Nghiên cứu ảnh hưởng của xử lý tia cực tím (UV) và Ethyl Methane Sunfonate (EMS) đến khả năng sinh trưởng, phát triển và biến dị của cây hoa cúc vàng (Chrysanthemum indicum) in vitro

Nghiên cứu ảnh hưởng của xử lý tia cực tím (UV) và Ethyl Methane Sunfonate (EMS) đến khả năng sinh trưởng, phát triển và biến dị của cây hoa cúc vàng (Chrysanthemum indicum) in vitroĐề tài được thực hiện với mục tiêu xử lý đột biến in vitro với hai tác nhân: tia UV và hóa chất EMS trên đối tượng giống cúc hoa vàng. Các chồi cúc sau xử lý đột biến được đánh giá khả năng sinh trưởng (khả năng sống, bật chồi, nhân nhanh) và phát triển (khả năng tạo cây in vitro hoàn chỉnh) và sàng lọc một số chồi cúc biến dị tạo nguồn nguyên liệu phục vụ cho công tác chọn, tạo giống tiếp theo.Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ EMS đến khả năng sống sinh trưởng chồi cúc in vitro Khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiếu tia cực tím đến khả năng sống , sinh trưởng của chồi cúc in vitro Nghiên cứu ảnh hưởng của xử lý EMS kết hợp tia cực tím tới khả năng sống sinh trưởng biến dị bật chồi của chồi cúc in vitro Nghiên cứu khả năng tạo cây in vitro hoàn chỉnh của chồi cúc invitro sau xử lý đột biến EMS và tia cực tím in vitro.

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kếtquả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan

Tôi cũng xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện báocáo đã được cảm ơn, các thông tin trích dẫn trong báo cáo này đều đượcchỉ rõ nguồn gốc

Bắc Giang, ngày … tháng năm 2018

Sinh viên

Phùng Minh Hiền

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi

đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp

đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình

Tôi xin bày tỏ long biết ơn trân thành tới Th.S Chu Thùy Dương đãtận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôitrong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Trung Tâm Công nghệ sinhhọc trường Đại Học Nông - Lâm Bắc Giang đã tận tình giúp đỡ tôi trong quátrình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành báo cáo thực tập tốt nghiệp

Bắc giang , ngày … tháng….năm 2018

Sinh viên

Phùng Minh Hiền

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC BẢNG BIỂU v

DANH MỤC HÌNH vi

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 3

4.1 Ý nghĩa khoa học 3

4.2 Ý nghĩa thực tiễn 3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Giới thiệu chung về cây hoa cúc 4

1.1.1 Nguồn gốc và phân loại 4

1.1.2 Đặc điểm thực vật học của hoa cúc 4

1.1.3 Yêu cầu ngoại cảnh 6

1.1.4 Tình hình sản xuất hoa cúc trên thế giới và ở Việt Nam 7

1.2 Phương pháp xử lý đột biến in vitro bằng Ethyl Methane Sunfonate (EMS) và tia cực tím (UV) 10

1.2.1 Đột biến và phương phương pháp xử lý đột biến in vitro 10

1.2.2 Cơ chế gây đột biến của Ethyl Methane Sunfonate (EMS) 13

1.2.3 Cơ chế gây đột biến của tia cực tím (UV) 17

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Vật liệu, địa điểm thời gian nghiên cứu 19

2.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 19

2.2.1 Nội dung 1: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ Ethyl methane sunfonate (EMS) tới khả năng sống, sinh trưởng và tạo biến dị của chồi cúc

vàng (Chrysanthemum indicum) in vitro 19

2.2.2 Nội dung 2: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian xử lý tia cực tím (UV) tới khả năng sống, sinh trưởng và tạo biến dị của chồi cúc vàng (Chrysanthemum indicum) in vitro 20

2.2.3 Nội dung 3: Đánh giá khả năng tạo cây hoàn chỉnh của chồi cúc vàng (Chrysanthemum indicum) sau xử lý EMS in vitro 21

2.2.4 Nội dung 4: Đánh giá khả năng tạo cây in vitro hoàn chỉnh của chồi cúc vàng (Chrysanthemum indicum) sau xử lý tia UV 23

2.3 Phương pháp xử lý số liệu 24

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 25

3.1 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ Ethyl methane sunfonate (EMS) tới khả năng sống, sinh trưởng và tạo biến dị của chồi cúc vàng (Chrysanthemum indicum) in vitro 25

3.2 Ảnh hưởng của thời gian xử lý tia cực tím (UV) tới khả năng sống, sinh trưởng và tạo biến dị của chồi cúc vàng (Chrysanthemum indicum) in vitro 28

3.3 Khả năng tạo cây hoàn chỉnh của chồi cúc vàng (Chrysanthemum indicum) sau xử lý EMS in vitro 32

3.4 Khả năng tạo cây hoàn chỉnh của chồi cúc vàng (Chrysanthemum indicum) in vitro sau xử lý tia UV 35

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 38

1 Kết luận 38

2 Đề nghị 38

TÀI LIỆU THAM KHẢO 39

PHỤ LỤC 41

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 3.1: Ảnh hưởng của nồng độ EMS đến khả năng sống, sinh trưởng

và tạo biến dị của chồi cúc invitro 2 tuần sau cấy chuyển 25Bảng 3.2: Ảnh hưởng của nồng độ EMS đến khả năng sống, sinh trưởng vàtạo biến dị của chồi cúc invitro 4 tuần sau cấy chuyển 27Bảng 3.3: Ảnh hưởng của thời gian xử lý tia cực tím (UV) đến khả năng sống,

sinh trưởng và tạo biến dị của chồi cúc in vitro sau lần cấy chuyển 1 28

Bảng 3.4: Ảnh hưởng của thời gian xử lý tia cực tím (UV) đến khả năng sống,

sinh trưởng và tạo biến dị của chồi cúc in vitro sau lần cấy chuyển 2 31

Bảng 3.5 Khả năng tạo cây hoàn chỉnh của chồi cúc vàng

(Chrysanthemum indicum) sau xử lý EMS in vitro 33

Bảng 3.6 Khả năng tạo cây hoàn chỉnh của chồi cúc vàng

(Chrysanthemum indicum) in vitro sau xử lý tia UV 35

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Sự kết cặp nhầm chuyên biệt do đột biến cảm ứng alkyl hóa(Trần Thượng Tuấn, 2005) 14Hình 1.2 Cơ chế gây đột biến của tia UV 18Hình 3.1 Chồi cúc biến dị thu được khi xử lý EMS nồng độ 0.10% 26Hình 3.2 Biến dị hình thái thu được sau xử lý chồi cúc vàng

(Chrysanthemum indicum) EMS 26 Hình 3.3 Chồi cúc vàng (Chrysanthemum indicum) sau xử lý tia UV in vitro 2 tuần sau cấy chuyển 30 Hình 3.4 Chồi cúc vàng (Chrysanthemum indicum) sau xử lý tia UV in vitro 4 tuần sau cấy chuyển 30

Hình 3.5 Biến dị hình thái thu được sau xử lý chồi cúc vàng

(Chrysanthemum indicum) in vitro tia UV 31

Hình 3.6 Khả năng tạo cây hoàn chỉnh của chồi cúc vàng sau xử lý EMS

in vitro 2 tuần sau cấy chuyển 33

Hình 3.7 Khả năng tạo cây hoàn chỉnh của chồi cúc vàng sau xử lý EMS

in vitro 3 tuần sau cấy chuyển 33 Hình 3.8 Khả năng tạo cây hoàn chỉnh của chồi cúc vàng in vitro sau xử lý

tia UV 2 tuần sau cấy chuyển 36

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Hoa cúc là một loại hoa đẹp với nhiều màu sắc khác nhau Đối vớicác nước trên thế giới cũng như Việt Nam thì hoa cúc luôn là loại hoa phùhợp với phần đông thị hiếu của người dân Hiện trên thế giới có 1500 giống

hoa cúc nhưng tại Việt Nam không phải giống nào cũng phát triển mạnh và

có hoa đẹp cho người chơi hoa Bởi vậy, các nhà khoa học đã và đangnghiên cứu các phương pháp chọn, tạo nhân giống hoa cúc nhằm tạo đadạng các giống hoa, phục vụ nhu cầu thẩm mỹ ngày càng cao của thịtrường, cũng như tăng lựa chọn, thu nhập cho người trồng hoa

Phương pháp chọn tạo giống bằng gây tạo đột biến được nghiên cứu,phát triển từ giữa thế kỷ 20 và ngày phát triển rộng rãi mang lại nhữngthành tựu to lớn trong công tác chọn tạo giống cây trồng Hơn thế nữa, việc

gây tạo đột biến nhân tạo kết hợp với nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro

đã trở thành công cụ hữu hiệu giúp giảm nhiều chi phí và thời gian chọntạo giống cây trồng mới

Kỹ thuật xử lý đột biến in vitro đã gây tạo và làm tăng tần số xuất

hiện đột biến với các tính trạng có giá trị kinh tế ở các loài thực vật nóichung và cây hoa nói riêng, góp phần không nhỏ cho việc cải tiến giốngcây trồng Bằng phương pháp chọn lọc và lai tạo thông thường để tạo mộtgiống cây trồng mới ổn định về năng suất, có chất lượng cao phải mất 6 –

10 thế hệ, nhưng nếu áp dụng phương pháp đột biến in vitro chỉ cần 3 – 6

thế hệ Phương pháp chọn, tạo giống này được đánh giá là một trong nhữngthành tựu của thế kỷ 20 (Đào Thị Thanh Bằng và cs, 1997 ) Các tác nhân

vật lý, hóa học được đưa vào nghiên cứu xử lý đột biến in vitro được sử

dụng phổ biến có thể kể đến là: các tia phóng xạ (tia X, tia gama…), tia cựctím (UV), hóa chất Ethyl methane sunfonat (EMS), colchicine …

Trong thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp của mình, tôi lựachọn hai tác nhân gây đột biến là tia cực tím (UV) và hóa chất Ethylmethane sunfonate (EMS) thực hiện trên đối tượng nghiên cứu là giống cúc

hoa vàng (Chrysanthemum indicum) – giống cúc được trồng khá phổ biến

hiện nay; để gia tăng tần suất xuất hiện biến dị nhằm tạo nguồn nguyên liệuphong phú cho công tác chọn tạo giống hoa cúc mới

Bởi vậy, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu ảnh hưởng của xử lý tia cực tím (UV) và Ethyl Methane Sunfonate (EMS) đến khả năng sinh trưởng, phát triển và biến dị của cây hoa cúc vàng (Chrysanthemum indicum)

in vitro”

2 Mục tiêu nghiên cứu

Đề tài được thực hiện với mục tiêu xử lý đột biến in vitro với hai tác

nhân: tia UV và hóa chất EMS trên đối tượng giống cúc hoa vàng Các chồicúc sau xử lý đột biến được đánh giá khả năng sinh trưởng (khả năng sống,

bật chồi, nhân nhanh) và phát triển (khả năng tạo cây in vitro hoàn chỉnh)

và sàng lọc một số chồi cúc biến dị tạo nguồn nguyên liệu phục vụ chocông tác chọn, tạo giống tiếp theo

*Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ EMS đến khả năng sống sinh trưởngchồi cúc in vitro

*Khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiếu tia cực tím đến khả năng sống ,sinh trưởng của chồi cúc in vitro

*Nghiên cứu ảnh hưởng của xử lý EMS kết hợp tia cực tím tới khả năngsống sinh trưởng biến dị bật chồi của chồi cúc in vitro

*Nghiên cứu khả năng tạo cây in vitro hoàn chỉnh của chồi cúc invitro sau

xử lý đột biến EMS và tia cực tím in vitro

3 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ Ethyl methanesunfonate (EMS) tới khả năng sống, sinh trưởng và tạo biến dị của chồi cúc

vàng Chrysanthemum indicum in vitro.

Nội dung 2: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian xử lý tia cực tím (UV)tới khả năng sống, sinh trưởng và tạo biến dị của chồi cúc vàng

(Chrysanthemum indicum) in vitro

Nội dung 3: Đánh giá khả năng tạo cây hoàn chỉnh của chồi cúc vàng

(Chrysanthemum indicum) sau xử lý EMS in vitro.

Nội dung 4: Đánh giá khả năng tạo cây hoàn chỉnh của chồi cúc vàng

(Chrysanthemum indicum) sau xử lý tia UV in vitro.

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Các dòng hoa cúc thu được sau xử lý EMS sẽ là nguồn nguyên liệu

di truyền khởi đầu cho các nghiên cứu tiếp theo về chọn, tạo giống hoa cúcđột biến mới

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu chung về cây hoa cúc

1.1.1 Nguồn gốc và phân loại

Cây hoa cúc có tên khoa học là Chrysanthemum, được định nghĩa từChiysos (vàng) và themum (hoa) bởi Linne 1973, thuộc lớp lá 2 mầm(dicotyledoneae), phân lớp cúc (asteridea), bộ cúc (asteraceae) ChiChrysanthemum (Võ Văn Chi, Dương Đức Tiến,1998) theo điều tra hiệnnay, chi chrysanthemum ở Việt Nam có 5 loài và trên thế giới có 200 loài.Các giống thuộc chi này đều được sử dụng làm hoa, cây cảnh ChiChrysanthemum được trồng phổ biến như một loài hoa trồng chậu hay hoacắt cành

Họ Cúc Asteraceae là một trong những họ lớn nhất của ngành NgọcLan (Magnoliophyta) thực vật hạt kín (Asgniospermatophyta) Qua haicuộc hội thảo quốc tế về họ asteraceae năm 1967 và 1994 mang tên sinhhọc và hóa học cuả hoa cúc đã có sự thống nhất tương đối về hệ thống học

họ Assteracae Họ cúc trên thế giới xếp trong 2 phân họ

Hoa cúc có nguồn gốc từ Trung quốc, Nhật Bản và một số nướcChâu Âu Ở Nhật Bản cây hoa cúc được di chuyển từ Trung Quốc sang, nóđược đánh giá rất cao và được mệnh danh: Hoàng thất quốc gia

Ở Việt Nam, hoa Cúc được du nhập vào từ thế kỷ 15, đến đầu thế kỷ

19 đã hình thành một số vùng chuyên nhỏ cung cấp cho dân Một phần đểchơi, một phần phục vụ cúng lễ Hiện nay hoa cúc được trồng khắp nước ta

nó có mặt ở mọi nơi và trở thành một loại hoa không thể thiếu trong các dịp

lễ, tết, hoa trang trí thường ngày

1.1.2 Đặc điểm thực vật học của hoa cúc

* Rễ: Rễ của cây hoa Cúc là loại rễ chùm, phần lớn phát triển theochiều ngang, phân bố ở tầng đất mặt từ 5-20cm Kích thước các rễ trong bộ

rễ Cúc chênh lệch nhau không nhiều, số lượng rễ rất lớn do vậy khả nănghút nước và dinh dưỡng rất mạnh Cúc chủ yếu trồng bằng nhân vô tính nên

các rễ không phát sinh từ mầm rễ của hạt mà từ những rễ mọc ở mấu củathân (gọi là mắt) ở những phần ngay sát mặt đất.

* Thân: Cây thuộc thân thảo nhỏ, có nhiều đốt giòn dễ gãy càng lớncàng cứng, cây dạng đứng hoặc bò Kích thước thân cao hay thấp, to haynhỏ, cứng hay mềm phụ thuộc vào từng giống và thời vụ trồng Nhữnggiống nhập nội thân thường to, mập, thẳng và giòn, ngược lại những giốngCúc dại hay giống cổ truyền Việt Nam thân nhỏ mảnh và cong Thân cóống tiết nhựa mủ trắng, mạch có bản ngăn đơn

* Lá: Thường là lá đơn không có lá kèm, mọc so le nhau, bản lá xẻthùy lông chim, phiến lá mềm mỏng có thể to hay nhỏ, màu sắc xanh đậmhay nhạt phụ thuộc vào từng giống Mặt dưới phiến lá bao phủ một lớplông tơ, mặt trên nhẵn, gân hình mạng Trong một chu kì sinh trưởng cây

có từ 30-50 lá trên thân

* Hoa, Quả: Hoa Cúc chủ yếu có 2 dạng :

+ Dạng lưỡng tính: Trong hoa có cả nhị đực và nhuỵ cái

+ Dạng đơn tính: Trong hoa chỉ có nhị đực hoặc nhụy cái, đôi khi cóloại vô tính (không có cả nhụy, nhị, hoa này thường ở phía ngoài đầu) Mỗihoa gồm rất nhiều hoa nhỏ gộp lại trên một cuống hoa, hình thành hoa tựđầu trạng mà mỗi đầu trạng là một bông hoa Trong thực tế tuỳ theo mụcđích sử dụng mà người ta để một bông trên một cành hay nhiều bông trênmột cành

Màu sắc của hoa Cúc rất khác nhau, hầu như có tất cả các màu tựnhiên: Trắng, vàng, đỏ, tím, hồng, nâu, xanh Trong đó, trên mỗi bông hoa

có thể có một màu duy nhất, có thể có vài màu riêng biệt hoặc có rất nhiềumàu pha trộn, tạo nên một thế giới màu sắc vô cùng phong phú và đa dạng

Tuỳ theo cách sắp xếp của cánh hoa mà người ta phân ra thành nhómhoa kép (có nhiều vòng hoa sắp xếp trên bông) và nhóm hoa đơn (chỉ cómột vòng hoa trên bông) Những cánh hoa nằm ở phía ngoài có màu sắcđậm hơn, xếp nhiều tầng, sít nhau, chặt hay lỏng tuỳ từng giống, cánh hoa

có nhiều hình dáng khác nhau: cong hoặc thẳng, có loại cánh ngắn, có loạicánh dài, cuốn ra ngoài hay cuốn vào trong

Đường kính của bông hoa phụ thuộc vào giống, giống hoa to cóđường kính 10-12cm, loại trung bình 5-7cm và loại nhỏ 1-2cm

Hoa có 4-5 nhị đực dính vào nhau làm thành 1 ống bao xung quanhvòi nhụy, bao phấn nở phía trong theo khe nứt dọc, khi phấn nhị đực chín,bao phấn nở tung hạt phấn ra ngoài nhưng lúc này nhụy chưa đến tuổitrưởng thành, chưa có khả năng tiếp nhận hạt phấn vì vậy sự thụ phấn, thụtinh không thành, dẫn đến quả không hạt, muốn có hạt giống phải thụ phấnnhờ sâu bọ hoặc thụ phấn nhân tạo cho hoa

Quả bế, đóng, chứa một hạt, quả có chùm lông do đài tồn tại để pháttán hạt, có phôi thẳng mà không có nội nhũ

1.1.3 Yêu cầu ngoại cảnh

* Nhiệt độ: Cây hoa cúc có nguồn gốc từ nơi có khí hậu ôn đới nên

nó ưu điều kiện thời tiết mát mẻ hoặc chỉ chịu nóng trung bình, nhiệt độthích hợp cho cây sinh trưởng và phát triển là 15 – 200C Cúc có thể chịuđược nhiệt độ từ 10 - 350C nhưng nhiệt độ cao trên 35ºC hoặc thấp hơn10ºC sẽ làm cho cây sinh trưởng phát triển kém Ban ngày cây cần nhiệt độcao hơn để quang hợp còn ban đêm cần nhiệt độ thấp hơn Nếu nhiệt độcao vào ban đêm sẽ thúc đẩy quá trình hô hấp làm tiêu hao lượng lớn chất

dự trữ trong cây

* Ánh sáng: Cúc là loại cây trồng ngắn ngày ưa sáng và lạnh nênquang chu kỳ ảnh hưởng rất lớn đến sự phân hóa mầm hoa và chất lượnghoa cúc Hầu hết các giống hoa cúc thuộc loại cây cần ánh sáng ngày dàitrên 13 giờ, còn trong thời gian trỗ hoa, cây chỉ cần ánh sáng ngày ngắn từ

10 -11 giờ và nhiệt độ không khí thấp trên dưới 20ºC Thời gian chiếu sángdài cây cúc sinh trưởng mạnh, cây cao, hoa to và đẹp Bởi vậy cúc rất thíchhợp với thời tiết thu đông Hiện nay, một số giống cúc mới nhập nội có thể

ra hoa trong điều kiện ngày dài điển hình là CN 93, CN 98, CN01, tím hè,

… rất thích hợp trồng vào vụ hè, do đó có thể sản xuất cúc quanh năm thay

vì chỉ trồng vào mùa đông như trước đây

* Ẩm độ: Ẩm độ đất từ 60 – 70%, độ ẩm không khí 55 – 60% thuậnlợi cho cúc sinh trưởng Nếu độ ẩm trên 80% cây sinh trưởng mạnh nhưng

lá dễ mắc phải một số bệnh nấm Đặc biệt vào thời kỳ thu hoạch hoa cúccần thời tiết khô ráo, thoáng mát, nếu độ ẩm không khí quá cao làm chonước đọng trên các tuyến mật gây thối hoa và sâu bệnh phát sinh phát triển,cây dễ bị đổ non, chất lượng hoa giảm sút, khó khăn trong việc thu hoạch

* Dinh dưỡng: Đối với cây hoa nói chung và hoa cúc nói riêng phânbón phải đảm bảo đầy đủ, cân đối Nếu thiếu phân cây sẽ còi cọc, hoa nhỏ,

dễ bị sâu bệnh phá hoại nhưng nếu bón thừa phân cây sẽ vống cao, dễ bị

đổ, khả năng chống chịu kém Các loại phân mà cúc cần bao gồm: phân vô

cơ như phân đạm, lân, kali; phân hữu cơ như phân bắc, phân chuồng, phân

vi sinh,… và các loại phân vi lượng như Cu, Fe, Zn, Mn…

1.1.4 Tình hình sản xuất hoa cúc trên thế giới và ở Việt Nam

* Tình hình sản xuất hoa cúc trên thế giới

Hiện nay ngành sản xuất hoa nói chung và sản xuất hoa cúc nói riêngtrên thế giới đang phát triển mạnh và mang tính thương mại cao Đến đầuthế kỷ 18, cây hoa cúc là cây hoa quan trọng nhất đối với Trung Quốc,Nhật Bản Ở Hà Lan, cúc là cây quan trọng thứ hai sau hoa hồng Hàngnăm kim ngạch giao lưu buôn bán hoa cúc trên thị trường thế giới ước đạttới 1.5 tỷ USD (Đặng Văn Đông, Đinh Thế Lộc, 2003)

Hoa cúc là một trong năm loại hoa cắt cành phổ biến trên thế giới.Cây cúc thu hút người tiêu dùng ở màu sắc phong phú: trắng, vàng, xanh,tím, đỏ, hồng, da cam,… Không những vậy, hình dáng và kích cỡ hoa rất

đa dạng cùng với khả năng có thể điều khiển cho ra hoa tạo nguồn hànghóa quanh năm đã khiến cho hoa cúc trở thành loài hoa được tiêu thụ đứngthứ hai trên thị trường thế giới (sau hoa hồng)

Trong các nước Châu Âu, Hà Lan có thể xem là nước đứng đầu thếgiới về sản xuất và xuất khẩu hoa nhằm phục vụ cho thị trường tiêu thụ rộng

lớn với hơn 80 nước trên thế giới bao gồm hoa cắt, hoa trồng thảm, trồng chậu

và trang trí Trong đó, diện tích trồng hoa cúc của Hà Lan chiếm 30% tổngdiện tích trồng hoa tươi Trung bình 1 năm 7 tỷ bó hoa tươi và 600 triệu chậuhoa cảnh các loại với tổng kim ngạch xuất khẩu là 2 tỷ USD/năm

Tiếp đến là Mỹ, ngành trồng hoa có thể xem như là một phần trongnền kinh tế Mỹ, chiếm khoảng 10 tỷ USD Ở Mỹ các loại hoa truyền thống

là cúc, cẩm chướng và hoa hồng Hiện nay, một lượng lớn hoa cắt đượcnhập khẩu vào Mỹ từ các nước Trung và Nam Mỹ, Hà Lan, các nước vùngbiển Caribe Theo tổ chức sáng kiến thương mại Anh, năm 2007, Colombia

là nước xuất khẩu hoa lớn thứ hai thế giới sau Hà Lan với kim ngạch xuấtkhẩu 700 triệu USD, 85% hoa của Colombia được xuất khẩu cho thị trườngChâu Âu với các loại hoa chính là cúc, hoa hồng, cẩm chướng

Ở Châu Á, Nhật Bản dẫn đầu về sản xuất và tiêu thụ hoa cúc Hàngnăm, Nhật Bản tiêu thụ khoảng 4.000 triệu Euro để phục vụ nhu cầu hoatrồng (Jo Wijnads, 2005) Người dân Nhật Bản yêu thích hoa cúc và hoacúc trở thành loài hoa quan trọng nhất tại Nhật Bản chiếm tới 36% sảnphẩm nông nghiệp Mỗi năm sản xuất khoảng hơn 200 triệu cành hoa phục

vụ cho nhu cầu trong nước và xuất khẩu Diện tích trồng hoa cúc chiếm 2/3tổng diện tích trồng hoa Năm 2008, diện tích trồng hoa cúc ở Nhật Bản là16.800 ha, giá trị sản lượng đạt 2.599 triệu USD Tuy vậy, hàng năm NhậtBản vẫn phải nhập một lượng lớn hoa cúc từ Hà Lan và một số nước trênthế giới như Trung Quốc, Đài Loan, Colombia,…

Tại Trung Quốc, ngành sản xuất hoa phát triển mạnh trong 15 nămgần đây với diện tích hằng năm tăng 24%, giá trị sản lượng tăng 38,8%.Năm 2006, diện tích hoa Trung Quốc đạt 722.000 ha với giá trị sản lượng55,62 tỷ nhân dân tệ Hoa cúc là 1 trong 10 loại hoa cắt quan trọng sau hoahồng và cẩm chướng, chiếm khoảng 20% tổng số hoa cắt trên thị trườngbán buôn ở Bắc Kinh và Côn Minh Vùng sản xuất hoa cúc chính là QuảngĐông, Thượng Hải, Bắc Kinh bao gồm các giống ra hoa mùa Hè, Thu,

Đông sớm và Xuân muộn với các loại cúc đơn với các màu được ưachuộng như đỏ, vàng, trắng

* Tình hình sản xuất hoa cúc ở Việt Nam

Ở Việt Nam, hoa cúc được trồng rộng rãi ở một số thành phố lớn như

Hà Nội, Hải Phòng, Đà Lạt, TP Hồ Chí Minh và một số tỉnh lân cận nhưVĩnh Phúc , Hưng Yên, Hải Dương……Nếu xét về cơ cấu chủng loại chotất cả các loại hoa thì trước những năm 1997 diện tích hoa hồng nhiều nhấtchiếm đến 31% nhưng từ 1998 trở lại đây diện tích hoa cúc đã vượt lênchiếm 42%, trong khi đó hoa hồng chỉ còn 29,4% Riêng ở Hà Nội tổng giátrị sản lượng hoa cúc năm 1999 đạt 41,3 tỷ đồng, tốc độ tăng trưởng hàngnăm khoảng 10%

Theo số liệu của tổng cục thống kê năm 2006, diện tích trồng hoacây cảnh của nước ta khoảng trên 13.000 ha Trong đó diện tích trồng hoacúc chiếm 25 – 30%, chỉ đứng thứ hai sau hoa hồng

Theo số liệu thống kê của Tổng cục Hải quan, trong thời gian từ17/12/2006 đến 16/1/2007, lượng hoa xuất khẩu của Việt nam đạt gần 2,6triệu cành với kim ngạch 500 nghìn USD Số lượng doanh nghiệp tham giaxuất khẩu hoa trong thời gian này gồm 5 doanh nghiệp Trong đó, công tyTNHH Agrivina là doanh nghiệp đạt kim ngạch xuất khẩu cao nhất, chiếmtới 95% tổng kim ngạch xuất khẩu hoa cắt cành của Việt Nam Cụ thể trongkhoảng 2,5 triệu cành hoa với các chủng loại hoa Cúc, cẩm chướng, hồng,địa lan, lily, đồng tiền mà doanh nghiệp này xuất khẩu thì hoa cúc vẫnchiếm ưu thế xuất khẩu nhiều nhất với 1,5 triệu cành (chiếm 61% tổnglượng hoa xuất khẩu của doanh nghiệp)

Theo chương trình phát triển sản xuất hoa của Bộ Nông nghiệp vàPhát triển Nông thôn, đến năm 2010 Việt Nam sẽ xuất khẩu 1 tỷ cành hoacác loại trong đó hoa hồng, hoa cúc và phong lan chiếm 85% Theo chươngtrình này, diện tích trồng hoa của cả nước sẽ đạt 8000ha cho sản lượng 4,5triệu cành/lượng hoa

Để đáp ứng nhu cầu tiêu thụ hoa trong nước cũng như trên thế giớiđòi hỏi các nhà sản xuất hoa Việt Nam phải có kế hoạch đầu tư và pháttriển một cách thích hợp, đặc biệt là trong công tác chọn tạo giống và nhângiống…công nghệ đóng gói và bảo quản để nâng cao năng suất chất lượng.

Như vậy, có thể thấy hoa cúc là một loại hoa có tiềm năng phát triểnrất lớn và có ý nghĩa vô cùng quan trọng trong việc phát triển ngành sảnxuất hoa của nước ta nói riêng và của thế giới nói chung

1.2 Phương pháp xử lý đột biến in vitro bằng Ethyl Methane

Sunfonate (EMS) và tia cực tím (UV)

1.2.1 Đột biến và phương phương pháp xử lý đột biến in vitro

 Một số khái niệm về biến dị, đột biến

Các nhà di truyền học phân biệt 2 dạng biến dị là biến dị di truyền vàbiến dị không di truyền (thường biến)

Biến dị không di truyền: đó là những biến đổi liên quan tới kiểu hình,

không liên quan tới vật chất di truyền Những biến đổi này gọi là cácthường biến

Biến dị di truyền: đó là những biến đổi có liên quan tới vật chất di

truyền của cơ thể Có thể phân ra 2 nhóm sau: Biến dị đột biến – nhữngbiến đổi có tính chất hoá học vật liệu di truyền, và biến dị tái tổ hợp – lànhững tổ hợp sắp xếp gen mới mà đời con thu được khác với bố mẹ do sựphân ly độc lập và sự trao đổi chéo của các gen

 Phân loại các dạng đột biến

Đột biến là những biến đổi có tính chất hoá học vật liệu di truyền,xảy ra do tác động của các yếu tố môi trường và bên trong tế bào; theo đặcđiểm biến đổi của kiểu gen có thể phân biệt 4 kiểu đột biến sau:

Đột biến gen (đột biến điểm): Là những biến đổi về thành phần bazơ

của ADN, làm biến đổi các cấu trúc của gen, dẫn tới chức năng của chúng

bị biến đổi

Đột biến cấu trúc nhiễm sắc thể: Là những biến đổi liên quan tới

những đoạn khác nhau trên nhiễm sắc thể, có thể quan sát thấy dưới kính

hiển vi (bao gồm những biến đổi như: mất đoạn, thêm đoạn, đảo đoạn,chuyển đoạn).

Biến đổi về số lượng nhiễm sắc thể: bao gồm thay đổi số lượng của

cả bộ nhiễm sắc thể - các dạng đa bội thể; thay đổi số lượng ở các đôinhiễm sắc thể riêng rẽ - các dạng lệch bội

Đột biến gen ở tế bào chất: đó là những biến đổi trên ADN của các

bào quan như ty thể, lạp thể, hay ở các episom, plasmid (ở vi khuẩn)

(Nguyễn Hồng Minh, 1999)

 Vai trò của đột biến trong công tác chọn tạo giống cây trồng

Ngày nay, khoa học kỹ thuật ngày càng phát triển, nhiều phươngpháp chọn tạo giống đã và đang được quan tâm phát triển Bằng cácphương pháp truyền thống như lai tạo hay chọn lọc, có thể tạo ra một sốgiống cây năng suất cao, ổn định nhưng cần ít nhất 6 -10 thế hệ Trong khi

đó chọn giống bằng phương pháp đột biến nhân tạo (đột biến thực nghiệm)chỉ cần 3 - 6 thế hệ (Nguyễn Hữu Đống và cộng sự, 1997) Đồng thời sửdụng phương pháp này có thể giải quyết những vấn đề mà nhiều phươngpháp khác không thể thực hiện được như: biến dị tự nhiên về một đặc tínhmong muốn không có sẵn trong nguồn vật liệu di truyền; khi có sẵn mộtgen cần thiết song do mối liên kết chặt chẽ với các gen khác làm cho gen

đó không sử dụng được; khi tạo đặc tính mong muốn không thể thực hiệnbằng phương pháp lai; khi muốn thay đổi một hoặc một số tính trạng riêngbiệt nhằm khắc phục nhược điểm của giống mà không làm thay đổi nhữngtính trạng khác của giống (Cox, RI., 1987)

Với các phương pháp đột biến thực nghiệm, sử dụng các tác nhân lýhóa gây đột biến đã làm tăng sự sai khác di truyền trong quần thể Việc xử

lý đột biến thực nghiệm có thể tạo ra những đột biến mang tính nhảy vọtđáng kể Do đó có thể tạo ra giống mới khác xa giống cũ (Nguyễn XuânLinh và cộng sự, 1998)

Với các thành tựu mới về vật lý, hóa học, con người đã sử dụng cáctia phóng xạ (tác nhân lý hóa) và các chất hóa học (tác nhân hóa học) như

cochichine, EMS,… trong công tác chọn giống cây trồng và đã thu đượccác thành tựu đáng kể Theo Ban Di Truyền và chọn giống thực vật của tổchức Nông nghiệp Quốc tế và tổ chức Năng lượng nguyên tử Quốc tế(FAO, IAEA) đã cho biết, tính đến năm 1996, số lượng các giống đột biếnthu được là 1737 giống từ hơn 50 nước trên thế giới Các giống đột biếnnày được tạo ra từ 154 loài thực vật Trong đó cây trồng chiếm 1257 giống,

187 giống hoa cúc, 35 giống cây cảnh, 34 giống hoa phong lan, 30 giốngxương rồng và rất nhiều loài khác (Nguyễn Hữu Đống và cộng sự, 1997)

Từ những kết quả thu được chứng tỏ đây là một trong những phươngpháp hiệu quả nhất để tạo ra giống mới Nhiều nhà khoa học trên thế giới

đã đánh giá: một trong những thành tựu xuất sắc của thế kỷ 20 là khám phá

ra phương pháp tạo giống bằng cách gây đột biến thực nghiệm

Theo một số tài liệu thì tác nhân gây đột biến hóa học có hiệu quảhơn tác nhân vật lý Nếu dưới ảnh hưởng của chiếu tia ở các cây nôngnghiệp xuất hiện 5 - 10% biến đổi di truyền có khả năng sống thì tác nhânhóa học cho phép thu nhận từ 30 - 60% Hơn nữa tác nhân gây đột biến hóahọc thường làm xuất hiện những biến dị đặc biệt hơn

 Xử lý đột biến thực nghiệm in vitro

Khi sử dụng các phương pháp cải tạo giống truyền thống như kếthợp phương pháp lai, sinh sản sinh dưỡng với phương pháp gây đột biến,các nhà sản xuất đã tạo ra hàng loạt giống cây trồng có năng suất cao, chấtlượng tốt, đáp ứng nhu cầu của xã hội Tuy nhiên vẫn còn nhiều hạn chếnhư thời gian tác động không lâu (khoảng 10 năm), cây bị tác động mạnh

về sinh lý, sinh hóa, nhu cầu về giống tốt rất lớn trong khi số lượng cungcấp lại hạn chế

Với sự phát triển của công nghệ tế bảo thực vật hiện nay, việc kếthợp xử lý đột biến nhân tạo và nuôi cấy mô trở thành một trong nhữnghướng tạo giống cây trồng quan trọng Vật liệu xử lý có thể là các cơ quanđang trong giai đoạn phát triển mạnh: đỉnh chồi, callus… Tác nhân gây độtbiến có thể là tác nhân vật lý hay hoá học

Xử lý đột biến chiếu xạ kết hợp nuôi cấy mô đã được nhiều nhà khoahọc chứng minh là phương pháp nhanh chóng tạo ra các biến dị mongmuốn, tạo nguồn vật liệu phong phú cho chọn giống và lai tạo giống Đồngthời kỹ thuật này có thể giải quyết vấn đề khó khăn: thể khảm sau xử lý

chiếu xạ Broetjes và cs năm 1976 đã đưa ra giả thuyết rằng tái sinh in vitro

có thể loại bỏ thể khảm Vì vậy kỹ thuật này càng có ý nghĩa hơn đối vớicây nhân giống vô tính, nhờ tiềm năng nhân nhanh trong thời gian ngắn, rútngắn chu trình chọn lọc đột biến

Xử lý đột biến in vitro sẽ giảm tác động không tốt của các tác nhân

gây đột biến tới môi trường, con người và động vật

(http://www.cababstractsplus.org/google/abstract.asp?AcNo=2005312067)

1.2.2 Cơ chế gây đột biến của Ethyl Methane Sunfonate (EMS)

* Giới thiệu về hóa chất Ethyl methane sulfonate (EMS)

EMS là hợp chất hóa học gây đột biến nằm trong nhóm các hợp chấtalkyl hóa, nhóm này gồm phần lớn các chất hóa học được dùng phổ biếncho mục đích chọn giống hiện nay như EI, EMS, NEU, NMU… quá trìnhalkyl hóa là sự thay thế hydro có trong bazo nito bằng một gốc alkyl cótrong các chất alkyl hóa ( như – C2H5 có trong EMS)

EMS có tên khoa học là Ethylmethane sulphonate, công thức hóahọc: CH3 – CH2 – O – SO2 – CH3

* Cơ chế tác động của EMS:

EMS là chất gây đột biến gen, gây nên những đột biến điểm và mấtđoạn nhỏ ADN EMS gây alkyl hóa với bazơ nitơ thường xuất hiện ở vị trí

O6 của Guanin khiến cho nó sau đó có thể kết cặp với Thymine và dẫn đến

sự đồng hoán giữa các bazo nito (đồng hoán – transition- là sự thay thế mộtpurin này bằng một purin khác hoặc một pyrimidin này bằng một pyrimidinkhác, hoặc sự thay thế một cặp bazo này bằng một cặp bazo khác mà vẫngiữ nguyên định hướng của purin và pyrimidin (Lê Duy Thành,2001)

Cho ví dụ, nhóm ethyl (CH3- CH2 -) ở vị trí N7 và ở vị trí O6 chắcchắn là hai hiệu quả tác động của EMS 7-ethylguanine rồi sẽ cặp đôi với

Thymine làm sai lệch sự cặp đôi theo nguyên tắc bán bảo toàn G – C( Guanin – Cytozin) (Eldon John Gardner và cs, 1984)

Trong các tác nhân gây đột biến bằng hóa học EMS là chất được sửdụng phổ biến và cho hiệu quả cao Dung dịch hóa chất gây đột biến nàyphải được chuẩn bị trước khi dùng và nó được tồn trữ như dung dịch gốc

“stock” Tốc độ thủy phân của hợp chất này được đo bằng phương phápbán thời gian “hafl life” Qua các kết quả nghiên cứu người ta cho thấy tốc

độ thủy phân của EMS phụ thuộc rất lớn vào nhiệt độ Trong nước cất ( pH

= 7) ở nhiệt độ 20ºC hafl life của EMS là 93 giờ, ở 30ºC là 26 giờ và 37ºC

là 10 giờ (Bùi Chí Bửu, 2007) Vì vậy, để đảm bảo hoạt tính của chất gâyđột biến chỉ nên chuẩn bị dung dịch trước khi xử lý không quá 30 phút vàgiữ trong bóng tối suốt thời gian xử lý (Đào Thanh Bằng, 1997)

Người ta còn phát hiện rằng dimethylsulphoxide (DMSO) là mộtchất mang có chức năng thúc đẩy hiện tượng phát sinh đột biến gen củaEMS Xử lý chất này làm giảm sự sinh trưởng 30 – 40% và có khả năng tạonên đột biến ở tần suất cao cho cây trồng thuộc nhóm mễ cốc (Bùi ChíBửu, 2007)

Hình 1.1: Sự kết cặp nhầm chuyên biệt do đột biến cảm ứng alkyl hóa

(Trần Thượng Tuấn, 2005)

Để gây đột biến cho cây trồng có thể xử lý hóa chất EMS trên các bộphận như hạt, chồi, củ, phôi trong thời gian đang phát triển Tuy nhiên, đốivới mỗi giống bộ phận của cây trồng có sự cảm ứng khác nhau với hóa chấtgây đột biến Các kết quả nghiên cứu cho thấy Vì vậy, đối với từng giống,từng bộ phận cây trồng cần phải xác định nồng độ, thời gian tác động hợp

lý mới có thể mong muốn đem lại hiệu quả di truyền cao

* Thành tựu về nghiên cứu chọn, tạo giống bằng phương pháp xử lý đột biến EMS in vitro trên thế giới

Các tác giả Tulman Neto et al (2004), đã nghiên cứu ảnh hưởng gây

đột biến của EMS lên giống cúc Dendranthema grandiflora Tzvelev Các

tác giả tiến hành thí nghiệm trên cuống nhỏ non của giống cúc cv Ingrid(màu hồng thẫm) được xử lý với dung dịch EMS nồng độ 0,77% trong 1h và

45 phút, sau đó ngâm trong nước 15 phút và làm sạch bề mặt Tiếp theo đó,mẫu được cấy trên môi trường MS + 1 g/l hydrolyzed casein, 1 mg/l 6-benzyl laminopurine (BAP) và 2 mg/l indole-3-acetic acid(IAA) Ước lượng

có khoảng 910 mẫu thu được xử lý từ EMS cuống hoa cho kết quả ra hoa.Thí nghiệm thu được khoảng 40 dạng đột biến (chiếm khoảng 5,2%) chomàu sắc cánh hoa khác nhau( màu hồng cam, màu hồng nhạt, màu đồng,màu trắng, màu vàng và màu cam) Hầu hết chúng (89,6% tổng số) là đồngdạng về kiểu hình

Chen Wei et al (2004) nghiên cứu ảnh hưởng của xử lý EMS lên các

phôi tiểu bào tử in vitro họ cải bắp (Brassia napus) cho thấy: Khi xử lý các tiểu bào tử của B.napusin in vitro ở các nồng độ 0; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; và 3,0

mM/l và các khoảng thời gian 12, 24 và 36 giờ), kết quả chỉ ra rằng sốlượng hầu hết các sản phẩm phôi tiểu bào tử đều giảm xuống, tăng dần ởcác nồng độ xử lý và các khoảng thời gian xử lý Sản phẩm phôi giảm cònmột nửa ở nồng độ 2,5 mM/l và khoảng thời gian 24 giờ Ở mức này, các

tiểu bào tử bị đột biến có giá trị rất quan trọng trong xử lý đột biến EMS in vitro B.napus.

Tác giả Luan et al (2007), đã sử dụng EMS nhằm gây đột biến tăng

tính chịu mặn của các giống Khoai lang (Ipomoea batatas L.) Mẫu mô lá

được sử dụng đem xử lý EMS ở nồng độ 0,5% trong thời gian 0; 1,0; 1,5;2,0; 2,5; và 3,0 ; sau đó tráng lại bằng nước cất vô trùng 4 lần Mẫu đượcnuôi cấy trên môi trường MS + 200mM NaCl nhằm chọn lọc các dòng tếbào đột biến và các dòng này sẽ được cấy chuyển 5 lần (20 ngày 1 lần)/ Sau

đó các dòng chọn được cấy chuyển sang môi trường tạo phôi vô tính MS + 4mg/l ABA + 10 mg/l GA Sau 15 ngày cấy chuyển sang môi trường MS +0,05 mg/l ABA + 0,2 mg/l ZT Các giống như ML1, ML2 và ML3 đượcphục tráng từ các dạng phôi vô tính thích hợp với xử lý EMS nồng độ 0,5%trong 2 và 2,5 giờ Các giống chọn tạo được có đặc tính chịu mặn hơn hẳncác giống gốc

* Thành tựu về nghiên cứu chọn, tạo giống bằng phương pháp xử lý đột biến EMS in vitro trên Việt Nam

Năm 1998, các tác giả thuộc Viện lúa đồng bằng sông Cửu Long đãgây đột biến thành công giống lúa thơm Jasmine 85 bằng xử lý hóa chấtEMS trong nuôi cấy mô Thí nghiệm được thực hiện từ vụ hè thu năm 1998đến năm 2001 Đặc điểm: Lúa Jasmine 85 có nguồn gốc từ Hoa Kỳ làgiống đặc sản xuất khẩu của Hoa Kỳ được thế giới ưa chuộng Khi trồng ởViệt Nam, lúa bị nhiễm sâu bệnh nên chi phí cao, không cạnh tranh với cácnước khác, thị trường nội địa cũng khó tiêu thụ Sau khi xử lý, thế hệ M1,các cá thể được trồng ở ruộng vào thời điểm có dịch rầy, phần lớn đều bịcháy rầy Từ 59 cá thể này, kỹ sư Phạm Thị Hường tiếp tục chọn lọc đếnthế hệ M5, tuyển chọn một số dòng đã thuần đưa vào so sánh năng suất,trong đó có 4 dòng OM 3566 – 14, OM 3566 – 15, OM 3566 – 16 và OM

3566 – 70 có triển vọng

Năm 2008, Viện sinh học Nông nghiệp, trường Đại học Nông nghiệp

Hà Nội triển khai xử lý đột biến bằng EMS trên đối tượng hoa cẩm chướng.Kết quả cho thấy khi tăng nồng độ EMS đã làm giảm khả năng sống, tăng

tỷ lệ các chồi biến dị Sau quá trình xử lý thì thu được 5 dạng chồi in vitro

và đã đánh giá được sự sinh trưởng và tạo cây hoàn chỉnh của các dạngchồi đó (Vũ Hoàng Hiệp, 2008).

1.2.3 Cơ chế gây đột biến của tia cực tím (UV)

* Giới thiệu về tia cực tím (UV)

Tia cực tím hay tia tử ngoại, tia UV (từ tiếng Anh Ultraviolet)

là sóng điện từ có bước sóng ngắn hơn ánh sáng nhìn thấy nhưng dàihơn tia X Phổ tia cực tím có thể chia ra thành tử ngoại gần (có bước sóng

từ 380 đến 200 nm) và tử ngoại xa hay tử ngoại chân không (có bước sóng

từ 200 đến 10 nm)

Tia cực tím (UV) được phát hiện vào năm 1801 bởi nhà khoa họcngười Đức tên Johann Wilhelm Ritter Sau phát hiện này, những cuộcnghiên cứu tiếp theo cho thấy trong một dãy ánh sáng mặt trời có đến 3nhóm tia sáng chính:

+ Nhóm UV-A: Chiếm 97% trong dãy phổ có bước sóng từ

315-400nm Tia này không gây ra hiện tượng cháy nắng nhưng cũng đủ gâythiệt hại cho các axit nucleic trong tế bào da Chính phát hiện này đã mởđường đưa nhóm ánh sáng UVA này ứng dụng vào công nghệ thuộc da

+ Nhóm UV-B: Chiếm khoảng 3% dãy phổ, có bước sóng từ

280-315nm và chủ yếu xuất hiện trong khoảng thời gian từ 12-16h hàng ngày.Tia này có khả năng gây cháy nắng, làm giảm khả năng sản xuất collagen

và elastin trên da

+ Nhóm UV-C: Đây là loại có bước sóng ngắn nhất (chỉ từ

100-280nm) và cũng là loại có hại nhất Tia sáng này có thể tiêu diệt acidnucleic trong các tế bào, phá hủy DNA tồn tại trong các cơ thể sống…

Đến giữa thế kỷ 20, cùng với sự bùng nổ về khoa học công nghệ,phương pháp tiệt trùng bằng tia cực tím (UVGI) đã được đưa vào thựchành trong công tác vệ sinh y tế và vô trùng phương tiện làm việc Từnhững ứng dụng thành công trong y tế, UVGI còn được giới khoa học cácnước đưa vào ứng dụng cho công nghệ quốc phòng và công nghệ dândụng…

* Cơ chế gây đột biến của tia UV

Tia tử ngoại (UV) có thể làm cho 2 bazơ Thymine trên cùng 1 mạchliên kết với nhau dẫn đến đột biến

Trong trường hợp 2 bazơ Thymine trên cùng một mạch liên kết vớinhau, sau quá trình tái bản DNA, một loạt các DNA “lỗi” được tạo ra Cácphân tử DNA này bị mất 2 cặp bazơ nitơ so với DNA nguyên bản (hai cặp

T = A, T = A liên tiếp) Kết quả của đột biến mất cặp bazơ nitơ làm thayđổi số lượng và trật tự sắp xếp các cặp nucleotide trong gen (đặc biệt dẫntới làm thay đổi khung đọc mã)

Trong trường hợp đột biến xảy ra ở tế bào sinh dưỡng, từ một tế bào

bị đột biến thông qua nguyên phân nó được nhân lên thành mô, có thể ditruyền bằng sinh sản sinh dưỡng Nếu đó là đột biến gen trội sẽ được biểuhiện thành một phần của cơ thể, gọi là "thể khảm" Nếu đó là đột biến genlặn, nó không biểu hiện ra kiểu hình và sẽ mất đi khi cơ thể chết Đột biếnlặn không biểu hiện thành kiểu hình ở trạng thái dị hợp Hậu quả làm giánđoạn một hay một số tính trạng nào đó (Gen -> mARN -> Protein -> tínhtrạng), ít ảnh hưởng đến sức sống và sự sinh sản của sinh vật

Hình 1.2 Cơ chế gây đột biến của tia UV

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu, địa điểm thời gian nghiên cứu

- Vật liệu nghiên cứu: Chồi cúc vàng (Chrysanthemum indicum) in vitro

- Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm Trung tâm Công nghệ Sinh

học - Trường đại học Nông - Lâm Bắc Giang

- Thời gian nghiên cứu: từ tháng 1/2018 đến tháng 5/2018

2.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Nội dung 1: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ Ethyl methane sunfonate (EMS) tới khả năng sống, sinh trưởng và tạo biến dị của chồi cúc vàng (Chrysanthemum indicum) in vitro

+ Phương pháp nghiên cứu: Phương pháp nuôi cấy mô tế bào hiện

hành (theo O.L.Gamborg và G.C.Phillip, 1995)

+ Phương pháp thực hiện: Các đoạn thân mang mắt ngủ (1 – 1.5 cm)

được cắt từ chồi cúc vàng (Chrysanthemum indicum) in vitro đưa vào bình

tam giác chứa 50 ml môi trường MS lỏng (phụ lục) có bổ sung 0,1 mg/l BA(môi trường đã tiệt trùng ở 120oC trong 20 phút) Sau đó, ta bổ sung EMS

vô trùng với các nồng độ tương ứng 0.00%, 0.05%, 0.10%, 0.15%, 0.20%,0.25%, 0.30% rồi đem lắc với tốc độ 100 vòng/phút trong thời gian 2h Mỗicông thức xử lý thực hiện với 60 mẫu, chia làm 3 lần nhắc lại (20 mẫu/bình

xử lý) Sau thời gian xử lý, các chồi cúc được đưa vào bốc cấy, rửa sạchbằng nước cất vô trùng 3 – 4 lần, thấm khô và cấy vào môi trường nhân

nhanh hoa cúc in vitro.

+ Phương pháp bố trí thí nghiệm: hoàn toàn ngẫu nhiên

+ Môi trường nuôi cấy: MS + 30g/l đường saccharose + 100ml/lnước dừa + 100mg/l myo inosytol + 0.1mg/l BA + 5g/l agar, pH= 5.7 Môitrường được khử trùng ở 121ºC trong thời gian 20 phút

+ Điều kiện nuôi cấy: nhiệt độ nuôi cấy 24ºC ± 2ºC, cường độ ánh

sáng 2000 – 2500 lux, thời gian chiếu sáng 14h sáng – 10h tối

Tỷ lệ mẫu biến dị (%) = ∑Số mẫubiến dị x 100 % ∑ sốmẫutheo dõi

2.2.2 Nội dung 2: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian xử lý tia cực tím (UV) tới khả năng sống, sinh trưởng và tạo biến dị của chồi cúc vàng (Chrysanthemum indicum) in vitro

+ Phương pháp nghiên cứu : Phương pháp nuôi cấy mô tế bào hiện

hành (theo O.L.Gamborg và G.C.Phillip, 1995)

+ Phương pháp thực hiện: Các đoạn thân mang mắt ngủ (1 – 1.5 cm)

được cắt từ chồi cúc vàng (Chrysanthemum indicum) in vitro và cấy vào

môi trường nhân nhanh hoa cúc Sau đó, các bình nuôi cấy này được đem

xử lý tia cực tím có cường độ 2025 candela trong các khoảng thời gian: 2giờ, 4 giờ, 6 giờ và 8 giờ Sau xử lý bằng tia cực tím các mẫu được chuyểnsang phòng nuôi cấy ở nhiệt độ 240C ± 20C, ẩm độ 70%, cường độ chiếusáng 2000 -2500 lux, thời gian chiếu sáng 14h sáng/8h tối Mỗi công thứcthực hiện trên 9 bình (6 mẫu/bình), chia làm 3 lần nhắc lại

+ Phương pháp bố trí thí nghiệm: hoàn toàn ngẫu nhiên

+ Môi trường nuôi cấy : MS + 30g/l đường saccharose +100ml/lnước dừa + 100ml/l myo inosytol + 0.1 mg/l BA + 5g/l agar, pH= 5.7 Môitrường được khử trùng 121ºC trong thời gian 20 phút

+ Công thức thí nghiệm:

Công thức 1: Đối chứng (không xử lý tia cực tím)

Công thức 2: Xử lý tia cực tím trong 2h

Công thức 3: Xử lý tia cực tím trong 4h

Công thức 4: Xử lý tia cực tím trong 6h

Công thức 5: Xử lý tia cực tím trong 8h

+ Phương pháp theo dõi: Theo dõi , đo đếm các chỉ tiêu 2 tuần , 4tuần sau cấy chuyển và thực hiện qua 2 lần cấy chuyển

+ Các chỉ tiêu theo dõi:

2.2.3 Nội dung 3: Đánh giá khả năng tạo cây hoàn chỉnh của chồi cúc vàng (Chrysanthemum indicum) sau xử lý EMS in vitro

+ Phương pháp nghiên cứu: Phương pháp nuôi cấy mô tế bào hiện

hành (theo O.L.Gamborg và G.C.Phillip, 1995)

+ Phương pháp thực hiện: Các chồi ngọn (1,5 – 2 cm) thu được từ

các chồi cúc vàng (Chrysanthemum indicum) in vitro sau xử lý EMS (thu

được từ nội dung 1) được cắt và cấy chuyển vào môi trường ra rễ Mỗicông thức thực hiện trên 9 bình (6 mẫu/bình), chia làm 3 lần nhắc lại

+ Phương pháp bố trí thí nghiệm: hoàn toàn ngẫu nhiên

+ Môi trường ra rễ : MS +30g/l đường saccharose +100ml/l nướcdừa + 100mg/l myo innosytol + 5g/l agar, pH= 5.7 Môi trường được khửtrùng 121ºC

+ Công thức thí nghiệm:

Công thức 1: Đối chứng (chồi cúc xử lý EMS 0.00%)

Công thức 2: Chồi cúc xử lý EMS 0.05%

Công thức 3: Chồi cúc xử lý EMS 0.10%

Công thức 4: Chồi cúc xử lý EMS 0.15%

Công thức 5: Chồi cúc xử lý EMS 0.20%

Công thức 4: Chồi cúc xử lý EMS 0.25%

Công thức 5: Chồi cúc xử lý EMS 0.30%

+ Phương pháp theo dõi: Đo đếm các chỉ tiêu 2 tuần sau cấy chuyển+ Các chỉ tiêu theo dõi:

Tỷ lệ mẫu biến dị (%) = ∑Số mẫubiến dị x 100 % ∑ Số mẫutheo dõi

Số chồi trung bình (chồi/ mẫu ) = ∑Số chồitạo thành ∑ Số mẫu theodõi