Nghiên cứu và chế tạo cảm biến sinh học điện hoá độ nhạy cao sử dụng điện cực in các bon ứng dụng trong chẩn đoán bệnh sớm

Kháng thể cố định trên bề mặt điện cực bằng liên kết cộng hóa trị; a giữa nhóm amin hoặc nhóm cacboxyl trên kháng thể với nhóm cacboxyl hoặc nhóm amin biến tính trên bề mặt điện cực; b

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

ĐỖ THỊ NGỌC TRÂM

NGHIÊN CỨU VÀ CHẾ TẠO CẢM BIẾN SINH HỌC ĐIỆN HÓA

ĐỘ NHẠY CAO SỬ DỤNG ĐIỆN CỰC IN CÁC BON ỨNG DỤNG

TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH SỚM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ VẬT LÝ KỸ THUẬT

Hà Nội - 2018

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

ĐỖ THỊ NGỌC TRÂM

NGHIÊN CỨU VÀ CHẾ TẠO CẢM BIẾN SINH HỌC ĐIỆN HÓA

ĐỘ NHẠY CAO SỬ DỤNG ĐIỆN CỰC IN CÁC BON ỨNG DỤNG

TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH SỚM

Ngành: Vật lý kỹ thuật

Mã số: 9520401

LUẬN ÁN TIẾN SĨ VẬT LÝ KỸ THUẬT

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1 PGS.TS Trương Thị Ngọc Liên

2 GS.TS Patrick Wagner

Hà Nội - 2018

i

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin bày lòng biết ơn sâu sắc nhất đến tập thể cán bộ hướng dẫn PGS.TS Trương Thị Ngọc Liên trường Đại học Bách khoa Hà Nội và GS.TS Patrick Wagner trường Đại học KU Leuven, Vương quốc Bỉ đã nhiệt tình chỉ bảo, định hướng và giúp đỡ về mặt khoa học để tôi có thể hoàn thành luận án tiến sĩ

Tôi xin chân thành cảm ơn các thành viên trong phòng thí nghiệm Cảm biến sinh học thuộc Bộ môn Vật liệu Điện tử, phòng thí nghiệm của GS Yoshiakia Ukita thuộc Đại học Yamanashi Nhật Bản, phòng thí nghiệm trọng điểm Quốc gia về Vật liệu và Linh kiện Điện

tử, Phòng thí nghiệm Siêu cấu trúc và Công nghệ nano y sinh thuộc Viện Vệ sinh dịch tễ, Khoa Vật lý trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi giúp tôi thực hiện các thí nghiệm trong thời gian nghiên cứu

Tôi xin chân thành cảm ơn sự hỗ trợ tài chính của đề tài NAFOSTED mã số 103.99.2012.12, đề tài VLIR-UOS mã số ZEIN2013RIP022 và đề tài AUN/SEED-Net CRC 2016-2018

Tôi xin cảm ơn tới ban lãnh đạo Viện Vật lý kỹ thuật và trường Đại học Bách khoa Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi và hỗ trợ trong thời gian học tập Tôi cũng xin cảm ơn tập thể các thầy cô, anh chị và bạn bè đồng nghiệp thuộc bộ môn Vật liệu điện tử, Viện Hóa học và Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã hỗ trợ và đóng góp những ý kiến quí báu về mặt chuyên môn trong quá trình thực hiện đề tài

Cuối cùng, tác giả xin dành những tình cảm chân thành và sâu sắc nhất tới gia đình đã luôn sát cánh, chia sẻ những khó khăn, thông cảm và động viên trong suốt quá trình học tập,

nghiên cứu

Tác giả

Đỗ Thị Ngọc Trâm

LỜI CAM ĐOAN

Tác giả xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu do tác giả thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Trương Thị Ngọc Liên và GS.TS Patrick Wagner Các số liệu và kết quả trong luận án là trung thực và chưa được tác giả khác công bố trong bất kỳ công trình nào Tất cả các công trình đã công bố chung với thầy hướng dẫn khoa học và đồng nghiệp đều được sự đồng ý của các tác giả trước khi đưa vào luận án

iii

MỤC LỤC

DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT viii

DANH MỤC CÁC BẢNG x

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ xi

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 CẢM BIẾN SINH HỌC ĐIỆN HÓA ỨNG DỤNG CHẨN ĐOÁN BỆNH SỚM 6

1.1 Cảm biến sinh học 6

1.1.1 Đầu thu sinh học 7

1.1.2 Bộ phận chuyển đổi tín hiệu 13

1.1.3 Phương pháp cố định đầu thu sinh học 15

1.1.4 Các phương pháp cố định kháng thể 17

1.1.4.1 Hấp phụ vật lý 18

1.1.4.2 Liên kết cộng hóa trị 18

1.1.4.3 Ái lực tương tác sinh học 20

1.2 Cảm biến sinh học điện hóa 21

1.2.1 Điện cực điện hóa 21

1.2.2 Phân loại cảm biến sinh học điện hóa 24

1.2.2.1 Cảm biến đo dòng 24

1.2.2.2 Cảm biến đo điện thế 26

1.2.2.3 Cảm biến đo độ dẫn 28

1.2.2.4 Cảm biến đo phổ tổng trở 29

1.3 Ung thư và một số chất chỉ dấu khối u 32

1.3.1 Chỉ dấu α-hCG và ung thư tế bào mầm tinh 34

1.3.2 Chỉ dấu PSA và ung thư tiền liệt tuyến 35

1.3.3 Chỉ dấu AFP và ung thư gan nguyên phát 36

1.4 Nghiên cứu về cảm biến sinh học điện hóa ứng dụng phát hiện chỉ dấu khối u 36

1.4.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 36

1.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 47

1.4.3 Định hướng nghiên cứu của luận án 47

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 49

2.1 Phương pháp điện hóa 49

2.1.1 Phương pháp phổ tổng trở điện hóa (EIS) 49

2.1.1.1 Mô hình mạch điện tương đương Randles 50

2.1.1.2 Biểu diễn phổ tổng trở trong mặt phẳng phức 51

2.1.2 Phương pháp quét thế tuần hoàn (CV) 53

2.2 Phương pháp khảo sát tính chất và hình thái học vật liệu 54

2.2.1 Ảnh hiển vi điện tử quét phát xạ trường (FE-SEM) 54

2.2.2 Phổ tán xạ năng lượng tia X (EDS) 54

2.2.3 Phổ tán xạ Raman 54

2.3 Công nghệ vi lưu ly tâm 55

2.3.1 Giới thiệu 55

2.3.2 Thiết kế và quy trình chế tạo chíp vi lưu ly tâm 55

2.3.3 Vận chuyển dung dịch trong chíp vi lưu ly tâm 57

2.4 Quy trình thực nghiệm chế tạo cảm biến 58

2.4.1 Tổng hợp hạt nano vàng trên điện cực làm việc SPCE 58

2.4.2 Màng đơn lớp tự lắp ghép (SAM) alkanethiol 58

2.4.3 Tổng hợp vật liệu polyme bằng phương pháp trùng hợp điện hóa 59

2.4.3.1 Polyme đồng trùng hợp PPy-PPa 59

2.4.3.2 Vật liệu lai cấu trúc nano hai chiều giữa polyme đồng trùng hợp PPy-PPa và erGO 60

2.4.3.3 Vật liệu lai poly(p-ATP) và hạt nano vàng 61

2.4.4 Cố định đầu thu sinh học bằng liên kết cộng hóa trị 61

2.4.4.1 Liên kết cộng hóa trị thông qua nhóm amin của đầu thu sinh học 62

2.4.4.2 Liên kết cộng hóa trị thông qua nhóm cacboxyl của đầu thu sinh học 63

2.5 Khảo sát hoạt động của cảm biến phổ tổng trở điện hóa 63

2.6 Quy hoạch số liệu thực nghiệm 65

2.6.1 Độ nhạy của cảm biến 65

2.6.2 Khoảng tuyến tính của cảm biến 66

2.6.3 Độ lặp lại của cảm biến 66

2.6.4 Giới hạn phát hiện của cảm biến 66

v

2.6.5 Độ chọn lọc của cảm biến 67

CHƯƠNG 3 CẢM BIẾN MIỄN DỊCH PHÁT HIỆN CHỈ DẤU α-hCG ỨNG DỤNG CHẨN ĐOÁN U TẾ BÀO MẦM TINH 68

3.1 Mở đầu 68

3.2 Thực nghiệm 69

3.2.1 Hóa chất 69

3.2.2 Điện cực và linh kiện 70

3.2.3 Quy trình cố định mAb hCG trên điện cực vàng 71

3.2.4 Khảo sát hoạt động của cảm biến mAb hCG/SAM(MHDA)/QCM 72

3.2.4.1 Vi cân tinh thể thạch anh 72

3.2.4.2 Khảo sát hoạt động của cảm biến 73

3.2.5 Khảo sát hoạt động của cảm biến mAb hCG/SAM(MHDA)/SPAuE 73

3.3 Kết quả và thảo luận 74

3.3.1 Cảm biến miễn dịch nhạy khối lượng mAb hCG/SAM(MHDA)/QCM 74

3.3.1.1 Hiệu suất cố định kháng thể 74

3.3.1.2 Đặc trưng chuẩn của cảm biến 75

3.3.2 Cảm biến miễn dịch phổ tổng trở mAb hCG/SAM(MHDA)/SPAuE 77

3.3.2.1 Đặc tính điện hóa sau mỗi bước công nghệ 77

3.3.2.2 Đặc trưng chuẩn của cảm biến 79

3.4 Kết luận 81

CHƯƠNG 4 CẢM BIẾN APTAMER PHÁT HIỆN CHỈ DẤU PSA ỨNG DỤNG CHẨN ĐOÁN UNG THƯ TIỀN LIỆT TUYẾN 82

4.1 Mở đầu 82

4.2 Thực nghiệm 83

4.2.1 Hóa chất 83

4.2.2 Điện cực và linh kiện 84

4.2.3 Tổng hợp hạt nano vàng trên điện cực SPCE 84

4.2.4 Cố định aptamer 86

4.3 Kết quả và thảo luận 87

4.3.1 Cảm biến aptamer phổ tổng trở điện hóa 87

4.3.2 Cảm biến PSA-aptamer/SAM (MHDA)/SPAuE 88

4.3.2.1 Đặc tính điện hóa sau mỗi bước công nghệ 88

4.3.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ aptamer lên tín hiệu cảm biến 89

4.3.3 Cảm biến PSA-aptamer/SAM (MHDA)/AuNPs-SPCE 90

4.3.3.1 Phân tán aptamer 90

4.3.3.2 Đặc tính điện hóa sau mỗi bước công nghệ 93

4.3.3.3 Đặc trưng chuẩn của cảm biến 95

4.3.3.4 Độ chọn lọc của cảm biến 97

4.4 Kết luận 97

CHƯƠNG 5 CẢM BIẾN MIỄN DỊCH PHÁT HIỆN CHỈ DẤU AFP ỨNG DỤNG CHẨN ĐOÁN UNG THƯ GAN 98

5.1 Mở đầu 98

5.2 Thực nghiệm 99

5.2.1 Hóa chất và điện cực 99

5.2.2 Cố định mAb AFP lên điện cực PPy-PPa/SPCE và PPy-PPa/erGO-SPCE 99

5.2.3 Cố định mAb AFP lên điện cực SPCE biến tính bởi SAM (p-ATP) 100

5.2.4 Cố định mAb AFP lên điện cực SPCE biến tính bởi vật liệu lai poly(p-ATP) và hạt nano vàng 100

5.3 Kết quả và thảo luận 101

5.3.1 Cảm biến miễn dịch điện hóa mAb AFP/PPy-PPa/SPCE 101

5.3.1.1 Polyme đồng trùng hợp PPy-PPa trên điện cực SPCE 101

5.3.1.2 Tối ưu hóa tỷ số hợp phần của monome Pa với Py 103

5.3.1.3 Đặc trưng chuẩn của cảm biến 104

5.3.2 Cảm biến miễn dịch điện hóa mAb AFP/PPa-PPy/erGO-SPCE 107

5.3.2.1 Khử điện hóa GO trên SPCE 107

5.3.2.2 Hình thái học bề mặt điện cực 111

5.3.2.3 Đặc trưng chuẩn của cảm biến 112

5.3.3 Cảm biến miễn dịch điện hóa mAb AFP/SAM (p-ATP)/AuNPs-SPCE 115

5.3.3.1 Ảnh hưởng của mật độ hạt nano vàng 115

5.3.3.2 Ảnh hưởng của thời gian tạo màng SAM 118

5.3.3.3 Đặc trưng điện hóa sau mỗi bước công nghệ 119

5.3.3.4 Đặc trưng chuẩn của cảm biến 120

vii

5.3.4 Cảm biến miễn dịch điện hóa mAb AFP/poly(p-ATP)/AuNPs-SPCE 121

5.3.4.1 Poly(p-ATP) kết hợp hạt nano vàng trên điện cực AuNPs-SPCE 122

5.3.4.2 Phổ tán xạ Raman của màng poly(p-ATP)/AuNPs-SPCE 124

5.3.4.3 Đặc trưng điện hóa sau các bước công nghệ 125

5.3.4.4 Đặc trưng chuẩn của cảm biến 126

5.4 Kết luận 128

CHƯƠNG 6 CẢM BIẾN ĐIỆN HÓA GLUCOSE 129

6.1 Glucose và đường huyết 129

6.2 Cảm biến điện hóa enzyme GOx 130

6.3 Polyme ôxy hóa khử Osmium và cảm biến GOx 133

6.4 Thực nghiệm 133

6.4.1 Hóa chất và thiết bị 133

6.4.2 Quy trình chế tạo cảm biến (GOx/Osmium)n/AuNPs-SPCE 134

6.5 Kết quả và thảo luận 135

6.5.1 Khảo sát hình thái bề mặt cấu trúc đa lớp (GOx/Osmium) 135

6.5.2 Khảo sát ảnh hưởng của số lớp (GOx/Osmium) 136

6.5.3 Đáp ứng dòng-thế của cảm biến (GOx/Osmium)4/AuNPs-SPCE 137

6.6 Kết luận 138

KẾT LUẬN 139

KIẾN NGHỊ 140

TÀI LIỆU THAM KHẢO 141

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN 160

PHỤ LỤC 1

-DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

AFP Alpha-fetoprotein

BSA Bovine serum albumin Albumin huyết thanh bò

CA Chronoamperometry Kỹ thuật đo dòng – thời gian

CV Cyclic voltammetry Kỹ thuật quét thế tuần hoàn

DNA Deoxyribo nucleic acid Axít deoxyribonucleic

DPV Different pulse voltammetry Kỹ thuật đo dòng-thế xung vi phân

EDC 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)

carbodimide EDS Energy dispertive spectroscopy Phổ tán xạ năng lượng

EIS Electrochemical impedance

spectroscopy

Phổ tổng trở điện hóa

ELISA Enzyme linked immuno sorbent

assay

Kỹ thuật miễn dịch gắn enzyme

FAD Flavin adenine dinucleotide

GDH Glucose dehydrogenase Enzyme glucose dehydrogenase GMC Graphitized mesoporous carbon Các bon lỗ xốp trung bình

hCG Human chorionic gonadotropin

IGCA Immunogold chromatographic assay Kỹ thuật miễn dịch sắc kí sử dụng

MHDA 16-Mercaptohexadecanoic acid Axít 16-mercaptohexadecanoic

ix

MIP Molercularly imprinted polymer Polyme in phân tử

MUA 11-Mercaptoundecanoic acid Axít 11-mercaptoundecanoic

NHS N-Hydroxysuccinimide

ODN Oligo deoxyribo nucleotide

Pa Pyrrole-2-cacboxylic acid

p-ATP Para-aminothiophenol

PBS Phosphate buffered saline Đệm chứa muối phosphat

PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi polymerase

PEGDGE Poly(ethylene glycol)diglycidyl

PPa Polypyrrole cacboxylic acid

PPy Polypyrrole

PSA Prostate specific antigen

QCM Quartz crystal microbalance Vi cân tinh thể thạch anh

SAM Self assembled monolayer Màng đơn lớp phân tử tự lắp ghép SELEX Systematic evolution of ligands by

exponential enrichment SEM Scanning electron microscopy Hiển vi điện tử quét

SPAuE Screen-printed gold electrode Điện cực in lưới mực in vàng

SPCE Screen-printed carbon electrode Điện cực in lưới mực in các bon SPR Surface plasmon resonance Kỹ thuật cộng hưởng plasmon bề mặt

SWSV Square wave stripping voltammetry Kỹ thuật đo xung vuông quét nhanh

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Phân loại enzyme [256] 10

Bảng 1.2 Nhóm chức thuộc amino axít tham gia cố định bằng liên kết cộng hóa trị [178] 19

Bảng 1.3 Điện cực điện hóa trong cảm biến sinh học điện hóa 22

Bảng 1.4 Nồng độ ngưỡng chỉ dấu khối u trong huyết thanh của người [260] 32

Bảng 1.5 Các chỉ dấu khối u thông dụng trong chẩn đoán và điều trị một số bệnh ung thư [32] 32

Bảng 1.6 Nồng độ hCG và β-hCG đối với người bình thường [201] 34

Bảng 1.7 Mối liên hệ giữa nồng độ PSA toàn phần trong máu và tỷ lệ mắc bệnh UTTLT [26] 35

Bảng 2.1 Cố định đầu thu sinh học bằng liên kết cộng hóa trị 61

Bảng 2.2 Mô hình mạch tương đương khớp phổ tổng trở thực nghiệm 65

Bảng 3.1 Số phân tử cố định trên bề mặt linh kiện QCM sau mỗi bước chế tạo 75

Bảng 3.2 Giá trị thành phần của mạch tương đương Randles sau mỗi bước thực hiện quy trình chế tạo cảm biến mAb α-hCG/SAM(MHDA)/SPAuE 78

Bảng 3.3 Một số kết quả nghiên cứu cảm biến sinh học phát hiện chỉ dấu khối u hCG 80 Giá trị thành phần của mạch tương đương Randles sau mỗi bước thực hiện quy trình chế tạo cảm biến PSA-aptamer/SAM(MHDA)/SPAuE 89

Bảng 4.2 Giá trị thành phần của mạch tương đương Randles sau mỗi bước thực hiện quy trình chế tạo cảm biến PSA-aptamer/SAM(MHDA)/AuNPs-SPCE 94

Bảng 4.3 Một số kết quả nghiên cứu cảm biến đện hóa sử dụng đầu thu aptamer phát hiện chỉ dấu khối u PSA 96

Bảng 5.1 Số sóng đặc trưng trong phổ Raman của polyme PPy-PPa theo thực nghiệm và so sánh với giá trị lý thuyết [179, 243] 102

Bảng 5.2 Giá trị thành phần của mạch tương đương Randles sau mỗi bước thực hiện quy trình chế tạo cảm biến mAb AFP/SAM (p-ATP)/AuNPs-SPCE 120

Bảng 5.3 Số sóng đặc trưng trong phổ Raman của poly(p-ATP) theo thực nghiệm 124

Bảng 5.4 Giá trị thành phần của mạch tương đương Randles sau mỗi bước thực hiện quy trình chế tạo cảm biến mAb AFP/poly(p-ATP)/AuNPs-SPCE 125

Bảng 5.5 Một số kết quả nghiên cứu cảm biến sinh học điện hóa phát hiện chỉ dấu khối u AFP 127

Bảng 6.1 Giá trị chuẩn của nồng độ đường huyết đối với người bình thường [5] 130

xi

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Cấu trúc của cảm biến sinh học 6

Hình 1.2 Phân loại cảm biến sinh học theo cơ chế chuyển đổi tín hiệu và loại đầu thu sinh học [134] 7

Hình 1.3 Cấu trúc của phân tử globulin miễn dịch [66] 8

Hình 1.4 Lực tương tác giữa kháng nguyên – kháng thể [66] 9

Hình 1.5 Mô hình cấu trúc của RNA, DNA [287] 11

Hình 1.6 Cấu trúc và tương tác giữa aptamer và chỉ dấu sinh học [288] 12

Hình 1.7 Đầu thu sinh học nhân tạo tổng hợp bằng phương pháp in polyme phân tử [255] 13

Hình 1.8 Biểu đồ tỷ lệ bài báo cảm biến sinh học theo cơ chế chuyển đổi tín hiệu Số liệu thống kê bài báo tìm kiếm theo từ khóa “electrochemical biosensor”, “optical biosensor”, “piezoelectric biosensor”, “calorimetric biosensor” từ năm 2000 ÷ 2018 theo website Science Direct [289] 14

Hình 1.9 Phương pháp cố định đầu thu sinh học: a) Hấp phụ vật lý, b) Liên kết cộng hóa trị, c) Bẫy, d) Liên kết chéo, e) Hóa rắn [139] 15

Hình 1.10 Biểu đồ số lượng bài báo cảm biến sinh học phân loại theo phương pháp cố định đầu thu sinh học Số liệu thống kê bài báo tìm kiếm theo từ khóa “adsorption”, “covalent”, “encapsulation”, “entrapment”, “cross-linking” trong khoảng từ năm 2000 ÷ 2018 theo website Science Direct [289] 16

Hình 1.11 Định hướng cố định của kháng thể trên bề mặt điện cực [254] 17

Hình 1.12 Kháng thể cố định trên bề mặt điện cực bằng liên kết cộng hóa trị; (a) giữa nhóm amin (hoặc nhóm cacboxyl) trên kháng thể với nhóm cacboxyl (hoặc nhóm amin) biến tính trên bề mặt điện cực; (b) giữa nhóm thiol sinh ra do phản ứng khử liên kết cầu disulfide trên kháng thể bởi TCEP (hoặc 2-MEA) và bề mặt điện cực vàng; (c) giữa nhóm aldehyde sinh ra do phản ứng ôxy hóa gốc đường nằm ở đoạn Fc của kháng thể và nhóm hydrazide biến tính trên bề mặt điện cực [254] 18

Hình 1.13 Kháng thể được cố định trên bề mặt điện cực thông qua ái lực tương tác: (a) giữa protein G và kháng thể; (b) lai hóa giữa ssDNA cố định và ssDNA gắn trên kháng thể [151] 20

Hình 1.14 Kháng thể cố định trên bề mặt điện cực thông qua ái lực tương tác giữa Avidin/ Streptavidin với Biotin [181] 21

Hình 1.15 Điện cực các bon thủy tinh (Glassy carbon electrode - GCE) và hệ điện hóa ba điện cực sử dụng điện cực làm việc GCE 22

Hình 1.16 Điện cực điện hóa in lưới màng dầy (a) hệ 2 điện cực, (b) hệ 3 điện cực 23

Hình 1.17 Điện cực in lưới mực in các bon của hãng Dropsen (Tây Ban Nha) (a) 1

điện cực làm việc; (b) 2 điện cực làm việc; (c) 4 điện cực làm việc; (d) 8 điện cực làm việc 23

Hình 1.18 Điện cực in lưới màng dày của hãng BioDevice Technology (Nhật Bản) (a)

điện cực làm việc mực in các bon; (b) điện cực làm việc mực in vàng 23

Hình 1.19 Cơ chế hoạt động của cảm biến miễn dịch đo dòng cấu trúc “sandwich” dựa

trên tác nhân đánh dấu enzyme HRP, ALP và GOx [105] 24

Hình 1.20 Cơ chế hoạt động của cảm biến miễn dịch đo dòng cấu trúc “sandwich” dựa

trên tác nhân đánh dấu: (a) muối của kim loại vàng, (b) kim loại bạc Ag, (c) chấm lượng tử PbS và CdS [105] 26

Hình 1.21 Điện cực chọn lọc ion ISE dùng trong cảm biến đo điện thế: (a) điện cực

màng chất lỏng; (b) điện cực màng chất rắn [252] 27

Hình 1.22 Cảm biến điện hóa đo điện thế dựa trên cấu trúc: (a) Transitor hiệu ứng

trường nhạy ion (ISFET), (b) Cảm biến điện thế chiếu sáng vùng (LAPS) [74] 27

Hình 1.23 Cảm biến miễn dịch điện hóa đo độ dẫn dựa trên cấu trúc FET, điện tích

dương của kháng nguyên – kháng thể trên kênh dẫn làm giảm độ dẫn đối với kênh dẫn là bán dẫn loại n và làm tăng độ dẫn đối với kênh dẫn là bán dẫn loại p [34] 28

Hình 1.24 Cảm biến DNA độ dẫn dựa trên cấu trúc dây nano polyme đồng trùng hợp

(poly EDOT-co-EDOT-COOH) giữa hai điện cực làm bằng kim loại vàng, phản ứng lai hóa giữa chuỗi DNA dò và DNA đích làm thay đổi độ dẫn của dây nano polyme [98] 28

Hình 1.25 Mô hình mạch điện tương đương Randles mô phỏng tính chất điện của hệ

điện hóa trong dung dịch điện ly (a) không có cặp chất ôxy hóa - khử, (b)

có cặp chất ôxy hóa - khử [105] 29

Hình 1.26 Mô hình cấu trúc cảm biến miễn dịch kiểu tụ và mạch điện tương đương

[105] 30

Hình 1.27 Cảm biến miễn dịch phổ tổng trở điện hóa sử dụng chất dò [Fe(CN)6]3-/4-;

(a) đầu thu kháng thể cố định trên điện cực vàng, (b) đầu thu kháng thể liên kết đặc hiệu với kháng nguyên cản trở quá trình truyền điện tích đến điện cực, (c) mạch tương đương Randles và (d) phổ tổng trở biểu diễn trên mặt phẳng Nyquist của cảm biến trước và sau phản ứng miễn dịch [105] 31

Hình 1.28 Biểu đồ thống kê số lượng bài báo cảm biến sinh học phát hiện chỉ dấu khối

u trong thời gian từ năm 2005÷2018 (dữ liệu từ nguồn Scopus truy cập ngày 01-08-2018): 37

xiii

(a) Theo phương pháp chuyển đổi tín hiệu với từ khóa tìm kiếm “cancer biomarkers”

kết hợp với “electrochemical biosensor”, “optical biosensor”, “piezoelectric biosensor”, “calorimetric biosensor” 37(b) Theo phương pháp đo tín hiệu với từ khóa tìm kiếm “electrochemical biosensor”,

“cancer biomarkers” kết hợp với “impedimetric”, “amperometric”,

“voltammetric”, “potentiometric”, “conductometric” 37

Hình 1.29 Biểu đồ thống kê số lượng bài báo cảm biến sinh học điện hóa phát hiện

chỉ dấu khối u theo loại đầu thu sinh học với từ khóa tìm kiếm “cancer biomarkers”, “electrochemical biosensor”, “electrochemical immunosensor”, “electrochemical aptasensor” (dữ liệu từ nguồn Scopus truy cập ngày 01-08-2018) 37

Hình 1.30 Cải thiện độ nhạy của cảm biến miễn dịch điện hóa phát hiện chỉ dấu khối

u bằng vật liệu nano; (a) biến tính bề mặt điện cực bằng vật liệu nano, (b) tác nhân đánh dấu bằng vật liệu nano [247] 38

Hình 1.31 Quy trình công nghệ chế tạo cảm biến miễn dịch cấu trúc “sandwich” phát

hiện chỉ dấu khối u AFP trên cơ sở điện cực vàng được biến tính bởi hạt nano vàng [263] 39

Hình 1.32 Quy trình chế tạo cảm biến miễn dịch phát hiện chỉ dấu khối u EGFR trên

cơ sở điện cực vàng được biến tính bởi hạt nano vàng: tạo màng SAM cysteamine trên hạt vàng, liên kết hóa học bởi chất trung gian p-phenyldiisothiocyanate (PDITC), protein G liên kết qua nhóm NH2, protein

G liên kết đặc hiệu với vùng Fc của kháng thể EGFG [54] 40

Hình 1.33 Quy trình chế tạo cảm biến miễn dịch phát hiện chỉ dấu khối u PSA trên cơ

sở điện cực GCE được biến tính bởi hạt nano vàng trên nền vật liệu Pyridinediamine) [269] 40

poly(2,6-Hình 1.34 Quy trình chế tạo cảm biến miễn dịch cấu trúc sandwich phát hiện chỉ dấu

khối u IL-6 trên cơ sở điện cực ITO được biến tính bởi tổ hợp vật liệu nano AuNPs – Graphene - Silica sol-gel [248] 41

Hình 1.35 Quy trình công nghệ chế tạo cảm biến miễn dịch phát hiện chỉ dấu khối u

AFP trên cơ sở điện cực GCE được biến tính bởi tổ hợp vật liệu nano AuNPs-PDA-Thi-GO [154] 42

Hình 1.36 Quy trình công nghệ chế tạo cảm biến miễn dịch sandwich phát hiện chỉ

dấu khối u CEA với kháng thể phát hiện được đánh dấu bởi tổ hợp vật liệu nano AgNPs - AuNPs - Graphene [80] 42

Hình 1.37 Quy trình công nghệ chế tạo cảm biến aptamer phổ tổng trở phát hiện chỉ

dấu Mucine trên cơ sở điện cực mực in các bon biến tính bởi MWCNT [142] 44

Hình 1.38 Quy trình thực nghiệm cố định aptamer trên bề mặt SWCNT và sơ đồ thiết

lập hệ khảo sát SWCNT FET trong dung dịch [235] 44

Hình 1.39 (a) Tác nhân đánh dấu enzyme HRP và kháng thể Con A được cố định trên SWCNT, (b) bề mặt điện cực GCE được biến tính bởi MWCNT/Au-S-mannose và cơ chế đáp ứng tín hiệu dòng của cảm biến, (c) đường đặc trưng chuẩn của cảm biến sử dụng tác nhân đánh dấu MWCNT kết hợp với enzyme HRP và cảm biến sử dụng kháng thể đánh dấu bởi enzyme HRP [280] 45

Hình 1.40 (a) Quy trình tạo cấu trúc ôxít graphene dạng khử (rGO) kết hợp với AuNPs và thionine (Thi) hoặc Prussian blue (PB), (b) cảm biến miễn dịch đa kênh phát hiện đồng thời chỉ dấu CEA và AFP trên cơ sở điện cực được biến tính bề mặt bởi rGO/Au/Thi và rGO/Au/PB [94] 46

Hình 2.1 (a) Quá trình điện hóa xảy ra tại phân biên giữa điện cực làm việc được áp điện thế dương và dung dịch điện ly chứa cặp chất dò; (b) Mô hình mạch điện tương đương Randles: Cdl điện dung lớp kép, Rct điện trở truyền điện tích, Rs điện trở dung dịch, ZW trở kháng Warburg, IHP mặt phẳng Helmholtz phía trong; OHP mặt phẳng Helmholtz bên ngoài; CE điện cực đối và WE là điện cực làm việc [150] 50

Hình 2.2 Biểu diễn phổ tổng trở ở vùng tần số cao trên mặt phẳng phức 52

Hình 2.3 Biểu diễn phổ tổng trở ở vùng tần số thấp trên mặt phẳng phức 52

Hình 2.4 Biểu diễn phổ tổng trở trên mặt phẳng Nyquist 53

Hình 2.5 Quan hệ giữa điện thế và dòng điện trong quét thế tuần hoàn 53

Hình 2.6 Cấu trúc thiết kế của chíp vi lưu a) chíp vi lưu một đầu vào, b) mặt cắt chíp vi lưu 56

Hình 2.7 Ảnh hiển vi quang học của vi kênh với độ rộng khoảng 200 µm 57

Hình 2.8 Thiết kế giá đỡ gắn với trục quay của máy ly tâm: a) Thứ tự lắp ghép chíp vi lưu và điện cực; b) Vị trí bốn hệ chíp vi lưu-điện cực được cố định đồng thời trên giá đỡ 57

Hình 2.9 Hình ảnh dòng dung dịch vận chuyển từ đầu vào qua kênh dẫn vào buồng phản ứng và dung dịch thoát ra ngoài theo thời gian quay ly tâm với tốc độ 1200 vòng/phút 58

Hình 2.10 Quy trình tổng hợp vật liệu lai cấu trúc nano hai chiều giữa polyme đồng trùng hợp PPy- PPa và erGO trên điện cực SPCE bằng phương pháp điện hóa quét thế tuần hoàn 60

Hình 2.11 Cơ chế phản ứng tạo liên kết giữa nhóm amin (NH2) của đầu thu sinh học và nhóm cacboxyl (-COOH) trên bề mặt điện cực sử dụng hợp chất NHS và EDC [219] 62

xv

Hình 2.12 Cơ chế phản ứng tạo liên kết giữa nhóm cacboxyl (-COOH) của kháng thể

và nhóm amin (NH2) trên bề mặt điện cực sử dụng EDC [219] 63

Hình 2.13 Quy trình xử lý mẫu máu toàn phần tách lấy phần huyết thanh: (a) mẫu máu

toàn phần, (b) mẫu máu sau khi để đông tự nhiên, (c) mẫu sau khi tách phần máu đông, (d) mẫu huyết thanh 64

Hình 3.1 (a) Linh kiện vi cân tinh thể thạch anh QCM 5 MHz được ghép nối với bộ

tạo dao động QCM25 của hãng Stanford Research Systems, (b) Hệ thiết bị khảo sát hoạt động của QCM ở chế độ đo động 70

Hình 3.2 (a) Ảnh hiển vi điện tử quét bề mặt điện cực mực in vàng, (b) Điện cực mực

in vàng SPAuE của hãng BioDevice Technology, (c) Hệ thiết bị điện hóa AutoLab PGSTAT 12 70

Hình 3.3 Quy trình công nghệ cố định mAb α-hCG lên điện cực vàng thông qua màng

Hình 3.7 Suy giảm tần số theo thời gian tại các nồng độ kháng nguyên từ 100 pg/mL

÷ 27 ng/mL của cảm biến mAb α-hCG/SAM (MHDA)/QCM 76

Hình 3.8 Đường đặc trưng chuẩn của cảm biến nhạy khối lượng sử dụng giá trị độ

dịch tần số như một hàm của nồng độ kháng nguyên α-hCG Giá trị tại mỗi điểm đo và sai số được lấy trung bình của 3 cảm biến độc lập chế tạo cùng quy trình và cùng điều kiện đo 77

Hình 3.9 Phổ EIS sau mỗi bước công nghệ chế tạo cảm biến mAb

α-hCG/SAM(MHDA)/SPAuE 78

Hình 3.10 Phổ tổng trở đáp ứng của cảm biến với kháng nguyên α-hCG có nồng độ

0÷100 ng/mL Phép đo thực hiện bởi dung dịch điện hóa gồm 0,1M KCl và

5 mM [Fe(CN)6]3-/4- Dải tần số quét 100 kHz ÷ 50 mHz, EDC = 0,16 V vs Ag/AgCl, Eac= 10 mV 79

Hình 3.11 Đường đặc trưng chuẩn của cảm biến mAb α-hCG/SAM(MHDA)/SPAuE.

79

Hình 4.1 (a) Ảnh hiển vi điện tử quét bề mặt điện cực mực in các bon, (b) Điện cực

mực in cácbon SPCE của hãng BioDevice Technology, (c) Hệ thiết bị điện hóa Vertex Invium 84

Hình 4.2 Đặc trưng dòng thế của điện cực SPCE quét thế vòng 20 chu kì trong dung

dịch HAuCl4 1 mM pha trong PBS 100 mM; tốc độ quét 50 mV/s trong dải điện áp từ -0,6 V đến 0,5 V vs Ag/AgCl 85

Hình 4.3 Đặc trưng dòng thế của điện cực trong dung dịch H2SO4 1M, tốc độ quét 50

mV/s, dải điện áp từ -0,2 V đến 1,4 V vs Ag/AgCl (a) Điện cực SPCE, (b) So sánh điện cực AuNPs-SPCE và SPAuE 86

AuNPs-Hình 4.4 Mô hình quá trình động học xảy ra trên bề mặt điện cực trong phép đo phổ

tổng trở Faradaic sử dụng cặp chất dò [Fe(CN)6]3-/4-: (a) điện cực SPAuE, (b) điện cực AuNPs-SPCE 87

Hình 4.5 Phổ EIS sau mỗi bước công nghệ chế tạo cảm biến

PSA-aptamer/SAM(MHDA)/SPAuE 88

Hình 4.6 Khảo sát sự phụ thuộc của ∆Rct như một hàm của nồng độ PSA của cảm biến

PSA-aptamer/SAM(MHDA)/SPAuE với nồng độ aptamer 5, 10, 100 µg/mL 90

Hình 4.7 Ảnh hiển vi điện tử quét bề mặt điện cực SPCE sau khi tổng hợp hạt nano

vàng bằng phương pháp quét thế tuần hoàn với số vòng quét khác nhau: 5,

10, 15, 20 vòng 91

Hình 4.8 Phổ EDS của điện cực AuNPs-SPCE với cac hạt nano vàng được tổng hợp

bằng phương pháp quét điện thế tuần hoàn 20 chu kỳ 92

Hình 4.9 Sự phụ thuộc của ∆Rct theo nồng độ kháng nguyên PSA của cảm biến trên

điện cực AuNPs-SPCE với lượng aptamer cố định (5 µg/mL, 10 µg/mL, 25 µg/mL, 50 µg/mL, 100 µg/mL) và số vòng quét tạo hạt vàng: (a) 5 vòng, (b) 10 vòng, (c) 15 vòng, (d) 20 vòng 93

Hình 4.10 Phổ EIS sau mỗi bước công nghệ chế tạo của cảm biến

PSA-aptamer/SAM(MHDA)/AuNPs-SPCE 94

Hình 4.11 Đáp ứng phổ tổng trở của cảm biến

PSA-aptamer/SAM(MHDA)/AuNPs-SPCE với nồng độ kháng nguyên PSA từ 0 ng/mL đến 14 ng/mL 95

Hình 4.12 Đường đặc trưng chuẩn của cảm biến

PSA-aptamer/SAM(MHDA)/AuNPs-SPCE 96

Hình 4.13 Độ chọn lọc của cảm biến PSA-aptamer/SAM(MHDA)/AuNPs-SPCE với

các kháng nguyên hCG, protein TAU, amylin và PSA 97

Hình 5.1 Quy trình cố định kháng thể AFP bằng liên kết cộng hóa trị giữa nhóm amin

của kháng thể và nhóm cacboxyl của polyme PPy-PPa: (a) trên điện cực SPCE; (b) trên điện cực erGO-SPCE 100

Hình 5.2 Quy trình công nghệ cố định kháng thể AFP bằng liên kết cộng hóa trị giữa

nhóm cacboxyl của kháng thể và nhóm amin của SAM (p-ATP) trên điện cực AuNPs-SPCE 100

xvii

Hình 5.3 Quy trình công nghệ cố định kháng thể AFP bằng liên kết cộng hóa trị giữa

nhóm cacboxyl của kháng thể và nhóm amin của vật liệu lai polyme ATP) và hạt nano vàng trên điện cực AuNPs-SPCE 101

(p-Hình 5.4 (a) Đặc trưng dòng-thế của quá trình đồng trùng hợp PPy-PPa quét thế tuần

hoàn 20 chu kì trong dung dịch PBS 10 mM (pH 7,4) có chứa KCl 100mM, monome Py 120 mM và Pa 40 mM với tốc độ quét 30 mV/s trong dải điện

áp từ -0,8 V đến 0,8 V vs Ag/AgCl; (b) Ảnh SEM màng polyme PPy-PPa trên điện cực SPCE 102

Hình 5.5 Phổ Raman của màng polyme PPy-PPa trên điện cực SPCE (đo tại 4 vị trí

khác nhau) với bước sóng kích thích 632,8 nm 103

Hình 5.6 Đáp ứng dòng-thế của điện cực PPy-PPa/SPCE với tỷ lệ mol Pa so với Py

thay đổi từ 0 đến 100% mol trong dung dịch gồm [Fe(CN)6]3-/4- 5 mM và KCl 0,1 M với tốc độ quét 50 mV/s 104

Hình 5.7 (a) Đáp ứng phổ tổng trở điện hóa của cảm biến mAb AFP/PPy-PPa/SPCE

với nồng độ kháng nguyên AFP thay đổi từ 0 đến 100 ng/mL (đường đo thực nghiệm được biểu diễn bằng các ký hiệu, đường nét liền biểu diễn đường cong khớp theo mạch tương đương Randles); (b) Đường đặc trưng chuẩn của cảm biến 105

Hình 5.8 (a) Đáp ứng dòng-thế của cảm biến mAb AFP/PPy-PPa/SPCE với nồng độ

kháng nguyên AFP thay đổi từ 0 đến 100 ng/mL, (b) Đường đặc trưng chuẩn của cảm biến thể hiện sự phụ thuộc Ipc vào nồng độ kháng nguyên AFP 106

Hình 5.9 Đặc trưng dòng-thế quá trình khử GO trên bề mặt điện cực SPCE thành erGO

trong dung dịch PBS 100 mM (pH 6,6) với 30 chu kỳ quét 108

Hình 5.10 Đặc trưng điện hóa của điện cực erGO-SPCE khảo sát trong dung dịch đo

gồm 5 mM [Fe(CN)6]3-/4- và KCl 0,1 M: (a) Đáp ứng phổ EIS, (b) Đáp ứng dòng-thế tại tốc độ quét 50 mV/s 109

Hình 5.11 Phổ Raman của GO và erGO trên điện cực SPCE với bước sóng kích thích

632,8 nm 110

Hình 5.12 Ảnh SEM (a) bề mặt điện cực SPCE trần, (b) điện cực GO/SPCE, (c) điện

cực erGO/SPCE, (d) vật liệu lai cấu trúc nano hai chiều giữa PPy-PPa và erGO trên SPCE 111

Hình 5.13 (a) Đáp ứng phổ tổng trở điện hóa của cảm biến mAb

AFP/PPy-PPa/erGO-SPCE với nồng độ kháng nguyên AFP thay đổi từ 0 đến 100 ng/mL (đường

đo thực nghiệm được biểu diễn bằng các ký hiệu, đường nét liền biểu diễn đường cong khớp theo mạch tương đương Randles), (b) Đường đặc trưng chuẩn của cảm biến 113

Hình 5.14 (a) Đáp ứng dòng-thế của cảm biến mAb AFP/PPy-PPa/erGO-SPCE với

nồng độ kháng nguyên AFP thay đổi từ 0 đến 100 ng/mL, (b) Đường đặc

trưng chuẩn của cảm biến thể hiện sự phụ thuộc Ipc vào nồng độ kháng

nguyên AFP 114

Hình 5.15 Ảnh SEM điện cực SPCE biến tính bởi AuNPs tổng hợp bằng phương pháp quét thế tuần hoàn với số vòng quét khác nhau 10, 20, 40 và 60 115

Hình 5.16 Phổ tổng trở của điện cực SPCE biến tính bởi AuNPs với số vòng quét tạo AuNPs (10, 20, 40, 60) và sau khi cố định kháng thể mAb AFP 116

Hình 5.17 Phổ tổng trở của điện cực SPCE biến tính bởi AuNPs với số vòng quét tạo AuNPs (10, 20, 40, 60) trước và sau phản ứng giữa mAb AFP và kháng nguyên AFP 100 ng/mL 117

Hình 5.18 Đáp ứng tín hiệu của các cảm biến mAb AFP/SAM (p-ATP)/AuNPs-SPCE có thời gian tổng hợp màng SAM (6, 12, 18, 24 giờ) với kháng nguyên AFP nồng độ (10, 50, 100 ng/mL) 118

Hình 5.19 Phổ tổng trở sau mỗi bước thực hiện quy trình chế tạo của cảm biến mAb AFP/SAM (p-ATP)/AuNPs-SPCE (đường đo thực nghiệm được biểu diễn bằng các ký hiệu và đường nét liền biểu diễn đường cong khớp theo mạch tương đương Randles) 119

Hình 5.20 (a) Đáp ứng phổ tổng trở của cảm biến tại các nồng độ kháng nguyên AFP từ 0 ng/mL đến 100 ng/mL (đường đo thực nghiệm được biểu diễn bằng các ký hiệu, đường nét liền biểu diễn đường cong khớp theo mạch tương đương Randles), (b) Đường đặc trưng chuẩn của cảm biến 121

Hình 5.21 (a) Đặc trưng dòng-thế của quá trình tổng hợp vật liệu lai poly(p-ATP) và hạt nano vàng trên điện cực AuNPs-SPCE, (b) Ảnh SEM của màng poly(p-ATP) trên điện cực SPCE 122

Hình 5.22 Cơ chế quá trình trùng hợp điện hóa poly(p-ATP) [284] 123

Hình 5.23 Phổ Raman của màng poly(p-ATP) trên điện cực AuNPs-SPCE 124

Hình 5.24 Phổ tổng trở sau mỗi bước thực hiện quy trình chế tạo của cảm biến

mAb AFP/poly( p-ATP)/AuNPs-SPCE 125

Hình 5.25 (a) Đáp ứng phổ tổng trở của cảm biến với nồng độ kháng nguyên AFP từ 0 ng/mL đến 100 ng/mL (đường đo thực nghiệm được biểu diễn bằng các ký hiệu, đường nét liền biểu diễn đường cong khớp theo mạch tương đương Randles), (b) Đường đặc trưng chuẩn của cảm biến 126

Hình 6.1 Cấu trúc phân tử α-D-glucose và β-D-glucose [290] 129

Hình 6.2 Nguyên lý hoạt động của cảm biến điện hóa Glucose sử dụng enzyme GOx (a) thế hệ thứ 1; (b) thế hệ thứ 2; (c) thế hệ thứ 3 130

Hình 6.3 Nguyên lý hoạt động của cảm biến điện hóa Glucose/(GOx/Osmium)n /AuNPs-SPCE 133

xix

Hình 6.4 Quy trình công nghệ chế tạo cảm biến điện hóa glucose sử dụng cấu trúc đa

lớp (GOx-Osmium) trên điện cực AuNPs-SPCE 134

Hình 6.5 Ảnh hiển vi điện tử quét SEM: (a) bề mặt điện cực AuNPs-SPCE, (b)

Osmium/AuNPs-SPCE, (c) (GOx/Osmium)/AuNPs-SPCE, (d) (GOx/Osmium)4/AuNPs-SPCE 135

Hình 6.6 (a) Đáp ứng dòng-thế của cảm biến với số lớp (GOx/Osmium) từ 1 đến 6

trong môi trường dung dịch glucose nồng độ 10 mM pha trong đệm PBS

pH 7,4 và (b) Đường đặc trưng đáp ứng mật độ dòng theo nồng độ glucose của cảm biến với số lớp (GOx/Osmium) khác nhau tại điện áp -0,02V (vs Ag/AgCl) 136

Hình 6.7 Đặc trưng dòng - thế của cảm biến (GOx/Osmium)4/AuNPs-SPCE khảo sát

trong dung dịch glucose nồng độ 0 - 100 mM với tốc độ quét là 5 mV/s 137

Hình 6.8 Đặc trưng đáp ứng mật độ dòng theo nồng độ glucose của cảm biến

(GOx-Os)4/AuNPs-SPCE làm việc tại điện áp -0,02V (vs Ag/AgCl) 138

MỞ ĐẦU

Ngày nay, cùng với sự bùng nổ dân số thế giới và quá trình đô thị hoá với tốc độ chóng mặt có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng xấu đến sức khỏe của con người Theo thống kê của cơ quan nghiên cứu ung thư quốc tế IARC (International Agency for Research on Cancer), trên toàn cầu hiện có khoảng 23 triệu người đang sống chung với căn bệnh này trong đó mỗi năm

có hơn 14 triệu người mắc mới và 8,2 triệu người tử vong Ung thư là bệnh có tỷ lệ bệnh nhân tử vong cao đứng thứ hai trên thế giới với hơn 200 loại ung thư khác nhau [60] Tại Việt Nam, số ca mắc mới ung thư từ 68.000 ca năm 2000 lên đến 126.000 năm 2010, và sẽ vượt ngưỡng 200.000 ca vào năm 2020 Theo số liệu này, Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) xếp Việt Nam ở vị trí 78 trên 172 quốc gia, vùng lãnh thổ được khảo sát với tỉ lệ tử vong 110/100.000 người, nằm trong 50 nước thuộc nhóm 2 của bản đồ ung thư thế giới [1] Theo các chuyên gia, số ca mắc ung thư tăng nhanh trong những năm gần đây do ba nguyên nhân chính: thực phẩm không an toàn, môi trường ô nhiễm và tuổi thọ tăng Tuy nhiên, phần lớn bệnh nhân mắc bệnh ung thư tại Việt Nam đến khám và điều trị ở giai đoạn khối u đã chuyển thành ác tính và di căn nên tỷ lệ chữa khỏi bệnh là thấp, chi phí điều trị tốn kém Nguyên nhân chính là do người dân chưa có thói quen khám bệnh định kì và các phương pháp phát hiện sớm bệnh ung thư vẫn chưa phổ biến Do vậy, có thể nói nhu cầu về xác định các chỉ dấu sinh học ứng dụng chẩn đoán sớm bệnh ung thư là một nhu cầu cấp thiết hiện nay Hiện nay, việc khám và chữa bệnh ung thư tại các bệnh viện chủ yếu dựa vào các phương pháp truyền thống như siêu âm, chụp cộng hưởng từ và sinh thiết Kết quả của các phương pháp này phụ thuộc vào kích thước và đặc tính của khối u nên thường phát hiện khi bệnh ở giai đoạn đã phát triển [17] Cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học, các chỉ dấu khối

u đã được nghiên cứu và đưa vào ứng dụng trong việc chẩn đoán sớm và theo dõi bệnh ung thư [109, 241] Chỉ dấu khối u thường được sản sinh từ tế bào ung thư, biểu mô và có nồng

độ cao hơn mức ở người bình thường Các chất này có thể xác định được bằng các kỹ thuật như ELISA [247], PCR [108], miễn dịch phóng xạ (RIA) [131], phổ huỳnh quang [59], phổ khối [285] và sắc kí [217] Các kỹ thuật truyền thống này cho phép phát hiện chỉ dấu khối u với độ chính xác và độ chọn lọc cao; tuy nhiên yêu cầu thời gian phân tích lâu, chi phí hóa chất cao, phân tích đơn lẻ từng chất chỉ dấu Cảm biến sinh học điện hóa với ưu điểm độ nhạy và độ chọn lọc cao, thời gian phân tích ngắn, cho phép phát hiện chất cần phân tích ở nồng độ thấp, đơn giản và rẻ tiền, khả năng tích hợp trong các thiết bị đo cầm tay ứng dụng phép phân tích tại chỗ đang là phương pháp được ưu tiên lựa chọn để phát hiện chỉ dấu khối

u Đề tài nghiên cứu với tiêu đề “Nghiên cứu và chế tạo cảm biến sinh học điện hóa độ

nhạy cao sử dụng điện cực in các bon ứng dụng trong chẩn đoán bệnh sớm” đã được lựa

chọn cho luận án tiến sĩ

➢ Mục đích nghiên cứu:

(1) Nghiên cứu cảm biến sinh học phổ tổng trở điện hóa sử dụng đầu thu sinh học (kháng thể, aptamer, enzyme) trên cơ sở điện cực in lưới thương mại với chi phí thấp hướng đến ứng dụng thực tế trong các thiết bị cầm tay

(2) Cải tiến và phát triển các kỹ thuật biến tính bề mặt điện mực in các bon nhằm nâng cao hiệu suất cố định đầu thu sinh học cũng như tăng cường đáp ứng tín hiệu đối với cảm biến phổ tổng trở điện hóa

(3) Chế tạo cảm biến sinh hóa điện hóa có độ nhạy và độ chọn lọc cao phát hiện chỉ dấu khối u (bao gồm kháng nguyên α-hCG, PSA, AFP) ứng dụng trong chẩn đoán sớm một

số bệnh ung thư; cảm biến điện hóa enzyme xác định glucose trong máu

➢ Đối tượng nghiên cứu:

- Nghiên cứu chế tạo cảm biến điện hóa phát hiện chỉ dấu khối u (α-hCG, PSA, AFP) dùng trong chẩn đoán và điều trị đối với bệnh ung thư (tế bào mầm tinh, ung thư tiền liệt tuyến, ung thư gan); phát hiện chỉ dấu sinh học glucose của bệnh đái tháo đường

- Nghiên cứu các giải pháp biến tính bề mặt điện cực in lưới màng dày mực in các bon giúp nâng cao hiệu suất cố định đầu thu sinh học cũng như cải thiện đáp ứng tín hiệu đối với cảm biến phổ tổng trở điện hóa ứng dụng trong phát hiện chỉ dấu khối u

➢ Phương pháp nghiên cứu:

Phương pháp nghiên cứu trong nội dung luận án là phương pháp thực nghiệm

- Phương pháp quét thế tuần hoàn (CV) được sử dụng để tổng hợp hạt nano vàng, trùng hợp điện hóa vật liệu polyme, khử điện hóa ôxít graphene trên nền điện cực SPCE Ngoài ra, phương pháp này còn được sử dụng để khảo sát tính chất điện hóa của vật liệu polyme đã tổng hợp, khảo sát hoạt động của cảm biến enzyme glucose và cảm biến miễn dịch

- Phương pháp phổ tổng trở (EIS) được sử dụng để khảo sát đặc tính của bề mặt cảm biến sau mỗi bước biến tính, khảo sát hoạt động của các cảm biến đã chế tạo

- Phương pháp chụp ảnh hiển vi điện tử quét SEM sử dụng nghiên cứu hình thái cấu trúc bề mặt điện cực sau mỗi bước công nghệ

- Phổ tán xạ năng lượng tia X (EDS), phổ tán xạ Raman nghiên cứu tính chất của vật liệu tiên tiến sử dụng trong chế tạo cảm biến

➢ Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án:

Luận án có tính liên ngành cao bao gồm hóa học, sinh học, vật lý và khoa học vật liệu Các định hướng nghiên cứu và kết quả thu được của luận án có ý nghĩa khoa học và khả năng ứng dụng thực tiễn cao

- Về lý luận khoa học: các kết quả thu được của luận án đã góp phần làm sáng tỏ cơ chế hoạt động cảm biến sinh học phổ tổng trở điện hóa sử dụng đầu thu sinh học tự nhiên (kháng thể) và đầu thu sinh học bán tổng hợp (aptamer)

- Về thực tiễn: các kết quả nghiên cứu của luận án hướng tới phát triển cảm biến sinh học có cấu trúc đơn giản, độ nhạy và độ chọn lọc cao, cho phép phát hiện chỉ dấu khối

u trong giai đoạn sớm của bệnh ung thư Cảm biến sinh học đã chế tạo có định hướng ứng dụng trong các thiết bị cầm tay đáp ứng yêu cầu xét nghiệm tại chỗ

➢ Những đóng góp mới của luận án:

- Luận án đã đóng góp các kết quả mới về công nghệ chế tạo hạt nano vàng phân tán đều trên bề mặt điện cực in lưới mực in các bon nhằm thay thế điện cực in lưới mực

in vàng Hơn thế nữa giải pháp công nghệ này giúp phân tán đều đầu thu sinh học trên

bề mặt điện cực, nhờ đó nâng cao hiệu suất bắt cặp giữa đầu thu và chỉ dấu sinh học cần phân tích

- Luận án đóng góp ba giải pháp biến tính bề mặt điện cực in lưới mực in các bon bằng

hệ vật liệu mới nhằm nâng cao hiệu suất cố định đầu thu sinh học và đáp ứng tín hiệu đối với cảm biến phổ tổng trở điện hóa Hệ vật liệu bao gồm: (i) Polyme dẫn đồng trùng hợp polypyrrole-polypyrrole cacboxyl (PPy-PPa); (ii) Vật liệu lai cấu trúc nano hai chiều giữa polyme đồng trùng hợp PPy-PPa và ôxít graphene dạng khử điện hóa (erGO); (iii) Vật liệu lai giữa poly(para-aminothiophenol) và hạt nano vàng

- Ứng dụng thành công đầu thu sinh học bán tổng hợp aptamer trong chế tạo cảm biến phổ tổng trở điện hóa xác định chỉ dấu ung thư tiền liệt tuyến Kết quả nghiên cứu này

là tiền đề cho định hướng nghiên cứu về cảm biến phổ tổng trở điện hóa phát hiện chỉ dấu sinh học với chi phí thấp, không yêu cầu điều kiện bảo quản nghiêm ngặt

- Ứng dụng thành công cấu trúc đa lớp giữa vật liệu polyme ôxy hóa-khử Osmium và enzyme trong cảm biến cảm biến điện hóa enzyme thế hệ thứ 2 Kết quả nghiên cứu này là tiền đề cho định hướng nghiên cứu về cảm biến điện hóa đo dòng phát hiện chỉ dấu sinh học trên cơ sở tác nhân sinh học enzyme

- Xây dựng quy trình chế tạo quy mô phòng thí nghiệm 06 cảm biến điện hóa sử dụng điện cực in lưới mực in các bon cho phép xác định nồng độ chỉ dấu khối u trong ngưỡng phát hiện sớm các bệnh ung thư (ung thư u tế bào mầm tinh, ung thư tiền liệt tuyến và ung thư gan) Các cảm biến đã chế tạo có độ nhạy và độ chọn lọc cao, yêu cầu lượng mẫu phân tích nhỏ (cỡ 3µL), thời gian phân tích nhanh (khoảng 30 phút), thao tác đơn giản, có khả năng tích hợp với thiết bị cầm tay

➢ Bố cục của luận án:

CHƯƠNG 1 CẢM BIẾN SINH HỌC ĐIỆN HÓA ỨNG DỤNG CHẨN ĐOÁN BỆNH SỚM

Chương 1 trình bày ngắn gọn tổng quan lý thuyết về cảm biến sinh học nói chung và cảm biến sinh học điện hóa nói riêng Khái niệm chung về chỉ dấu khối u và vai trò trong chẩn đoán sớm đối với bệnh ung thư Ba loại chỉ dấu khối u (α-hCG, PSA, AFP) là đối tượng nghiên cứu của luận án cũng được trình bầy chi tiết Tình hình nghiên cứu cảm biến sinh học điện hóa ứng dụng phát hiện chỉ dấu khối u trong cộng đồng khoa học trong nước và

quốc tế

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chương 2 trình bày hai phương pháp điện hóa chính sử dụng trong nội dung của luận án

là phương pháp phổ tổng trở điện hóa (EIS) và phương pháp quét thế tuần hoàn (CV) Các phương pháp khảo sát tính chất và hình thái học vật liệu biến tính bề mặt điện cực như chụp ảnh hiển vi điện tử quét (SEM), phổ tán xạ năng lượng tia X (EDS), phổ tán xạ Raman Quy trình thực nghiệm chế tạo cảm biến cũng như quy hoạch số liệu thực nghiệm

Kỹ thuật vi lưu ly tâm tích hợp với điện cực in lưới ứng dụng trong cảm biến sinh học điện

hóa cũng sẽ được trình bày chi tiết

CHƯƠNG 3 CẢM BIẾN MIỄN DỊCH PHÁT HIỆN CHỈ DẤU α-h CG ỨNG DỤNG CHẨN ĐOÁN U

TẾ BÀO MẦM TINH

Chương 3 trình bày các kết quả nghiên cứu chế tạo cảm biến nhạy khối lượng sử dụng linh kiện vi cân tinh thể thạch anh (QCM) và cảm biến phổ tổng trở điện hóa sử dụng điện cực in lưới mực in vàng (SPAuE) Kháng thể đơn dòng α-hCG được cố định lên điện cực vàng cảm biến thông qua liên kết cộng hóa trị giữa nhóm amin của kháng thể với nhóm cacboxyl của màng đơn lớp tự lắp ghép (MHDA) Hiệu suất cố định đầu thu kháng thể được đánh giá thông qua khảo sát sự thay đổi tần số dao động của QCM sau mỗi bước công nghệ chế tạo cảm biến Bên cạnh đó, tác giả cũng tiến hành nghiên cứu cảm biến điện hóa sử dụng điện cực SPAuE với ưu điểm như giá thành rẻ, yêu cầu một lượng nhỏ dung dịch mẫu, dễ tích hợp với các thiết bị cầm tay Kết quả nghiên cứu cho thấy cảm biến điện hóa có dải làm việc tuyến tính trong vùng nồng độ kháng nguyên α-hCG từ 4 đến 100 ng/mL với giới hạn phát hiện là 9,35 ng/mL, đáp ứng yêu cầu phát hiện chỉ dấu

α-hCG trong chẩn đoán sớm ung thư tế bào mầm tinh

CHƯƠNG 4 CẢM BIẾN APTAMER PHÁT HIỆN CHỈ DẤU PSA ỨNG DỤNG CHẨN ĐOÁN UNG

THƯ TIỀN LIỆT TUYẾN

Chương 4 trình bày các kết quả nghiên cứu chế tạo cảm biến phổ tổng trở điện hóa trên

cơ sở điện cực in lưới mực in vàng (SPAuE) và điện cực in lưới mực in các bon (SPCE) được biến tính bởi lớp hạt nano vàng Trong nghiên cứu này, đầu thu sinh học aptamer được thay thế cho đầu thu kháng thể trong cảm biến miễn dịch Điểm nổi bật của kết quả

là đầu thu aptamer được cố định phân tán trên điện cực mực in các bon biến tính bởi lớp hạt nano vàng có kích thước từ 10 ÷ 20 nm Các kết quả thực nghiệm thu được đã giải thích một cách khoa học và trọn vẹn cơ chế tín hiệu của cảm biến phổ tổng trở điện hóa sử dụng đầu thu aptamer Cảm biến đã chế tạo có tính chọn lọc cao và độ tuyến tính cao trong dải nồng độ kháng nguyên PSA từ 2 ÷ 10 ng/mL, hoàn toàn đáp ứng được yêu cầu phát hiện

chỉ dấu PSA trong chẩn đoán ung thư tiền liệt tuyến

CHƯƠNG 5 CẢM BIẾN MIỄN DỊCH PHÁT HIỆN CHỈ DẤU AFP ỨNG DỤNG CHẨN ĐOÁN UNG

THƯ GAN

Chương 5 trình bày các kết quả nghiên cứu chế tạo cảm biến miễn dịch xác định chỉ dấu AFP trên cơ sở điện cực in lưới mực in các bon được biến tính bởi vật liệu nano Đầu thu kháng thể AFP được cố định trên bề mặt điện cực thông qua liên kết cộng hóa trị giữa nhóm chức -COOH (hoặc -NH2)trênkháng thể với nhóm chức -NH2 (hoặc -COOH) biến tính trên bề mặt điện cực Bề mặt điện cực SPCE được biến tính bởi bốn loại vật liệu khác nhau: polyme dẫn đồng trùng hợp PPy-PPa, vật liệu lai cấu trúc nano hai chiều giữa polyme PPy-PPa và ôxít graphene dạng khử điện hóa (erGO), màng đơn lớp tự lắp ghép SAM(p-ATP), vật liệu lai giữa poly(p-ATP) và hạt nano vàng Các giải pháp biến tính bề mặt điện cực giúp nâng cao hiệu suất cố định đầu thu kháng thể cũng như cải thiện đáp ứng tín hiệu đối với cảm biến phổ tổng trở điện hóa Kết quả nghiên cứu cho thấy bốn loại

cảm biến chế tạo có dải làm việc tuyến tính trong vùng nồng độ kháng nguyên AFP từ 1

đến 100 ng/mL, đáp ứng yêu cầu phát hiện chỉ dấu AFP trong chẩn đoán sớm ung thư gan CHƯƠNG 6 CẢM BIẾN ĐIỆN HÓA GLUCOSE

Chương 6 trình bày kết quả nghiên cứu bước đầu về cảm biến điện hóa enzyme glucose thế hệ thứ 2 trên cơ sở vật liệu polyme ôxy hóa-khử Osmium GOx được cố định trong mạng polyme Osmium trên nền điện cực SPCE biến tính bởi lớp hạt nano vàng Cấu trúc

đa lớp giữa polyme Osmium và enzyme GOx với ưu điểm đơn giản trong quy trình chế tạo, độ đồng nhất bề mặt cao và không làm suy giảm hoạt tính của enzyme Cảm biến hoạt động tại điều kiện điện áp thấp (-0,02 V vs Ag/AgCl) cho phép loại bỏ được các tín hiệu không đặc hiệu có trong mẫu máu bệnh phẩm Cảm biến hoạt động tốt trong dải nồng độ glucose từ 0 đến 10 mM (R2 = 0,99) Kết quả này là tiền đề cho những nghiên cứu tiếp theo về cảm biến sinh học điện hóa enzyme phát hiện chỉ dấu sinh học ứng dụng chẩn

đoán bệnh sớm

CHƯƠNG 1 CẢM BIẾN SINH HỌC ĐIỆN HÓA ỨNG DỤNG

CHẨN ĐOÁN BỆNH SỚM

Cảm biến sinh học là một lĩnh vực đa ngành kết hợp giữa vật lý, hóa học, sinh học phân

tử, khoa học vật liệu, điện và điện tử đã thu hút được sự quan tâm của nhiều nhà khoa học trong nước và trên thế giới Cảm biến sinh học là thiết bị cho phép chuyển đổi các tương tác sinh học sang các dạng tín hiệu có thể đo lường được như điện hóa, quang học, áp điện và nhiệt Cảm biến sinh học có nhiều ưu điểm như độ đặc hiệu ở mức độ sinh học phân tử, cấu trúc đơn giản, tiết kiệm thời gian phân tích, thao tác sử dụng đơn giản, có khả năng phân tích đa chất Cảm biến được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực của đời sống như công nghệ sinh học thực phẩm, trong y sinh và môi trường Trong chương này, tác giả trình bày tổng quan về cảm biến sinh học nói chung và cảm biến sinh học điện hóa Khái niệm chung về chỉ dấu khối u và vai trò của chúng trong chẩn đoán sớm đối với bệnh ung thư Ba loại chỉ dấu khối u là đối tượng nghiên cứu của luận án (α-hCG, PSA, AFP) cũng được trình bầy chi tiết Từ tổng quan tình hình nghiên cứu cảm biến sinh học điện hóa phát hiện chỉ dấu khối u trong cộng đồng khoa học trong nước và quốc tế, tác giả đưa ra những định hướng nghiên cứu chính của luận án

1.1 Cảm biến sinh học

Hình 1.1 Cấu trúc của cảm biến sinh học

Theo Hiệp hội Quốc tế về Hóa học và Hóa học ứng dụng (IUPAC – International Union

of Pure and Applied Chemistry), cảm biến sinh học (biosensor) là một thiết bị tích hợp có khả năng cung cấp thông tin, phân tích định lượng hoặc bán định lượng của chất cần phân tích thông qua việc sử dụng đầu thu sinh học được cố định lên bộ phận chuyển đổi tín hiệu [85] Cấu tạo của một cảm biến sinh học bao gồm ba phần chính: đầu thu sinh học, bộ phận

Chuyển sang tín hiệu điện

chuyển đổi và bộ phận xử lý đọc tín hiệu Trên hình 1.1 cấu tạo của một cảm biến sinh học nói chung Cảm biến sinh học có thể phân loại dựa trên cơ chế chuyển đổi tín hiệu hoặc loại đầu thu sinh học sử dụng như được trình bày trên hình 1.2

Hình 1.2 Phân loại cảm biến sinh học theo cơ chế chuyển đổi tín hiệu và loại đầu thu sinh học [134]

1.1.1 Đầu thu sinh học

Đầu thu sinh học là phần tử sinh học được cố định trên bộ phận chuyển đổi nhằm phát hiện các chất cần phân tích thông qua các phản ứng hóa sinh, tín hiệu này được nhận biết bởi bộ chuyển đổi tín hiệu Có sáu loại đầu thu sinh học cơ bản thường được sử dụng trong cảm biến sinh học bao gồm: kháng nguyên/ kháng thể, enzyme, chuỗi axít nucleic (ssDNA, DNA, RNA), aptamer, tế bào hoặc bộ phận của tế bào, polyme in phân tử

➢ Kháng nguyên/ kháng thể

Kháng nguyên/ kháng thể là những phần tử sinh học phức tạp gồm các chuỗi polypeptide được cấu tạo từ vài trăm phân tử axít amin liên kết với nhau theo một trật tự xác định [4] Tương tác giữa kháng thể với kháng nguyên theo nguyên tắc ổ khóa và chìa khóa có tính đặc hiệu cao Đầu thu kháng thể được sử dụng trong cảm biến sinh học phát hiện các tế bào và chỉ dấu sinh học như kháng nguyên [122, 133], xác định chủng virus, vi khuẩn [224] và các chất độc tố [15, 196]

• Kháng nguyên

Kháng nguyên là thành phần sinh học khi tiếp xúc với hệ thống miễn dịch (in vitro hay

in vivo) sẽ tạo ra đáp ứng miễn dịch và có khả năng kết hợp đặc hiệu với kháng thể hay các

thụ thể bề mặt của tế bào T đã hình thành trong đáp ứng miễn dịch Kháng nguyên hoàn

chỉnh (antigen) vừa có tính sinh miễn dịch vừa có tính đặc hiệu kháng nguyên [6] Tính đặc

hiệu kháng nguyên không phải do toàn bộ cấu trúc phân tử kháng nguyên gây ra mà do một hoặc nhiều vùng (domain) cấu trúc trong phân tử kháng nguyên quyết định Những domain cấu trúc này sẽ quyết định tính đặc hiệu kháng nguyên được gọi là nhóm quyết định kháng

Vi cân tinh thể thạch anh (QCM)

Sóng bề mặt (SAW)

Áp điện

Đầu thu sinh học

Kháng thế Enzyme Axít nucleic Aptamer

Nhiệt

Polyme in phân tử

nguyên Nhóm quyết định kháng nguyên được nhận biết đặc hiệu bởi các kháng thể đặc hiệu hoặc thụ thể đặc hiệu trên tế bào T mẫn cảm Phần cấu trúc đặc biệt này còn được gọi là

“epitope” Epitope có kích thước từ 1 đến 3 nm, cấu tạo khoảng 6-8 gốc axít amin hay 4-6

phân tử monosaccharide Số lượng epitope trên một kháng nguyên chính là hóa trị của kháng

nguyên hay còn được gọi là giá của kháng nguyên Kháng nguyên được phân thành làm 2

loại:

- Kháng nguyên đơn giá (monotonous antigen) thường có bản chất là polysaccharide, chúng chỉ có một epitope đặc hiệu Kháng nguyên đơn giá sẽ kích thích cơ thể sinh ra một loại kháng thể tương ứng và kháng nguyên đó chỉ kết hợp đặc hiệu và duy nhất với kháng thể đó

- Kháng nguyên đa giá (polytonous antigen) thường có bản chất là polypeptide, protein với nhiều epitope đặc hiệu Kháng nguyên đa giá sẽ kích thích sinh ra nhiều kháng thể tương ứng, nhưng epitope nào thì kết hợp đặc hiệu với kháng thể tương ứng với epitope đó

• Kháng thể

Hình 1.3 Cấu trúc của phân tử globulin miễn dịch [66]

Kháng thể là những phân tử globulin được sản xuất bởi những những tế bào lympho B khi có sự kích ứng đáp ứng miễn dịch bởi kháng nguyên trên cơ thể vật chủ Những phân tử này có khả năng nhận diện kháng nguyên tương ứng và kết hợp đặc hiệu với nhóm quyết định kháng nguyên Các globulin miễn dịch được phân thành năm lớp bao gồm IgG, IgA, IgD, IgE, IgM, trong đó IgG chiếm khoảng 70% trong globulin miễn dịch huyết thanh Phân

tử globulin miễn dịch có cấu trúc đối xứng được tạo thành từ hai chuỗi polypeptide L (light chain-chuỗi nhẹ) và hai chuỗi polypeptide H (heavy chain-chuỗi nặng) giống hệt nhau từng đôi một (hình 1.3) Sự liên kết giữa chuỗi H và L nhờ các cầu nối disulfide (S-S) tạo cấu trúc không gian hình chữ Y [6] Vùng siêu biến của chuỗi nặng (VH) và chuỗi nhẹ (VL) tạo nên

cấu trúc “paratope”, vùng này có khả năng liên kết đặc hiệu với kháng nguyên Vùng dễ

tác động để phân cắt phân tử Ig thành các mảnh khác nhau là khu vực giữa CH1 và CH2, được gọi là vùng bản lề (hinge region) Vùng bản lề giúp cho kháng thể linh hoạt có thể co gắn hoặc vươn dài ra để bắt kháng nguyên Trong từng polypeptide của phân tử Ig có các búi được cố định bằng gọi là các domain, mỗi domain dài khoảng 60 amino axít Phân tử Ig sẽ

bị cắt thành 3 phần bằng nhau khi bị tác động bởi enzyme papain Trong đó có 2 tiểu phần

còn khả năng kết hợp với kháng nguyên (chỉ còn một hóa trị) gọi là đoạn Fab (fragment antigen binding) và phần còn lại gồm đoạn tận cùng về đầu C của hai chuỗi nặng có tính chất dễ kết tinh nên gọi là đoạn Fc (fragment crystallisable) Nếu tác động bằng pepsin, phân

tử Ig bị cắt thành hai phần không bằng nhau: phần F(ab’)2 có hai hóa trị do hai Fab liên kết với nhau bởi cầu S-S và phần nhỏ là Fc Kháng thể được phân thành hai loại:

- Kháng thể đơn dòng (monoclonal antibody - mAb): chỉ nhận biết một epitope trên một kháng nguyên cho sẵn Tất cả các kháng thể đơn dòng cùng một dòng thì giống hệt nhau và được sản xuất bởi cùng một dòng tương bào

- Kháng thể đa dòng (polyclonal antibody - pAb): tập hợp các kháng thể đặc hiệu với các epitope khác nhau trên một kháng nguyên cho trước Trong đáp ứng miễn dịch, cơ thể tổng hợp nhiều kháng thể tương ứng với các epitope của cùng một kháng nguyên, đáp ứng này được gọi là đa dòng

• Kết hợp kháng nguyên – kháng thể

Hình 1.4 Lực tương tác giữa kháng nguyên – kháng thể [66]

Phản ứng sinh nhiệt: Mỗi vị trí “paratope” trên kháng thể kết hợp với một “epitope”

của kháng nguyên tương ứng bởi các lực hấp dẫn có năng lượng nhỏ (vào khoảng <10 Kcal/mol) và có bản chất không phải là liên kết cộng hóa trị Sự kết hợp giữa kháng nguyên

và kháng thể xảy ra nhờ các lực như được trình bày trên hình 1.4

- Lực liên kết ion giữa các nguyên tử hoặc các nhóm hóa học mang điện trái dấu, ví dụ như: nhóm COO- và NH3+ đối diện nhau của axít amin trong chuỗi polypeptide

- Lực liên kết của các cầu nối hydro giữa các nguyên tử hydro mang điện tích dương

H+ và các nguyên tử mang điện tích âm như O- hoặc N-

- Lực liên kết Wan der Waals do chuyển động trong các đám mây điện tử ở mặt ngoài làm cho phân tử bị phân cực và hút các phân tử trái dấu khác bên cạnh

- Lực liên kết do tính kỵ nước giữa các axít amin

Tính đặc hiệu: Mỗi vị trí paratope trên kháng thể chỉ kết hợp với một epitope của kháng

nguyên tương ứng theo quy tắc “ổ khóa và chìa khóa”

Tính thuận nghịch: Phức hệ kháng nguyên – kháng thể có thể bị phân ly do nhiệt, do

môi trường axít (pH<3) hoặc do môi trường có lực ion cao

Hằng số ái lực liên kết kháng nguyên-kháng thể: Ái lực liên kết giữa kháng nguyên và

kháng thể được thể hiện bằng cấu trúc không gian bổ sung giữa epitope và paratope Phản ứng miễn dịch giữa kháng nguyên – kháng thể được biểu diễn theo phương trình (1.1):

d

K K

cho các phản ứng xảy ra trong điều kiện in-vivo hoặc in-vitro Enzyme có hai cấu trúc cơ

bản là protein thuần hoặc protein tạp (gồm phần protein thuần gọi là apoenzyme; phần chất hữu cơ gọi là coenzyme) Enzyme phản ứng xúc tác thông qua trung tâm hoạt động bao gồm các nhóm chức hóa học của các axít amin (nhóm thiol của Cys; nhóm hydroxyl của Tyr; nhóm cacboxyl của Glu, Asp; nhóm amin ở đầu N hoặc nhóm ε-amin của Lys; vòng imidazole của His…) hoặc các nhóm chức của coenzyme Trung tâm hoạt động có cấu trúc không gian xác định nhờ mạng lưới các liên kết hyđro Theo hội Hóa sinh quốc tế, enzyme được chia thành 6 lớp chính dựa theo cơ chế phản ứng (Bảng 1.1)

Bảng 1.1 Phân loại enzyme [256].

Loại enzyme Phản ứng do enzyme xúc tác

Oxydoreductase Xúc tác cho phản ứng ôxy hóa khử

Transferase Xúc tác cho phản ứng chuyển vị

Hydrolase Xúc tác cho phản ứng thủy phân

Lyase Xúc tác cho phản ứng cắt đứt liên kết tạo thành 2 phân tử nhưng không cần H2O,

hoặc loại H 2 O tạo thành nối đôi, hoặc kết hợp với H 2 O vào nối đôi

Isomerase Xúc tác cho phản ứng đồng phân hóa

Ligase Xúc tác cho phản ứng kết hợp hai phân tử kèm theo cắt đứt liên kết giầu năng lượng của ATP hoặc các nucleoside triphosphate khác

Enzyme phản ứng chọn lọc với một cơ chất hoặc một loại cơ chất nhất định do tính đặc hiệu của trung tâm hoạt động enzyme Hoạt tính của enzyme chịu ảnh hưởng của rất nhiều yếu tố như như nhiệt độ, độ pH của môi trường, phương pháp cố định đầu thu enzyme… Trong cảm biến sinh học, đầu thu sinh học enzyme khi tương tác với cơ chất sẽ tạo ra các sản phẩm phản ứng có thể phát hiện được thông qua sự thay đổi về mầu sắc, về nhiệt, hoặc tín hiệu điện Cảm biến sinh học enzyme được ứng dụng trong phân tích thực phẩm [75], đánh giá các thông số của môi trường [18], ứng dụng trong y sinh để chẩn đoán và điều trị bệnh [87].

➢ Axít nucleic (ssDNA, DNA, RNA)

Hình 1.5 Mô hình cấu trúc của RNA, DNA [287]

Axít nucleic là các cấu trúc cao phân tử của axít nucleic (NA) được sắp xếp theo một trật

tự xác định và qui định toàn bộ hệ gen của tế bào Axít deoxyribonucleic (DNA) là một cấu trúc xoắn kép được tạo nên từ bốn loại axít nucleic là Adenine (A), Thymine (T), Guanine (G), Cytosine (C) và gồm hai chuỗi liên kết với nhau theo nguyên tắc bổ sung A:T thông qua 2 cầu nối liên kết hydro, G:C thông qua 3 cầu nối liên kết hydro được gắn trên khung xương là chuỗi phosphate – đường deoxy ribose Axít ribonucleic (RNA) là một cấu trúc sợi đơn và chủ yếu được tạo nên từ bốn loại axít nucleic Adenine (A), Thymine (T), Guanine (G), và Uracil (U) (thay cho Cytosine trong DNA) được gắn trên khung xương là chuỗi phosphate – đường ribose (hình 1.5) Dựa trên nguyên tắc bổ sung, các đầu thu sinh học là chuỗi đơn ssDNA và RNA với chức năng làm đầu dò sẽ liên kết với chuỗi bổ sung là tác nhân cần phát hiện Đầu thu chuỗi axít nucleic được sử dụng phổ biến trong cảm biến sinh học do giá thành rẻ, độ nhạy và tính chọn lọc cao do ái lực liên kết mạnh [121] Các đầu thu này cho phép phát hiện sự đột biến trong cấu trúc của DNA, phát hiện các DNA của tế bào ung thư [81] và xác định kim loại nặng và độc tố [277]…

➢ Aptamer

Hình 1.6 Cấu trúc và tương tác giữa aptamer và chỉ dấu sinh học [288]

Aptamer là một đoạn ngắn oligonucleotide (DNA hoặc RNA) hoặc peptide có cấu trúc nhỏ hơn 100 mer (hình 1.6) Aptamer có khả năng liên kết với một phân tử đích một cách đặc hiệu bởi ái lực cao và độ đặc hiệu về cấu trúc ba chiều [70, 136] Aptamer được tổng hợp nhân tạo bằng quy trình SELEX gồm từ 8 đến 15 chu trình sàng lọc theo 3 quá trình chính là chọn lọc những aptamer có khả năng liên kết đặc hiệu với phân tử đích từ thư viện oligonucleotide ngẫu nhiên, thu nhận và khuếch đại aptamer [57] Aptamer được biết đến

như một “kháng thể nhân tạo” với nhiều ưu điểm vượt trội so với kháng thể

(i) Aptamer có tính ổn định cao hơn so với kháng thể: Tại điều kiện nhiệt độ cao, kháng thể

dễ bị phân hủy và phá vỡ cấu trúc bậc ba trong khi các chuỗi oligonucleotide lại có tính

ổn định nhiệt và khả năng duy trì cấu trúc Aptamer có khả năng hồi phục quay lại cấu trúc ban đầu sau khi liên kết với phân tử đích trong khi kháng thể sau khi phản ứng với phân tử đích sẽ bị biến tính và không thể hồi phục [136] Hoạt tính của aptamer có thể lưu giữ trong thời gian dài và không đòi hỏi điều kiện bảo quản phức tạp như đối với kháng thể

thể, có khả năng tạo ra trong điều kiện in vitro không cần các đáp ứng miễn dịch trên động vật thí nghiệm, không sinh đáp ứng miễn dịch khi sử dụng in vivo

nhờ tính lặp lại của các phản ứng hóa học trong chuỗi tổng hợp SELEX Trong khi kháng thể được tách chiết từ sản phẩm của phản ứng miễn dịch trên các cơ thể sống nên hiệu suất của kháng thể là không đồng đều và phụ thuộc vào từng lô sản xuất [197, 209]

ứng nhiều mục đích khác nhau Aptamer có thể gắn thêm các nhóm chức như thiol, disulfite, amin hoặc biotin giúp cố định trên bề mặt điện cực rắn hoặc gắn với các chất phát huỳnh quang (fluorophore) và chất hấp phụ quang (quencher) ứng dụng trong các cảm biến sinh học trên cơ sở phép đo quang học

(v) Aptamer có khối lượng phân tử trong khoảng từ 5 đến 15 kDa và kích thước cỡ 3 đến 5

nm, nhỏ hơn so với kháng thể cả về khối lượng (khoảng 150 kDa đối với kháng thể IgG)

và kích thước (12 - 15 nm) Aptamer có khả năng tương tác với các phân tử sinh học

Aptamer

nhỏ như amino axít đến các phân tử lớn như protein, tế bào, virus, vi khuẩn cao hơn so với kháng thể [147] Bên cạnh đó, aptamer còn có khả năng đặc hiệu với các phân tử không đáp ứng miễn dịch như ion kim loại và các độc tố [91]

➢ Tế bào, mô tế bào

Đầu thu tế bào hoặc mô tế bào cho phép phát hiện đối tượng cần phân tích thông qua sự thay đổi trạng thái điện hóa trên màng tế bào Đầu thu loại này cũng có thể ở trạng thái biến đổi gen để thích nghi trong điều kiện nhiệt độ và độ pH của môi trường khác nhau [71] Cảm biến sinh học dựa trên tế bào có độ nhạy tốt, độ chọn lọc cao được ứng dụng trong giám sát các độc tố trong môi trường, phát hiện kim loại nặng, phân tích thực phẩm, dược phẩm, sàng lọc ma túy [29, 170]

➢ Polyme in phân tử

Đầu thu polyme in phân tử (MIP- Molecularly Imprinted Polymer) là đầu thu nhân tạo

được tổng hợp bằng phương pháp in phân tử trong đó các chất phân tích được đưa vào mạng nền polyme và giữ bởi các liên kết chéo Sau quá trình polyme hóa, các chất phân tích được tách khỏi cấu trúc polyme nhờ các dung môi hữu cơ Kết quả là trong cấu trúc polyme rắn tồn tại các vị trí khuyết có các nhóm chức liên kết tương ứng với chất cần phát hiện Trên hình 1.7 trình bày quy trình công nghệ chế tạo đầu thu sinh học nhân tạo tổng hợp bằng phương pháp in phân tử

Hình 1.7 Đầu thu sinh học nhân tạo tổng hợp bằng phương pháp in polyme phân tử [255]

1.1.2 Bộ phận chuyển đổi tín hiệu

Bộ phận chuyển đổi giúp chuyển các tương tác hóa sinh giữa chất cần phân tích và đầu thu sinh học thành dạng tín hiệu có thể đo đạc được Bộ phận chuyển đổi tín hiệu của cảm biến sinh học có thể chia thành bốn dạng chuyển đổi cơ bản [134]

➢ Chuyển đổi điện hóa: Phản ứng hóa sinh giữa đầu thu sinh học và chất cần phân tích

sẽ sinh ra các đáp ứng tín hiệu điện hóa như điện áp, cường độ dòng điện hay độ dẫn Tùy thuộc vào tín hiệu đầu ra của bộ chuyển đổi mà cảm biến sinh học được chia thành các loại: cảm biến điện hóa đo dòng (amperometric), cảm biến điện hóa đo điện thế (potentiometric),

cảm biến điện hóa đo độ dẫn (conductometric), cảm biến điện hóa đo phổ tổng trở (impedimetric) [69, 157]

➢ Chuyển đổi quang: Loại chuyển đổi này dựa trên nguyên tắc ghi nhận tín hiệu quang

học như phổ hấp thụ, huỳnh quang, lân quang, phổ tán xạ Raman, phổ nhiễu xạ, phổ tán sắc… được phát ra khi các chất cần phân tích (sinh học, hóa sinh, lý sinh) bị kích thích bởi bức xạ điện từ năng lượng cao [14] Các đại lượng về biên độ, năng lượng, sự phân cực, pha của tín hiệu quang thu nhận được sẽ cho ta các thông tin liên quan đến đối tượng sinh học cần phân tích Các cảm biến sinh học sử dụng bộ chuyển đổi quang có độ nhạy cao, thời gian đáp ứng nhanh [50]

➢ Chuyển đổi áp điện: Loại chuyển đổi này dựa trên nguyên tắc thay đổi tần số dao

động của vật liệu áp điện khi có tương tác sinh học trên bề mặt điện cực của cảm biến Tần

số dao động sẽ được chuyển thành tín hiệu điện nhờ hiệu ứng áp điện thuận Có hai loại cảm biến áp điện là sóng khối (BW- bulk wave) và sóng bề mặt (SAW- surface acoustic wave) [50] Các cảm biến sinh học sử dụng bộ chuyển đổi áp điện có ưu điểm là độ nhạy cao, thời gian đáp ứng nhanh, có thể phát hiện trực tiếp mà không cần đánh dấu thành phần sinh học [40]

➢ Chuyển đổi nhiệt: Loại chuyển đổi này dựa trên nhiệt lượng sinh ra (hoặc hấp thụ)

do hình thành (hoặc phá vỡ) liên kết hóa học giữa đầu thu sinh học và đối tượng cần phân tích [262] Cảm biến sinh học sử dụng chuyển đổi nhiệt có độ ổn định lớn, tuy nhiên độ chọn lọc và độ nhạy thấp

Hình 1.8 Biểu đồ tỷ lệ bài báo cảm biến sinh học theo cơ chế chuyển đổi tín hiệu Số liệu thống kê bài

báo tìm kiếm theo từ khóa “electrochemical biosensor”, “optical biosensor”, “piezoelectric biosensor”, “calorimetric biosensor” từ năm 2000 ÷ 2018 theo website Science Direct [289]

Theo số liệu thống kê số các bài báo trên website Science Direct, cảm biến sinh học điện hóa đứng đầu trong bốn loại cảm biến sinh học dựa theo cơ chế chuyển đổi tín hiệu (hình 1.8) Cảm biến sinh học điện hóa không chỉ được nghiên cứu trong phạm vi phòng thí nghiệm

mà đã phát triển thành các sản phẩm thương mại ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như y tế [47], môi trường [132, 171] và công nghệ thực phẩm [22, 276] Hiện nay, xu hướng phát triển của cảm biến sinh học điện hóa đang được các nhóm trên thế giới tập trung nghiên cứu

là ứng dụng cảm biến trong các thiết bị phân tích cầm tay, thiết bị xét nghiệm y sinh tại chỗ (POC- point of care) [49, 155]

Điện hóa 48%

Quang 45%

Áp điện 6%

Nhiệt 1%

1.1.3 Phương pháp cố định đầu thu sinh học

Một trong những yếu tố có ý nghĩa quyết định đến sự thành công của cảm biến sinh học chính là phương pháp cố định các đầu thu sinh học lên bộ phận chuyển đổi tín hiệu Quá trình gắn kết này phải đảm bảo duy trì được hoạt tính của đầu thu sinh học, có tính ổn định

và điều khiển được sự phân bố cũng như tính định hướng của các đầu thu sinh học Các phương pháp cố định thường được sử dụng đối với các cảm biến sinh học (hình 1.9): hấp phụ vật lý (adsorption), liên kết cộng hóa trị (covalent binding), bẫy (entrapment), liên kết chéo (cross-linking), hoặc hóa rắn (encapsulation) [164, 182]

Hình 1.9 Phương pháp cố định đầu thu sinh học: a) Hấp phụ vật lý, b) Liên kết cộng hóa trị, c) Bẫy, d)

Liên kết chéo, e) Hóa rắn [139]

➢ Hấp phụ vật lý

Hấp phụ vật lý là phương pháp sử dụng liên kết Van der Waals, liên kết hydro, liên kết ion để cố định đầu thu sinh học lên trên bề mặt điện cực của cảm biến Có nhiều loại vật liệu như cellulose, collodion, silica gel, thủy tinh… được sử dụng làm thành phần hấp phụ các phân tử sinh học Đây là một phương pháp đơn giản, tuy nhiên do lực liên kết giữa đầu thu sinh học yếu, định hướng của đầu thu sinh học là ngẫu nhiên và hiệu suất cố định thấp Bên cạnh đó, hiệu suất cố định còn phụ thuộc nhiều vào điều kiện công nghệ như độ pH, nhiệt

độ, dung môi…

➢ Liên kết cộng hóa trị

Liên kết cộng hóa trị là phương pháp dựa trên liên kết giữa nhóm chức thuộc đầu thu sinh học với nhóm chức biến tính trên bề mặt cảm biến Bề mặt cảm biến được hoạt hóa thông các bước xử lý hóa học nhằm tạo ra các nhóm chức như amin (-NH2), thiol (-SH), cacboxyl (-COOH), andehit (-CHO), hydroxyl (-OH) Ưu điểm của phương pháp này là tạo ra lực liên kết giữa bề mặt cảm biến với đầu thu sinh học lớn hơn so với phương pháp hấp phụ vật lý với mức độ ổn định, độ lặp lại và hiệu suất cố định đầu thu sinh học cao Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi tiến hành qua nhiều bước trung gian nên phức tạo hơn so với phương pháp hấp phụ vật lý Hoạt tính của đầu thu sinh học có thể bị ảnh hưởng sau các bước cố định

➢ Liên kết chéo

Phương pháp này sử dụng liên kết chéo giữa các nhóm chức của đầu thu sinh học bằng chất hữu cơ trung gian có hai nhóm chức hoặc đa nhóm chức Hóa chất thường được sử dụng trong phương pháp này như glutaraldehyde, hexamethylene di-isocyanate, 1,5-difluoro 2,4-dinitrobenzene và axít bisdiazobenzidine-2,2’-disulphonic… Ưu điểm của phương pháp này

là tạo liên kết bền vững, tuy nhiên nhược điểm là tạo cấu trúc đa lớp và làm giảm hoạt tính của đầu thu sinh học

➢ Bẫy

Đầu thu sinh học được cố định bên trong thể mẹ là các mạng polyme cấu trúc ba chiều Các loại polyme thường được sử dụng là polyacrylamide, tinh bột, aliganate, pectate, polyvinyl chloride, polycarbonate, polyacrylamide, cellulose acetate và silica gel Ưu điểm của phương pháp này là khả năng thích ứng cao của thể mẹ đối với nhiều loại đầu thu sinh học Tuy nhiên, phương pháp này có nhược điểm là làm giảm hoạt tính của đầu thu sinh học

và đầu thu sinh học có thể bị tách khỏi mạng polyme trong quá trình sử dụng

➢ Hóa rắn

Phương pháp hóa rắn sử dụng màng xốp bao xung quanh đầu thu sinh học và gắn kết chúng với cảm biến Ưu điểm của phương pháp này là cố định đầu thu sinh học khá bền vững nhưng nhược điểm là hạn chế sự bắt cặp giữa đầu thu và tác nhân sinh học cần phát hiện do kích thước cũng như độ bền của lỗ xốp khó kiểm soát

Hình 1.10 Biểu đồ số lượng bài báo cảm biến sinh học phân loại theo phương pháp cố định đầu thu

sinh học Số liệu thống kê bài báo tìm kiếm theo từ khóa “adsorption”, “covalent”, “encapsulation”,

“entrapment”, “cross-linking” trong khoảng từ năm 2000 ÷ 2018 theo website Science Direct [289]

Theo số liệu thống kê bài báo đã công bố về cảm biến sinh học trên cơ sở phương pháp

cố định đầu thu sinh học đã sử dụng (hình 1.10) thì phương pháp hấp phụ vật lý chiếm ưu thế do ưu điểm đơn giản và chi phí thấp, tuy nhiên lực liên kết cũng như hiệu suất cố định thấp Phương pháp cố định bằng liên kết cộng hóa trị đứng thứ hai trong các phương pháp

cố định với ưu điểm hiệu suất cố định cao, liên kết bền vững và độ lặp lại cao Các phương pháp hóa rắn, bẫy và liên kết chéo ít được sử dụng do hiệu suất cố định thấp cũng như giảm hoạt tính của đầu thu sinh học

1.1.4 Các phương pháp cố định kháng thể

Trong các loại cảm biến sinh học phát hiện chỉ dấu sinh học của các bệnh thì đầu thu kháng thể chiếm ưu thế hơn cả Tuy nhiên, đáp ứng tín hiệu của cảm biến phụ thuộc rất lớn vào khả năng gắn kết, số lượng cũng như định hướng của kháng thể được cố định trên bề mặt cảm biến Các công trình nghiên cứu về cố định kháng thể đã công bố được phân loại theo 3 hướng chính là cố định bằng hấp phụ vật lý, cố định bằng liên kết cộng hóa trị và cố định bằng ái lực tương tác sinh học Mỗi phương pháp cố định đều bộc lộ những ưu điểm và nhược điểm khác nhau, tuy nhiên cho đến nay chưa có phương pháp nào được lựa chọn làm phương pháp chuẩn Chính vì vậy, việc lựa chọn phương pháp cố định kháng thể phù hợp với tính chất hóa lý của bề mặt điện cực và hiệu suất cố định cao nhất là yêu cầu đặt ra đối với luận án

Hình 1.11 Định hướng cố định của kháng thể trên bề mặt điện cực [254]

Kháng thể gồm các chuỗi polypeptide được cấu tạo từ vài trăm phân tử axít amin liên kết với nhau theo một trật tự xác định, có khối lượng khoảng 150 kDa với kích thước ba chiều (14 x 10 x 4 nm) Trong cấu trúc của kháng thể, các amino axít kỵ nước được cuộn phía trong và để lại các nhóm ưa nước trên bề mặt phía bên ngoài bao gồm nhóm amin, cacboxyl

và hydroxyl Kháng thể có cấu trúc không gian hình chữ Y bao gồm hai đoạn Fab có khả năng liên kết với kháng nguyên và đoạn Fc dễ kết tinh Hai đoạn Fab liên kết với nhau bởi cầu S-S được gọi là F(ab’)2 [254] Kháng thể cố định trên bề mặt điện cực có thể tồn tại nhiều định hướng khác nhau như “end on”, “head on”, “side on”, “lying on” (hình 1.11) Kháng thể cố định tại vị trí tận cùng của đoạn Fc (dạng end-on), vị trí liên kết đặc hiện giữa kháng thể và kháng nguyên tự do Bên cạnh đó, kháng thể cố định trên điện cực có thể tồn tại ở các dạng định hướng khác như dạng “head-on”, tức là toàn bộ vùng F(ab’)2 hướng về phía bề mặt điện cực; định hướng “side-on”, tức là cả vùng Fab và Fc hướng về phía bề mặt điện cực hoặc dạng “lying-on” tức là cả vùng F(ab’)2 và Fc cùng hướng về phía bề mặt điện cực Ái lực bắt cặp giữa kháng nguyên và kháng thể đạt được là tối đa với định hướng cố định “end on” của kháng thể

1.1.4.1 Hấp phụ vật lý

Kháng thể được cố định trên bề mặt điện cực rắn bằng phương pháp hấp phụ vật lý thông qua liên liên kết ion, liên kết hydro, liên kết kỵ nước, liên kết Van der Waals Đây là phương pháp đơn giản nhất để cố định kháng thể, tuy nhiên kháng thể cố định trên bề mặt theo định hướng ngẫu nhiên, liên kết không bền và dễ bị rửa trôi trong quá trình xét nghiệm Kháng thể phân bố không đều trên bề mặt và có xu hướng kết tụ với nhau dẫn đến sự che phủ vùng liên kết đặc hiệu với kháng nguyên Tuy nhiên, sự phân bố kháng thể trên bề mặt điện cực

có thể được cải thiện bằng màng đơn lớp tự sắp xếp (SAM) Trong điều kiện dung môi có

độ pH xác định, các nhóm chức của màng SAM như methyl (CH3-), hydroxyl (OH-), cacboxyl (COOH-), amin (NH2-) bị phân ly và mang điện tích phụ thuộc vào hằng số phân

ly pKa; kháng thể mang điện tích phụ thuộc vào điểm đẳng điện pI Kháng thể sẽ được cố định trên màng SAM thông qua tương tác tĩnh điện [246] Ưu điểm của hấp phụ vật lý trên màng đơn lớp tự lắp ghép là có thể chọn lọc được kháng thể cố định thông qua nhóm chức của SAM và độ pH của môi trường

1.1.4.2 Liên kết cộng hóa trị

Hình 1.12 Kháng thể cố định trên bề mặt điện cực bằng liên kết cộng hóa trị; (a) giữa nhóm amin

(hoặc nhóm cacboxyl) trên kháng thể với nhóm cacboxyl (hoặc nhóm amin) biến tính trên bề mặt điện cực; (b) giữa nhóm thiol sinh ra do phản ứng khử liên kết cầu disulfide trên kháng thể bởi TCEP (hoặc 2-MEA) và bề mặt điện cực vàng; (c) giữa nhóm aldehyde sinh ra do phản ứng ôxy hóa gốc đường nằm

ở đoạn Fc của kháng thể và nhóm hydrazide biến tính trên bề mặt điện cực [254]

Kháng thể được cố định bằng liên kết cộng hóa trị giữa nhóm chức trên kháng thể và nhóm chức năng hóa trên bề mặt điện cực rắn Quy trình cố định bằng liên kết cộng hóa trị phải đảm bảo sao cho vị trí gắn kết đặc hiệu với kháng nguyên trên kháng thể không bị ảnh hưởng và không làm suy giảm hoạt tính sinh học của kháng thể Ưu điểm của liên kết cộng hóa trị là kháng thể cố định bền vững, có độ lặp lại cao Các nhóm chức thuộc amino axít cấu tạo nên kháng thể dùng trong liên kết cộng hóa trị và nhóm chức trên bề mặt điện cực

biến tính tương ứng được trình bày trong bảng 1.2 Do liên kết hóa học có thể xảy ra cùng một lúc với nhiều nhóm chức của amino axít trên bề mặt kháng thể nên định hướng của kháng thể cố định thường ngẫu nhiên Tuy nhiên, định hướng của kháng thể có thể được cải thiện bằng cách sử dụng nhóm chức aldehyde tạo ra bởi phản ứng ôxy hóa chuỗi đường gắn

với đoạn Fc của kháng thể [231]

Bảng 1.2 Nhóm chức thuộc amino axít tham gia cố định bằng liên kết cộng hóa trị [178]

Nhóm chức Amino axít Bề mặt chức năng hóa

Amin (-NH 2 ) Lysine, hydroxyl-Lysine

Cacboxyl Epoxy Aldehyde Cacboxyl (-COOH) Aspartic, Glutamic Amin

Thiol (-SH) Cysteine

Maleimide Pyridyil disulfide Thiosulfonate Vinylsulfone Hydroxyl (-OH) Serine, Threonine Epoxy

➢ Cố định qua nhóm amin (-NH 2): nhóm amin tồn tại ở điểm cuối N của chuỗi polypeptide

và trong chuỗi bên của amino axít Lysine Các nhóm chức này thường nằm trên mặt ngoài cấu trúc của kháng thể nên không làm biến đổi cấu trúc của kháng thể khi cố định Tuy nhiên, do số lượng các nhóm chức amin rất lớn dẫn đến xác suất gắn kết với bề mặt điện cực ở nhiều vị trí khác nhau và giảm tính định hướng của kháng thể Nhóm amin trên kháng thể sẽ tạo liên kết cộng hóa trị trực tiếp với bề mặt được biến tính bởi nhóm chức epoxy [126], hay nhóm aldehyde [275] Trong trường hợp bề mặt điện cực biến tính bởi nhóm cacboxyl, sử dụng hợp chất carbodiimide (EDC) kết hợp succinimide (NHS) hoạt hóa nhóm cacboxyl thành NHS-este trung gian, este này tiếp tục phản ứng với nhóm amin trên kháng thể để tạo liên kết amide bền vững [79]

➢ Cố định qua nhóm cacboxyl (-COOH): nhóm cacboxyl nằm ở tận cùng đầu C của chuỗi

polypetide (đầu tận cùng của đoạn Fc và CL) (hình 1.3) và chuỗi bên của amino axít Aspartic và Glutamic; nhóm chức này tồn tại trên bề mặt ngoài cấu trúc của kháng thể Nhóm cacboxyl trên kháng thể bị hoạt hóa bởi hợp chất carbodiimide (EDC), sau đó liên kết cộng hóa trị với bề mặt điện cực được chức năng hóa bởi nhóm amin[239]

➢ Cố định qua nhóm thiol (-SH): liên kết disulfide (-S-S-) của Cysteine trong cấu trúc nội

phân tử của kháng thể, liên kết này bị khử bởi hóa chất tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) hoặc 2- mercaptoethylamine (2-MEA) tạo nhóm thiol trên mảnh đơn của kháng thể (Fab’) [187] Do số lượng Cysteine ít hơn so với Lysine nên kháng thể cố định qua nhóm thiol sẽ giảm được sự định hướng ngẫu nhiên Nhóm thiol sẽ tạo liên kết hóa trị với

bề mặt điện cực vàng [187] hoặc bề mặt được biến tính bởi nhóm maleimide [28]

➢ Cố định qua nhóm aldehyde (-CHO): chuỗi polypeptide của kháng thể sau khi được tổng

hợp và được sửa đổi bằng cách bổ xung thêm gốc đường được gọi là glycoprotein Các gốc đường nằm rải rác trên kháng thể, tuy nhiên hầu hết trình tự glycosyl hóa nằm ở đoạn

Fc Khi tiến hành phản ứng ôxy hóa chuỗi đường sẽ tạo ra nhóm aldehyde gắn kết với đoạn CH2 trên Fc của kháng thể [275] Kháng thể cố định bằng nhóm aldehyde có tính