Nghiên cứu tách và định lượng beta sitosterol trong cây lô hội và dịch chiết từ cây lô hội

ii ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --- Trần Thị Khánh Hòa NGHIÊN CỨU TÁCH VÀ ĐỊNH LƯỢNG BETA-SITOSTEROL TRONG CÂY LÔ HỘI VÀ DỊCH CHIẾT TỪ CÂY LÔ HỘI Chuyên

i

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Trần Thị Khánh Hòa

NGHIÊN CỨU TÁCH VÀ ĐỊNH LƯỢNG BETA-SITOSTEROL TRONG CÂY LÔ HỘI

VÀ DỊCH CHIẾT TỪ CÂY LÔ HỘI

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2018

ii

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Trần Thị Khánh Hòa

NGHIÊN CỨU TÁCH VÀ ĐỊNH LƯỢNG BETA-SITOSTEROL TRONG CÂY LÔ HỘI

VÀ DỊCH CHIẾT TỪ CÂY LÔ HỘI

Chuyên ngành: Hóa phân tích

Mã số : 60440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS ĐỖ THỊ VIỆT HƯƠNG PGS.TS TẠ THỊ THẢO

Hà Nội – Năm 2018

iii

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này lời đầu tiên cho em gửi lời cảm ơn sâu sắc tới

TS Đỗ Thị Việt Hương, Bộ môn Hoá dược – Khoa Hoá học – Đại học Khoa học tự nhiên – ĐHQG Hà Nội và PGS.TS Tạ Thị Thảo, Bộ môn Hoá phân tích – Khoa Hoá học - Đại học Khoa học tự nhiên – ĐHQG Hà Nội đã tận tình hướng dẫn, đóng góp những ý kiến quý báu và tạo mọi điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô giáo giảng dạy tại khoa Hoá học, đặc biệt là các thầy cô trong bộ môn Hoá phân tích, đã cho em những kiến thức quý giá, tạo điều kiện cho em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các đồng nghiệp tại labo Hóa – Hoá dược đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình làm thực nghiệm

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn động viên, chia sẻ mọi khó khăn cùng tôi

Hà Nội, năm 2018

Trần Thị Khánh Hoà

iv

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN iii

DANH MỤC BẢNG BIỂU vi

DANH MỤC HÌNH VẼ vii

BẢNG KÍ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT ix

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 3

1.1 Khái quát về lô hội 3

1.1.1 Mô tả thực vật 3

1.1.2 Sự phân bố 4

1.1.3 Thành phần hóa học của lô hội 4

1.1.4 Nghiên cứu dược lý của cây Lô hội 6

2.1 Đối tượng nghiên cứu 13

2.2 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 13

2.3 Phương pháp nghiên cứu 14

2.3.1 Phương pháp chiết tách β-sitosterol từ dịch chiết cây lô hội 14

2.3.2 Phương pháp phân tích 18

2.4 Nghiên cứu các điều kiện tối ưu và đánh giá phương pháp phân tích 19

2.4.1 Phương pháp nghiên cứu điều kiện tối ưu 19

2.4.2 Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp 19

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21

3.1 Tối ưu điều kiện xác định trên thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC 21

3.1.1 Khảo sát thành phần pha động 21

3.1.2 Khảo sát tốc độ dòng của pha động 23

3.1.3 Khảo sát độ lặp lại của thiết bị 24

3.1.4 Điều kiện tối ưu cho quá trình phân tích β-sitosterol 26

3.2 Tối ưu quá trình tách chiết β-sitosterol từ cây Lô hội 26

3.2.1 Khảo sát cấu trúc các hợp chất phân lập được từ các cặn chiết 26

3.2.2 Khảo sát dung môi chiết mẫu lô hội thô ban đầu 29

v

3.3 Đường chuẩn xác định β-sitosterol 31

3.3.1 Dựng đường chuẩn 31

3.3.2 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 32

3.4 Đánh giá phương pháp phân tích 33

3.4.1 Đánh giá độ lặp lại của phương pháp xử lý mẫu 33

3.4.2 Đánh giá hiệu suất thu hồi của phương pháp 34

3.5 Phân tích mẫu thực tế 37

KẾT LUẬN 40

TÀI LIỆU THAM KHẢO 41

vi

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1 Thành phần hoá học của cây Lô hội 5

Bảng 3 1 Độ lặp lại thời gian lưu và diện tích pic của β-sitosterol 26

Bảng 3.2 Số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất H1 28

Bảng 3 3 Diện tích pic phân tích β-sitosterol trong các hệ dung môi chiết khác nhau 31

Bảng 3 4 Kết quả đánh giá độ tuyến tính của β-sitosterol 31

Bảng 3 5 Bảng kết quả LOD, LOQ của β-sitosterol 33

Bảng 3 6 Độ lặp lại quy trình phân tích β-sitosterol trong mẫu lô hội thô 33

Bảng 3 7 Kết quả diện tích pic đánh giá hiệu suất thu hồi β-sitosterol 36

Bảng 3 8 Kết quả hiệu suất thu hồi xác định β-sitosterol 36

Bảng 3 9 Kết quả phân tích mẫu lô hội thực tế 38

Bảng 3 10 Hàm lượng β-sitosterol trong cây lô hội và dịch chiết từ cây lô hội 39

vii

DANH MỤC HÌNH VẼ

Hình 1 1 Cây lô hội được tác giả trồng tại vườn nhà thuộc tỉnh Nam Định và thu

hoạch để làm mẫu nghiên cứu 3

Hình 1 2 Vỏ ngoài và lớp gel của cây lô hội 3

Hình 1 3 Cấu trúc của các hợp chất anthraquinone tìm thấy trong gel lô hội 6

Hình 1 4 Các hợp chất phytosterol có trong gel lô hội 7

Hình 1 5 Cấu trúc của hợp chất β-sitosterol 8

Hình 2 1 Mẫu lá cây lô hội 13

Hình 2 2 Quy trình điều chế các cặn chiết n-hexan 15

Hình 2 3 Sắc ký lớp mỏng TLC khảo sát cặn chiết EH 17

Hình 2 4 Phân tách các phân đoạn cặn chiết n-hexan (EH) 18

Hình 3.1 Sắc đồ HPLC khi sử dụng hệ dung môi ACN/AcOH 0,1% 22

Hình 3.2 Sắc đồ HPLC khi sử dụng hệ dung môi MeOH/AcOH 0,1% 22

Hình 3.3 Sắc đồ HPLC tại tốc độ dòng 0,6 ml/phút, hệ dung môi ACN/AcOH 0,1% 23

Hình 3.4 Sắc đồ HPLC tại tốc độ dòng 0,8 ml/phút, hệ dung môi ACN/AcOH 0,1% 23

Hình 3.5 Sắc đồ HPLC tại tốc độ dòng 1 ml/phút, hệ dung môi ACN/AcOH 0,1% 24

Hình 3 6 Sắc đồ HPLC của β-sitosterol 5ppm bơm lần 1 25

Hình 3 7.Sắc đồ HPLC của β-sitosterol 5ppm bơm lần 2 25

Hình 3 8 Sắc đồ HPLC của β-sitosterol 5ppm bơm lần 3 25

Hình 3 9 Phổ 1H NMR (CDCl3) của chất H1 27

Hình 3 10 Phổ DEPT của chất H1 27

Hình 3 11 Cấu trúc của H1: 3β-Stigmast-5-en-3-ol 28

Hình 3 12 Sơ đồ quy trình phân tích mẫu lô hội 29

Hình 3 13 Sắc đồ HPLC của β-sitosterol trong dịch chiết MeOH tại tốc độ dòng 0,8 ml/phút, hệ dung môi ACN/AcOH 0,1% 30

viii

Hình 3 14 Sắc đồ HPLC của β-sitosterol trong dịch chiết EtOH tại tốc độ dòng 0,8

ml/phút, hệ dung môi ACN/AcOH 0,1% 30

Hình 3 15 Mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ β-sitosterol 32

Hình 3 16 Sắc đồ HPLC mẫu trắng thiết bị 34

Hình 3 17 Sắc đồ HPLC mẫu không chứa β-sitosterol 35

Hình 3 18 Sắc đồ HPLC mẫu thêm chuẩn lượng β-sitosterol 5 ppm 35

Hình 3 19 Sắc đồ HPLC mẫu thêm chuẩn lượng β-sitosterol 10 ppm 35

Hình 3 20 Sắc đồ HPLC mẫu thêm chuẩn lượng β-sitosterol 20 ppm 36

Hình 3 21 Sắc đồ xác định β-sitosterol từ dịch chiết cây lô hội ở lần đo 1 37

Hình 3 22 Sắc đồ xác định β-sitosterol từ dịch chiết cây lô hội ở lần đo 2 37

Hình 3 23 Sắc đồ xác định β-sitosterol từ dịch chiết cây lô hội ở lần đo 3 38

ix

BẢNG KÍ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT

HPLC High performance liquid

chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

LOD Limit of Detection Giới hạn phát hiện

LOQ Limit of Quantitation Giới hạn định lượng

RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối

1

MỞ ĐẦU

Nước Việt Nam chúng ta nằm trong vùng nhiệt đới cho nên những điều kiện khí hậu như nhiệt độ, lượng mưa, ánh sáng…và hơn hết điều kiện thổ nhưỡng đặc trưng thích hợp cho nhiều loài thực vật có giá trị tồn tại và phát triển Đó là nguồn tài nguyên sinh học quý giá, thuộc loại tài nguyên tái tạo được Từ thời xa xưa cho đến xã hội loài người hiện nay đều khai thác nguồn tài nguyên này để làm thực phẩm, thuốc chữa bệnh, các vật liệu cũng như nhiên liệu cho cuộc sống thường ngày

Lô hội là một loại thực vật được sử dụng nhiều y học cổ truyền thuộc họ

Liliaceae Hơn 360 loài lô hội được biết đến, trong đó loài Aloe vera Linne.var Sinensis Beger tức cây lô hội lá nhỏ là loài duy nhất được tìm thấy ở Việt Nam [4]

Lô hội có hai phần chính, phần lá xanh bên ngoài chứa phần lớn các hợp chất anthraquinon, được sử dụng như một loại thuốc xổ và thuốc tẩy nhẹ; phần thứ hai là một lớp gel màu sáng được dùng làm thực phẩm, chữa trị vết bỏng nhiệt hay các vết thương khác [18, 22]; trị viêm da hay các vết thương do côn trùng cắn [13, 19]; viêm khớp, mụn trứng cá, bệnh gout [7]; hen suyễn, bệnh do nấm Candida, chứng mệt mỏi mãn tính, eczema, viêm loét, rối loạn tiêu hóa [19, 27, 37] Hợp chất β-sitosterol là một được tìm thấy nhiều trong thực vật trong đó có cả cây lô hội, nó là hợp chất phi dinh dưỡng hay còn có tên là hóa chất thực vật, với các chức năng cơ bản giống như cholesterol trong động vật như điều chỉnh tính lưu động của màng tế bào thực vật và các chức năng khác trong thực vật Các hoạt động chức năng gan

(GDP, GOP) có thể được cải thiện với β-sitosterol [39], và điều này có thể làm giảm ung thư tuyến tiền liệt và tăng trưởng tế bào ung thư ruột kết [7, 12] β-

sitosterol cũng được chứng minh làm ức chế khả năng tăng glucose trong máu

trong thí nghiệm trên chuột được gây bệnh tiểu đường type 2 do streptozotocin gây ra [23]

Do tính chất sử dụng rộng rãi của cây lô hội hiện nay cũng như tác dụng hữu

ích của hợp chất β-sitosterol có trong cây lôi hội, nên nhiều công trình khoa học

nghiên cứu về loài cây này Để góp phần vào việc nghiên cứu nhằm nâng cao giá trị

sử dụng của lô hội, chúng tôi chọn đề tài: ―Nghiên cứu tách và định lượng

β-2

sitosterol trong cây lô hội và dịch chiết từ cây lô hội‖ và từ đó đưa ra hướng khai

thác, ứng dụng loài lô hội này trong lĩnh vực thực phẩm chức năng Vì vậy, mục tiêu của đề tài nhằm:

1 Xây dựng quy trình tách và định lượng β- sitosterol từ dịch chiết cây lô

hội

2 Từ đó đánh giá hàm lượng β- sitosterol trong cây lô hội và dịch chiết từ

cây lô hội

3

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 1.1 Khái quát về lô hội

Aloe vera thuộc họ lô hội (L.var.chinesis (Haw) Berger), chi Aloe Chi Aloe

là chi quan trọng và được biết đến nhiều nhất, gồm hơn 400 loài, trong đó chỉ có 4 loài được sử dụng làm thuốc bổ dưỡng và chữa bệnh, một số loài có độc tố Hai loài

được chú ý nhiều nhất là Aloe Ferox Mill và Aloe Vera [11] Theo sách ―Cây cỏ Việt Nam‖ của Phạm Hoàng Hộ thì Aloe ở nước ta chỉ có 1 loài là Aloe Vera

L.sinensis.Beger tức là cây lô hội lá nhỏ [4]

Hình 1 1 Cây lô hội được tác giả trồng tại vườn nhà thuộc tỉnh Nam Định

và thu hoạch để làm mẫu nghiên cứu

1.1.1.Mô tả thực vật

Theo Võ Văn Chi (1991), Đỗ Thanh Hội (1997), lô hội là 1 loại cây mọng nước, sống lâu năm, không có thân hoặc thân rất ngắn, thân ngắn hóa gỗ, lá màu xanh không cuống, mọc sát nhau Lá dài, dễ gẫy và có gai hai bên mép, trên mặt có những đốm trắng [2, 3]

Lô hội trưởng thành có lá mập, dài 30-50 cm, rộng 5-10 cm, dày 1-2 cm Lá

lô hội gồm 2 phần: phần vỏ ngoài là lớp xanh, khi cắt ngang chảy ra nhựa màu vàng

có mùi hắc, để khô chuyển thành màu đen; phần trong là phần thịt mọng nước ở

4

dạng gel Hoa nở vào mùa thu và hè, mọc thành chùm dài màu vàng lục hoặc phớt hồng Quả nang có hình bầu dục, lúc đầu có màu xanh, sau chuyển sang vàng Ở Việt Nam, lô hội thường được trồng làm cảnh; lá, hoa và rễ được dùng làm thuốc

Hình 1 2 Vỏ ngoài và lớp gel của cây lô hội

1.1.2.Sự phân bố

Chi Aloe Vera có khoảng hơn 400 loài trên thế giới, phân bố ở vùng nhiệt đới Châu Phi, Madagasca và Ả Rập Ở nước ta cây lô hội được trồng nhiều nhất ở các tỉnh phía nam và ven biển miền Trung như Bình Thuận, Ninh Thuận Lô hội là cây có biên độ sinh thái khá rộng, thích nghi với nhiều loại đất, kể cả đất cát pha hoặc chỉ có cát Chúng chịu hạn và khô nóng rất giỏi vì chúng có khả năng tồn trữ nước trong lá, sinh trưởng phát triển mạnh trong điều kiện chiếu sáng đầy đủ và ra hoa quả nhiều

1.1.3 Thành phần hóa học của lô hội

Có rất nhiều nghiên cứu tập trung phân lập các hợp chất trong Aloe vera và kiểm tra các đặc tính dược phẩm của chúng Aloe vera gel được báo cáo chứa chủ yếu các glycoprotein, anthraquinones, saccharides và chất có trọng lượng phân tử thấp [33] Các hợp chất anthraquinoes được nhận dạng trong lô hội là aloin, aloe

emodin, balaloin và emodin (bảng 1.1) với các cấu trúc thể hiện trong hình 1.3 [38]

Carbohydrate Mannan tinh khiết, Mannan acetyl hóa, Gluco mannan acetyl

hóa, gluco galacto mannan, galactan, galacto galacturan, arabino galactan, galacto gluco arabino mannan, chất pectic, xylan, và cellulose

Chromones glucosyl-(2'-O-cinnamoyl)-7-O-methylaloediol A,

8-C-glucosyl-(S)-aloesol, C-glucosyl-7-O-methylaloediol, 8-C-glucosyl noreugenin, iso aloeresin D, isorabai chromone, và neoaloesin

8-C-glucosyl-7-O-methyl-(S)-aloesol,8-Enzyme Alkaline phosphatase, amylase, carboxypeptidase, catalase,

cyclooxidase, cyclooxygenase, lipase, oxidase, carboxylase phosphoenolpyruvate, và superoxide dismutase

Khoáng chất vô cơ Canxi, clo, crom, đồng, sắt, magiê, mangan, kali, phốt pho,

natri, kẽm Vitamin B1, B2, B6, C, E, và axit folic

Axit amin Alanine, arginine, axit aspartic, axit glutamic, glycine, histidine,

hydroxyproline, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, proline, threonine, tyrosine, và valine

Saccharides Mannose, glucose, L-rhamnose và aldopentose

6

Hình 1 3 Cấu trúc của các hợp chất anthraquinone tìm thấy trong gel lô hội

1.1.4 Nghiên cứu dược lý của cây Lô hội

Một số nghiên cứu đã chứng minh rằng các polysaccharides trong lô hội có khả năng kiểm soát lượng đường trong máu, kích thích sản xuất chất chống oxy hóa của cơ thể và giảm cholesterol Nó làm giảm lượng đường và triglycoside cho bệnh nhân tiểu đường [19, 21, 22,24]

Nước Aloe vera giúp tăng cường hấp thu các chất dinh dưỡng và duy trì cân bằng lượng đường trong máu bằng cách cải thiện hoạt động tiêu hóa Aloe vera có thể tăng cường tác dụng các loại thuốc hoặc các chế phẩm thảo dược được sử dụng với insulin cho bệnh đái tháo đường [36]

Nghiên cứu ảnh hưởng của Aloe vera lên đường huyết và lipid đã cho thấy kết quả khác nhau trên các mô hình động vật khác nhau Trong mô hình động vật gặm nhấm, kiểm soát mãn tính của Aloe vera với alloxan (chất phá hủy tế bào beta của tuyến tụy - nơi tiết ra insulin) dẫn đến giảm đường huyết ở chuột mắc bệnh tiểu đường Mức độ insulin trong máu, huyết tương lúc đói và làm giảm nồng độ cholesterol, triglycerid và acid béo tự do trong huyết tương, gan và thận của chuột

bị tiểu đường [23, 26, 31]

7

Trong nghiên cứu thử nghiệm của Kim và cộng sự, tác dụng trị đái tháo đường của Aloe vera gel đã được nghiên cứu trên chuột bệnh béo phì (DIO) Uống gel giảm nồng độ đường trong máu đến mức độ bình thường, giảm đáng kể insulin huyết tương,

và hạ mức chất béo trung tính trong gan và huyết tương của chuột DIO [24]

Năm 2006, Tanaka Mvà cộng sự thuộc phòng thí nghiệm nghiên cứu Sinh Hóa, Kanagawa, Nhật Bản trong nghiên cứu đánh giá tác dụng chống tăng đường huyết của Aloe Vera đã tách được một số hợp chất từ gel Trên cơ sở dữ liệu quang phổ, các hợp chất này được xác định thuộc nhóm phytosterol gồm lophenol, 24 -methyl-lophenol, 24-ethyl- lophenol, cycloartanol, và 24 - methylene – cycloartanol [35]

CH3C

H3H

H H

H H H O

H3 H

CH3 H H

trưng, không tan trong nước nhưng tan trong ancol [8]

β-sitosterolcũng được tìm thấy trong các loài lô hội, nó có cấu trúc hoá học

tương tự cholesterol, trong phân tử có chứa 1 liên kết đôi rất dễ bị oxi hoá từ đó được đặc trưng bởi đặc tính chống ung thư và chống xơ vữa Nó có tác dụng làm giảm cholesterol trong máu do phong toả sự hấp thu cholesterol, kích thích chức

năng miễn dịch, kiểm soát sự tăng sinh tế bào Ngoài ra, β-sitosterol còn làm giảm lượng đường trong máu và là tác nhân kháng khuẩn, kháng vi rút và kháng nấm β-

sitosterol có nhiều trong giới thực vật và đã được tìm thấy trong các loại hạt, quả

bơ, hạt bông, lúa mì [8, 15, 29, 32]

β-sitosterolcòn là một trong những thành phần chính của một số loại thảo

dược, nó có tác dụng kiểm soát hàm lượng cholesterol, giảm hoạt động của tế bào ung thư, thúc đẩy sức khoẻ tuyến tiền liệt, tăng khả năng miễn dịch trong cơ thể

người β-sitosterol cũng đã được xác định bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng

cao từ một số loại thảo mộc và dầu thực vật [20]

Hình 1 5 Cấu trúc của hợp chất β-sitosterol

9

Trong một nghiên cứu đánh giá về khả năng kháng viêm của β-sitosteroltrên loài chuột, các tác giả tiến hành nghiên cứu khả năng kháng viêm của β-

sitosterolvới hội chứng phù nề chân của chuột, chuột phù tai và viên màng phổi ở

chuột Các kết quả thu được đều cho thấy tác dụng ức chế từ 50% đến 70% với chuột phù nề chân, với chuột viêm phổi thì lượng dịch giảm tới 46%, còn với chuột phù tai khả năng ức chế là 75% Từ các kết quả cho thấy khả năng kháng viêm của

β-sitosterolkhá tốt [46]

1.3.Tổng quan về phương pháp tách và định lượng β-sitosterol

Một số nghiên cứu đã tách và xác định hàm lượng β-sitosterol cùng với các

sterol thực vật khác bằng các phương pháp sắc kí khí thường hoặc có kết nối như kết nối với đầu dò ngọn lửa, hoặc kết hợp khối phổ có kĩ thuật ion hoá điện tử như 2 nghiên cứu được trình bày dưới đây:

TheoSorenson WR và Sullivan D [40]thì β-sitosterolđược tách ra từ cây Saw

Palmetto và được định lượng bằngphương pháp sắc kí khí với đầu dò ion hoá ngọn lửa(GC-FID) Mẫu cây Saw Palmetto sau khi thực hiện xà phòng hoá ở nhiệt độ cao với dung dịch KOH và dung môi ethanol, phần không xà phòng hoá có chứa những phytosterol được chiết với toluene Sau đó được mang đi định lượng bằng phương

pháp sắc kí khí với đầu dò ion hoá ngọn lửa (GC-FID) Hàm lượng của β-sitosterol được phát hiện ở nồng độ khá lớn, đường chuẩn xác định β-sitosterol cho hệ số

tương quan lớn hơn hoặc bằng 0,995, với độ lệch chuẩn tương đối RSD là 1,39 10,5%, hiệu suất thu hồi từ 85 – 103%

-Trong một nghiên cứu khác [43], cholesterol và 4 phytosterol trong đó

cóβ-sitosterol đã được xác định trong thực phẩm không dẫn xuất (dầu thực vật, trứng,

sữa, nước giải khát) bằng phương pháp sắc kí khí kết hợp khối phổ có kết hợp kĩ thuật ion hoá điện tử (GC-EI-MS/MS) Các mẫu phân tích được xà phòng hoá với KOH 7,5% trong methanol, đun nóng trong thời gian 60 phút để quá trình xà phòng hoá xảy ra hoàn toàn Dung dịch thu được đem chiết với hỗn hợp n-hexane/ ete dầu hoả (50:50,v/v) Dịch chiết thu được tiến hành cô quay chân không để đuổi bớt dung môi sau đó rửa giải với tetrahydrofuran Lớp tetrahydrofuran được lọc với màng lọc 0,22mm và bơm vào hệ thống GC Giới hạn định lượng với cholesterol và

10

4 phytosterol là 2 mg/kg Hiệu suất thu hồi của cholesterol và 4 phytosterol từ thực phẩm trong khoảng 91% đến 100% [42]

Trong một nghiên cứu khác [45], β-sitosterol và cholesterol đã được chiết

tách và xác định hàm lượng từ các mẫu dầu đậu tương và dầu hướng dương Trong nghiên cứu, các tác giả đã đồng nhất các mẫu dầu với Triton X-100, sau đó thêm methanol để tạo 2 pha Sau đó tiến hành li tâm để thu được phần chiết Triton X-

100, sau đó được xử lí bằng hỗn hợp nước và chloroform (1000 μL:300 μL) để chiết chất phân tích trong pha chloroform bằng hệ thống rung siêu âm Sau khi ly tâm, lớp chloroform được bơm vào hệ thống GC-FID Sự ảnh hưởng của một số yếu tố đến kết quả phân tích đã được đánh giá Trong quá trình tối ưu hoá các điều kiện thực nghiệm, khoảng tuyến tính của phương trình đường chuẩn trong khoảng 1,0 – 30,0 mg/L, với hệ số tương quan là 0,994 cho các chất phân tích Giới hạn phát hiện của phương pháp nằm trong khoảng 0,2 – 0,7 mg/L Giới hạn định lượng trong khoảng 0,7 – 2,4 mg/L Trong cùng ngày, độ lệch chuẩn tương đối trong khoảng 1,0 đến 2,7% Các điều kiện phân tích đã được áp dụng thành công và cho

kết quả đáng tin cậy trong việc xác định hàm lượng β-sitosterolvà cholesterol trong

mẫu dầu đậu nành và dầu hướng dương Hiệu suất thu hồi trung bình dao động từ 93,6% đến 105,0%

Ngoài ra β-sitosterolcòn được định tính bằng phương pháp sắc kí lớp mỏng,

sau đó định lượng bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao, hoặc định lượng bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao với các loại detector, và các loại dung môi pha động khác nhau như:

Susmlta Chawla và Yogendra Kumar Bansal [41] đã định tính và định lượng

β-sitosterol từ việc nuôi cấy in vitro vỏ thân và vỏ của cây Helicteres Isora L Trong nghiên cứu này, dung môi chiết axetone được sử dụng cho phương pháp sắc kí lớp mỏng với thành phần pha động là toluene : diethyl ether : ethylacetate : axit acetic

(80:10:10:0,2) đã định tính được sự có mặt của β-sitosterol Sau đó sử dụng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) định lượng được β-sitosterol tại bước sóng 196nm.Hàm lượng β-sitosterol tối đa được xác định trong thân và vỏ của cây

Helicteres Isora L bằng nuôi cấy in vitro là 0,18%

11

Một báo cáo cũng đã được đưa ra về sử dụng phương pháp HPLC để phân

tích β-sitosterol trong một số dược liệu và dầu thực vật Báo cáo cho thấy phương pháp HPLC là phương pháp thích hợp để xác định β-sitosterol Một số điều kiện về

thành phần pha động đã được bài báo đưa ra với các mẫu phân tích khác nhau Phân

tích hàm lượng sitosteroltrong mẫu sitosterolchuẩn và viên nén

β-sitosterolđược thực hiện với thành phần pha động là 100% acetonitril ở pH 6,5 cho

thấy thời gian lưu là 67,25 và 67,89 Với thành phần pha động là 95% acetonitrile

và 5% ethanol cho thấy thời gian lưu đều là 55,75 với 85% acetonitrile và 15% ethanol cho thấy thời gian lưu lần lượt là 36,23 và 36,81 Trong một số loại dầu

thực vật, khi xác địnhβ-sitosterolthì tài liệu cũng đưa ra thời gian lưu như: với dầu

mầm lúa mì là 36,91; dầu hạt bông là 36,21; dầu đậu phộng 36,12 [41]

Nair VD, Kanfer I và Hoogmartens J[42] đã định lượng đồng thời

stigmasterol, β-sitosterolvà stigmastanol trong các loại thảo dược bằng phương

pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao với detector ELSD Các hợp chất được xác định trên

hệ thống HPLC, pha tĩnh là cột C18, pha động là methanol: nước (95:5 v/v), tốc độ dòng 1ml/phút, với thời gian lưu là 12 phút Trong nghiên cứu các tác giả đã sử dụng cholesterol (50 microg/ml) là chất chuẩn nội, methanol là dung môi chiết tách Các thông số giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) là 2 và 5 microg/ml Giá trị độ lệch chuẩn (%RSD) 3%, hiệu suất thu hồi từ 97 đến 103% khi phân tích 5 sản phẩm thảo dược Từ đây, các tác giả đã nhận định phương pháp này

có thể được dùng để khảo sát các sản phẩm thảo dược có sẵn công thức nhằm kiểm soát chất lượng sản phẩm

Bên cạnh đó β-sitosterolcũng được xác định bằng phương pháp sắc kí lỏng

hiệu năng cao với kĩ thuật ion hoá tia điện và kết hợp với khối phổ như ở nghiên cứu sau đây: Hàm lượng các phytosterol tự do (cholesterol, ergosterol, stigmasterol,

β-sitosterol) đã được xác định từ lá cây thuốc lá bằng phương pháp sắc kí lỏng siêu

hiệu năng với kĩ thuật ion hoá tia điện kết hợp với khối phổ Việc tách 4 phytosterol trên được thực hiện trên hệ pha đảo cột C18, trong thời gian là 6 phút Kỹ thuật ion hoá tại áp suất khí quyển (API) được sử dụng kết hợp với phổ khối cho thấy hiệu quả cao trong việc phân tích Quá trình định tính và định lượng các chất phân tích được thực hiện ở chế độ khảo sát đa phản ứng (MRM), từ đó cho hiệu suất thu hồi

12

khả quan, dao động từ 86,3% đến 106,4% ở nồng độ thấp trong lá thuốc lá Độ chính xác của phép đo trong ngày và độ chính xác của phép đo giữa các ngày trong khoảng 0,43% và 2,42% Giới hạn định lượng (LOQ) là 4,8 đến 9,7 ng/mL Từ đó nhóm tác giả nhận định đây là phương pháp đơn giản, có độ nhạy cao, thời gian phân tích nhanh cho quá trình phân tích các phytosterol tự do trong lá thuốc lá [44]

Như vậy trong rất nhiều nghiên cứu đã chỉ ra nguồn gốc thực vật của

β-sitosterol, như có trong các loại hạt, quả, và đặc biệt có trong cây lô hội, một loại

cây rất dễ trồng và được trồng khá phổ biến ở Việt Nam, cùng với những lợi ích

đáng kể của β-sitosteroltrong hỗ trợ điều trị một số chứng bệnh, chúng tôi nhận thấy việc phân tích đánh giá hàm lượng β-sitosteroltrong dịch chiết cây lô hội và

cây lô hội là rất cần thiết Theo điều kiện phòng thí nghiệm cùng với việc nghiên cứu các tài liệu tham khảo, chúng tôi đã lựa chọn phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao làm phương pháp phân tích Hệ thống sắc kí lỏng hiệu năng cao Agilent

1200, detector PDA (max = 210nm), cột C30 (5μm; 4,6 x 250mm) Khi tiến hành phân tích bằng phương pháp HPLC chúng tôi tiến hành khảo sát các yếu tố thành

phần pha động và thời gian lưu của chất phân tích Để tách β-sitosterolra khỏi cây

lô hội chúng tôi dự kiến chiết bằng phương pháp chiết lỏng – lỏng với các dung môi phân cực như các ancol, và chúng tôi dự kiến khảo sát các loại dung môi chiết để

phân tách β-sitosterol

13

CHƯƠNG 2 -NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là phần gel của lá cây lô hội được nuôi trồng ở vườn nhà tại tỉnh Nam Định và được thu hái vào tháng 9/2017

Hình 2 1 Mẫu lá cây lô hội Mẫu thực vật được xác định là loài Aloe Vera Linne var Sinensis Beger bởi giáo sư Nguyễn Thế Nhã, Khoa Quản lý tài nguyên rừng và môi trường, ĐH Lâm Nghiệp, Hà Nội kết hợp với tham khảo tài liệu

2.2 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất

+) Thiết bị

- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1200, detector PDA

- Cột sắc ký Acclaim C30 (250mm × 4,6mm × 5μm) hãng Thermo

- Máy lắc xoáy (vortex) VELP

- Máy ly tâm MIKRO 22R có thể đạt được tốc độ tối thiểu 4000 vòng/phút với ống ly tâm 50 mL

- Cân phân tích (có độ chính xác 0,1mg và 0,01mg) (Metter Toledo)

- Máy cất quay chân không có bể điều nhiệt Buchi, rotavapor R215

- Sắc kí bản mỏng silica gel tráng DC Alufolien 60F254

- Máy Bruker AM x 500, TMS (tetrametyl silan)

- Bình định mức thuỷ tinh loại A dung tích 10, 25, 50, 100, 500 mL

- Ống nghiệm thủy tinh

+) Chất chuẩn

- Chất chuẩn: 10 mg β-sitosterol độ tinh khiết 98% được cung cấp bởi viện

Hóa sinh biển, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam Độ tinh khiết của hợp chất

đã được xác định bằng các phương pháp vật lý

- Dung dịch chuẩn gốc β-sitosterol 500 ppm: cân chính xác 5,1021 mg chất chuẩn β-sitosterol bằng cân phân tích có độ đọc là 0,0001g, hòa tan và định mức tới

10 mL bằng ACN Bảo quản trong tủ lạnh 40C, thời gian 4 tuần

+) Các loại hóa chất, dung môi khác:

Methanol (Merck 99,9%), Acetonitril (Merck 99,9%), acid acetic băng (Merck), ethylacetat (Trung Quốc), n-hexan (Trung Quốc) Nước cất hai lần, nước cất deion

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp chiết tách β-sitosterol từ dịch chiết cây lô hội

2.3.1.1 Điều chế các cặn chiết từ dịch chiết cây lô hội

β-sitosterollà một hợp chất thuộc nhóm steroid, có độ phân cực thấp, vì vậy

nó tan tốt trong các dung môi hữu cơ có độ phân cực kém như benzene, diethyl ether, n-hexan, toluene, chloroform, ancol Lá lô hội có đặc điểm có lớp vỏ khá dày

và phần gel chứa một lượng nước khá lớn, đồng thời là mẫu thực vật có chứa rất nhiều các hợp chất hữu cơ thuộc các lớp chất khác nhau như phân cực trung bình và rất phân cực, vì vậy việc loại bớt các hợp chất này là cần thiết để làm giảm khả năng ảnh hưởng của chúng đến quá trình phân tích, từ đó việc chọn phương pháp chiết lỏng-lỏng là phù hợp Do trong mẫu thực vật có chứa nhiều các hợp chất hữu

cơ nên trước hết phải dùng một dung môi có độ phân cực cao để tách toàn bộ phần

15

hữu cơ ra khỏi phần vô cơ và các chất xơ của mẫu thực vật Từ đó chúng tôi tiến hành khảo sát loại dung môi chiết mẫu thô ban đầu, cụ thể là 2 loại dung môi ethanol và methanol Sau đó tiến hành chiết dịch chiết ethanol và methanol với dung môi có độ phân cực kém Qua tham khảo các tài liệu 42, chúng tôi lựa chọn dung môi chiết lần 2 là n-hexan và khảo sát cấu trúc của các hợp chất có thể phân lập từ các cặn chiết n-hexan Quy trình điều chế cặn chiết n-hexan được thể hiện ở

sơ đồ dưới đây:

Hình 2 2 Quy trình điều chế các cặn chiết n-hexan 2.3.1.2 Xử lí mẫu nghiên cứu

16

Thu hái khoảng 2 kg lá lô hội, rửa sạch, tráng bằng nước cất sau đó phơi khô trong bóng râm cho ráo nước trong Tách lấy phần gel lô hội khỏi lớp vỏ xanh, phần gel lô hội được sấy khô trong tủ sấy ở 45oC trong 24 giờ, sau đó để nguội và cân trên cân phân tích được khối lượng thô gel lô hội (mthô = 104,1089g) Tiến hành ngâm gel lô hội thô trong 2 loại dung môi là methanol và ethanol, rung siêu âm 30 phút ở nhiệt độ 40oC để giúp quá trình hoà tan các chất phân tích dễ dàng hơn Sau

đó lọc lấy dịch chiết 3 lần và gộp dịch chiết Tiến hành cô quay dịch chiết ở áp suất thấp để loại bớt dung môi (Büchi, Rotavapor R215) Các dịch chiết methanol và ethanol thu được lại mang chiết với dung môi n-hexan Dịch chiết này lại được cô quay ở áp suất thấp để loại bớt dung môi thu được các cặn chiết ở dạng cao lỏng tương ứng n-hexan là cặn EH Sau đó tiến hành xác định thành phần và phân tích hàm lượng trong cặn EH

2.3.1.3 Phân lập β-sitosterol từ cặn chiết cây lô hội

β-sitosterol là một hợp chất thuộc nhóm steroid, có độ phân cực thấp, vì vậy

theo dự đoán hợp chất này sẽ nằm chủ yếu trong cặn chiết n-hexan EH, nên chúng tôi tiến hành phân lập β-sitosterol từ cặn chiết EH

Trước khi thực hiện phân lập β-sitosterol từ cặn chiết n-hexan (EH) bằng

phương pháp sắc ký cột thường CC, việc khảo sát hệ dung môi tách tốt nhất trên sắc

ký lớp mỏng TLC để có thể thu được các hợp chất tinh khiết là điều cần thiết Tiến hành khảo sát các cặn chiết trên sắc ký lớp mỏng TLC: sử dụng bản mỏng silica gel tráng DC Alufolien 60F254 để khảo sát hệ dung môi tách tốt nhất cho các cặn chiết Sau khi triển khai sắc kí, quan sát sắc ký đồ dưới ánh sáng tử ngoại (bước sóng  =

254 nm) và phun thuốc thử vanillin sunfat 1% lên lớp mỏng và hơ nóng, đanh dấu các vết tách hiện trên TLC, nhận thấy cặn chiết EH tách tốt nhất với hệ dung môi n-hexan/etylacetat 19:1 (v/v) Sau đó tiến hành tách cặn chiết thành các phân đoạn trong trên sắc kí cột nhồi silicagel bằng phương pháp rửa giải gradient với hỗn hợp dung môi khác nhau, và triển khai sắc kí lớp mỏng TLC để gom các phân đoạn giống nhau

độ phòng, ở phân đoạn EH3.3 có xuất hiện các tinh thể bám lên thành ống nghiệm, chúng tôi có thu các tinh thể này vào ống eppendorf, kí hiệu tinh thể thu đƣợc là H1 Quá trình phân tách dịch chiết và các nhóm phân đoạn của cặn chiết EH đƣợc

tóm tắt trong hình 2.4

Tốc độ dòng pha động: 0,8mL/phút

Hệ dung môi pha động ACN:AcOH 0,1%