thể với huyết thanh đặc hiệu Đây là một phương pháp được phát triển bởi Ernest

14

William Goodpasture và các đồng nghiệp của ông tại Đại học Vanderbilt vào đầu những năm 1930 Phương pháp này có thể được sử dụng để chẩn đoán và có độ nhạy cao, nhưng có thể phải mất đến 60 ngày để cho một kết quả dương tính Phương pháp này chỉ được sử dụng ở những phòng thí nghiệm đạt tiêu chuẩn an toàn sinh học cấp II trở lên, bởi việc nuôi cấy trực tiếp vi khuẩn sống dễ gây nguy hiểm cho người thực hiện thí nghiệm và lây lan ra môi trường bên ngoài [68] Vì

vậy phương pháp này không được phổ biến trong chẩn đoán Rickettsiaceae

1.5.3 Phương pháp ELISA

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), còn được gọi là enzyme immunoassay (EIA), là một kỹ thuật ứng dụng nguyên lý kháng nguyên – kháng thể

để phát hiện sự hiện diện của một kháng thể hoặc kháng nguyên trong một mẫu

Năm 1971, Peter Perlmann và Eva Engvall tại Đại học Stockholm ở Thụy Điển, Anton Schuurs và Bauke van Weemen ở Hà Lan đã độc lập xuất bản các bài báo tổng hợp các kiến thức từ những phương pháp trước đây để mô tả đầy đủ phương pháp EIA / ELISA [16]

Nguyên lý của ELISA chính là dựa vào tính đặc hiệu kháng nguyên – kháng thể và gồm các bước cơ bản sau:

 Kháng nguyên – antigen (KN) chưa biết được gắn trên một bề mặt

 Kháng thể – antibody (KT) biết trước được ―rửa‖ qua bề mặt đó Kháng thể này được gắn kết với ezyme

 Thêm vào một cơ chất (substance), enzyme sẽ biến đổi cơ chất này và tạo tín hiệu có thể xác định được

Hình 1.12: Nguyên lý phương pháp ELISA [78]

15

Một phản ứng ELISA xảy ra trong đó kháng thể bắt cặp đặc hiệu với kháng nguyên cụ thể Các mẫu có số lượng kháng nguyên chưa biết được cố định trên một giá thể rắn (thường là một tấm polystyrene vi chuẩn) hoặc không đặc hiệu (thông qua hấp phụ lên bề mặt) hoặc đặc hiệu (thông qua chụp bằng kháng thể khác đặc hiệu với kháng nguyên tương tự trong thí nghiệm ELISA sandwich)

Sau khi kháng nguyên được cố định, các kháng thể phát hiện được thêm vào, tạo thành một phức hợp với các kháng nguyên Các kháng thể phát hiện có thể liên kết với một loại enzyme, hay chính nó có thể được phát hiện bởi một kháng thể thứ cấp liên kết với một loại enzyme thông qua liên kết cộng hóa trị giữa các phân tử sinh học Các phần của kháng thể ELISA là tương tự với phương pháp western blot Giữa mỗi bước, các đĩa thường được rửa bằng dung dịch tẩy nhẹ để loại bỏ các protein hoặc các kháng thể không gắn Sau bước rửa cuối cùng, cơ chất của enzyme được thêm vào để tạo ra tín hiệu có thể nhìn thấy, giúp chỉ ra số lượng kháng nguyên trong mẫu [6]

Do có những ưu điểm về độ nhạy, độ đặc hiệu và khả năng sản xuất kit thương mại, ELISA được khuyến cáo sử dụng như xét nghiệm chuẩn cho chẩn đoán

các loài Rickettsiaceae ở vùng bệnh lưu hành [13] Tuy nhiên phương pháp này còn

những hạn chế trong việc chẩn đoán bệnh ở giai đoạn sớm hay trong trường hợp xuất hiện vết loét và không chẩn đoán được bằng huyết thanh học [33]

1.5.4 Phương pháp kháng thể miễn dịch huỳnh quang gián tiếp

Indirect Fluorescent Antibody (IFA) lần đầu tiên được Bozeman và cộng sự

mô tả vào năm 1963 [9] Sau đó đã được thay đổi để cho phép sử dụng lượng huyết thanh và kháng nguyên nhỏ hơn Hiện nay phương pháp này được sử dụng phổ biến

nhằm chẩn đoán nhanh chóng bệnh nhân nhiễm Rickettsiaceae

Phương pháp miễn dịch huỳnh quang có độ nhạy cao, tuy nhiên sự khác nhau

giữa các loài Rickettsiaceae khó phân biệt do có phản ứng liên kết chéo kháng thể Một phương pháp được phát triển bởi phòng thí nghiệm tham chiếu Rickettsiaceae

của Úc đã tối ưu hoá phương pháp này, tăng giá trị ngưỡng phát hiện lên 1:128 nhằm giảm tỉ lệ dương tính giả [22] IFA vẫn đang được xem là tiêu chuẩn vàng trong việc chẩn đoán huyết thanh học, nhưng gần đây các phương pháp chẩn đoán

16

phân tử đang được kiểm chứng để giúp việc chẩn đoán nhanh chóng chính xác hơn

ở giai đoạn đầu của bệnh Trong một nghiên cứu mới đây của Cherry Lim và cộng

sự (2015), 24 bệnh nhân bị nhiễm sốt Dengue, được kiểm tra bằng IFA IgM-STG

cho kết quả 5 bệnh nhân dương tính Trong khi đó với các xét nghiệm nuôi cấy tế bào, hay phương pháp PCR đều cho kết quả âm tính Như vậy, điều đó chỉ ra rằng

độ đặc hiệu của phương pháp IFA thấp hơn so với phương pháp PCR [36]

1.5.5 Phương pháp PCR, nested PCR

 Phương pháp PCR (polymerase chain reaction) là phương pháp khuếch đại nhanh nhiều bản sao các đoạn ADN mà không qua tạo dòng Phương pháp này được Kary Mullis đưa ra năm 1985 và Saiki hoàn thiện năm 1988 [39] Phương pháp PCR được thực hiện hoàn toàn trong các eppendoff và trong thời gian ngắn ta

có thể thu nhận rất nhiều bản sao ADN Kỹ thuật PCR có thể được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực: chẩn đoán, xét nghiệm các tác nhân vi sinh vật gây bệnh, xác định giới tính của phôi, giải mã di truyền, tạo giống mới với các đột biến định hướng, nghiên cứu sự tiến hoá của sinh vật ở mức độ phân tử,… Đây là một phương pháp tổng hợp ADN dựa trên mạch khuôn là một trình tự đích ADN ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn ADN này Mồi là những đoạn ADN ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một mạch của đoạn ADN khuôn và nhờ hoạt động của ADN polymerase đoạn mồi này được kéo dài để hình thành mạch mới Kỹ thuật PCR được hình thành dựa trên đặc tính này của ADN polymerase, đoạn ADN nằm giữa hai mồi sẽ được khuếch đại thành số lượng lớn bản sao đến mức có thể thấy được sau khi nhuộm bằng ethidium bromide và có thể thu nhận đoạn ADN này cho các mục đích khác nhau bằng các thao tác trên gel Như vậy, để khuếch đại một trình tự ADN xác định, cần phải có những thông tin tối thiểu về trình tự của ADN, đặc biệt là trình tự base ở hai đầu đoạn ADN đủ để tạo các primer bổ sung chuyên biệt

Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lăp lại nối tiếp nhau Mỗi chu kỳ gồm 3 bước như sau :

Bước 1: (Biến tính tách đôi sợi ADN, denaturation)

17

Giai đoạn này được thực hiện ở nhiệt độ cao (94 - 95oC) trong vòng 30 giây đến 1 phút, làm cho phân tử ADN mạch kép tách thành 2 mạch đơn Chính 2 mạch đơn này đóng vai trò là mạch khuôn cho sự tổng hợp 2 mạch bổ sung mới

Bước 2: (bắt cặp, annealing)

Trong bước này ở nhiệt độ được hạ thấp hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của các primer, cho phép các primer bắt cặp với mạch khuôn Trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động trong khoảng 55 – 65oC Tùy thuộc vào Tm của các mồi mà thời gian bắt cặp kéo dài từ 30 – 60 giây

Bước 3: (kéo dài, elongation – extension)

Nhiệt độ được tăng lên 72oC giúp cho ADN polymerase hoạt động tốt nhất Dưới tác động của ADN polymerase, các nucleotide lần lượt gắn vào mồi theo nguyên tắc bổ sung với mạch khuôn Thời gian của giai đoạn này tùy thuộc vào độ dài của trình tự ADN khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến vài phút Sự khuếch đại này có thể được tính như sau:

Tổng lượng ADN khuếch đại = m x 2n (m: Là lượng ADN ban đầu; n: số chu kỳ) Như vậy, qua một chu kỳ nhiệt, một DNA đích đã được nhân bản thành hai bản sao; và nếu chu kỳ này được lặp đi lặp lại liên tục 30 đến 40 lần thì từ một DNA đích đã nhân bản được thành 230 đến 240 bản sao, tức là đến hàng tỷ bản sao

 Nested PCR là một dạng thay đổi của PCR thường, trong đó hai cặp mồi PCR được dùng để khuếch đại đoạn DNA Phản ứng nested PCR phải được thực hiện hai lần Lần đầu, phản ứng PCR được thực hiện trong 15 đến 30 chu kỳ, với cặp mồi thứ 1, cho phép khuếch đại đoạn gen dài hơn đoạn gen cần xác định nằm trong đoạn gen được khuếch đại lần 1 Sản phẩm PCR lần 1 sau đó sẽ là mẫu cho PCR lần 2, cặp mồi thứ 2 sẽ bắt cặp phía trong của sản phẩm PCR lần 1 và khuếch đại đoạn gen cần xác định

Ưu điểm của nested PCR là tăng độ đặc hiệu vì phản ứng PCR lần 2 chỉ xảy ra dựa trên sản phẩm của PCR lần 1 Đồng thời phương pháp này tăng độ nhạy vì tổng

số chu kỳ nhân lên nhiều hơn Tuy nhiên hạn chế của phương pháp này dễ lây nhiễm do phải chuyển mẫu giữa hai lần thực hiện phản ứng

Năm 2006, ở Hàn Quốc, một báo cáo của Kim và cộng sự bằng phản ứng PCR

mẫu vết loét cho thấy ADN O tsutsugamushi đã được phát hiện trong 6 trên 7 bệnh

18

nhân có xuất hiện vết loét mà âm tính với IFA [26] Trong một nghiên cứu khác ở Thái Lan, kết quả chỉ ra 3 trong số 20 (15%) bệnh nhân có biểu hiện sốt là dương tính khi thực hiện phản ứng PCR, mặc dù có kết quả huyết thanh học âm tính [60] Như vậy kĩ thuật phân tử là phương pháp cần thiết giúp cho việc chẩn đoán ngày càng chính xác hơn Một nghiên cứu khác năm 2011 của Prakash và cộng sự đã sử

dụng nested PCR trên vùng gen 56kDa để phát hiện O tsutsugamushi, kết quả cho

thấy độ đặc hiệu của kĩ thuật này là 100% cao hơn so với hai phương pháp ELISA

và Weil-Felix với độ đặc hiệu lần lượt là 73% và 94% [51]

1.5.6 Phương pháp real-time PCR

Real-time PCR là kỹ thuật nhân bản ADN đích trong ống nghiệm lên hàng tỷ bản sao dựa vào các chu kỳ nhiệt và kết quả khuếch đại đích thể hiện ngay sau mỗi chu kỳ của phản ứng bằng cách thu nhận các tín hiệu huỳnh quang Trong quá trình xảy ra phản ứng, có sản phẩm khuếch đại đặc hiệu xuất hiện trong ống PCR thì taqman probe đặc hiệu với trình tự đích sẽ bắt cặp vào sản phẩm khuếch đại và sẽ bị phân giải bởi enzyme taqpolymerase (nhờ hoạt tính 5‘-3‘ exonuclease) khi tổng hợp sợi bổ sung ở giai đoạn kéo dài Sự phân giải taqman probe sẽ làm tách rời chất phát huỳnh quang (fluorophore) FAM ở đầu 5‘ khỏi chất hấp phụ huỳnh quang (quencher) ở đầu 3‘của probe, nhờ vậy ống phản ứng sẽ phát huỳnh quang khi bị chiếu tia cực tím hay laser và sự phát huỳnh quang này sẽ được ghi nhận bởi đầu đọc real-time của máy

Hình 1.13: Biểu đồ đường biểu diễn tín hiệu cường độ huỳnh quang khuếch đại

19

Mặc dù kĩ thuật PCR chi phí thấp hơn so với real-time PCR nhưng đối với các bệnh truyền nhiễm cấp tính thì việc chuẩn đoán nhanh và chính xác là ưu tiên hàng đầu Hơn nữa kĩ thuật PCR có một số nhược điểm như sau:

- Nguy cơ ngoại nhiễm cao Trong quá trình thực hiện, việc mở nắp phản ứng chứa sản phẩm PCR có thể sẽ làm lây nhiễm sản phẩm PCR vào không khí, đặc biệt khi hàm lượng mạch khuôn cho PCR ban đầu cao Lượng sản phẩm PCR này có khả năng nhiễm vào các ống phản ứng PCR của những lần chạy kế tiếp, và gây ra hiện tượng dương tính giả Đối với real-time PCR, vẫn có nguy cơ ngoại nhiễm nhưng với tỷ lệ thấp hơn, do cả quá trình ống phản ứng luôn được đóng cho đến khi tiêu hủy

- Tốn nhiều thời gian hơn Để có kết quả từ phương pháp này, phải thực hiện nhiều thao tác như pha gel, điện di, nhuộm gel, soi gel Do đó sẽ tốn nhiều thời gian hơn và dễ bị ảnh hưởng đến kết quả Đối với real-time PCR, kết quả sẽ được hiển thị ngay sau mỗi chu kỳ

- Tính độc hại Một số loại thuốc nhuộm gây độc hại như ethidium bromide, và điều này cũng gây khó khăn trong việc xử lý chất thải

- Độ đặc hiệu thấp hơn real-time PCR Mặc dù cả PCR và real-time PCR đều sử dụng cặp mồi xuôi và mồi ngược khẳng định độ đặc hiệu của phản ứng, nhưng real-time PCR có thêm probe là trình tự thứ ba tăng thêm tính đặc hiệu cho phương pháp này Hơn nữa phương pháp PCR chỉ sử dụng để định tính, real-time PCR có khả năng định tính và định lượng chính xác nồng độ mẫu bệnh phẩm

Trong những năm gần đây, kĩ thuật real-time PCR đã được phát triển rộng rãi trong các phòng thí nghiệm vi sinh học lâm sàng để chẩn đoán các bệnh truyền nhiễm, đặc biệt là các bệnh do vi khuẩn Ở Việt Nam, công cụ phân tử này cũng đã được ứng dụng cho việc phát hiện nhanh chóng các tác nhân gây bệnh như virut hay

vi khuẩn, bởi phương pháp này cho phép xác định sớm, độ nhạy và độ đặc hiệu cao Năm 2009, Kramme và cộng sự đã sử dụng kĩ thuật real-time PCR trên vùng gen

56kDa để phát hiện O tsutsugamushi trong các bệnh nhân nhiễm STG ở Việt Nam

[31] Trong một nghiên cứu mới đây năm 2017, kĩ thuật này cũng đã được Nhiem

và cộng sự áp dụng để chẩn đoán O tsutsugamushi trên mẫu bệnh phẩm vết loét tại

Việt Nam [70]

20

1.6 Tình hình bệnh do Rickettsiaceae ở Việt Nam

Trong những năm 1920 và đầu 1930, một số ca sốt mò (STG) lần đầu được mô

tả trong y văn về biểu hiện lâm sàng bao gồm sốt, có vết loét kèm theo nổi hạch tại chỗ,

và phản ứng huyết thanh trong giai đoạn hồi phục dương tính với Proteus X19 Trong nghiên cứu về tiêu chuẩn chẩn đoán, trên Bán đảo Đông Dương sau năm 1945, sốt mò trở nên là một vấn đề y tế quan trọng, gây những tổn thất đáng kể cho Quân đội Pháp

về lực lượng: 5708 người bị bệnh và 158 ca tử vong Sau năm 1954 cho đến nay, nhiều

ổ dịch sốt mò đã được phát hiện tại các vùng rừng núi và hải đảo ở vùng núi phía Bắc, Tây Nguyên, Trung Bộ; tuy nhiên, vùng lưu hành thực sự của sốt mò có thể rộng lớn hơn rất nhiều, bao gồm nhiều địa phương và nhiều vùng trong cả nước Một báo cáo

hồi cứu gần đây cho thấy 251 ca được xác định là dương tính với O tsutsugamushi

tại bệnh viện Bệnh nhiệt đới Trung ương năm 2001-2003 [40] Theo Hamaguchi

và cộng sự (2015) đã tiến hành nghiên cứu hồi cứu ta ̣i Bê ̣nh viê ̣n Ba ̣ch Mai , Viê ̣t Nam cho thấy tỷ lê ̣ nhiễm sốt mò và sốt phát ban do bo ̣ chét chuô ̣t truyền chiếm tỷ

lê ̣ cao nhất [21] Nguyễn Vũ Trung và cộng sự nghiên cứu tỷ lệ nhiễm SFG, TG, STG tại vùng nông thôn và thành phố các tỉnh miền Bắc Việt Nam bằng kỹ thuật

ELISA cho thấy, tỷ lệ nhiễm Rickettsia là 9,14% (83/908) Trong đó, tỷ lệ nhóm

SFG chiếm tỷ lệ cao nhất 6,5% (58/908), tỷ lệ nhóm STG chiếm tỷ lệ 1,1% (10/908) và TG chiếm tỷ lệ 1,7% (15/908) [66]

Bệnh do Rickettsiaceae có bệnh cảnh lâm sàng đa dạng Trước đây,

tetracyclines được sử dụng khá phổ biến trong điều trị các bệnh sốt do vi khuẩn, bởi vậy những trường hơp sốt chưa rõ nguyên nhân có thể do các loài

Rickettsiaceae gây ra sẽ được khống chế, điều trị Tuy nhiên ngày nay với sự tiến bộ

khoa học nghiên cứu, tetracyclines được thay thế bởi các loại kháng sinh phổ rộng khác, một số báo cáo cho thấy vi khuẩn bắt đầu giảm nhạy cảm với các kháng sinh này Hơn nữa, nhiều loại trong số đó không có khả năng tiêu diệt Rickettsiaceae, đây cũng là yếu tố nguy cơ bùng phát những bệnh sốt này nếu không được chẩn đoán và chữa trị kịp thời Thêm vào đó, bệnh có thể để lại những biến chứng thần kinh nặng

nề và có thể gây tử vong cho bệnh nhân Do vậy, chẩn đoán xác định căn nguyên gây bệnh sớm và chính xác để điều trị sớm có ý nghĩa rất lớn

21

Việc chẩn đoán Rickettsiaceae hiện nay ở Việt Nam chủ yếu vẫn dựa vào các

yêu tố lâm sàng Tại các cơ sở ở tuyến địa phương, do sự thiếu hụt về khoa học kĩ

thuật nên việc chẩn đoán những bệnh này còn nhiều hạn chế Phương pháp đang

được sử dụng chủ yếu vẫn là phương pháp huyết thanh học (Weil – Felix) Bởi vậy

việc nghiên cứu tình hình và mức độ nghiêm trọng của những bệnh do

Rickettsiaceae gây ra vẫn là vấn đề khó khăn ở Việt Nam

Trong những năm gần đây, nhờ tiến bộ của khoa học kỹ thuật, một số trung

tâm, bệnh viện lớn có khả năng chẩn đoán chính xác hơn bệnh do Ricketssiaceae

gây ra Tuy nhiên cho đến nay, ở Việt Nam vẫn chưa có một nghiên cứu nào đề cập

một cách đầy đủ và toàn diện về 3 nhóm bệnh trên

Real-time PCR là một công cụ chẩn đoán phòng thí nghiệm vừa có độ nhạy

vừa có độ đặc hiệu cao nên việc phát triển kỹ thuật này cho chẩn đoán xác định

bệnh Rickettsiaceae là một yêu cầu hết sức cần thiết Lựa chọn và tối ưu qui trình

real-time PCR phát hiện căn nguyên Rickettsia và O tsutsugamushi cụ thể cho từng

quốc gia, từng vùng địa lý sẽ phụ thuộc sự lưu hành của loài Rickettsia và

O tsutsugamushi ở từng nơi đó Dựa vào những kết quả nghiên cứu trên thế giới

và trong khu vực, chúng tôi đã phát triển kỹ thuật real-time PCR phát hiện

Rickettsiaceae gây bệnh ở người

22

Chương 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Tất cả bệnh nhân điều trị nội trú tại Bệnh viện Trung ương Quân đội 108 từ tháng 6 năm 2016 đến tháng 9 năm 2017 có các triệu chứng lâm sàng nghi ngờ sốt

do Rickettsiaceae

* Tiêu chuẩn lựa chọn:

Bệnh nhân sốt cấp tính và có ít nhất 1 trong những triệu chứng lâm sàng như: Vết loét (Eschar), sung huyết , phát ban, nổi hạch, đau đầu, đau cơ nhiều Hoặc sốt cấp tính chưa xác định được nguyên nhân sau 1 tuần nhập viện

* Tiêu chuẩn loại trừ:

Bệnh nhân sốt cấp tính vào viện có bằng chứng lâm sàng, cận lâm sàng rõ ràng

do căn nguyên không nhiễm trùng hoặc nhiễm trùng khác: Bệnh hệ thống tự miễn, ung thư, cấy máu (+), ký sinh trùng sốt rét (+), huyết thanh chẩn đoán sởi IgM (+), Rubella (+), PCR cúm (+),…

Mẫu đối chứng: E.coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis,

Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Samonella.sp, Neisseria meningitidis, Staphylococcus aureus, Streptococcus suis,… Khoa Sinh học phân tử

Bệnh viện Trung ương quân đội 108 cung cấp

2.1.2 Hóa chất

Kit tách chiết ADN: Blood genomic DNA isolation Mini Kit (Norgen); kit tách plasmid: GenJET Plasmid Miniprep Kit (Thermo); kit tinh sạch sản phẩm PCR: GenJET PCR Purification Kit (Thermo); The Thermo Scientific™ InsTAclone™ PCR Cloning Kit Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1 (Sigma), Gel agarose của hãng Norgen, Thuốc nhuộm gel Ethidium Bromide, Đệm TAE 1x, Mastermix Promega, Mastermix Qiagen, Primer, Probe, Ống eppendorf: ống 1,5ml; ống 0,2ml PCR, ống 0,2ml RT-PCR hãng Thermo, Đầu côn, Ống máu EDTA, Môi trường LB, Ampicilin 50mg/mL, X-Gal 20mg/mL, IPTG 100mM

- Mỹ), Máy ly tâm lạnh (Eppendorf - Đức), Máy block nhiệt (Eppendorf - Đức), Bộ pipets (Eppendorf - Đức), Máy Vortex M52 (IKA - Đức), Máy khuấy từ gia nhiệt model RCT (IKA - Đức), Máy Real-time PCR (Agilent - Mỹ)

2.2 Sơ đồ tiến hành thí nghiệm

Thu mẫu

Tách chiết Loại RBC

DNA vi khuẩn

Giải trình tựMẫu dương tínhSản phẩm khuếch đại DNA

Tạo plasmid chuẩn dương

Real-time PCR

Điện di Nested PCR

Cloning Tinh sạch

Phân tích kết quả

24

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp thiết kế mồi, probe

Để thiết kế các cặp mồi trong phản ứng PCR phát hiện vi khuẩn

O tsutsugamushi và các loài Rickettsia khác, chúng tôi tiến hành thu thập cơ sở dữ

liệu, trình tự gen của các loài Rickettsia đã được công bố Đặc biệt chú trọng các

loài đã được báo cáo ở các khu vực lân cận như: Đông Á (Trung Quốc, Triều Tiên,

Nhật Bản), các nước vùng Đông Nam Á (Thái Lan, Lào, ), Ấn Độ,… Đồng thời,

tham khảo các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra những vùng gen đặc hiệu và bảo thủ,

chúng tôi thiết kế mồi dựa trên các vùng gen đó theo một số nguyên tắc như: độ dài

của mồi, nhiệt độ nóng chảy của mồi (Tm), nhiệt độ gắn mồi (Ta), mật độ GC,… và

kiểm tra lại bằng BLAST

Đối với việc thiết kế primer, probe cho phản ứng real-time PCR cũng giống

như thiết kế primer như trên Tuy nhiên, nên thiết kế mồi để có sản phẩm khuếch

đại từ 75-200 bps Không nên ít hơn 75 bps vì như vậy khó phân biệt được sản

phẩm khuếch đại đặc hiệu với sản phẩm khuếch đại của dimer-primer, cũng không

nên quá 200 bps vì như vậy sẽ khó đạt được hiệu quả PCR chuẩn để cho kết quả

PCR chính xác Thêm vào đó, cần thiết kế sao cho nhiệt độ gắn mồi của probe phải

lớn hơn nhiệt độ gắn mồi của primer từ 5-10oC

2.3.2 Tách chiết ADN

Đối với mẫu bệnh phẩm máu:

- Mẫu bệnh phẩm máu sau khi thu thập được tiến hành hút 1ml máu chuyển

sang ống EDTA, bổ sung 3ml RBC lysis buffer (Red blood cell lysis buffer),

lắc đều ở nhiệt độ thường 5-7 phút Sau khi ly tâm ở tốc độ 5000 vòng/phút

trong 5 phút thì loại bỏ toàn bộ dịch rửa và thu cặn Tiếp theo cho vào 190µl

H2O để hòa tan cặn và chuyển toàn bộ sang ống eppendorf 1,5ml sau đó bổ

sung 10µl nội chuẩn (Internal Quality Control)

- Tiến hành tách chiết ADN bằng Blood genomic DNA isolation Mini Kit

(Norgen, Canada) theo qui trình cuả hang như sau:

+ Cho 20 µl proteinase K vào ống eppendorf 1,5ml