Xác định thành phần vi sinh vật có trong đất trồng rau, phân lập, nhân nuôi và đánh giá hiệu quả của một số vi sinh vật có lợi trong việc hạn chế bệnh hại rau tại địa bàn huyện Việt Yên tỉnh Bắc Giang

Rau là loại thực phẩm không thể thiếu trong bữa ăn hàng ngày của mỗi người. Giá trị của rau được thể hiện nhiều mặt trong cuộc sống trong đó rau sạch lại là vấn đề được nhiều người ưa chuộng. Chất lượng của sản phẩm rau phụ thuộc vào nhiều yếu tố trong đó có vi sinh vật có nguồn gốc từ đất trồng rau. Trong thực tế sản xuất xuất hiện tình trạng nhiều trường hợp rau mang yếu tố gây hại trong đó có thuốc bảo vệ thực vật, sinh vật gây bệnh... làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe con người cũng như uy tín của nông sản xuất khẩu Việt Nam ra thị trường quốc tế. Đất là môi trường trồng trọt chủ yếu trong sản xuất rau. Thành phần vi sinh vật trong đất không những ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm rau mà còn chi phối hiệu quả của quá trình sản xuất. Việc xác định thành phần vi sinh vật trong đất trồng rau, xác định các đối tượng có hại để khống chế, đồng thời phát hiện và đánh giá mức độ có lợi của các vi sinh vật đối kháng có thể sử dụng trong việc hạn chế bệnh hại là một phương hướng đang và sẽ ngày càng được chú ý. Xuất phát từ những vấn đề trên tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Xác định thành phần vi sinh vật có trong đất trồng rau, phân lập, nhân nuôi và đánh giá hiệu quả của một số vi sinh vật có lợi trong việc hạn chế bệnh hại rau tại địa bàn huyện Việt Yên tỉnh Bắc Giang”.

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi và được

sự hướng dẫn của TS Nguyễn Bình Nhự Các số liệu, kết quả nêu trong khóa luận là trung thực và chưa được công bố trong các công trình nghiên cứu khác Nếu không đúng như đã nêu trên, tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về đề tài của mình.

Người cam đoan

Nguyễn Thị Vân Anh

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành, sâu sắc tới thầy giáo - TS Nguyễn Bình Nhự đã định hướng nghiên cứu, động viên tôi vượt qua những khó khăn trong suốt quá trình học tập nghiên cứu và tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo trường Đại học Nông - Lâm Bắc Giang, các thầy cô giáo trong Trung tâm Công nghệ Sinh học - Khoa Nông học – Trường Đại học Nông - Lâm Bắc Giang đã luôn nhiệt tình giúp

đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi thực hiện và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này.

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình và bạn bè đã luôn tin tưởng, động viên, hỗ trợ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.

Xin chân thành cảm ơn!

Bắc Giang, ngày tháng năm 2018

Sinh viên

Nguyễn Thị Vân Anh

MỤC LỤ

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ CÁI VIẾT TẮT vi

DANH MỤC BẢNG vii

DANH MỤC HÌNH viii

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 1

2.1 Mục tiêu chung 1

2.2 Mục tiêu cụ thể 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 2

4.1 Ý nghĩa khoa học 2

4.2 Ý nghĩa thực tiễn 2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Môi trường đất và sự phân bố của VSV trong đất 3

1.1.1 Môi trường đất 3

1.1.2 Sự phân bố vi sinh vật trong đất và mối quan hệ giữa các nhóm vi sinh vật 4

1.1.3 Mối quan hệ giữa đất, vi sinh vật và thực vật 7

1.2 Vai trò của vi sinh vật trong đất 9

1.3 Một số bệnh hại chủ yếu trong đất trồng rau 10

1.3.1 Bệnh chết yểu cây con 10

1.3.2 Thối hạch cải bắp 11

1.3.3 Thối khô củ khoai tây 11

1.3.4 Bệnh héo lá, thối cuống 12

1.3.5 Bệnh thán thư 12

1.3.6 Bệnh sương mai (mốc sương) 12

1.3.7 Bệnh héo lá xanh vi khuẩn 13

1.4 Vai trò của một số vi sinh vật có ích hiện diện trong đất 13

1.4.1 Khả năng kiểm soát bệnh cây của nấm Trichoderma 13

1.4.2 Vi khuẩn Bacillus đối kháng với vi sinh vật gây bệnh cây 16

1.4.3 Xạ khuẩn đối kháng nấm bệnh cây 18

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Vật liệu nghiên cứu 20

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 20

2.1.2 Dụng cụ - thiết bị 20

2.1.3 Hóa chất 20

2.1.4 Môi trường nuôi cấy 20

2.2 Phương pháp nghiên cứu 21

2.2.1 Phương pháp lấy mẫu đất 21

2.2.2 Phương pháp xác định thành phần vi sinh vật có trong đất trồng rau 22

2.2.3 Phương pháp phân lập tạo chủng thuần với vi sinh vật có lợi trong việc hạn chế bệnh hại rau 23

2.2.4 Khả năng phân giải cellulose của vi khuẩn Bacillus 26

2.2.5 Thử nghiệm khả năng đối kháng của nấm Trichoderma với nấm bệnh thối hạch cải bắp (Sclerotinia sclerotiorum) 27

2.2.6 Bước đầu sản xuất chế phẩm từ nấm đối kháng Trichoderma 27

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 29

3.1 Kết quả phân tích xác định thành phần vi sinh vật có trong đất trồng rau 29

3.2 Kết quả phân lập tạo chủng thuần với vi sinh vật có lợi trong việc hạn chế bệnh hại rau 33

3.2.1 Kết quả phân lập tạo chủng thuần với nấm Trichoderma 33

3.2.2 Kết quả phân lập vi khuẩn Bacillus 35

3.3 Kết quả nhân sinh khối một số chủng vi sinh vật có lợi trong việc hạn

chế bệnh hại rau 36

3.3.1 Kết quả nhân nuôi tạo sinh khối nấm Trichoderma 36

3.3.2 Kết quả nhân sinh khối vi khuẩn Bacillus 39

3.4 Thử nghiệm khả năng khống chế của Trichoderma với nấm bệnh thối hạch cải bắp và khả năng phân giải cellulose của vi khuẩn Bacillus 42

3.4.1 Kết quả thử nghiệm khả năng khống chế của Trichoderma với nấm bệnh thối hạch cải bắp 42

3.4.2 Kết quả thử nghiệm khả năng phân giải cellulose của vi khuẩn Bacillus 43

3.5 Kết quả bước đầu sản xuất chế phẩm Trichoderma 44

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 47

1 Kết luận 47

2 Đề nghị 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO 48

PHỤ LỤC MỘT SỐ HÌNH ẢNH MINH HỌA 51

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ CÁI VIẾT TẮT

BVTV : Bảo vệ thực vậtCFU : Colony Forming UnitCMC : Carboxyl Methyl Cellulose

MT : Môi trườngPDA : Patato Dextrose AgarTPA : Cao thịt – Pepton – AgarTSA : Tryptic Soy Agar

TSB : Triptic Soy Broth

VSV : Vi sinh vật

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Lượng VSV trong đất xác định theo chiều sâu đất 4Bảng 3.1 Số lượng và hình dạng khuẩn lạc vi sinh vật có trong đấttrồng rau 29Bảng 3.2 Thành phần vi sinh vật ở các mẫu đất quan sát dưới kính hiển vi 32

Bảng 3.3 Bảng theo dõi kết quả nhân sinh khối nấm Trichoderma sau 48h,

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Hình thái vi khuẩn Bacillus 16

Hình 2.1 Phương pháp pha loãng mẫu hệ thập phân 22

Hình 2.2 Cách cấy truyền trên môi trường thạch đĩa 25

Hình 3.1 Khuẩn lạc vi sinh vật sau khi vào mẫu 31

Hình 3.2 Khuẩn lạc Trichoderma qua các lần cấy chuyển 33

Hình 3.3 Khuẩn lạc và bào tử nấm Trichoderma trên MT thạch đĩa 34

Hình 3.4 Bào tử nấm Trichoderma soi trên kính hiển vi 34

Hình 3.5 Giữ giống nấm Trichoderma trong ống nghiệm 35

Hình 3.6 Chủng thuần vi khuẩn Bacillus trên môi trường thạch đĩa và nhuộm Gram soi dưới kính hiển vi 35

Hình 3.7 Giữ giống vi khuẩn Bacillus trong ống nghiệm 36

Hình 3.8 Nấm Trichoderma nhân sinh khối lần 1 38

Hình 3.9 Nấm Trichoderma nhân sinh khối lần hai sau 48h nuôi cấy 38

Hình 3.10 Vi khuẩn Bacillus trong môi trường lỏng nuôi lắc sau 24h (1) và 48h (2) 39

Hình 3.11 Khuẩn lạc vi khuẩn Bacillus 40

Hình 3.12 Đường kính khuẩn lạc vi khuẩn Bacillus sau 24h và 48h 41

Hình 3.13 Nấm thối hạch cải bắp (A) và nấm Trichoderma (B) 42

Hình 3.14 Nấm Trichoderma đối kháng với nấm bệnh 43

Hình 3.15 Khả năng phân giải cellulose của vi khuẩn Bacillus 44

Hình 3.16 Dịch nuôi sử dụng để bước đầu sản xuất chế phẩm Trichoderma .45 Hình 3.17 Bịch thóc sau 3 và 5 ngày cấy giống 46

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Rau là loại thực phẩm không thể thiếu trong bữa ăn hàng ngày của mỗingười Giá trị của rau được thể hiện nhiều mặt trong cuộc sống trong đó rausạch lại là vấn đề được nhiều người ưa chuộng Chất lượng của sản phẩm rauphụ thuộc vào nhiều yếu tố trong đó có vi sinh vật có nguồn gốc từ đất trồngrau Trong thực tế sản xuất xuất hiện tình trạng nhiều trường hợp rau mang yếu

tố gây hại trong đó có thuốc bảo vệ thực vật, sinh vật gây bệnh làm ảnhhưởng nghiêm trọng đến sức khỏe con người cũng như uy tín của nông sảnxuất khẩu Việt Nam ra thị trường quốc tế

Đất là môi trường trồng trọt chủ yếu trong sản xuất rau Thành phần

vi sinh vật trong đất không những ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm rau

mà còn chi phối hiệu quả của quá trình sản xuất Việc xác định thành phần

vi sinh vật trong đất trồng rau, xác định các đối tượng có hại để khống chế,đồng thời phát hiện và đánh giá mức độ có lợi của các vi sinh vật đối kháng

có thể sử dụng trong việc hạn chế bệnh hại là một phương hướng đang và sẽngày càng được chú ý

Xuất phát từ những vấn đề trên tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Xác định thành phần vi sinh vật có trong đất trồng rau, phân lập, nhân nuôi và đánh giá hiệu quả của một số vi sinh vật có lợi trong việc hạn chế bệnh hại rau tại địa bàn huyện Việt Yên tỉnh Bắc Giang”.

2 Mục tiêu nghiên cứu

2.2 Mục tiêu cụ thể

- Xác định được thành phần VSV có trong đất trồng rau;

- Phân lập và nuôi cấy vi sinh vật có ích;

- Bước đầu sản xuất chế phẩm vi sinh vật đối kháng sử dụng cho việcphòng trừ bệnh hại trên cây rau

3 Nội dung nghiên cứu

- Lấy mẫu đất phân tích xác định thành phần vi sinh vật trong đấttrồng rau

- Phân lập tạo chủng thuần và nuôi cấy vi sinh vật có ích

- Bước đầu sản xuất chế phẩm vi sinh vật đối kháng

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

4.1 Ý nghĩa khoa học

Cung cấp, bổ sung dữ liệu vào kết quả nghiên cứu về thành phầnsinh vật trong đất đối với một số loại đất trồng rau

4.2 Ý nghĩa thực tiễn

- Xác định các vi sinh vật gây hại và các vi sinh vật có lợi (vi sinhvật đối kháng) trong một số loại đất trồng rau là cơ sở để khuyến cáo chophòng trừ bệnh hại nhằm tăng năng suất và chất lượng rau

- Bước đầu tạo ra một số chế phẩm sinh học cho việc phòng trừ bệnhhại rau, hạn chế việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật hóa học

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Môi trường đất và sự phân bố của VSV trong đất

1.1.1 Môi trường đất

Theo tác giả Lê Xuân Phương (2008), môi trường đất là một hệ sinhthái phức tạp được hình thành qua nhiều quá trình sinh học, vật lý và hoáhọc Nó bao gồm các nhóm sinh vật sống trong đất, có quan hệ tương hỗ lẫnnhau dưới tác động của môi trường sống, có sự trao đổi vật chất và nănglượng Trong hệ sinh thái đất vi sinh vật đóng vai trò quan trọng, chúngchiếm đại đa số về thành phần cũng như số lượng so với các sinh vật khác

Đất là môi trường thích hợp nhất đối với vi sinh vật, bởi vậy nó là nơi cưtrú rộng rãi nhất của vi sinh vật, cả về thành phần cũng như số lượng so với cácmôi trường khác Sở dĩ như vậy vì trong đất nói chung và trong đất trồng trọtnói riêng có một khối lượng lớn chất hữu cơ Đó là nguồn thức ăn cho cácnhóm vi sinh vật dị dưỡng, ví dụ như nhóm vi sinh vật các hợp chất cácbon hữu

cơ, nhóm vi sinh vật phân huỷ các hợp chất Nitơ hữu cơ Các chất vô cơ cótrong đất cũng là nguồn dinh dưỡng cho các nhóm vi sinh vật tự dưỡng Đó làcác nhóm phân huỷ các chất vô cơ, chuyển hoá các chất hợp chất S, P, Fe

Mức độ thoáng khí của đất cũng là một điều kiện ảnh hưởng đến sựphân bố của vi sinh vật Các nhóm háo khí phát triển ở nhiều nơi có nồng

độ ôxy cao Những nơi yếm khí, hàm lượng oxy thấp thường phân bố nhiềuloại vi sinh vật kị khí

Độ ẩm và nhiệt độ trong đất cũng ảnh hưởng đến sự phát triển của visinh vật đất Đất vùng nhiệt đới thường có độ ẩm 70 - 80% và nhiệt độ

200C – 300C Đó là nhiệt độ và độ ẩm thích hợp với đa số vi sinh vật

1.1.2 Sự phân bố vi sinh vật trong đất và mối quan hệ giữa các nhóm vi sinh vật

1.1.2.1 Sự phân bố của vi sinh vật trong đất

Các nhóm vi sinh vật chính cư trú trong đất bao gồm: Vi khuẩn, Vinấm, Xạ khuẩn, Virus, Tảo, Nguyên sinh động vật Trong đó vi khuẩn lànhóm chiếm nhiều nhất về số lượng

Số lượng và thành phần vi sinh vật trong đất thay đổi khá nhiều Thứnhất là số lượng và thành phần vi sinh vật trên bề mặt đất rất ít do ngay trên

bề mặt đất độ ẩm không phải là thích hợp cho vi sinh vật phát triển, thứ hai

là bề mặt đất bị mặt trời chiếu rọi nên vi sinh vật bị tiêu diệt

Số lượng và thành phần vi sinh vật trong đất còn thay đổi tùy chấtđất, ở nơi đất nhiều chất hữu cơ, giàu chất mùn có độ ẩm thích hợp vi sinhvật phát triển mạnh Lợi dụng sự có mặt của vi sinh vật trong đất mà người

ta phân lập, tuyển chọn, đồng thời duy trì những chuyển hoá có lợi phục vụcho cuộc sống (Lê Xuân Phương, 2008)

Bảng 1.1 Lượng VSV trong đất xác định theo chiều sâu đất

Chiều sâu đất (cm) Vi khuẩn Xạ khuẩn Nấm mốc Rong tảo

phát triển của vi sinh vật lại chính là nhân tố làm cho đất thêm phì nhiêu,màu mỡ.

Bởi vậy, khi đánh giá độ phì nhiêu của đất phải tính đến thành phần

và số lượng vi sinh vật Nếu chỉ tính đến hàm lượng chất hữu cơ thì khógiải thích được tại sao ở một vùng đất chiêm trũng hàm lượng chất hữu cơ,chất mùn, đạm, lân đều cao mà cây trồng phát triển lại kém Đó là do điềukiện yếm khí của đất hạn chế các loại vi sinh vật hiếm khí phát triển làmcho các chất hữu cơ không được phân giải Các dạng chất khó tiêu đối vớicây trồng không được chuyển thành dạng dễ tiêu Các chất độc tích luỹtrong đất trong quá trình trao đổi chất của cây cũng không được phân giảinhờ vi sinh vật, gây ảnh hưởng xấu đến cây trồng Sự phân bố của vi sinhvật trong đất có thể chia ra theo các kiểu phân loại sau đây:

* Phân bố theo chiều sâu:

Quần thể vi sinh vật thường tập trung nhiều nhất ở tầng canh tác Đó

là nơi tập trung rễ cây, chất dinh dưỡng, có cường độ chiếu sáng, nhiệt độ,

độ ẩm thích hợp nhất Số lượng vi sinh vật giảm dần theo tầng đất, càngxuống sâu càng ít vi sinh vật

Riêng đối với đất bạc màu, do hiện tượng rửa trôi, tầng 0 - 20 cm ítchất hữu cơ hơn tầng 20 - 40cm Bởi vậy ở tầng này số lượng vi sinh vậtnhiều hơn tầng trên Sau đó giảm dần ở các tầng dưới

* Phân bố theo các loại đất:

Các loại đất khác nhau có điều kiện dinh dưỡng, độ ẩm, độ thoángkhí, pH khác nhau Bởi vậy sự phân bố của vi sinh vật cũng khác nhau Ởđất lúa nước các loại vi sinh vật kị khí phát triển mạnh Ở đất trồng màu,không khí lưu thông tốt, quá trình ôxy hoá chiếm ưu thế, các loài sinh vậtháo khí phát triển mạnh, vi sinh vật yếm khí phát triển yếu

Ở đất giàu chất dinh dưỡng như phù sa sông Hồng, số lượng vi sinhvật tổng số rất cao Ngược lại, vùng đất bạc màu Hà Bắc có số lượng visinh vật ít nhất

* Phân bố theo cây trồng:

Đối với tất cả các loại cây trồng, vùng rễ cây là vùng vi sinh vật pháttriển mạnh nhất so với vùng không có rễ vì rễ cây cung cấp một lượng lớnchất hữu cơ khi nó chết đi Khi còn sống, bản thân rễ cây cũng thườngxuyên tiết ra các chất hữu cơ làm nguồn dinh dưỡng cho vi sinh vật Rễ câycòn làm cho đất thoáng khí, giữ được độ ẩm Tuy nhiên, mỗi loại cây trồngtrong quá trình sống của nó thường tiết qua bộ rễ những chất khác nhau Bộ

rễ khi chết đi cũng có thành phần các chất khác nhau Thành phần và sốlượng các chất hữu cơ tiết ra từ bộ rễ quyết định thành phần và số lượng visinh vật sống trong vùng rễ đó

Số lượng và thành phần vi sinh vật cũng thay đổi theo các giai đoạnphát triển của cây trồng Ở đất vùng phù sa sông Hồng, số lượng vi sinh vậtđạt cực đại ở giai đoạn lúa hồi nhanh, đẻ nhánh, giai đoạn này là cây lúasinh trưởng mạnh Bởi vậy thành phần và số lượng chất hữu cơ tiết qua bộ

rễ cũng lớn, đó là nguồn dinh dưỡng cho vi sinh vật vùng rễ Số lượng visinh vật đạt cực tiểu ở thời kỳ lúa chín Thành phần vi sinh vật cũng biếnđộng theo các giai đoạn phát triển của cây phù hợp với hàm lượng các chấttiết qua bộ rễ

1.1.2.2 Mối quan hệ giữa các nhóm vi sinh vật trong đất

Dựa vào tính chất của các loại quan hệ giữa các nhóm vi sinh vậtchia làm 4 loại quan hệ: ký sinh, cộng sinh, hỗ sinh và kháng sinh (LêXuân Phương, 2008)

* Quan hệ hỗ sinh:

Quan hệ hỗ sinh là quan hệ hai bên cùng có lợi nhưng không nhấtthiết phải có nhau mới sống được như quan hệ cộng sinh Quan hệ nàythường thấy trong sự sống của vi sinh vật vùng rễ

* Quan hệ kháng sinh:

Quan hệ kháng sinh là mối quan hệ đối kháng lẫn nhau giữa hai nhóm visinh vật Loại này thường tiêu diệt loại kia hoặc hạn chế quá trình sống của nó

1.1.3 Mối quan hệ giữa đất, vi sinh vật và thực vật

1.1.3.1 Quan hệ giữa đất và vi sinh vật đất

Trong quá trình phân giải chất hữu cơ, nấm mốc và xạ khuẩn pháttriển một hệ khuẩn ti khá lớn trong đất Khi nấm mốc và xạ khuẩn chết đi,

vi khuẩn phân giải chúng tạo thành các chất dẻo có khả năng kết dính cáchạt đất với nhau Bản thân vi khuẩn chết đi và tự phân huỷ cũng tạo thànhcác chất kết dính Ngoài ra lớp dịch nhày bao quanh các vi khuẩn có vỏnhày cũng có khả năng kết dính các hạt đất với nhau

Genxe - một nhà nghiên cứu về kết cấu đã nhận xét rằng: khi bónvào đất những chất như Xenluloza và Protein thì kết cấu của đất được cảithiện Đó là do vi sinh vật phân giải xenluloza và protein đã phát triểnmạnh mẽ, các sản phẩm phân giải của chúng và các chất tiết trong quá trìnhsống của chúng đã liên kết các hạt đất với nhau tạo nên cấu trúc đất

Rudacop khi nghiên cứu về kết cấu đoàn lạp ở đất trồng cây họ đậu

đã kết luận rằng: Nhân tố kết dính các hạt đất trong đất trồng cây họ đậuchính là một sản phẩm kết hợp giữa axit galactorunic và sản phẩm tự dung

giải của vi khuẩn Clostridium polymyxa Axit galactorenic là sản phẩm của

thực vật được hình thành dưới tác dụng của enzym protopectinaza do vikhuẩn tiết ra Các chất kết dính tạo thành kết cấu đất còn được gọi là mùnhoạt tính Như vậy mùn không những là nơi tích luỹ chất hữu cơ làm nên

độ phì nhiêu của đất mà còn là nhân tố tạo nên kết cấu đất Sự hình thành

và phân giải mùn đều do vi sinh vật đóng vai trò tích cực Vì vậy các điều

kiện ngoại cảnh ảnh hưởng đến vi sinh vật cũng ảnh hưởng đến hàm lượngmùn trong đất Đặc biệt nước ta ở trong vùng nhiệt đới nóng ẩm, sự hoạtđộng của vi sinh vật rất mạnh ảnh hưởng rất lớn đến sự tích luỹ và phângiải mùn Các biện pháp canh tác như cày bừa, xới xáo, bón phân đều ảnhhưởng trực tiếp đến vi sinh vật và qua đó ảnh hưởng đến hàm lượng mùntrong đất.

1.1.3.2 Mối quan hệ giữa vi sinh vật và thực vật

Vi sinh vật sống trong vùng rễ có quan hệ mật thiết với cây, chúng

sử dụng những chất tiết của cây làm chất dinh dưỡng, đồng thời cung cấpchất dinh dưỡng cho cây qua quá trình hoạt động phân giải của mình Visinh vật còn tiết ra các vitamin và chất sinh trưởng có lợi đối với cây trồng.Bên cạnh đó có rất nhiều vi sinh vật gây bệnh cho cây, có những loại ứcchế sự sinh trưởng của cây, có những loại tàn phá mùa màng nghiêm trọng

Đó là mối quan hệ ký sinh của vi sinh vật trên thực vật Nhóm vi sinh vậtgây bệnh cây thuộc loại dị dưỡng, sống nhờ vào chất hữu cơ của thực vậtđang sống

Hàng năm bệnh cây đã gây thiệt hại to lớn cho sản xuất nông nghiệp

Vi sinh vật gây bệnh không chỉ làm giảm sản lượng mà còn làm giảm phẩmchất nông sản Vi sinh vật sử dụng các chất hữu cơ của cây bằng cách tiết

ra các loại men phân huỷ chúng Trong quá trình sống chúng tiết ra cácchất độc làm cây chết

Vi sinh vật gây bệnh có khả năng tồn tại trong đất hoặc trên tàn dưthực vật từ vụ này qua vụ khác dưới dạng bào tử hoặc các dạng tiềm sinhkhác gọi là nguồn bệnh tiềm tàng Từ nguồn bệnh tiềm tàng vi sinh vậtđược phát tán đi khắp nơi nhờ gió, nước mưa, dụng cụ lao động, động vật

và người, đặc biệt là qua côn trùng môi giới Qua các con đường đó nguồnbệnh lây lan sang các cây khoẻ và bắt đầu xâm nhiễm vào cây khi gặp điềukiện thuận lợi Các bào tử nằm trên bề mặt cây khi gặp độ ẩm và nhiệt độthích hợp sẽ nảy mầm và xâm nhập vào cây Sau khi xâm nhập vào cây

chúng bắt đầu sử dụng các chất của cây và tiết chất độc làm cây suy yếuhoặc chết Qua quá trình hoạt động của vi sinh vật cây bị thay đổi các quátrình sinh lý, sinh hoá, sau đó thay đổi về cấu tạo và hình thái tế bào cuốicùng là xuất hiện những triệu chứng bệnh như những đốm trên lá, trên thân.Nếu bệnh xuất hiện ở bó mạch thì biểu hiện triệu chứng héo lá, héo thân Sau một thời gian phát triển vi sinh vật bắt đầu hình thành cơ quan sinh sảnmọc ra ngoài bề mặt của cây và từ đó lại lan truyền đi.

Để tránh bệnh cho cây người ta dùng nhiều biện pháp hoá học, biệnpháp sinh vật học, biện pháp tổng hợp bảo vệ cây trồng Ngày nay người

ta hạn chế việc chống bệnh bằng hoá học vì biện pháp này thường phá hoại

sự cân bằng sinh thái, ô nhiễm môi trường Các biện pháp sinh học đangđược nghiên cứu và áp dụng ngày càng nhiều do những ưu điểm của nó Đó

là những biện pháp dùng vi sinh vật chống côn trùng hại cây

1.2 Vai trò của vi sinh vật trong đất

Cải thiện cấu trúc đất: khi bón vào đất những chất như Xenluloza vàProtein thì kết cấu của đất được cải thiện Đó là do vi sinh vật phân giảixenluloza và protein đã phát triển mạnh mẽ, các sản phẩm phân giải củachúng và các chất tiết trong quá trình sống của chúng đã liên kết các hạt đấtvới nhau tạo nên cấu trúc đất

Chuyển hóa dinh dưỡng trong phân bón cung cấp cho cây trồng: Khi

ta bón các loại phân hữu cơ và vô cơ vào đất, phân tác dụng nhanh haychậm đến cây trồng là nhờ hoạt động của vi sinh vật Vi sinh vật phân giảihữu cơ thành dạng vô cơ cho cây trồng hấp thụ, biến dạng vô cơ khó tiêuthành dễ tiêu

Vi sinh vật sống trong vùng rễ có quan hệ mật thiết với cây, chúng

sử dụng những chất tiết của cây làm chất dinh dưỡng, đồng thời cung cấpchất dinh dưỡng cho cây qua quá trình hoạt động phân giải của mình Visinh vật còn tiết ra các vitamin và chất sinh trưởng có lợi đối với cây trồng

Phân giải các chất hữu cơ trong đất: celluloze, lignin để tạo nên cácchất khoáng, mùn bổ sung cho đất.

Hoạt động của vi sinh vật, nhất là nhóm háo khí đã hình thành nênmột thành phần của mùn là axit humic Axit humic cùng với các axit mùnkhác có tác dụng kích thích sự phát triển của hệ rễ để hấp thu chất dinhdưỡng tốt hơn, cây sinh trưởng phát triển mạnh hơn Nếu được hấp thu trựctiếp qua lá chúng sẽ giúp tăng cường sự quang hợp của cây do kích thích sựhoạt động của các men tham gia trong quá trình quang hợp Cường độquang hợp mạnh cây sẽ sinh trưởng nhanh Ngoài ra axit humic còn làmtăng sức đề kháng của cây với sâu bệnh và các điều kiện bất lợi như nóng,rét, hạn, úng, chua phèn

Chuyển hóa các chất khó tan thành chất dễ tan giúp cây trồng hấpthụ dễ dàng: lân

Giải phóng các chất khoáng bị giữ chặt trong đất thành dạng cây hấpthụ dễ dàng: lưu huỳnh, sắt, Kali…

Cố định Nitơ trong không khí, chuyển hóa đạm thành dạng NH4+ vàN03- là dạng cây dễ hấp thu

1.3 Một số bệnh hại chủ yếu trong đất trồng rau

1.3.1 Bệnh chết yểu cây con

Là bệnh rất phổ biến và chung cho các loại rau, bệnh làm ảnh hưỏngđến độ nảy mầm của hạt và cây con trước khi nhổ ra trồng Bệnh thưòng có 2giai đoạn: cây con bị chết trong các vườn ươm và cây đổ gục bất kỳ lúc nào.Bệnh xuất hiện khi độ ẩm đất cao, nhiệt độ không khí 24 – 280C Bệnh do các

loại nấm gây ra như: Pythium spp; Phytophthora spp; Rhizoctonm… Bệnh lây

truyền qua đất, tàn dư cây trồng, nước tưới, nước mưa

Phòng trừ bệnh bằng cách: tránh trồng cây quá dày và che bóng;trước khi trồng phải phơi ải đất, đốt tàn dư cây; bón phân hợp lý; tẩy mầmbệnh bằng formaldehyt pha loãng 50 lần với nước; xử lý đất vối thuốc diệtnấm Vitavac 200…

1.3.2 Thối hạch cải bắp

Bệnh do nấm Sclerotinia sclerotiorum gây ra, bệnh hại trên nhiều

cây trồng hai lá mầm (lá rộng) bao gồm cà chua và khoai tây, xà lách, đậutương, lạc, đậu cô ve lùn, đậu cô ve leo, cải bắp, súp lơ xanh, súp lơ trắng

và bầu bí

Trên cải bắp: Cây con bị bệnh, gốc thân sát mặt đất bị thối nhũn làmcây chết gục đổ trên ruộng Trên cây lớn, vết bệnh thường bắt đầu từ các lágià sát mặt đất và gốc thân

Ở trên thân vết bệnh lúc đầu có màu vàng nâu, nếu trời ẩm ướt chỗ bịbệnh dễ bị thối nhũn nhưng không có mùi thối, nếu trời khô hanh, chỗ bịbệnh khô teo có màu nâu nhạt Khi cắt ngang thân thấy lớp vỏ và lớp gỗ cómàu nâu sẫm Cuống lá và phiến lá bị bệnh có màu trắng ủng nước, thườnglan từ rìa mép lá vào trong Khi trời ẩm ướt lá bệnh dễ bị thối, rách nát, các

lá khác bị vàng dần

Bệnh lan rộng lên bắp đang cuốn làm bắp cải thối từ ngoài vào trong,dần dần cây chết khô trên ruộng Đặc biệt trên bề mặt hình thành lớp nấmmàu trắng xen lẫn nhiều hạch nấm màu đen nâu hình dạng không đều bámchặt trên đó Đến giai đoạn này bắp cải rất dễ bị gục đổ trên ruộng

Nấm bệnh thường phát triển ở nhiệt độ 17 - 250C Nguồn gốc lâybệnh ban đầu là đất và các cây chủ mang bệnh Các hạch nấm có thể lantruyền cùng hạt giống

Phòng trừ bằng cách luân canh cây họ Cải với cây họ Đậu và họ Lúa;chỉ lấy hạt ở những cây khỏe mạnh Không nên trồng dày, xới xáo kịp thờinhất là sau khi tưới; bón đầy đủ phân, tăng cường bón kali Thu dọn tàn dưcây sau khi thu hoạch Cày sâu phơi ải đất

1.3.3 Thối khô củ khoai tây

Bệnh do nấm Fusarium gây ra, thường gặp trên củ khoai tây đang cất

giữ Trên củ xuất hiện các vết nâu hay vết màu tro hơi lõm Thịt củ lúc mớichớm bệnh màu nâu khô Kích thước vết bệnh tăng dần, da nhăn nheo, mặt

ngoài củ có đám nấm hơi nổi lên, màu xám trắng có khi màu vàng hoặchồng Nếu cất giữ khoai tây nơi khô ráo, củ dần dần khô, trọng lượng giảm,

da nhăn nheo Nấm lan truyền bằng các sợi nấm, ở nhiệt độ 17 – 25°C với

ẩm độ 70% Củ khoai bị bệnh không mọc được, nếu có mọc cũng tạo ra cáccây yếu ớt

Phòng trừ bằng cách chọn củ không mang mầm bệnh; phơi thật khô

vỏ củ trước khi cất; tăng cường bón phân và bón đủ phân

1.3.4 Bệnh héo lá, thối cuống

Bệnh gây ra do Fusarium oxysporum và Scirerotium rolfsii gây hại

đến 90% ở các loại cà, cà chua, khoai tây và các loại rau khác như bắp cải,súp lơ… làm cho lá bị héo, thối cuống quả Bệnh lây truyền qua hạt, tàn dưcây vụ trước, đất, nước tưới, nước mưa

Phòng trừ bằng cách dọn sạch cỏ, tàn dư cây vụ trước Áp dụng cácbiện pháp tổng hợp: chọn cây khỏe từ ruộng sạch bệnh; luân canh cây khác

họ, chế độ tưới hợp lý, tránh cho nước vào rãnh

1.3.5 Bệnh thán thư

Bệnh do nấm Gleosporium và Colktotrichum gây ra Biểu hiện trên

lá xuất hiện vết đốm tròn xung quanh có viền nâu đỏ Vết đốm có thể nứt

ra, lõm sâu trên thân, trên quả

Phòng trừ bệnh bằng cách vệ sinh nơi trồng, đốt tàn dư cây vụ trước;luân canh cây trồng; trồng các giống kháng bệnh; xử lý hạt giống bằngthuốc trừ bệnh trước khi gieo trồng Phun thuốc nhóm cacbanat nhưBavistin, Zineb 80 WP… Topsin 50 WP

1.3.6 Bệnh sương mai (mốc sương)

Bệnh do các loài nấm mốc gây ra Trên mặt lá xuất hiện các đốmnấm màu nâu xám, thường gặp trong những ngày có sương mù Gặp ở càchua, khoai tây, cần tây

Phòng trừ bệnh sương mai bằng cách tỉa cành, nhánh, lá gốc Khixuất hiện bệnh thì phun Boocđô 1%; có thể dùng một số loại thuốc khác

như Zineb 80 WP, Alitte 80 WP (theo liều lượng và thời gian cách ly ghitrên bao bì của từng loại thuốc)

1.3.7 Bệnh héo lá xanh vi khuẩn

Bệnh do vi khuẩn Pseudomonas gây ra, làm cây đột nhiên héo rũ, lá

vẫn còn màu xanh Nếu cắt ngang thân cây cho vào cốc nước trong, mộtlúc sau thấy dịch trắng chảy ra Bệnh xuất hiện khi độ ẩm cao, ấm Bệnhthường gặp ở cà chua sớm

Khi thấy bệnh xuất hiện hạn chế tưới nước, nhổ bỏ cây bệnh, dùngvôi bột rắc quanh gốc cây Để phòng bệnh héo xanh có thể trồng cà chuatrên gốc ghép cà tím để tăng khả năng chịu nóng, giảm bệnh héo cho càchua sớm, cần luân canh cà chua với lúa nước

1.4 Vai trò của một số vi sinh vật có ích hiện diện trong đất

1.4.1 Khả năng kiểm soát bệnh cây của nấm Trichoderma

Trichoderma có tên đầy đủ là Trichoderma spp, thường sống trong

đất tập trung nhiều ở khu vực rễ cây Chủng nấm này có đến 33 loài, hầuhết đều có lợi cho cây trồng Một số giúp cố định đạm trong đất, số khácphân giải lân hoặc tấn công tiêu diệt các loài nấm bệnh gây hại cho cây

trồng Do tính chất đối kháng với nấm bệnh, nên nấm Trichoderma còn được gọi là “Nấm đối kháng Trichoderma”.

Đặc tính sinh trưởng: Trichoderma sinh sản vô tính theo cấp số nhân,

sinh trưởng mạnh mẽ với nhiệt độ từ 25 – 300C, tồn tại trên môi trườngthuận lợi khoảng 18 tháng Có thể bị huỷ diệt dưới ánh nắng kéo dài trong 2giờ với nhiệt độ cao và trời mưa nhiều ngày (Elad và ctv, 1983)

* Cơ chế hoạt động: Cơ chế tiết men (enzyme), đây là cơ chế quan

trọng giúp Trichoderma đối kháng hiệu quả với các loại nấm gây bệnh.

Nấm Trichoderma có khả năng kích thích sự sinh trưởng của cây trồng Trichoderma bám vào những vùng rễ cây như những sinh vật cộng sinh khác,

sự đeo bám này mang lại lợi ích cho cả cây trồng lẫn Trichoderma Nó tiết ra

đất những chất kích thích để rễ cây ăn sâu xuống lòng đất, làm cho rễ khoẻ

hơn và tăng khả năng hút dinh dưỡng, tăng khả năng phòng vệ, tạo thành mộtlớp măng - sông bảo vệ vùng rễ cây tránh sự xâm nhập của mầm bệnh của các

loại nấm bệnh, làm giảm khả năng nhiễm bệnh nhờ Trichoderma bám vào các

đầu rễ cây, tăng khả năng ra hoa, thụ phấn, tăng trọng lượng quả và chiều caocủa cây, làm tăng năng suất cây trồng…

Trichoderma còn cung cấp cho đất một lượng N cho cây dưới dạng

nitrat, aminonium và các nguồn đạm hữu cơ mà đặc biệt là amino acit, P(lân), tham gia vào thành phần cấu trúc, phân hủy cellulose, phân giải lânchậm tan

* Tác dụng của nấm Trichoderma trong nông nghiệp

- Tăng cường hệ vi sinh vật có ích trong đất và có lợi cho cây (vi sinhvật cố định đạm, phân giải lân), ức chế và cô lập các vi sinh vật gây hại

- Một số chủng Trichoderma còn tiết ra enzym giúp phân hủy mùn,

rễ cây, xác bã động thực vật, tăng cường hàm lượng chất hữu cơ trong đấtgiúp chuyển hóa thành các dạng chất mà cây có thể hấp thu được (J F.Walter and A S Paau, 1996)

- Trichoderma có cơ chế sinh ra các “kháng thể” được cây truyền đi

khắp các bộ phận, giúp tiêu diệt nấm hại ở cả lá, cành cây, ngọn cây,quả… mà không cần tiếp xúc

- Nấm Trichoderma tiết ra enzym có tác dụng phá hủy vỏ tế bào, sau đó hấp thu dinh dưỡng, tiêu diệt các loài nấm có hại như Rhizoctonia solani, Fusarium solani, Phytophtora, Sclerotium rolfsii… Phòng ngừa

tình trạng xì mủ, vàng lá, thối rễ, chết chậm trên đối tượng (cam, quýt,bưởi, sầu riêng, tiêu, chè, cà phê )

- Ngăn ngừa hiện tượng chạy dây, thối rễ, lỡ cổ rễ, thối thân (dưa leo,dưa hấu, cà chua, ớt, bắp cải…) (Chang và ctv, 1986; World J G, 2013)

- Sản sinh kích tố (hoocmôn) thực vật, giúp cây tăng trưởng tốt, khoẻmạnh Làm thay đổi bộ mặt của đất, tạo mầu mỡ trù phú cho những vùng đất

bị hoá chất, sức nóng, hạn hán, lụt lội, đất nghèo, lạnh và sương mù gây hại

- Trong quá trình ủ phân chuồng, ủ phân hữu cơ từ xác động thực

vật, việc trộn chung Trichoderma vào thành phần ủ giúp giảm mùi hôi,

đẩy nhanh tiến trình phân giải, tiết kiệm được thời gian ủ phân

- Giúp tăng năng suất mùa màng và chống chịu stress

- Có thể kết hợp với biolactyl, subtyl… để tổng hợp nên các chếphẩm sinh học khác

* Kết quả ứng dụng khả năng kiểm soát bệnh cây của nấm

Trichoderma:

Rất nhiều giống Trichoderma có khả năng kiểm soát tất cả các loài

nấm gây bệnh khác Tuy nhiên một số giống thường có hiệu quả hơn nhữnggiống khác trên một số bệnh nhất định Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy,

nấm Trichoderma giết nhiều loại nấm gây thối rễ chủ yếu như: Pythium, Rhizoctonia và Fusarium (Bemtez, 2004; Wilson, 2011) Quá trình đó được gọi là: ký sinh nấm (mycoparasitism) Trichoderma tiết ra một enzym làm

tan vách tế bào của các loài nấm khác Sau đó nó có thể tấn công vào bêntrong loài nấm gây hại đó và tiêu diệt chúng Sự kết hợp này cho phép nóbảo vệ vùng rễ của cây trồng chống lại các loại nấm gây thối rễ trên câytrồng (Chang và ctv, 1986; World J G, 2013)

Theo kết quả nghiên cứu của Trần Ngọc Hùng và Nguyễn Thị LiênThương (2015), các tác giả phân lập mẫu đất từ các khu vực trồng rau

màu tại Bình Dương, trong số 16 chủng Trichoderma sp phân lập được sau 5 ngày nuôi cấy, chủng Trichoderma koningii T2.2, T4 và T5.1 có khả năng đối kháng đạt hiệu quả 100% với 5 chủng Colletotrichum sp Tạo chế phẩm từ Trichoderma sp và thử nghiệm trên đồng ruộng để kiểm soát bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp gây ra trên cây ớt (capsicum frutescens) Sau 4 tháng thử nghiệm, chế phẩm bào tử Trichoderma có

khả năng hạn chế bệnh thán thư trên cây ớt lên đến 58,4% so với khi sửdụng các sản phẩm phòng trị bệnh khác

1.4.2 Vi khuẩn Bacillus đối kháng với vi sinh vật gây bệnh cây

* Đặc điểm phân bố

Vi khuẩn Bacillus được phân bố hầu hết trong tự nhiên như cỏ khô,

bụi, đất, nước Phần lớn chúng tồn tại trong đất, thông thường đất trồng trọtchứa khoảng 10 - 100 triệu CFU/g Đất nghèo dinh dưỡng ở sa mạc, đất

hoang thì Bacillus rất hiếm Nước và bùn ở cửa sông cũng như nước biển có

sự tồn tại của bào tử và tế bào sinh dưỡng vi khuẩn Bacillus.

* Đặc điểm hình thái

(http://

en.wikipedia.org/wiki/Sporulation)

Hình 1.1 Hình thái vi khuẩn Bacillus

Vi khuẩn Bacillus có dạng trực khuẩn nhỏ và ngắn, hai đầu tròn, bắt

màu Gram dương, kích thước 0,5 - 0,8 µm x 1,5 - 3 µm, thường đứng đơn lẻhoặc tạo thành chuỗi ngắn Vi khuẩn có khả năng di động, có từ 8 - 12 chiênmao, sinh bào tử nhỏ hơn tế bào sinh dưỡng, kích thước 0,9 - 0,6 µm Vị trícủa bào tử trong tế bào sinh dưỡng không theo một nguyên tắc chặt chẽ nào,

có thể lệch tâm hoặc gần tâm nhưng không chính tâm (trích dẫn bởi NguyễnLân Dũng,1983)

* Đặc điểm nuôi cấy

- Điều kiện nuôi cấy: hiếu khí, nhiệt độ tối ưu 370C

- Nhu cầu Oxi: Bacillus là vi khuẩn hiếu khí nhưng có khả năng phát

triển trong môi trường thiếu oxy

- Độ pH: Bacillus thích hợp nhất với pH = 7 - 7,4

- Trên môi trường thạch đĩa TSA: khuẩn lạc dạng tròn, rìa răng cưakhông đều, có tâm sẩm màu, phát triển chậm, màu vàng xám, đường kính 3– 5 mm Sau 1 - 4 ngày bề mặt nhăn nheo, màu hơi sẩm

- Trên môi trường thạch nghiêng TSA: dễ mọc, tạo thành màu hơixám, rìa gợn sóng

- Môi trường canh TSB: Bacillus phát triển làm đục môi trường, tạo

màng nhăn trên bề mặt môi trường canh, lắng cặn kết lại như vẩn mây ởđáy, khó tan đều khi lắc lên

- Dinh dưỡng: cần các nguyên tố C, H, O, N và các nguyên tố khác

* Tính chất đối kháng của Bacillus với vi sinh vật gây bệnh cây

Bacillus là một tác nhân sinh học đầy tiềm năng trong việc phòng trừbệnh hại cây trồng Chúng có khả năng đối kháng các loại vi nấm gây bệnhvới phổ tác động rộng, khống chế và tiêu diệt một số loại vi sinh vật gâybệnh cho cây trồng bởi các chức năng sinh học chuyên biệt của chúng,không gây hại cho con người và cây trồng Trong các vi sinh vật đối kháng,

vi khuẩn Bacillus được chứng minh có khả năng đối kháng với nhiều loại

nấm như: Rhizoctonia, Sclerotinia, Fusarium, Pythium và Phytopthora và

một số vi khuẩn khác nhờ vào khả na ̆ng sinh ra các chất kháng sinh (LêĐức Mạnh và ctv, 2003; Nguyễn Va ̆n Thanh, Nguyễn Thu Hoa, 2005;Nguyễn Xuân Thành và ctv, 2003; Võ Thị Thứ, 1996)

Thay đổi môi trường hoặc các yếu tố môi trường bất lợi tức là thayđổi điều kiện sống sẽ hạn chế hoặc ức chế sự phát triển của vi sinh vật

Thực tế, khi môi trường nuôi cấy nấm bệnh có sự hiện diện của Bacillus

với một số lượng lớn sẽ xảy ra sự cạnh tranh chất dinh dưỡng, cạnh tranhkhông gian giữa vi khuẩn và nấm Do vi khuẩn phát triển nhanh hơn sẽ sửdụng phần lớn các chất dinh dưỡng trong môi trường, đồng thời tạo ra một

số loại kháng sinh nên sự sinh trưởng của nấm bị ức chế (Nguyễn LânDũng và Hoàng Đức Nhuận, 1976, trích dẫn Lý Kim Hữu, 2005)

Phương thức diệt nấm và các tác nhân gây bệnh của vi khuẩn

Bacillus như sau:

- Đầu tiên vi khuẩn Bacillus tạo thành khối xung quanh tác nhân gây

bệnh ngăn chặn không cho chúng bám vào vật chủ để gây bệnh

- Sau đó Bacillus tiết ra hỗn hợp gồm nhiều lipopeptid để làm thủng

vách tế bào và màng tế bào chất của tác nhân gây bệnh do đó ngăn chặn sựphát triển của chúng

- Ngoài nấm gây bệnh ra thì Bacillus cũng đối kháng với vi khuẩn gây bệnh như Escherichia coli Khi nuôi cấy chung trên môi trường TSB thì Bacillus có khả năng tổng hợp một số chất kháng sinh nên sẽ ức chế quá trình sinh trưởng và phát triển của Escherichia coli (trích dẫn bởi Nguyễn

Huỳnh Nam, 2006)

* Khả năng chuyển hóa các chất hữu cơ khó phân hủy trong đất

của vi khuẩn Bacillus

Vi khuẩn Bacillus tham gia vào quá trình chuyển hóa các chất hữu cơ

khó phân hủy thành những chất hữu cơ đơn giản cho cây trồng dễ sử dụng,giúp cải tạo đất

Theo tác giả Đinh Hồng Duyên và cs (2017), phân lập và tuyển chọn

vi khuẩn từ 300 mẫu phế phụ phẩm sau thu hoạch quả vải, mẫu đất trồng vàmẫu mùn đất Đã phân lập được 98 chủng vi khuẩn phân giải cellulose vàxác định được hai chủng vi khuẩn V19 và V98 có hoạt tính cellulase,amylase, protease cao; có khả năng sinh trưởng và thể hiện các hoạt tínhenzyme ngoại bào tốt trên môi trường nuôi cấy, ở các điều kiện pH, nhiệt

độ khác nhau Kết quả định tên V19 thuộc loài Bacillus cereus, là nhóm an toàn bậc 2; V98 thuộc loài Bacillus toyonensis, là nhóm an toàn bậc 1.

1.4.3 Xạ khuẩn đối kháng nấm bệnh cây

Streptomyces là xạ khuẩn sống ở trong đất, có vai trò là vi sinh vật

phân hủy rất quan trọng Một trong những đặc điểm quan trọng nhất là xạkhuẩn có khả năng hình thành kháng sinh Các chất kháng sinh có nguồn

Trong số các tác nhân sinh học thường được sử dụng để ức chế visinh vật gây bệnh, xạ khuẩn là nhóm có nhiều tiềm năng nhất vì có khảnăng sinh chất kháng sinh cao, trong đó có nhiều chất kháng sinh kháng

nấm mạnh Xạ khuẩn, đặc biệt là các loài thuộc chi Streptomyces được xem

là nguồn sản xuất chất kháng sinh nhiều nhất (Qin et al., 1994) Chotới nay, trong khoảng hơn 8.000 chất trong kháng sinh được biết trên thếgiới, 80% là do xạ khuẩn sinh ra (Dhanasekaran et al., 2012) Vì vậy, việctìm kiếm các chủng xạ khuẩn có khả năng sinh chất kháng sinh kháng nấm

bệnh cây (Fusarium spp., Phytophthora spp., Botryosphaeria spp., Sclerotium hydrophylum) có thể góp phần vào công tác bảo vệ cây trồng

và xây dựng nền nông nghiệp an toàn và bền vững

Việc ứng dụng các xạ khuẩn Streptomyces để đối kháng với nấm

bệnh cây đang rất có triển vọng do xạ khuẩn có khả năng đối kháng mạnhthông qua việc tiết ra các sản phẩm hữu cơ đa dạng (Shimizu et al., 2008)

Theo kết quả nghiên cứu của Lê Thị Hiền và cs (2014) phân lập và

tuyển chọn các chủng xạ khuẩn (streptomyces spp) đối kháng nấm bệnh

cây từ các mẫu đất khác nhau tại các địa điểm Hà Nội, Hưng Yên, ĐàNẵng, Vĩnh Phúc, Bắc Giang, Thái Bình, Nghệ An và Gia Lai Từ 8 mẫuđất khác nhau, đã phân lập và làm thuần được 43 chủng xạ khuẩn Trong số

đó có 16 chủng đối kháng nấm Fusarium oxysporum, 11 chủng đối kháng nấm Botryosphaeria dothidea; 3 chủng đối kháng nấm Phytophthora capsici và 4 chủng đối kháng nấm Sclerotium hydrophylum.

Đã tuyển chọn được 2 chủng xạ khuẩn HN6 và NA1 có hoạt tính khángnấm mạnh nhất Khảo sát khả năng sinh trưởng trên môi trường Gause Icho thấy HN6 và NA1 có khả năng sinh trưởng tốt ở nhiệt độ 300C, pHtrung tính, đồng thời, chúng có khả năng chịu nhiệt độ, nồng độ muốitương đối cao Khảo sát khả năng sinh trưởng trên môi trường ISP 9 chothấy HN6 và NA1 có khả năng sử dụng các nguồn đường khác nhau: D -glucose, saccarose, D - xylose, rhamnose, raffinose Bước đầu đã xác định

được chủng HN6 thuộc loài Streptomyces roseosporus, chủng NA1 thuộc loài Streptomyces albofaciens.

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Một số VSV (vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm) có trong đất trồng rau:

- Su hào thuộc địa bàn thôn Vàng xã Bích Sơn huyện Việt Yên tỉnhBắc Giang;

- Cải bắp thuộc địa bàn thôn Đồng Niên xã Tự Lạn huyện Việt Yêntỉnh Bắc Giang;

- Khoai tây thuộc địa bàn thôn Xuân Lâm xã Tự Lạn huyện Việt Yêntỉnh Bắc Giang;

Một số chủng VSV có lợi trong số VSV kể trên;

Chủng nấm gây bệnh thối hạch cải bắp do Trung tâm Công nghệSinh học cung cấp

2.1.2 Dụng cụ - thiết bị

Nồi hấp khử trùng , cân phân tích, máy chuẩn độ pH, tủ ấm, tủ lạnh

40C, box cấy, tủ lắc ấm, lò vi sóng, máy đếm khuẩn lạc, kính hiển vi

Ngoài ra, còn một số dụng cụ và thiết bị khác tại phòng thí nghiệmTrung tâm Công nghệ Sinh học – Khoa Nông học – Trường Đại học Nông -Lâm Bắc Giang được sử dụng để tiến hành thí nghiệm Tất cả các dụng cụ bằng

sứ, thủy tinh, nhựa đều được hấp khử trùng trước khi đưa vào sử dụng

2.1.3 Hóa chất

- Đường: Glucose

- Các loại muối: K2HPO4, KNO3, NaCl, FeSO4 7H2O,

- Các loại cao: cao thịt, cao nấm men, peptone

- Nguồn cơ chất khác: Tinh bột tan (bột ngô, bột mì), dịch chiếtkhoai tây

2.1.4 Môi trường nuôi cấy

Môi trường PDA (Potato Dextrose Agar)(g/l): Khoai tây - 200;

Môi trường TPA (Cao thịt – Pepton – Agar)(g/l): Cao thịt - 5;

pepton - 10; NaCl - 5; Agar - 12; pH = 7,4

Môi trường Gause – I (g/l): Tinh bột tan - 20; K2HPO4 - 0,5; KNO3

- 1; NaCl - 0,5; FeSO4.7H2O - 0,01; Agar - 12; pH = 7,2 – 7,4

Môi trường CMC (Carboxyl Methyl Cellulose): (NH)4SO4– 1g/l;

K2HPO4 – 1g/l; MgSO4.7H2O – 0,5g/l; NaCl – 0,001g/l; CMC – 10g/l,Agar – 12g/l; Nước cất 1 lít; pH = 7,0

Cách pha chế:

- Đối với môi trường PDA có khoai tây thì củ khoai tây được gọt hết

vỏ, rửa sạch và cắt hạt lựu, cân đủ lượng cần dùng đem đun sôi nhỏ lửakhoảng 30 phút cho khoai chín giừ, lọc lấy nước rồi cho vào vừa đủ 1 lítnước, cân thêm 20g đường và 12g agar đun sôi tắt bếp và chuẩn độ pH

- Đối với các môi trường còn lại cân đúng trọng lượng thành phầnnhư trên hòa vào 1 lít nước đem đun sôi nhỏ lửa để các chất đảm bảo hòatan hoàn toàn rồi tắt bếp, tiến hành chuẩn độ pH Đổ môi trường vào lọ thủytinh, hấp khử trùng ở 1210C, 1atm, trong thời gian 20 phút

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp lấy mẫu đất

Tiến hành lấy 3 mẫu đất trên 3 loại đất trồng rau (su hào, cải bắp, khoaitây) trên 3 địa bàn khác nhau Khi lấy mẫu đất chọn những ruộng rau có bềmặt đất tơi xốp, độ ẩm vừa đủ, không quá khô và cũng không quá ướt

Trên một loại đất trồng chọn 5 điểm (1 điểm giữa ruộng, 4 điểm ởbốn góc ruộng) dùng muỗng gạt bỏ lớp đất mặt khoảng 5 – 7cm, lấy lớp đất

ở dưới Trộn đều 5 điểm đất đó ta được một mẫu đất Ghi dán nhãn bênngoài mẫu đất tên cây trồng, địa điểm lấy mẫu

Tương tự với 2 loại đất trồng trên 2 địa điểm khác

Mẫu lấy về được phơi khô trong điều kiện phòng 5 – 7 ngày

2.2.2 Phương pháp xác định thành phần vi sinh vật có trong đất trồng rau

* Phương pháp pha loãng mẫu

Sử dụng phương pháp pha loãng mẫu hệ thập phân thể hiện tronghình ảnh sau:

Hình 2.1: Phương pháp pha loãng mẫu hệ thập phân

Cân 1g đất cho vào cối chày sứ nghiền nhỏ, cho 1ml nước cất vôtrùng vào ống nghiệm sau đó cho đất đã nghiền vào lắc đều khoảng 5 phút

để đất hòa tan trong nước Tiếp tục bổ sung 9ml nước cất vô trùng vào ốngnghiệm đó và lắc đều ta được mẫu đất có nồng độ pha loãng 10-1 Để yênống nghiệm khoảng 10 phút để làm lắng lại đất

Tiếp tục dùng micropipet hút 1ml dịch mẫu từ ống nghiệm thứ nhấtsang ống nghiệm thứ 2 có chứa 9ml nước cất vô trùng, trộn đều ta đượcmẫu đất có nồng độ pha loãng 10-2 Cứ tiếp tục như vậy đối với các nồng

độ pha loãng tiếp theo

* Phương pháp quan sát hình thái VSV dưới kính hiển vi:

- Làm vết bôi: nhỏ một giọt nước đã được khử trùng, lấy một ít khuẩn lạcVSV đặt vào giữa phiến kính, dàn đều tạo thành vùng tròn nhỏ, để khô tự nhiên

- Cố định vết bôi: kẹp phiến kính, hơ nhẹ mặt dưới trên đèn cồn vài lần

- Đặt miếng giấy thấm lên vết bôi

- Nhỏ một giọt dầu soi lên vết bôi và quan sát hình thái tế bào VSVtrên kính hiển vi vật kính x100

* Phương pháp nhuộm Gram: Thực hiện theo các bước sau:

Bước 1: Làm tiêu bản mẫu cần nhuộm

Bước 2: Cố định mẫu bằng ngọn lửa đèn cồn

Bước 3: Dùng thuốc nhuộm Fuchsin kiềm nhuộm mẫu trong 1 phútBước 4: Rửa nước tối đa 5 giây

Bước 5: Thêm dung dịch Lugol (1% iot, 2% KI) trong 1 phút

Bước 6: Rửa nước tối đa 5 giây

Bước 7: Phủ lên mẫu với Ethanol 95% vài lần cho đến khi khôngxuất hiện màu trong mẫu (khoảng 1 phút) Dung dịch này sẽ rửa sạch thuốcnhuộm kiềm không kết gắn, vi khuẩn Gram dương giữ lại màu tím còn vikhuẩn Gram âm mất màu

Bước 8: Rửa nước

Bước 9: Nhuộm tiếp với Fuchsin trong 1 phút

Bước 10: Rửa nước, để khô

Bước 11: Đưa lên soi kính hiển vi

2.2.3 Phương pháp phân lập tạo chủng thuần với vi sinh vật có lợi trong việc hạn chế bệnh hại rau.

Phân lập VSV là quá trình tách riêng các loài VSV từ quần thể banđầu và đưa về dạng thuần khiết bằng cách nuôi cấy các tế bào trên môitrường dinh dưỡng đặc trưng để cho khuẩn lạc riêng rẽ, tách biệt nhau

Từ thành phần VSV xác định được trong đất trồng rau, chọn cácchủng VSV có lợi và có khả năng khống chế vi sinh vật gây bệnh cho cây

và đất trồng rau như: nấm Trichodema, vi khuẩn Bacillus, vi khuẩn Clostridium

Vào mẫu và phân lập vi sinh vật sử dụng từng loại môi trường đãchuẩn bị sẵn đổ vào đĩa petri với lượng môi trường dải đều trên đĩa dàykhoảng 2mm, chờ cho môi trường trong đĩa nguội hẳn thì tiến hành cấymẫu Dùng micropipet hút 50µl dịch mẫu ở nồng độ pha loãng 10-2 cho lêntrên bề mặt thạch đĩa, mỗi mẫu cấy 2 đĩa, dùng que trang vô trùng trang