định lượngcefuroxime acetyl trong thuốc kháng sinh dạng viên bằng phương pháp hplc

Kháng sinh là những chất có khả năng tiêu diệt vi khuẩn hay kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn một cách đặc hiệu. Nó có tác dụng lên vi khuẩn ở cấp độ phân tử, thường là một vị trí quan trọng của vi khuẩn hay một phản ứng trong quá trình phát triển của vi khuẩn. Cefuroxime acetyl là một kháng sinh thế hệ 2 của nhóm cephalosporin nằm trong danh mục các kháng sinh có chứa vòng Beta_lactam. Cefuroxime acetyl có tác dụng trị bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn gây ra về các đường hô hấp, taimũihọng và các bệnh về đường tiêu hóa, đường sinh dục. Cefuroxime là loại thuốc có hoạt tính kháng khuẩn hữu hiệu và có khả năng phân bố rộng khắp cơ thể, kể cả dịch màng phổi, hoạt dịch và thủy dịch. Cefuroxime thường có 2 dạng muối: Cefuroxime natri dễ tan trong nước, thường được dùng ở dạng bột pha tiêm, cefuroxime acetyl ít tan trong nước thường được dùng dưới dạng viên nén

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN- ĐHQG HÀ NỘI

KHOA HÓA HỌC

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG CEFUROXIME ACETYL TRONG THUỐC KHÁNG SINH DẠNG VIÊN BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC HỆ CHÍNH QUY

CHUYÊN NGÀNH HÓA PHÂN TÍCH

Giảng viên hướng dẫn:

Sinh viên : Nguyễn Quốc Cường

Lớp : K53a hóa học

HÀ NỘI – 2012

LỜI CẢM ƠN

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin cảm ơn đến TS

Từ Bình Minh, ThS Lê Thị Hường Hoa người đã giáo đề tài và tận

tình hướng dẫn em trong quá trình nghiên cứu để em có thể hoànthành luận văn này

Em xin chân thành cảm ơn ThS Hoàng Thanh Tâm cùng các

anh chị trong khoa Mĩ Phẩm đã nhiệt tình chỉ bảo, giúp đỡ em trongquá trình em thực tập tại khoa Mĩ Phẩm -Viện kiểm nghiệm thuốc TW

Em xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo trong Bộ môn HóaPhân Tích cùng các thầy, cô giáo Trường Đại Học Khoa Học TựNhiên đã giảng dạy và trang bị cho em những kiến thức cơ sở trongnhững năm qua, các kỹ thuật viên phòng thí nghiệm trong Bộ mônHóa Phân Tích đã tận tình giúp đỡ trong quá trình nghiên cứu

Cuối cùng, em muốn nói lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè,những người đã tận tình giúp đỡ và động viên khích lệ để em có thể

hoàn thành bản khóa luận này

Hà Nội, Ngày 20, Tháng 5, Năm 2012

Sinh viên:

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ

1.4 Các phương pháp đã áp dụng để định lượng Cefuroxime

1.4.1 Phương pháp quang phổ tử ngoại

1.4.2 Phương pháp LCMS

1.4.3 Phương pháp HPLC định lượng viên nén Cefuroxime

1.5 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

1.5.1 Khái niệm về sắc ký

1.5.2 Khái niệm về sắc ký lỏng hiệu năng cao

1.5.3 Nguyên tắc của quá trình sắc ký

1.5.4 Nguyên tắc cấu tạo của máy sắc ký lỏng hiệu năng cao

1.5.5 Pha tĩnh trong sắc ký lỏng hiệu năng cao

1.5.6 Pha động trong sắc ký lỏng hiệu năng cao

1.5.7 Ứng dụng của sắc ký lỏng hiệu năng cao

1.5.7.1 Định tính

1.5.7.2 Định lượng

1.5.7.3 Thử tạp chất

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU (NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, DUNG MÔI VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU)

2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị

2.1.1 Dung môi và hóa chất

2.1.2 Thiết bị và dụng cụ

2.2 Đối tượng nghiên cứu, nội dung, phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.2.4 Một số công thức sử dụng trong thống kê

Chương 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Khảo sát lựa chọn qui trình xử lý mẫu

3.1.1 Lựa chọn dung môi pha mẫu

3.1.2 Quy trình xử lý mẫu

3.2 Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký

3.3 Đánh giá tính thích hợp của hệ thống sắc ký

3.4 Khảo sát khoảng tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ

3.5 Khảo sát độ lặp lại của quá trình phân tích

3.6 Khảo sát độ đúng của phương pháp

3.7 Xác định giới hạn định lượng và giới hạn phát hiện của

DUV-VIS : Detector tử ngoại khả kiến.

DĐVN : Dược điển Việt Nam

KS : Kháng sinh

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay, nền kinh tế nước ta đang phát triển đời sống nhândân ngày càng được cải thiện nhưng nguy cơ về bệnh tật cũng ngàycàng tăng Từ lâu, người ta đã tìm ra các kháng sinh có tác dụng diệt

kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn một cách đặc hiệu Nó có tác

dụng lên vi khuẩn ở cấp độ phân tử, thường là một vị trí quan trọng của vi khuẩn hay một phản ứng trong quá trình phát triển của vi

khuẩn Cefuroxime acetyl là một kháng sinh thế hệ 2 của nhóm

cephalosporin nằm trong danh mục các kháng sinh có chứa vòngBeta_lactam Cefuroxime acetyl có tác dụng trị bệnh nhiễm trùng do

vi khuẩn gây ra về các đường hô hấp, tai-mũi-họng và các bệnh vềđường tiêu hóa, đường sinh dục Cefuroxime là loại thuốc có hoạttính kháng khuẩn hữu hiệu và có khả năng phân bố rộng khắp cơthể, kể cả dịch màng phổi, hoạt dịch và thủy dịch

Cefuroxime thường có 2 dạng muối: Cefuroxime natri dễ tantrong nước, thường được dùng ở dạng bột pha tiêm, cefuroximeacetyl ít tan trong nước thường được dùng dưới dạng viên nén

Để góp phần vào công tác kiểm tra chất lượng thuốc nói chung

và nghiên cứu phương pháp định lượng Cefuroxime nói riêng, chúngtôi thực hiện đề tài:

“Nghiên cứu định lượng cefuroxime acetyl trong thuốc viên nén

bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao”

Mục tiêu của đề tài:

1 Khảo sát chọn ra quy trình xử lý mẫu, điều kiện sắc ký phùhợp để có thể phân tích được cefuroxime acetyl trong chế phẩmbằng phương pháp HPLC

2 Ứng dụng phương pháp vừa xây dựng để định lượngCefuroxime acetyl trong chế phẩm viên nén Cezirnate 500mg trên thịtrường

Cơ chế tác dụng: Ngăn cản xây dựng và giảm độ bền của

màng tế bào vi khuẩn nên chủ yếu kìm hãm sự tồn tại và phát triểncủa vi khuẩn

1.1.2 Kháng sinh Cephalosporin [5,8,9].

Cấu tạo :

Năm 1948, Abraham và cộng sự phân lập từ môi trường nuôicấy nấm cephalosporium aeremonium được cephalosporin C là dẫnchất acyl của acid 7-aminocephalosporanic(A7AC)

Các kháng sinh cephalosporin được dùng là kháng sinh bán

có tác dụng sinh học

Cơ chế tác dụng: Ngăn cản xây dựng và giảm độ bền của

màng tế bào vi khuẩn nên chủ yếu kìm hãm sự tồn tại và phát triểncủa vi khuẩn

1.1.2.1 Các thế hệ cephalosporin và chế phẩm đại diện

1.2.1 Cefuroxime natri [5,8,9,11].

Công thức cấu tạo: C16H15N4NaO8S

+ Cefuroxime natri hấp thụ ánh sáng mạnh ở bước sóng: 278nm

Công dụng: Có phổ kháng khuẩn điển hình của cephalosporin

thế hệ II Và trong thế hệ này, duy nhất là chất đạt nồng độ tác dụng

ở dịch não tủy

Chỉ định: cho các trường hợp :

+ viêm màng não, bệnh lậu

+ viêm đường hô hấp dưới, viêm phổi, viêm phế quản

+ viêm đường tiết niệu, có hạn chế số trường hợp được dùng so vớicác chất thế hệ II

+ nhiễm trùng máu, viêm xương ( bởi các vi khuẩn nhạy cảm).+ phòng nhiễm trùng trong phẫu thuật

Dạng thuốc: Lọ bột pha tiêm

1.2.2 Cefuroxim acetyl [5,8,9,11].

Công thức cấu tạo: C20H22N4O10S

Tên khoa học:

Là hỗn hợp 2 đồng phân không đối quang (diastereo-isomer A

và diastereo-isomer B) của

(1RS)-1-(acetyloxy)ethyl(6R,7R)-3-

((cacbamoyloxy)methyl)-7((Z)-2-(furan-2-(furan-2-yl)-2-(me-2-carboxylat

thoxyimino)acetyl)amino)-8-oxo-5-thia-1-a-azabicyclo-(4.2.1)oct-2-en-Tính chất:

+ Bột trắng hoặc trắng ngà, ít tan trong nước, tan trong aceton ethylacetate và methanol, ít tan trong ethanol

+ Cefuroxime acetyl hấp thụ ánh sang mạnh ở bước sóng 278nm

+ Là tiền chất của cefuroxime, có ít hoạt tính kháng khuẩn khi chưa

bị thủy phân thành cefuroxim trong cơ thể

Chỉ định: Cho các nhiễm khuẩn nhẹ hơn, nhất là các trường

hợp viêm tai giữa, viêm phổi, viêm đường tiết liệu

Dạng thuốc: thuốc viên

1.3 Tình hình sử dụng thuốc kháng sinh Beta-lactame

và Cefuroxime ở Việt Nam.

Bệnh nhiễm khuẩn chiếm 60% trong số các bệnh có tỷ lệ mắccao nhất tại Việt Nam, do vậy kháng sinh vẫn là loại thuốc được dungphần lớn Tuy nhiên việc sử dụng kháng sinh ở bước ta vẫn cònchưa hợp lý Trước tiên là việc chuẩn đoán bệnh chưa đúng do bác

sĩ chưa chú ý, chưa xác định chính xác vi khuẩn gây bệnh; chưa chú

ý hiệu chỉnh liều kháng sinh nhóm aminoglycozid, beta lactam…đốivới nhóm bệnh nhân đặc biệt (người cao tuổi, trẻ em, phụ nữ mang

thai, bà mẹ cho con bú…) Qua khảo sát tình hình sử dụng khángsinh ở bệnh nhi viêm phổi trước và trong quá trình điều trị tại khoaNhi bệnh viện Bạch Mai trong năm 2006 với đối tượng nghiên cứu là

303 trẻ từ 2 tháng tới 5 tuổi Kết quả cho thấy 63% (191/303) bệnhnhi đã dùng KS trước khi vào viện, trong đó 29,3% không có đơnthầy thuốc Cephalosporin là thuốc được sử dụng phổ biến nhất(55,1%) Tất cả 303 trẻ viêm phổi vào viện đều được điều trị KS từ 2tới 32 ngày, trung bình là 8,7 ± 4,2 ngày dù chỉ có 54 trẻ (17,8%) cónhiều khả năng nhiễm vi khuẩn, trong đó phần lớn (68,7%) đượcđiều trị bằng 1 loại KS; 30,3% được điều trị bằng từ 2 loại KS KSđiều trị ban đầu phổ biến nhất là Cephalosporin thế hệ 1(48,5%), KS thay thế chủ yếu là Cephalosporin thế hệ 3 (31,0%).Không có sự khác biệt về thời gian cũng như số nhóm thuốc đượcchỉ định điều trị cho hai nhóm ít và nhiều khả năng nhiễm vi khuẩn

Có 15,2 % trẻ được phối hợp KS ngay khi nhập viện, giữaCephalosporin với aminosid Việc sử dụng KS trong điều trị viêm hổitrẻ em rất khác nhau tuỳ thuộc từng trường hợp bệnh, theo kinhnghiệm của từng thầy thuốc vì khó xác định nguyên nhân gây bệnh

và cần được chuẩn hoá qua các nghiên cứu tiến cứu quy mô lớn

Tại huyện Yên Minh, tỉnh Hà Giang đã xảy ra vụ hàng loạtngười từ 6 - 51 tuổi bị thủng ruột do uống thuốc mua từ chợ Kiểmnghiệm của cơ quan chức năng cho thấy loại thuốc mà số người này

1.4.1 Phương pháp quang phổ tử ngoại [1, 2, 11, 12]

Nguyên lý dựa trên khả năng hấp thụ chọn lọc các bức xạ rọi

vào dung dịch của chất nghiên cứu trong một dung môi nhất định.+ Theo DĐVN 3, với kháng sinh Cefuroxime acetyl thì việc định tínhdựa trên sự phù hợp của phổ hồng ngoại của chế phẩm viên nén vớiphổ hồng ngoại của Cefuroxime acetyl chuẩn

+ Phương pháp đo quang được sử dụng để đánh giá độ hòa tan củacefuroxime acetyl bằng cách lấy một phần dung dịch môi trường đã

hòa tan mẫu thử, lọc (bỏ 20ml dịch lọc đầu) Pha loãng dịch lọc thuđược tới nồng độ thích hợp với môi trường hòa tan (nếu cần) Đo độhấp thụ của dung dịch thu được bước sóng hấp thụ cực đại 278nm,cốc đo dày 1cm, mẫu trắng là môi trường có nồng độ tương đươngpha trong môi trường hòa tan Kết quả thu được lượng Cefuroximeacetyl được hòa tan trong 45 phút là 98% (>70%) so với lượngcefuroxime acetyl ghi trên nhãn.

1.4.2 Phương pháp LC-MS-MS.[13]

Mẫu phân tích được ly trích bằng một dung môi hữu cơ Sau

đó, dịch chiết được làm sạch và được hòa tan trong dịch pha độngtiêm vào hệ thống HPLC với đầu dò MS/MS, cấu tử ra khỏi cột đượcđưa vào đầu dò MS (phân tích “tỉ lệ khối lượng theo điện tích (m/z)của ion”) dựa trên sự bắn phá các phân tử hợp chất hữu cơ trunghòa thành các ion phân tử mang điện tích (+) hoặc phá vỡ thành cácmảnh ion, các gốc bằng các phân tử mang năng lượng cao Ion phân

tử và các mảnh ion là các phân tử có khối lượng từ đó người ta tínhđược số khối z=m/e (khối lượng ion/điện tích)

Tiến sĩ Từ Bình Minh (ĐHKHTN-ĐHQG Hà Nội): ứng dụng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao ghép nối khối phổ hai lần trong phân tích kháng sinh trong mẫu nước biển và mẫu nước thải Với kháng sinh Beta-lactame kết quả thu được như sau:

Bảng 1: Kết quả phân tích Beta-lactam trong mẫu nước ở Hồng Kông

độ dòng: 30µl/phút

1.4.3.Phương pháp HPLC định lượng viên nén Cefuroxime [8, 9]

Trong tài liệu tham khảo là dược điển Việt Nam sử dụng cộtthép không gỉ (25cm*4.6nm) nhồi pha tĩnh trimethylsilyl silicagel dungcho sắc ký (5µm) ( cột Hypersil SAS) Tuy nhiên khi định lượngcefuroxime acetyl, dược điển Việt Nam lại sử dụng cột octadecylsilylsilicagel 5µm( cột RP18e) là cột khá thông dụng dang có tại Việnkiểm nghiệm thuốc TW

Nhận xét: Để định lượng cefuroxime trong thuốc (dạng viên nén) gặpnhiều khó khăn trong việc tách chiết phức tạp, loại bỏ ảnh hương củacác tá dược (đặc biệt là các chất màu) Do đó phương pháp HPLCđược lựa chọn là giải pháp tốt bởi những ưu điểm của nó như khôngcần chiết tách, hạn chế sai số, nhanh Xuất phát từ thực tế trên,chúng tôi lựa chọn phương pháp HPLC với cột RP18 để nghiên cứuxây dựng quy trình định lượng cefuroxime acetyl trong viên nén

*Hai tác giả Yuko Ito và Hisao Oka đã:

_Phân tích penicillin trong mẫu huyết thanh bằng phương pháp

HPLC-UV : pha tĩnh là cột Spherisorb ODS (250*4,6 mm i.d cỡ hạt

Acetonitrile, detector 720LC UV-VIS, bước sóng: 208nm Kết quả chothấy penicillin chiếm 79,4 tới 95,7 % trong các mẫu huyết thanh Giớihạn phát hiện là 0,05µg/ml với benzyl penicillin, 0,1µg/ml, chophenoxy methyl penicillin và cloxacillin, 0,15 µg/ml với benzylpenicillin, 0,1µg/ml, cho phenoxy methyl penicillin và cloxacillin, 0,15µg/ml cho ampicillin và dicloxacillin và 0,2 µg/ml cho nafcillin Nồng

độ nghiên cứu trong khoảng ( 0,5- 50 µg/ml) Sự tách biệt của 6 loạithuốc tương đối tốt

Phân tích thuốc kháng sinh cephem trong mẫu huyết tươngbằng phương pháp HPLC với hệ thống cột chuyển đổi: pha tĩnh làcột Corasil RP C18 (40*20mm i.d, kích thước hạt 37-50µm), phađộng: Acetonitrile/ đệm acetate 0,02M (pH 4,3)( 15:85), tốc độ dòng1ml/phút, detector UV :254nm Kết quả cho thấy 5 loại thuốc cephemchiếm từ 72,3 đến 85,6% trong mẫu huyết tương

1.5 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC.

1.5.1 Khái niệm về sắc ký [2].

Sắc ký là quá trình tách dựa trên sự phân bố liên tục các cấu

tử chất phân tích lên hai pha: một pha thường đứng yên, có khả

năng hấp thụ chất phân tích gọi là pha tĩnh, một pha di chuyểnqua pha tĩnh gọi là pha động, do các cấu tử chất phân tích có ái lực

khác nhau với pha tĩnh, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau vàtách ra khỏi nhau.

1.5.2 Khái niệm về sắc ký lỏng hiệu năng cao [2]

HPLC ( High performance liquid chromatoghraphy) là một kỹthuật tách trong đó các chất phân tích di chuyển qua cột chứa cáchạt pha tĩnh Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân

bố của chúng giữa 2 pha tức là liên quan đến ái lực tương đối củacác chất này với pha tĩnh và pha động Thứ tự rửa giải các chất rakhỏi cột vì vậy phụ thuộc vào các yếu tố đó Thành phần pha độngđưa các chất phân tích di chuyển qua cột cần được điều chỉnh đểrửa giải các chất phân tích với thời gian hợp lý

1.5.3 Nguyên tắc của quá trình sắc ký [3, 4, 10]

Pha tĩnh được nhồi vào cột theo một kỹ thuật nhất định Phatĩnh là một yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc

ký và loại sắc ký Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có sắc ký phathuận Pha tĩnh là các chất đã được liên kết với một nhóm chức khác

ta có sắc ký pha liên kết ( pha thuận, pha đảo, trao đổi ion) Nếu phatĩnh là gel thì ta có sắc ký gel hay sắc ký rây phân tử Cùng với phatĩnh, để rửa giải các chất phân tích ra khỏi cột, chúng ta cần có mộtpha động

Như vậy nếu ta nạp mẫu phân tích gồm hỗn hợp chất phân tích

A, B, C… vào cột tách, kết quả là các chất A, B, C…sẽ được tách rakhỏi nhau Sau khi đi qua cột nhờ pha động Quyết định hiệu quả của

sự tách sắc ký ở đây là tổng của các tương tác

Tổng của ba tương tác này sẽ quyết định chất nào được rửagiải ra khỏi cột trước tiên khi lực lưu gữ là nhỏ nhất, và ngược lại.Đối với mỗi chất, sự lưu giữ được tạo thành bởi ba lực thành phần :F1, F2, F3 Trong đó F1, F2 là quyết định còn F3 là yếu tố ảnh hưởngkhông lớn Ở đây F1 là lực lưu giữ chất phân tích trên cột, F2 là lựckéo nó đi ra khỏi cột Như vậy các chất khác nhau thì F1 và F2 sẽkhác nhau, kết quả là các chất khác nhau sẽ di chuyển trong cột vớitốc độ khác nhau và tách hẳn nhau khi ra khỏi cột.

1.5.4 Nguyên tắc cấu tạo của máy sắc ký lỏng hiệu năng cao

Nguyên tắc cấu tạo của máy sắc ký lỏng đều giống nhau, bao gồm

Hình 2: Sơ đồ hệ thống HPLC

1.5.4.1 Hệ thống cấp pha động [2, 4]

Pha động trong sắc ký lỏng thường là hai hay nhiều dung môihòa tan vào nhau để có khả năng tách với độ phân giải phù hợp.Trước khi chạy mẫu, cần lọc (màng lọc 0,45µm) và đuổi khí hòa tantrong pha động Khí hòa tan có thể làm biến dạng pic, giảm hiệu lựccột, làm nhiễu đường nền

Có hai cách dùng để rửa giải pha động:

Đẳng dòng (isocratic): Thành phần pha động không thay đổi

trong quá trình sắc ký, thường được trộn sẵn và đựng trong một bìnhthủy tinh có nắp

Gradient: Pha động là hỗn hợp nhiều dung môi, thường 2-4

loại được đựng trong các bình khác nhau Tỷ lệ các thành phần thayđổi trong quá trình sắc ký theo chương trình đã định

1.5.4.2 Hệ thống bơm [2, 4]

Hệ thống bơm có chức năng tạo áp suất cao để đẩy pha động

từ bình dung môi qua hệ thống sắc ký Hệ thống bơm hiện nay đượcđiều khiển bằng máy tính có thể lập chương trình để thay đổi tỉ lệ cácthành phần pha động theo yêu cầu (sắc ký gradient) Bơm HPLC cầnđáp ứng một số yêu cầu sau:

Tạo được áp suất cao 3000–6000psi (250–500atm)

Lưu lượng bơm khoảng 0,1–10ml/phút

Không bị ăn mòn với các thành phần pha động

Có tốc độ bơm không đổi

Những máy sắc ký lỏng hiện đại có cấu hình hoàn thiện hơn.Khoảng bơm có lưu lượng dao động từ 2-3µL/phút, áp suất có thểlên tới 10000psi

1.5.4.3 Hệ tiêm mẫu [2,4]

Để đưa mẫu vào cột có thể tiêm mẫu bằng tay hoặc tiêm mẫubằng hệ thống tiêm mẫu tự động Thể tích tiêm được xác định nhờvòng chứa mẫu (tiêm tay) hay trong hệ tiêm mẫu tự động Sai sốtiêm mẫu dùng van khoảng 0,5 %

1.5.4.4 Cột sắc ký [2, 4,10].

Cột sắc ký lỏng hiệu năng cao thường được chế tạo bằng thépkhông gỉ, thủy tinh hoặc chất dẻo có chiều dài 10-30cm, đường kínhtrong 4-10mm Thường có cột nhồi và cột bảo vệ

- Cột nhồi thường có hạt cỡ 5-10µm, gần đây có loại cột nhỏđường kính trong 1-2mm, dài 3-7,5cm loại này nhồi được cỡ hạtkhoảng 3 đến 5µm có ưu điểm là chạy sắc kí tốn ít dung môi và ítthời gian hơn Có thể điều nhiệt để tăng nhiệt độ cột nhằm đạt hiệuquả phân tách tốt hơn nhưng hiếm khi tiến hành ở nhiệt độ trên 60°C

vì ở nhiệt độ này có thể làm suy giảm hiệu lực cột và làm bay hơi phađộng Chất nhồi cột thường là Silicagel có bao một lớp mỏng chấthữu cơ (hoặc liên kết hóa học với một số chất hữu cơ) Ngoài ra, còn

có các chất nhồi khác như nhôm oxyd, polyme xốp, nhựa trao đổiion

- Cột bảo vệ được đặt trước cột sắc ký để loại các chất có mặttrong pha động và trong mẫu phân tích làm giảm tuổi thọ của cột Cột

bảo vệ ngắn hơn cột sắc kí, được nhồi hạt cùng loại nhưng kíchthước hạt lớn hơn

1.5.4.5 Detector [2,4].

Detector là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột vàcho tín hiệu ghi trên sắc kí đồ Phát hiện các chất phân tích có thểdựa vào:

Đáp ứng chọn lọc với chất phân tích khi detector hấp thụ bức

xạ UV hoặc huỳnh quang

Tính chất chung của chất phân tích trong pha động, nhưdetector chỉ số khúc xạ, độ dẫn điện

Detector trong sắc kí lỏng cần đáp ứng nhưng yêu cầu sau:Đáp ứng nhanh và lặp lại

Độ nhạy cao, có thể phát hiện chất phân tích ở khối lượng hoặcnồng độ thấp

Vận hành ổn định, sử dụng dễ dàng

Khoảng hoạt động tuyến tính rộng

Ít thay đổi theo nhiệt độ và tốc độ dòng

1.5.4.6 Hệ thu nhận và xử lý số liệu [2,3,4,10]

Gồm có máy ghi, máy tích phân, máy tính

Máy ghi đơn giản thì có thể vẽ sắc ký đồ, ghi thời gian lưu, diệntích pic hoặc chiều cao pic, % diện tích pic…Máy vi tính ngoài khảnăng ghi còn có khả năng xử lý số liệu

1.5.5 Pha tĩnh trong sắc ký lỏng hiệu năng cao.[2, 4,6,10].

Pha tĩnh trong HPLC là chất nhồi cột có nhiệm vụ tách hỗn hợpchất phân tích Pha tĩnh có bản chất là chất rắn, xốp và kích thước hạt nhỏ, đường kính hạt cỡ từ 3-10µm, diện tích bề mặt riêng từ 50-500m²/g

Phân loại pha tĩnh

+ Căn cứ theo bản chất chính của quá trình sắc ký trong cột tách, người ta chia thành nhiều loại như hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, rây phân tử.Tương ứng với các loại chất nhồi như thế người ta

có một loại sắc ký riêng trong kỹ thuật HPLC

+ Căn cứ theo trạng thái rắn hoặc lỏng của pha tĩnh Nếu pha tĩnh là chất rắn người ta có sắc ký lỏng- rắn (LSC) Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì có sắc ký lỏng-lỏng (LLC).

+ Căn cứ theo cấu trúc xốp của pha tĩnh là các hạt rắn, người

ta chia nó thành hai loại: xốp toàn phần và xốp chỉ ở lớp vỏ ngoài

- Yều cầu của pha tĩnh trong HPLC:

+ Phải trơ và bền vững với môi trường sắc ký

+ Có khả năng tách một hỗn hợp chất tan nhất định

+ Tính chất bề mặt ổn định, đặc biệt là đặc trưng xốp của nó.+ Cân bằng động học của sự tách phải xảy ra nhanh và lặp lại tốt

+ Cỡ hạt phải tương đối đồng nhất

1.5.6 Pha động trong sắc ký lỏng hiệu năng cao

Pha động là dung môi dùng để rửa giải các chất tan (chất phântích) ra khỏi cột tách để thực hiện một quá trình sắc ký

Pha động trong HPLC có thể chỉ là một dung môi hữu cơ hayhỗn hợp của 2, 3 dung môi theo tỉ lệ nhất định Pha động là yếu tốquan trọng quyết định hiệu suất tách sắc ký của một hỗn hợp, thời

Pha động có thể ảnh hưởng tới:

1.5.7 Ứng dụng của sắc ký lỏng hiệu năng cao [4,10].

Sắc ký nói chung và HPLC nói riêng có 3 ứng dụng chính sau:

1.5.7.1 Định tính

Sắc ký đồ cho ta thời gian lưu của chất phân tích trong cùngđiều kiện sắc kí (pha động, pha tĩnh, nhiệt độ), những thông tinđịnh tính giúp ta khẳng định sự có mặt của chất phân tích trongmẫu Với mẫu nhiều thành phần, việc định tính bằng quang phổ

thường gặp nhiều khó khăn Do vậy HPLC thường dùng để táchcác thành phần trước khi phân tích bằng quang phổ

1.5.7.2 Định lượng

Tất cả các phương pháp định lượng bằng sắc ký đều dựa trênnguyên tắc: Nồng độ của chất tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích piccủa nó

Có 4 phương pháp định lượng thường sử dụng:

- Phương pháp chuẩn ngoại:

Phương pháp định lượng cơ bản: mẫu thử và mẫu chuẩn đượctiến hành sắc ký trong cùng diều kiện

So sánh diện tích hoặc chiều cao pic của mẫu thử với mẫuchuẩn tính được nồng độ của mẫu thử Có thể sử dụng phươngpháp chuẩn hóa một điểm hoặc nhiều điểm

- Phương pháp chuẩn nội:

Thêm những lượng giống nhau của chuất chuẩn thứ hai vào cảchuẩn ngoại lẫn mẫu thử rồi tiến hành sắc ký Chất chuẩn thứ hainày được gọi là chất chuẩn nội

Yêu cầu đối với chất chuẩn nội:

+ Trong điều kiện sắc ký, chuẩn nội phải được tách hoàn toàn

và có thời gian lưu gần với chất cần phân tích

+ Có cấu trúc hóa học tương tự chất thử

+ Có nồng độ xấp xỉ với nồng độ của chất thử

+ Không phản ứng với bất kỳ thành phần nào của mẫu thử.+ Phải có độ tinh khiết cao và dễ kiếm

- Phương pháp thêm chuẩn:

Kỹ thuật này phối hợp phương pháp chuẩn nội và chuẩn ngoại

Ưu điểm của kỹ thuật thêm chuẩn là có độ chính xác cao

vì nó loại trừ được sai số (do các yếu tố ảnh hưởng, đặc biệt là doquá trình xử lý mẫu: chiết xuất, tinh chế các chất từ dạng bào chế )

- Phương pháp chuẩn hóa diện tích:

Hàm lượng phần trăm (%) của một chất trong hỗn hợp nhiều

thành phần được tính bằng tỷ lệ % diện tích pic của nó so với tổngdiện tích của tất cả các pic trên sắc ký đồ

Phương pháp này yêu cầu tất cả các thành phần đều phảiđược rửa giải và phát hiện Tất cả các thành phần đều có đáp ứngdetector như nhau

1.5.7.3 Thử tạp chất

Về cơ sở cũng giống như định lượng Ngoài ra, đối với phépthử tạp chất liên quan, khi không biết tên tạp chất hoặc không có tạpchuẩn ta có thể tính tỷ lệ tạp chất dựa vào phần trăm (%) diện tíchpic của tạp so với hoạt chất

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU (NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, DUNG MÔI VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU)

2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị

2.1.1 Dung môi và hóa chất

Methanol tinh khiết dùng cho HPLC (Merck, Đức)

Amoni dihydrophosphat 0,2M lọc qua màng lọc milipore0,45µm

Chuẩn cefuroxime acetyl hàm lượng 93,0%, độ ẩm 0,25%(Viện kiểm nghiệm thuốc TW)

Dung dịch acid phosphoric 1%, lọc qua màng lọc milipore0,45µm

Nước cất được lọc qua màng lọc milipore 0,45µm (Viện kiểmnghiệm thuốc TW)

2.1.2 Thiết bị và dụng cụ

+ Máy sắc ký lỏng Shimadzu

- Bơm: Model LC - 10Avp

- Detector mảng diod: Model SPD - M10Avp

- Module điều khiển: Model SCL - 10Avp

- Bộ trộn dung môi: FCV - 10Alvp

- Bộ loại khí (Degasser): DGU - 14A

+ Cột Apollo C18 (250 x 4,6mm, 5µm).

+ Bộ lọc dung môi, lọc mẫu với màng lọc 0,45µm

+ Máy lắc siêu âm Elmasonic

+ Cân phân tích Mettler Toledo có độ chính xác ± 0,1 mg

+ Các dụng cụ thủy tinh chính xác: bình định mức, pipet chínhxác, ống đong, giấy lọc

2.2 Đối tượng nghiên cứu, nội dung, phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là thuốc viên cezirnate 500mg của công

ty cổ phần dược phẩm trung ương II Có tính chất: dạng viên nénmàu trắng bao phim

- Công thức bào chế cho 1viên thuốc cezirnate 500mg

magnesi stearat, Pharmacoat 615, titan dioxyd, PEG6000

- Lô sản xuất: 501111

2.2.2 Nội dung nghiên cứu

+ Xây dựng phương pháp định lượng Cefuroxime acetyl trong thuốc

bắng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với hai quy trình:

* Quy trình xử lý mẫu, áp dụng phương pháp hòa tan mẫutrong dung môi thích hợp để chuyển chất phân tích sang dạng dịchlỏng đồng nhất và phù hợp cho bước phân tích tiếp theo

* Quy trình phân tích cefuroxime acetyl được thực hiện với việcxây dựng quy trình phân tích với điều kiện thích hợp:

+ Khảo sát tính thích hợp của hệ thống.

+ Khảo sát độ đúng

+ Khảo sát khoảng tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic.+ Khảo sát độ lặp lại của quá trình phân tích.Giới hạn pháthiện, giới hạn định lượng

+ Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng

+ Áp dụng phương pháp đã xây dựng để định lượngCefuroxime acetyl trong chế phẩm đã chọn

2.2.3 Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu được tiến hành trên thiết bị là máy HPLC củaShimadzu Tiến hành thực nghiệm để tìm ra điều kiện phân tích thíchhợp, xử lý thống kê các kết quả thu được và nhận xét rút ra kết luận

2.2.4 Một số công thức sử dụng trong thống kê

n

Độ lệch chuẩn tương đối: RSD (%) = x 100

n là số lần xác định

Chương 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ

BÀN LUẬN3.1 Khảo sát lựa chọn qui trình xử lý mẫu

3.1.1 Lựa chọn dung môi pha mẫu

Cần lựa chọn dung môi pha mẫu sao cho đảm bảo hòa tan tốthoạt chất và hòa tan càng ít các tá dược khác có trong mẫu thuốc bôi

da nghiên cứu càng tốt Việc lựa chọn trên dựa vào tính chất tan tốttrong methanol, amoni dihydrophosphat của cefuroxime acetyl

Thử nghiệm với một số dung môi pha mẫu nhưnước,methanol, chúng tôi thấy dung môi pha mẫu là hỗn hợp gồm

acid photphoric 1%) với tỉ lệ (38:62) là hệ dung môi thích hợp hơn cả

Hệ dung môi này có một số ưu điểm sau:

+ Hòa tan được cefuroxime và đưa ra khỏi thuốc viên với hàmlượng cao và ít tạp chất nhất

+ Dễ trộn lẫn với dung môi pha động của hệ sắc ký pha đảo.+ Cách tiến hành nhanh và dễ thực hiện

3.1.2 Quy trình xử lý mẫu.

Cân chính xác khoảng 0.3552g bột viên ( tương ứng với 250mgcefuroxime acetyl), cho vào bình 50ml, thêm metanol khoảng 2/3bình, đem lắc siêu âm cho tan hết, sau đó vừa đủ bằng dung môi phamẫu, lọc qua giấy lọc, hút 1ml dịch lọc vào bình 20ml, vừa đủ bằngdung môi pha mẫu Lọc qua màng lọc 0,45µm

3.2 Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký

Chúng tôi phải nghiên cứu điều kiện sắc ký sao cho pic củaCefuroxim acetyl tách được riêng rẽ 2 đồng phân A và B, đồng thờitách riêng với các pic còn lại trên sắc ký đồ và thời gian lưu phù hợpcho quá trình phân tích

Trên cơ sở tham khảo các tài liệu đã nghiên cứu về Cefuroximhúng tôi chọn phương pháp HPLC pha đảo và sử dụng cột apoloC18 (250x4,6mm, 5µm) Trong quá trình thực nghiệm chúng tôi đãtiến hành khảo sát các điều kiện sắc ký trên cột này: Thành phần và

tỷ lệ dung môi trong pha động, bước sóng phát hiện, tốc độ dòngchạy sắc ký

Sau khi tiến hành khảo sát với pha động là: MeOH : dung dịch

- Với kết quả này chúng tôi quyết định chọn pha động theo tỉ lệ

ký

- Để chọn bước sóng làm việc của detector dựa vào tài liệutham khảo chúng tôi chọn bước sóng 278nm là bước sóng lấy sắc kýđồ

Tiếp tục tiến hành khảo sát lựa chọn tốc độ dòng theo các điềukiện đã chọn ở trên với các giá trị là 0,8; 1,0; 1,2mL/phút nhằm lựachọn được tốc độ dòng thích hợp đảm bảo việc phân tách và định lượng Cefuroxime acetyl đồng thời rút ngắn thời gian phân tích Quakết quả thực nghiệm chúng tôi thấy với tốc độ dòng là 1,0ml/phút, piccủa Cefuroxime acetyl gọn, cân đối, thời gian lưu hợp lý, áp suất vừaphải Vậy chúng tôi quyết định lưạ chọn tốc độ dòng 1ml/phút để tiếnhành chạy sắc ký

Như vậy qua khảo sát thực nghiệm, chúng tôi đã lựa chọn cácđiều kiện sắc ký để định lượng Cefuroxime acetyl trong thuốc viênnhư sau:

Máy sắc ký lỏng năng hiệu nâng cao Shimadzu

Cân chính xác khoảng 50,0mg chất chuẩn Cefuroxime acetylvào bình định mức 50,0ml thêm methanol khoảng 2/3 bình, lắc siêu

âm đến khi tan hoàn toàn Sau đó vừa đủ bằng dung môi pha mẫu.Pha loãng 5,0ml dung dịch này thành 20,0ml bằng dung môi pha mẫu,

lắc đều, được dung dịch chuẩn có nồng độ khoảng 0.025mg/ml Lọcqua màng lọc 0,45µm, được dịch lọc để tiêm sắc ký Tiến hành tiêmmẫu vào hệ thống sắc ký với điều kiện đã nêu ở mục 3.2 Kết quảđược trình bày ở bảng 2

Bảng2 Đánh giá độ thích hợp của hệ thống

STT Thời gian lưu

(phút)

Diện tích pic (mAU)

Số đĩa lý thuyết trung bình (N)

Nhận xét: Kết quả thực nghiệm cho thấy RSD (%) của các

thông số đặc trưng của quá trình sắc ký là thời gian lưu nhỏ hơn 2%(0,17%) và diện tích pic nhỏ hơn 2% (0,27%) Số đĩa lý thuyết caothể hiện cột được lựa chọn có khả năng tách tốt Những điều nàychứng tỏ hệ thống HPLC mà chúng tôi sử dụng là phù hợp và đảmbảo sự ổn định của phép định tính và định lượng Cefuroxime acetyl

Cách pha: Cân chính xác khoảng 50,0mg chất chuẩn

Cefuroxime acetyl , hòa tan, lắc siêu âm và thêm dung môi pha mẫuvừa đủ 50,0ml Sau đó pha loãng thành 1 dãy dung dịch chuẩn trongkhoảng khảo sát Lọc qua màng lọc 0,45µm Tiến hành tiêm sắc kýtheo điều kiện sắc ký đã chọn Kết quả khảo sát được thể hiện ởbảng 3 và hình 4