La nghiên cứu sự di truyền các đột biến gây bệnh ở bệnh nhân beta thalassemia vùng đồng bằng sông cửu long bằng kỹ thuật sinh học phân tử

Luận án được sự giúp đỡ của các GSTS có kinh nghiệm trong lĩnh vực nông lâm ngư để đưa ra những luận điệu khoa học và tổng hợp một cách chi tiết nhất đến môi trường phát triển của các loài để đưa ra biện pháp hiệu quả nhất và năng suất nhất cho bà con và mọi người nghiên cứu.

LỜI CẢM TẠ

Nghiên cứu sinh xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành đến

- Ban Giám Hiệu Trường Đại học Cần Thơ

- Ban nh đạo và các Thầy, Cô Viện Nghiên cứu & Phát triển Công nghệ sinh học

- Ban giám đốc trung tâm Thalasemia (TRC), Trường Đại học Mahidol, Thái Lan

- PGS.TS Hoàng Anh Vũ, Trưởng trung tâm Y - Sinh học phân tử, Trường Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh

- Ban giám đốc và quý đồng nghiệp trung tâm chẩn đoán Y Khoa Medic, thành phố Hồ Chí Minh

Đ dạy dỗ, quan tâm giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Xin trân trọng cảm ơn Ban Giám Đốc các bệnh viện: đa khoa Nguyễn Đình Chiểu, Bến Tre; đa khoa Kiên Giang; Nhi Đồng thành phố Cần Thơ; đa khoa trung tâm An Giang, Huyết học và Truyền máu Cần Thơ, đa khoa Châu Đốc và bệnh viện Nhi Đồng 1, thành phố Hồ Chí Minh, đ giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thu thập số liệu

Xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới giáo viên hướng dẫn đ tận tình, chỉ bảo tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án này

Cảm ơn gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đ ủng hộ, giúp đỡ và động viên tôi trong quá trình hoàn thành khóa học

Xin trân trọng cảm ơn!

Cần Thơ, ngày 17 tháng 4 năm 2017

Phạm Th Ngọc Nga

TÓM LƯỢC

Tên đề tài: Nghiên cứu sự di truyền các đột biến gây bệnh ở bệnh nhân

Beta thalassemia v ng ng b ng sông Cửu Long b ng kỹ thuật sinh học phân tử

Βeta thalassemia (β-Thal) là bệnh di truyền đơn gen phổ biến nhất trên thế giới Việt Nam là một trong những nước có tỷ lệ mắc bệnh và mang gen bệnh β-Thal cao Tại khu vực ng b ng sông Cửu Long hiện nay có hơn 2.000 trẻ β-Thal mắc bệnh Vì vậy, nghiên cứu thực hiện nh m mục tiêu: xác định tỷ lệ các kiểu đột biến gen β-globin và xây dựng phả hệ theo dõi sự di truyền bệnh β-Thal trên bệnh nhân β-Thal ở khu vực ng b ng sông Cửu Long Nghiên cứu cũng xác định tỷ lệ mang gen bệnh và kiểu hình huyết học của các thể bệnh trong phả hệ và ánh giá kiến thức về bệnh β-Thal trước, sau tư vấn di truyền cho người mang gen bệnh đ ng thời kết hợp chẩn đoán trước sinh cho các cặp vợ ch ng mang gen và đang mang thai giai đoạn đầu Nghiên cứu được thực hiện theo phương pháp mô tả cắt ngang trên 341 bệnh nhân mắc bệnh β-Thal, có hộ khẩu tại 13 tỉnh, thành phố thuộc khu vực ng

b ng sông Cửu Long 12 trong số 341 bệnh nhân được chọn ngẫu nhiên để xây dựng phả hệ nh m nghiên cứu sự di truyền bệnh β-Thal Kết quả nghiên cứu xác định được 17 kiểu đột biến, 97,2% các đột biến thuộc 8 kiểu phổ biến của Việt Nam; 2,2% kiểu B thuộc dạng không phổ biến: Cd15 G>A, Cd11G>A, Cd26 G>T, IVS1.5 G>C, () del ,-pro) del Ngoài ra, có 3 kiểu đột biến mới được phát hiện: Cd38-39 ACCCAG>CCCAA; IVS2.499 C>T; IVS2.636 A>C Bên cạnh đó, có tổng 12 phả hệ đã được xây dựng: 7 dân tộc Kinh, 03 dân tộc Khmer, 1 dân tộc Chăm và 1 dân tộc Hoa 100% phả

hệ mang đặc điểm di truyền gen lặn trên nhiễm sắc thể thường Có 91/251 (36,3%) người mang gen bệnh và 7 thể bệnh được xác định trong phả hệ, trong đó có 03 thể bệnh: β-Thal đ ng hợp tử, phối hợp HbE/β-Thal, β-Thal dị hợp tử kép đều có kiểu hình thiếu máu nặng và cần truyền máu phụ thuộc; các thể bệnh còn lại chỉ biểu hiện thiếu máu nhẹ, không cần truyền máu ánh giá kiến thức về bệnh β-Thal: 100% các nội dung kiến thức về bệnh β-Thal, kiến thức chăm sóc bệnh nhân, phòng bệnh β-Thal đều đã được tăng lên có ý nghĩa thống kê (p<0,001) sau tư vấn Như vậy, có nhiều kiểu đột biến gây bệnh β- Thal tìm gặp ở khu vực ng b ng sông Cửu Long và cũng theo nghiên cứu thì khai thác tiền sử gia đình kết hợp với tư vấn và sàng lọc người mang gen

đ ng thời sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử thích hợp chẩn đoán trước sinh sẽ là biện pháp phòng bệnh hiệu quả

Từ khóa: β-Thal, bệnh nhi, ng b ng sông Cửu Long, kỹ thuật sinh

học phân tử, tư vấn di truyền

Title: Study on inheritance of pathogenous mutations in Beta thalassemia patients living in the Mekong Delta using molecular biology technique

Βeta thalassemia is the most commonly inherited genetic disorders in the world Vietnam is one of the countries with high incidence of β-Thal disease The Mekong Delta had more than 2,000 β-Thal children Therefore, the subject of the project: to determine the ratio of mutant genotypes and to construct pedigree charts that study the β-Thal inheritance in β-Thal patients who live in the Mekong Delta Determining the ratio of gene carrier and the hematological phenotypes of the diseases in the pedigree To evaluate the change of knowledge of β-Thal disease after genetic counseling for gene carriers and prenatal diagnosis for couples of gene carriers The study was conducted using a cross-sectional descriptive study was performed on 341 patients, residents in 13 provinces and cities in the area of Mekong Delta 12 patients will be purposively selected for genealogy to study the inheritance of β-Thal The study results: 17 types of mutants were identified 97.2% of the mutations belong to 8 common types of Vietnam; 2.2% uncommon mutations: Cd15 G>A, Cd11G>A, Cd26 G>T, IVS1.5 G>C, () del ,-pro) del There were three new mutant types discovered accounting for 0.6%: Cd38-39 ACCCAG>CCCAA; IVS2.499 C>T; IVS2.636 A>C In addition, there were

12 pedigree charts: 7 Vietnamese, 3 Khmer, 1 Cham and 1 Chinese All pedigrees were inherited in an autosomal recessive pattern There were 36,3% gene carriers and seven diseases identified in the pedigrees: β-Thal homozygotes, compound heterozygotes of HbE/β-Thal and compound heterozygotes β-Thal had a major anemia and require dependent blood transfusion The rest of the disease only showed minor anemia, no blood transfusion Evaluating the change of knowledge of β-Thal disease: 100% of knowledge about β-Thal disease, knowledge of patient health care and prevention of β-Thal disease have been increased significantly (p<0.001) According to this study, genetic counseling combined with family history, screening of gene carriers and using of various molecular biology techniques for prenatal diagnosis is an effective way to rapidly reduce the β-Thal major, disease prevention and improvement of population quality

Keywords: β-Thal, molecular biology technique, genetic counseling,

pediatric patient, the Mekong Delta

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân và thầy hướng dẫn Các số liệu, kết quả trình bày trong luận án là trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ nghiên cứu nào trước đây

Người hướng dẫn Tác giả luận án

MỤC LỤC

Trang

CẢM TẠ i

TÓM LƯỢC ii

ABSTRACT iii

LỜI CAM ĐOAN iv

MỤC LỤC v

DANH SÁCH BẢNG ix

DANH SÁCH HÌNH xii

TỪ VIẾT TẮT xv

BẢNG ĐỐI CHIẾU THUẬT NGỮ xvi

CHƯƠNG I GIỚI THIỆU 1

1.1 ặt vấn đề 1

1.2 Câu hỏi nghiên cứu và mục tiêu đề tài 2

1.3 Ý nghĩa của luận án 2

1.4 Tính mới của luận án 2

CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 4

2.1 Bệnh Beta thalassemia 4

2.1.1 Đặc điểm phân tử của bệnh Beta thalassemia 4

2.1.2 Di truyền bệnh Beta thalassemia 5

2.1.3 Cơ chế gây mất chức năng sinh học của các kiểu đột biến gen beta-globin 5

2.1.4 Đột biến gây bệnh Beta thalassemia 7

2.1.5 Các thể bệnh Beta thalassemia 11

2.1.6 Chẩn đoán bệnh Beta thalassemia 14

2.1.7 Điều tr Beta thalassemia 16

2.1.8 Phòng bệnh Beta thalassemia 17

2.2 Phương pháp lập và phân tích phả hệ bệnh Beta thalassemia 18

2.2.1 Ý nghĩa của phương pháp nghiên cứu phả hệ 18

2.2.2 Phương pháp lập phả hệ 19

2.2.3 Phân tích phả hệ 19

2.2.4 Các ký hiệu dùng để lập gia hệ 20

2.3 Tư vấn di truyền và các phương pháp chẩn đoán trước sinh phòng bệnh Beta thalassemia 21

2.3.1 Tư vấn di truyền cho bệnh nhân Beta thalassemia 21

2.3.2 Các phương pháp chẩn đoán trước sinh bệnh Beta thalassemia 22

2.4 Tổng quan các nghiên cứu về đột biến gây bệnh Beta thalassemia tại Việt Nam 29

CHƯƠNG III PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32

3.1 ối tượng nghiên cứu 32

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu cho mục tiêu 1: xác đ nh tỷ lệ kiểu đột biến gen 32

3.1.2 Đối tượng nghiên cứu cho mục tiêu 2: xây dựng phả hệ 32

3.1.3 Đối tượng nghiên cứu cho mục tiêu 3 32

3.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 32

3.3 Phương pháp nghiên cứu 33

3.3.1 Thiết kế nghiên cứu 33

3.3.2 Cỡ mẫu và phương pháp chọn mẫu 33

3.3.3 Nội dung nghiên cứu 34

3.3.4 Phương pháp thu thập số liệu 39

3.3.5 Phương pháp hạn chế sai số 54

3.3.6 Phương pháp xử lý số liệu 54

3.4 Phạm vi nghiên cứu 55

3.5 ạo đức trong nghiên cứu 55

CHƯƠNG IV KẾT QUẢ 57

4.1 ặc điểm của đối tượng nghiên cứu 57

4.1.1 Đặc điểm của đối tượng tham gia xác đ nh kiểu đột biến 57

4.1.2 Đặc điểm của đối tượng xây dựng phả hệ 58

4.1.3 Đặc điểm của đối tượng tham gia tư vấn để đánh giá sự thay đổi kiến thức về bệnh β-Thal 59

4.2 Tỷ lệ các kiểu đột biến gen beta-globin gây bệnh Beta thalassemia 60

4.2.1 Các kỹ thuật sinh học phân tử xác đ nh đột biến gen β-globin 60

4.2.2 Tỷ lệ các kiểu đột biến gen gây bệnh và các thể bệnh Beta

thalassemia ở khu vực Đồng bằng sông Cửu ong 63

4.3 Phả hệ di truyền của một số bệnh nhân Beta thalassemia 72

4.3.1 Xây dựng phả hệ di truyền 72

4.3.2 Tỷ lệ mang gen bệnh trong phả hệ nghiên cứu 83

4.3.3 Tỷ lệ các kiểu đột biến trong 12 phả hệ 86

4.3.4 Tỷ lệ các thể bệnh trong phả hệ nghiên cứu 86

4.3.5 Kiểu hình huyết học của các thể bệnh Beta thalassemia trong các phả hệ 87

4.4 Sự thay đổi kiến thức về bệnh Beta thalassemia của người mang gen sau tư vấn di truyền và chẩn đoán trước sinh cho các cặp vợ ch ng mang gen có thai giai đoạn đầu 89

4.4.1 Kiến thức đúng về bệnh Beta thalassemia 89

4.4.2 Kiến thức đúng về chăm sóc bệnh nhân Beta thalassemia 90

4.4.3 Kiến thức đúng về phòng bệnh Beta thalassemia 91

4.4.4 Chẩn đoán trước sinh cho các cặp vợ chồng mang gen có thai giai đoạn đầu trong các phả hệ 91

CHƯƠNG V THẢO LUẬN 93

5.1 ặc điểm của đối tượng nghiên cứu 93

5.1.1 Đặc điểm của đối tượng tham gia xác đ nh kiểu đột biến 93

5.1.2 Đặc điểm của đối tượng xây dựng phả hệ 94

5.1.3 Đặc điểm của đối tượng tham gia tư vấn để đánh giá sự thay đổi kiến thức về bệnh β-Thal 94

5.2 Tỷ lệ các kiểu đột biến gen β-globin gây bệnh Beta thalassemia 95

5.2.1 Các kỹ thuật sinh học phân tử dùng để xác đ nh đột biến gen beta globin 95

5.2.2 Tỷ lệ các kiểu đột biến gen gây bệnh và các thể bệnh Beta thalassemia ở khu vực Đồng bằng sông Cửu ong 99

5.3 Phả hệ di truyền của một số bệnh nhân Beta thalassemia 112

5.3.1 Xây dựng phả hệ di truyền 112

5.3.2 Tỷ lệ mang gen bệnh trong phả hệ nghiên cứu 117

5.3.3 Tỷ lệ các kiểu đột biến trong 12 phả hệ nghiên cứu 119

5.3.4 Các thể bệnh Beta thalassemia và kiểu hình huyết học của các thể

bệnh trong 12 phả hệ 119

5.3.5 Ứng dụng kết quả nghiên cứu vào sàng lọc các thể bệnh trong gia đình bệnh nhân và cộng đồng 125

5.4 Sự thay đổi kiến thức về bệnh Beta thalassemia của người mang gen sau tư vấn di truyền và chẩn đoán trước sinh cho các cặp vợ ch ng mang gen có thai giai đoạn đầu 128

5.4.1 Kiến thức về bệnh Beta thalassemia 128

5.4.2 Kiến thức về chăm sóc bệnh nhân Beta thalassemia 131

5.4.3 Kiến thức về phòng bệnh Beta thalassemia 132

5.4.5 Chẩn đoán trước sinh cho các cặp vợ chồng mang gen có thai giai đoạn đầu trong các phả hệ 133

CHƯƠNG VI KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 137

6.1 Kết luận 137

6.2 ề xuất 138

TÀI LIỆU THAM KHẢO 139 PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Giấy chấp thuận lấy mẫu nghiên cứu của các bệnh viện

Phụ lục 2: Danh sách bệnh nhân tham gia nghiên cứu tại các bệnh viện Phụ lục 3: Tờ thông tin dành cho bệnh nhân và gia đình nghiên cứu Phụ lục 4: Phiếu đồng thuận tham gia nghiên cứu bệnh Beta thalassemia Phụ lục 5: Phiếu đồng thuận tham gia nghiên cứu phả hệ

Phụ lục 6: Phiếu đồng thuận tham gia tư vấn di truyền

Phụ lục 7: Phiếu thông tin bệnh nhân Beta thalassemia

Phụ lục 8: Phiếu thông tin đối tượng xây dựng phả hệ

Phụ lục 9: Bộ câu hỏi đánh giá kiến thức tư vấn di truyền

Phụ lục 10: Kết quả kiểu đột biến của bệnh nhân tham gia nghiên cứu Phụ lục 11: Kết quả M PA trên gen α/β-globin của bệnh nhân Nguyễn

Th Thu H và Nguyễn Th Mộng N

Phụ lục 12: Kết quả công thức máu, điện di và kiểu đột biến của người bệnh và người mang gen bệnh của 12 phả hệ

DANH SÁCH BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Phân bố bệnh nhân theo các thể bệnh tại Đức 7

Bảng 2.2 Các đột biến -Thal phổ biến ở một số quần thể trên thế giới 9

Bảng 2.3 Phân bố các kiểu gen -Thal ở Hy ạp và Thổ Nhĩ Kỳ 10

Bảng 2.4 Các kiểu đột biến thường gặp, mức độ nặng và phân bố theo

Bảng 2.6 Kiểu gen, công thức máu, điện di hemoglobin và triệu chứng

của các thể bệnh -Thal có đột biến HbE

Bảng 3.1 Một số ký hiệu sử dụng trong 12 phả hệ nghiên cứu 36

Bảng 3.2 Trình tự các mồi sử dụng trong giải trình tự gen -globin 46

Bảng 3.4 Trình tự các primer trong phản ứng GAP-PCR 50

Bảng 4.1 Đặc điểm tuổi của đối tượng tham gia xác đ nh kiểu đột biến 57

Bảng 4.2 Phân bố giới tính theo các dân tộc của đối tượng tham gia

Bảng 4.5 Đặc điểm chung về tuổi, nghề nghiệp, trình độ, quan hệ với

bệnh nhân của đối tượng tư vấn

59

Bảng 4.6 Các kiểu đột biến phát hiện bằng kỹ thuật giải trình tự và loại

Bảng 4.9 Thể bệnh, kiểu phối hợp đột biến và dân tộc của 3 bệnh nhân

mang đột biến mới

65

Bảng 4.10 Chỉ số huyết học và hemoglobin của các đột biến mới 65 Bảng 4.11 Tỷ lệ các kiểu đột biến ở dân tộc Kinh 66 Bảng 4.12 Tỷ lệ các kiểu đột biến ở dân tộc Khmer 67 Bảng 4.13 Tỷ lệ các kiểu đột biến ở dân tộc Hoa 67 Bảng 4.14 Tỷ lệ các kiểu đột biến ở dân tộc Chăm 68 Bảng 4.15 Tỷ lệ các kiểu gen trên 341 bệnh nhân 68 Bảng 4.16 Tỷ lệ các thể bệnh trên 341 bệnh nhân 69 Bảng 4.17 Các kiểu gen và các kiểu phối hợp giữa các đột biến ở bệnh

Bảng 4.19 Các kiểu gen và các kiểu phối hợp giữa các đột biến ở bệnh

nhân dạng phối hợp HbE/β-Thal

Bảng 4.27 Kiến thức đúng về bệnh β-Thal 89 Bảng 4.28 Kiến thức đúng về chăm sóc bệnh nhân mắc bệnh β-Thal 90 Bảng 4.29 Kiến thức đúng về phòng bệnh β-Thal 91 Bảng 4.30 Kết quả chẩn đoán trước sinh của các cặp vợ chồng mang

Bảng 5.3 Phân bố các kiểu đột biến của nghiên cứu so với một số nước

tại khu vực Đông Nam Á

101

DANH SÁCH HÌNH

Trang

Hình 2.3 Hình dạng hồng cầu bất thường của bệnh nhân -Thal 6

Hình 2.4 Bản đồ phân bố tỷ lệ bệnh -Thal và HbE ở Đông Nam Á 8

Hình 2.6 Một phả hệ điển hình của di truyền alen trội NST thường 19

Hình 2.10 Đọc kết quả của phương pháp ARMS-PCR 26

Hình 2.11 Kết quả giải trình tự gen được phân tích trên phần mềm 27

Hình 2.12 Các bước chính trong kỹ thuật M PA 28

Hình 3.1 Máy luân nhiệt Mastercycler Pro S® 40

Hình 3.2 Máy điện di nằm ngang (A) và máy soi Gel (B) 40

Hình 3.3 Hệ thống giải trình tự ABI 3500® 41

Hình 3.4 Hệ thống CEQ 8000® (Beckman Coulter) 41

Hình 3.5 Máy ly tâm ống 1,5mL (A), máy ủ nhiệt nước (B), máy

lắc mẫu trong tối (C)

41

Hình 3.6 Máy xét nghiệm công thức máu Cell Dyn 3200® 41

Hình 3.8 Biểu đồ kết quả điện di Hemoglobin 43

Hình 3.9 Quy trình tách chiết DNA từ máu ngoại vi bằng Kit

QIAGEN

43

Hình 3.10 Các bước chính trong kỹ thuật RDB 44

Hình 3.11 Strip mang 22 kiểu đột biến và thể bệnh -Thal tương ứng 45

Hình 3.12 Đọc kết quả kỹ thuật RDB 45

Hình 3.14 Cấu tạo đoạn dò trong kỹ thuật M PA 48

Hình 3.16 Hình điện di sản phẩm PCR phát hiện đột biến α-Thal trên

Hình 4.3 Đột biến (δ)del được phát hiện bằng M PA 63

Hình 5.2 Kết quả xét nghiệm DCIP mẫu HbE (bên phải) và mẫu

bình thường

128

Sơ đồ 2.1 Cơ chế sinh bệnh do thừa chuỗi α ở bệnh nhân β-Thal 6

Sơ đồ 4.1 Các kỹ thuật sinh học phân tử và số lượng mẫu đ thực

hiện

60

Sơ đồ 4.14 Các bước sàng lọc, xác đ nh người mang gen và các đột

biến trong 12 phả hệ nghiên cứu

vấn

90

TỪ VIẾT TẮT

ARMS Amplification refractory mutation system

ASO Allele-specific oligonucleotide

β-Thal Beta Thalassemia

HMO Health maintenance organization

HLA Human leukocyte antigen

MCH Mean Corpuscular Hemoglobin

MCV Mean Corpuscular Volume

MLPA Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification

OF Osmotic fragility

PCR Polymerase chain reaction

TRC Thalassemia reseach center

TIF Thalassaemia International Federation

TVDT Tư vấn di truyền

WHO World Health Organization

BẢNG ĐỐI CHIẾU THUẬT NGỮ ANH - VIỆT

Amplification refractory mutation

system

Hệ thống nhân bản đột biến ch u nhiệt

Allele-specific oligonucleotide Oligonucleotide đặc trưng alen

Denaturing gradient gel electrophoresis Điện di DNA biến tính trên gel

gradient

Health maintenance organization Tổ chức bảo vệ sức khỏe

Human leukocyte antigen Kháng nguyên bạch cầu người Mean Corpuscular Hemoglobin Số lượng hemoglobin trung bình

trong một hồng cầu Mean Corpuscular Volume Thể tích trung bình một hồng cầu Multiplex Ligation-dependent Probe

Amplification

Khuếch đại đa đoạn dò

Osmotic fragility Test đo sức bền thẩm thấu hồng cầu Polymerase chain reaction Phản ứng khuếch đại chuỗi

Thalassemia reseach center Trung tâm Thalassemia

Thalassaemia International Federation iên đoàn Thalassemia thế giới World Health Organization Tổ chức Y tế thế giới

Chương 1 GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

Thalassemia là bệnh Hemoglobin (Hb) di truyền đơn gen theo kiểu

Mendel phổ biến nhất Bệnh do đột biến (ĐB) trên gen globin gây ra 71%

quốc gia trên thế giới có bệnh lưu hành với 7% dân số thế giới mang gen bệnh Bệnh phân bố rộng từ Địa Trung Hải qua Trung Cận Đông, châu Á đến Đông Nam Á,… thường là ở những nước có nguồn lực thấp và tạo ra một gánh nặng lên hệ thống y tế của các nước này (Harper, P., 2010; Higgs, D.R

et al, 2011) Tổ chức Y tế Thế giới đã xác định thalassemia là vấn đề sức khỏe

nghiêm trọng và khuyến cáo các nước Đông Nam Á nên chọn thalassemia là một trong những ưu tiên về di truyền người (Laosombat, V., 2001; Dương Bá

Trực và ctv, 2002; Eleftheriou, A., 2003)

Việt Nam là một trong những nước có tỷ lệ mắc bệnh và mang gen bệnh cao Nhiều nghiên cứu đã được tiến hành cho thấy tần suất mang gen bệnh β-Thal khoảng 1,7-25% tùy từng vùng miền và dân tộc Theo hiệp hội Tan huyết Việt Nam, hiện có khoảng hơn 20.000 bệnh nhân nặng cần điều trị, mỗi năm

có khoảng gần 2.000 trẻ sinh ra bị bệnh Và theo báo cáo của Chi hội Tan máu bẩm sinh khu vực Tây Nam Bộ, năm 2015, Đồng bằng sông Cửu Long có khoảng 2.105 người bị Thalassemia được các bệnh viện chẩn đoán

Trẻ mắc bệnh -Thal sẽ gặp những hậu quả nghiêm trọng về phát triển

cơ thể, tuổi thọ bởi sự tan máu và các biến chứng của nó Việc điều trị chủ yếu

là truyền máu, thải sắt rất tốn kém, ít hiệu quả và chỉ để duy trì sự sống tạm thời nên trẻ thường tử vong sớm trong những năm đầu của cuộc sống Ghép tuỷ xương giúp cải thiện bệnh nhưng chỉ hạn chế ở một vài trường hợp Đây là

lý do khiến bệnh thalassemia trở thành gánh nặng cho gia đình và xã hội Theo khuyến cáo của liên đoàn thalassemia thế giới (TIF), bên cạnh việc xây dựng chương trình quản lý bệnh nhân -Thal thì phòng bệnh thông qua tư vấn di truyền và chẩn đoán trước sinh là một giải pháp hữu hiệu nhất nhằm ngăn chặn sự lan tràn của bệnh (Cai, S and Chehab, F.F, 1996; Samavat, A and

Modell, B., 2004; Gallanello, R., 2005; Moghaddam, Z.K et al, 2012)

Với tỷ lệ thalassemia lưu hành cao, Việt Nam rất cần một chương trình quản lý và phòng chống thalassemia Do vậy, nghiên cứu ứng d ng các k

thuật sinh học phân tử để tìm hiểu r các đột biến gây bệnh; sự di truyền bệnh

trong các gia đình là hết sức cần thiết Ngoài ra, tư vấn cho người mang gen bệnh sẽ góp phần giúp nâng cao ý thức về căn bệnh Người mang gen có thể chủ động tìm tư vấn, lựa chọn tiền hôn nhân, chẩn đoán trước sinh trong trường hợp cần thiết Đây là giải pháp quan trọng nhất để phòng bệnh, giúp giảm tỷ lệ mắc bệnh β-Thal ở trẻ em

Đề tài “Nghiên cứu sự di truyền các đột biến gây bệnh ở bệnh nhân Beta thalassemia v ng Đồng bằng sông Cửu Long bằng kỹ thuật sinh học phân tử” được thực hiện, kết quả của nghiên cứu sẽ cung cấp cung cấp thêm

số liệu khoa học về các kiểu đột biến gen gây bệnh -Thal ở khu vực Đồng bằng Sông Cửu Long, bổ sung vào cơ sở dữ liệu các kiểu đột biến gen gây bệnh -Thal trong nước Việt Nam Bên cạnh đó, kết quả sự di truyền các đột biến cũng sẽ giúp hỗ trợ công tác tư vấn di truyền, chẩn đoán trước sinh cho các cặp vợ chồng mang gen, hạn chế sự chào đời của các trẻ thể nặng

1.2 Câu hỏi nghiên cứu và mục tiêu nghiên cứu

Có nhiều kiểu đột biến gây bệnh β-Thal được phát hiện ở Việt Nam Tại vùng Đồng bằng Sông Cửu Long, có nhiều vấn đề về bệnh β-Thal chưa có số liệu nghiên cứu: có bao nhiêu kiểu các đột biến gen gây bệnh β-Thal tại khu vực? Tỷ lệ các kiểu đột biến đó như thế nào? Trong các gia đình có bệnh nhân mắc bệnh β-Thal, các kiểu đột biến được di truyền ra sao? Những người mang gen bệnh β-Thal đã biết thông tin gì về bệnh thiếu máu di truyền mắc phải? Vì

vậy, đề tài “Nghiên cứu sự di truyền các đột biến gây bệnh ở bệnh nhân Beta thalassemia v ng Đồng bằng sông Cửu Long bằng kỹ thuật sinh học phân tử” thực hiện với 3 m c tiêu:

(1) Xác định tỷ lệ các kiểu đột biến gen β-globin gây bệnh và các thể

bệnh ở các bệnh nhân β-Thal vùng Đồng bằng sông Cửu Long bằng các k thuật sinh học phân tử

(2) Xây dựng phả hệ di truyền 3 thế hệ của một số bệnh nhân β-Thal và xác định tỷ lệ người mang gen bệnh, các kiểu đột biến, các thể bệnh và kiểu hình huyết học của các thể bệnh ở người mang gen bệnh β-Thal trong phả hệ (3) Đánh giá sự thay đổi kiến thức về bệnh β-Thal sau tư vấn di truyền cho những người mang gen bệnh và thực hiện chẩn đoán trước sinh cho các cặp vợ chồng mang gen có thai giai đoạn đầu trong các phả hệ nghiên cứu

1.3 Ý nghĩa của luận án

* Ý nghĩa về mặt khoa học, phục vụ công tác đào tạo:

- Có thêm số liệu khoa học về tỷ lệ các kiểu đột biến gen gây bệnh

β-Thal; sự di truyền bệnh trong phả hệ của một số gia đình bệnh nhân (bệnh nhân) khu vực Đồng bằng sông Cửu Long

- Làm tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo

* Ý nghĩa về mặt xã hội:

- Góp phần nâng cao hiểu biết của người mang gen về bệnh -Thal từ đó góp phần làm giảm tỷ lệ mắc bệnh và nâng cao chất lượng sống, kéo dài tuổi thọ cho người bị bệnh thalassemia

- Sàng lọc và chẩn đoán trước sinh hạn chế chào đời các bé thể nặng, giảm gánh nặng cho gia đình và xã hội

1.4 Tính mới của luận án

- Nghiên cứu về bệnh -Thal trên cả 4 nhóm dân tộc: Kinh, Chăm, Khmer, Hoa ở khu vực Đồng bằng sông Cửu Long

- Nghiên cứu thực hiện theo định hướng mới:

+ Phối hợp nhiều k thuật sinh học phân tử khác nhau để xác định nhiều

nhất các đột biến gây bệnh trên bệnh nhân -Thal một cách hiệu quả, nhanh chóng

+ Nghiên cứu khá toàn diện về bệnh -Thal: nguyên nhân gây bệnh (kiểu đột biến), sự di truyền bệnh qua các thế hệ, đánh giá kiến thức về bệnh thông qua tư vấn di truyền kết hợp chẩn đoán trước sinh cho người mang gen

Chương 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Bệnh Beta thalassemia

Bệnh β-Thal là một loại bệnh Hb xảy ra do các đột biến gen làm giảm hoặc không tổng hợp được chuỗi β-globin của phân tử Hb Kết quả tạo nên các Hb bất thường dẫn đến giảm hoặc không thực hiện được chức năng vận chuyển khí cho cơ thể Nếu ĐB gen làm chuỗi -globin giảm hay không được tạo thành gọi là bệnh -Thal Cũng có trường hợp cả hai chuỗi β và α bị thiếu

h t hơn bình thường, trường hợp này gọi là thể phối hợp α/β thalassemia

(Sollaino, M.C et al, 2009)

Bệnh hemoglobin E (HbE) do ĐB sai nghĩa tại vị trí nucleotide 129 của chuỗi -globin (bộ ba mã hoá thứ 26 trên exon 1): GAG bị thay bằng AAG, làm cho acid amin vị trí thứ 26 là Glutamic acid bị thay bằng Lysine, dẫn đến giảm số lượng chuỗi -globin Như vậy, HbE cũng là -Thal thể nhẹ (Nguyễn

Công Khanh, 1993; Vichinsky, E., 2007; Bachir, D et al, 2014)

2.1.1 Đặc điểm phân tử của bệnh Beta thalassemia

C m gen β-globin nằm trên nhánh ngắn nhiễm sắc thể (NST) số 11 (11p15.5), với đoạn DNA dài 73.308 cặp base, mã số trên ngân hàng gen là U01317, bao gồm các gen có trật tự: 5’– epsilon – gamma – G – gamma – A –

delta – beta – 3’

Gen β-globin dài 1606 cặp base, nằm ở vị trí nucleotide

5203272-5204877 của NST số 11, tương ứng với nucleotide 62137-63742 của c m gen β-globin và đoạn khởi động sát đầu 5’ ở vị trí các nucleotide thứ 62061, 62106

và 62144

Gen β-globin có 3 exon và 2 intron mã hoá cho chuỗi -globin dài 146 acid amin Exon 1 ở nucleotide 1-142 và mã hoá các acid amin 1-30, acid amin thứ nhất bắt đầu từ vị trí nucleotide 50 Exon 2 ở nucleotide 273-495 và

mã hoá các acid amin 31-104 Exon 3 bắt đầu từ nucleotide 1346-1606 và mã hoá các acid amin 105-146 Các exon này tương ứng với 3 vùng cấu trúc và chức năng của chuỗi -globin Exon 1 và exon 3 nằm phía ngoài chủ yếu là các acid amin ưa nước Exon 2 nằm bên trong phân tử tạo bởi các acid amin

kỵ nước Khi có ĐB gen xảy ra thì trình tự các acid amin sẽ thay đổi Các acid amin ở bề mặt bị thay bằng các acid amin kị nước và tạo ra các thay đổi hoá học dẫn đến giảm đàn hồi, gây mất ổn định của phân tử protein, tạo ra các

chuỗi β-globin bị lỗi (Wochenschr, S.M., 1983; Quách Thị Hoàng Oanh, 2009;

Fettah, A et al, 2013)

Hình 2.1 Cấu trúc gen -Thal (Chanane Wanapirak et al, 2009)

2.1.2 Di truyền bệnh Beta thalassemia

Beta thalassemia là bệnh di truyền lặn trên NST thường, theo quy luật di truyền Mendel Khi chỉ có cha hoặc mẹ mang gen bệnh, 50% khả năng con sinh ra là thalassemia dị hợp tử và không có trẻ đồng hợp tử bị bệnh Nếu cả cha và mẹ đều bị thalassemia dị hợp tử thì 25% khả năng sinh con bình thường, 50% khả năng con dị hợp tử và 25% khả năng con đồng hợp tử (Nguyễn Công Khanh, 1985; Wochenschr, S.M., 1983; Thein S, 2005)

biến đổi khác nhau Thông thường các ĐB đều làm giảm hoặc không tổng hợp

loại Hb bình thường nên hồng cầu có biểu hiện nhược sắc và tăng sinh các hồng cầu non trong tủy

Đột biến gây thiếu h t chuỗi  dẫn đến dư thừa chuỗi  Các chuỗi  dư

thừa tạo thành các hạt tủa xuống màng hồng cầu và nguyên sinh chất của hồng cầu Với hồng cầu ở máu ngoại vi, những hạt tủa này làm cho màng hồng cầu

mất độ mềm dẻo, hồng cầu trở thành tế bào cứng nên khó vượt qua các “màng

lọc” ở lách (Maria-Domenica Cappellini et al, 2008; Srisupundit K, 2013)

Hình 2.3 Hình dạng hồng cầu bất thường của bệnh nhân -Thal

(Gelehrter, T.D et al, 2000)

Mặt khác, các hạt tủa cũng làm cho màng hồng cầu tăng diện tích tiếp xúc, dễ bị các tác nhân oxy hóa phá hủy Đồng thời tính thấm của màng thay đổi nên kali ở bên trong tế bào thoát ra ngoài huyết tương Những tác hại trên của các hạt tủa làm hồng cầu bị vỡ sớm gây nên hiện tượng tan máu

Sơ đồ 2.1 Cơ chế sinh bệnh do thừa chuỗi ở bệnh nhân -Thal β

(Olivieri,N.F., 1999) Còn ở tủy xương, các hạt tủa gắn lên nguyên sinh chất và màng của hồng cầu non, làm cho hồng cầu bị chết trước khi trưởng thành, dẫn đến tăng sinh

Bình thường α-Thal β-Thal

mạnh các hồng cầu trong tủy, gây nên các biến dạng xương, tăng hấp thu sắt dẫn đến nhiễm sắt cho cơ thể Hiện tượng các hồng cầu non bị chết sớm không đến được giai đoạn trưởng thành như trên gọi là hiện tượng sinh hồng cầu không hiệu quả Như vậy, dư thừa chuỗi dẫn đến tuỷ xương sinh hồng cầu không hiệu quả, đây là cơ chế chủ yếu gây ra những biến đổi về lâm sàng và huyết học ở những bệnh nhân -Thal thể nặng (Sơ đồ 2.1)

Ở thể dị hợp, các biến đổi về hồng cầu cũng tương tự như đồng hợp, nhưng mức độ không trầm trọng, vì thế chỉ có hiện tượng thiếu máu nhẹ Cũng tương tự, ở các bệnh nhân thể nhẹ, sự mất cân bằng giữa chuỗi  và chuỗi  không nặng nề nên bệnh nhân hầu như không có biểu hiện lâm sàng thiếu máu

(Run, D et al, 1992)

2.1.4 Đột biến gây bệnh Beta thalassemia

Bệnh β-Thal phân bố rộng rãi từ Địa Trung Hải, Trung Đông, Ấn Độ

qua Pakistan cho đến Đông Nam Á (Hình 2.4) (De Siva, S et al, 2000) Bệnh

cũng có tần số cao ở một số vùng thuộc Liên Xô cũ và Trung Quốc Ở châu

Âu, châu Phi bệnh tương đối ít gặp Gần đây do sự di dân, gen bệnh phát tán

đi khắp nơi và thalassemia trở thành vấn nạn toàn cầu

Đức, một quốc gia không nằm trong vành đai phân bố của bệnh β-Thal

là một minh chứng Theo nghiên cứu của Elisabeth Kohne và Enno Kleihauer (2010) β-Thal chiếm 23,2% trên tổng số bệnh nhân mắc bệnh thiếu máu tại Đức Trong tổng số 23.330 bệnh nhân mắc bệnh β-Thal ở quốc gia này, số người có nguồn gốc bản địa là 3.693 chiếm chỉ 15,8% 84,2% bệnh nhân còn lại được di cư từ các quốc gia Địa Trung Hải ở phía nam châu Âu và Thổ Nhĩ

Kì

Bảng 2.1 Phân bố bệnh nhân theo các thể bệnh tại Đức

Thể bệnh - thal Số người (%) Dân nhập cư (%) Dân bản xứ (%)

Ngày nay, có khoảng 200 kiểu ĐB khác nhau trên gen β-globin đã được

mô tả Chúng thường là ĐB điểm (point mutations), ĐB khung (frameshift mutation), ĐB vô nghĩa (nonsense mutations),… xuất hiện trên tất cả các vùng của gen β-globin bao gồm cả intron, vùng promotor Các ĐB xuất hiện tùy theo kiểu và vị trí mà sẽ ảnh hưởng nhiều hay ít đối với việc tổng hợp chuỗi β gây ra bệnh β-Thal với biểu hiện thiếu máu mức độ nặng, nhẹ khác nhau Các

ĐB chủ yếu rơi vào các nhóm sau (Weathrall D.J et al, 2001; Peng, C.T et

+ Đột biến đoạn khởi động: có 18 đột biến đoạn khởi động được phát hiện Các ĐB này ảnh hưởng đến phiên mã do làm giảm khả năng gắn enzyme RNA polymerase và chỉ gây giảm số lượng chuỗi -globin với các biểu hiện lâm sàng -Thal thể trung gian Ví d : đột biến c.-78A>G (-28A>G)

+ Đột biến cắt/nối mRNA: sau phiên mã, mRNA được cắt/nối để loại bỏ intron Các ĐB cắt nối có thể gây mất hoàn toàn hoặc giảm một phần quá trình cắt/nối bình thường hoặc tạo ra vị trí cắt/nối mới intron hoặc ở exon gây ra 0hoặc + thalassemia như các đột biến c.92+1 G>T (IVS1.1 G>T), c.316-197 C>T (IVS2.654 C>T)

+ Đột biến tạo mRNA không có chức năng:

Đột biến vô nghĩa: xảy ra khi thay thế một nucleotide này bằng một nucleotide khác làm xuất hiện mã dừng, gây chấm dứt dịch mã sớm tạo chuỗi globin không hoàn chỉnh và nhanh chóng bị thoái hoá Các ĐB này gây ra kiểu hình 0 thalassemia Ví d : đột biến c.52A>T (Cd17AAG>TAG)

Đột biến lệch khung: xảy ra khi mất hoặc thêm một hoặc vài nucleotide ở vùng mã hoá của gen làm thay đổi khung đọc bình thường bắt đầu từ vị trí ĐB và tạo mã vùng xuất hiện sớm, tạo ra các chuỗi -globin không hoàn chỉnh Đây là ĐB nghiêm trọng, gây ra kiểu 0 thalassemia Một

số ĐB loại này là đột biến c.124-127delTTCT (Cd41/42 –TTCT), c.214insA (Cd 71/72 +A) và c.28insA (Cd95 +A) (Newton, C.R., 1989)

Ở những vùng có tỷ lệ gen bệnh cao, thường có một số ĐB mang tính phổ biến, các ĐB này có tính đặc trưng theo dân tộc và vùng miền

(Weatherall, D et al, 2001; Loukopoulos, D and Kollia, P., 2001; Nguyễn

Khắc Hân Hoan, 2013) Thường mỗi cộng đồng có khoảng 4 đến 10 đột biến

phổ biến như ở Ấn Độ Dương và các nước lân cận: các ĐB hay gặp là c.92+5

G>C, c.46 G>A, c.27-28 +G và c.124-127 – TTCT Một số khu vực khác, các kiểu ĐB được trình bày trong bảng 2.2

Bảng 2.2 Các đột biến -Thal phổ biến ở một số quần thể trên thế giới

Codon 8/9 +G Codon 26 GAG>AAG IVS 1-5 G>C

Tại vùng Địa Trung Hải, tần số người mang bệnh cao (6,8 - 15% dân số) Đột biến hay gặp nhất tại khu vực này là +: IVS1.110 G>A Tuy nhiên, ở mỗi quốc gia trong khu vực này có một số đột biến đặc trưng Ví d : tại Iran: IVS2.1 G>A, IVS1.1 G>A, Codon 8/9 +G, Cd8 -AA, IVS1.110 G>A, Cd39 C>T, IVS1.6 T>C), IVS2.745 C>G), IVS1.5 G>C), Cd5 -CT Ở Hy Lạp và Thổ Nhĩ Kỳ được trình bày trong bảng 2.3 (Loukopoulos, D and Kollia, P., 2001)

Bảng 2.3 Phân bố các kiểu gen -Thal ở Hy Lạp và Thổ Nhĩ Kỳ

(Maria-Domenica Cappellini et al, 2008)

Ở Việt Nam theo các nghiên cứu, có 8 loại ĐB phổ biến (Bảng 2.2) Các

ĐB này luôn chiếm >90% các trường hợp khi nghiên cứu trên người Việt Nam, trong đó Cd95 +A (c.286insA) là ĐB đặc trưng của nước ta

Bảng 2.4 Các kiểu đột biến thường gặp, mức độ nặng và phân bố theo chủng tộc

Trung Quốc IVS2-654 (C>T) β+

Địa Trung Hải IVS2-745 (C>G) β+

Địa Trung Hải Cd39 (C>T) β0

Địa Trung Hải Cd5 (-CT) β0

Địa Trung Hải; M gốc Phi Cd6 (-A ) β0

Đông Nam Á Cd41/42 (-TCTT) β0

M gốc Phi AATAAA > AACAAA β++

Địa Trung Hải AATAAA > AATGAA

2.1.5.1 Các thể bệnh Beta thalassemia theo lâm sàng

Trên lâm sàng bệnh được chia thành 3 thể chính (Cao, A et al, 1997;

Thein, S L., 2004)

* Thể nặng: còn gọi là bệnh Cooley, thể đồng hợp tử

Bệnh nhân có thiếu máu, tan máu mạn tính mức độ nặng với các triệu chứng thiếu máu, lách to, gan to, da bị nhiễm sắc tố, biến dạng xương, chậm phát triển thể chất

Hình 2.5 Bệnh nhân -Thal thể nặng (Gelehrter, T D et al, 2000)

MCH 14-20pg

HbA2 tăng, thay đổi HbF 70-90%

thiếu máu nặng cần truyền máu

HbA2 >3,2%

HbF 0,5-6%

không có triệu chứng thiếu máu trên lâm sàng

-Thal thể

trung gian

β+/β++

β0/β+

β0/β0 + yếu

tố khác

Hb 6-10g/dL MCV 55-70fL MCH 15-23pg

HbA2 tăng, thay đổi HbF tăng đến

100%

thiếu máu vừa, cần truyền máu nhưng không ph thuộc

* Thể trung gian (intermedia): có thể là thể đồng hợp tử, thể dị hợp tử kép hay thể phối hợp

Thể này có thiếu máu vừa hoặc nhẹ, bệnh tiến triển chậm và nhẹ, thường kèm theo vàng da, gan, lách to Bệnh nhân không có thay đổi về thể trạng, chỉ

bị thiếu máu mức độ trung bình và thỉnh thoảng mới cần truyền máu

Kiểu gen ĐB, công thức máu, chỉ số điện di Hb và triệu chứng chính của

3 thể bệnh được trình bày trong bảng 2.5

2.1.5.2 Các thể bệnh Beta thalassemia khác

* Các thể bệnh β-Thal có đột biến HbE

HbE rất phổ biến ở Đông Nam Á khi chỉ có mỗi đột biến HbE hoặc

kết hợp thêm với đột biến HbE hay ĐB khác gây β-Thal sẽ tạo ra 4 thể bệnh

và kiểu hình của từng thể bệnh được mô tả ở bảng 2.6

Bảng 2.6 Kiểu gen, công thức máu, điện di Hb và triệu chứng của các thể bệnh -Thal có đột biến HbE (Kohne, 2011)

Dị hợp tử

HbE βE/β

Hb bình thường hoặc giảm nhẹ MCV <80fL

MCH <28pg

HbE =25-35%

bệnh nhân thiếu máu nhược sắc nhẹ

Đồng hợp

E/βE

Hb 10-14g/dL MCV <80fL MCH <28pg

HbE > 95%

HbA2 ≈ 2,5%

HbF < 3%

Thiếu máu nhược sắc nhẹ, tan huyết khi nhiễm trùng HbE phối

HbA2 < 5%

HbF = 15-25%

HbE tăng đến 85%

Thiếu máu tương tự như β-Thal thể nặng

* Các thể bệnh phối hợp giữa β-Thal và α-Thal

Sự cùng tồn tại của ĐB gây giảm tổng hợp chuỗi α-globin dẫn đến bệnh α-Thal có thể điều chỉnh kiểu hình của đột biến β-Thal Sự kết hợp của hai ĐB này sẽ giúp bệnh nhân giảm triệu chứng thiếu máu do ĐB β-Thal gây ra nhờ

cơ chế giảm sự mất cân bằng của chuỗi α và β globin Ví d : sự kết hợp ĐB mất 2 gen alpha (-α/-α hoặc /αα) phối hợp với thể dị hợp thử kép β0

/β+ hay kiểu gen bệnh HbH của alpha α-Thal phối hợp với thể β0/β+ hoặc β+/β+ sẽ làm giảm bệnh cảnh của bệnh nhân β-Thal từ thiếu máu nặng thành thiếu máu vừa hoặc nhẹ

Ngược lại, khi ĐB gây thừa gen α-globin kết hợp với các thể bệnh Thal làm sẽ nghiêm trọng hơn mức độ thiếu máu của bệnh nhân , người mang

β-cùng lúc hai ĐB này Ví d : đột biến tăng thêm 2 gen α (ααα/ααα hoặc

αααα/αα) kết hợp với β-Thal thể nhẹ sẽ tạo ra β-Thal thể trung gian Tuy nhiên, nếu chỉ thừa một gen α (ααα/αα) thì kiểu hình bệnh nhân β-Thal thể nhẹ sẽ thay đổi tùy thuộc vào loại ĐB của gen α-globin (Kohne, 2011)

* Thể bệnh β-Thal trội

β-Thal trội được phát hiện ở người châu Âu và Nhật Bản Mặc dù các

cá thể chỉ có kiểu gen dị hợp tử (mang một ĐB gây bệnh β-Thal) vốn không

có biểu hiện triệu chứng trên lâm sàng nhưng các bệnh nhân này lại có bệnh cảnh của β-Thal trung gian Đã có hơn 30 đột biến di truyền theo kiểu trội được mô tả, trong đó ĐB phổ biến nhất là codon 121 GAA>TAA

(Weatherall, D J et al, 2001; Kohne, 2011)

* Thể bệnh HPFH và δβ-Thal

Đây là các thể bệnh hiếm gặp, cả hai thể HPFH (duy trì HbF của bào thai) và δβ-Thal có chung đặc điểm là tăng lên đáng kể lượng HbF nhưng chỉ

số HbA2 vẫn duy trì ở mức bình thường Nguyên nhân thường do ĐB trên

c m gen β-globin trên nhiễm sắc thể 11 như: ĐB mất gen Gamma (HbG) kéo

dài đến gen β-globin hay gen Delta (HbD) kết hợp với ĐB trên gen β-globin (HbB) hoặc các ĐB mất đoạn lớn từ gen HbD kéo dài đến gen β-globin Các

bệnh nhân này sẽ có lâm sàng biểu hiện từ nhẹ đến trung gian hay nặng tùy

vào loại ĐB và kiểu gen có phối hợp hay không (Waye, J.S et al, 2003; Steinberg, M.H et al, 2009)

Hai thể bệnh này phân biệt dựa vào lâm sàng và huyết học Thường thì HPFH dị hợp tử có HbF tăng trong khoảng 15-30% nhưng chỉ số hồng cầu lại bình thường, trong khi δβ-Thal lại có khuynh hướng tăng HbF thấp hơn 5-20% nhưng lại đi kèm biểu hiện lâm sàng thiếu máu nhẹ kết hợp với chỉ số

hồng cầu nhỏ, nhược sắt (MCV<80fL và/hoặc MCH <28pg) (Flavell, R A et

al, 1978; Nakamura, T et al, 1987; Thais Arouca Fornari et al, 2013)

* Thể bệnh β-Thal có HbA 2 tăng cao bất thường

Thể này có HbA2 tăng cao khác thường trên 6,5% Nguyên nhân thường

do mất đoạn DNA chứa các yếu tố điều hòa nhóm gen  Các bệnh nhân

nà y có HbA2 tăng cao thường kèm với HbF tăng nhẹ (Cao, A et al, 1998; Weatherall, D J et al, 2001; Thein, S.L., 2008)

2.1.6 Chẩn đoán bệnh Beta thalassemia

Tùy ĐB ở mỗi quốc gia mà các k thuật chẩn đoán bệnh β-Thal được ứng d ng cho phù hợp Dù áp d ng k thuật nào thì xét nghiệm huyết học luôn được sử d ng để sàng lọc cơ bản bệnh β-Thal và chủ yếu dựa vào chỉ số MCV và MCH Ở những quốc gia y tế còn kém (một số quốc gia ở châu phi), hoặc quốc gia có tỷ lệ mắc bệnh hạn chế, k thuật điện di Hb là k thuật chủ yếu được sử d ng để chẩn đoán bệnh Tiêu chí sàng lọc và chẩn đoán bệnh qua xét nghiệm huyết học và điện di của từng thể bệnh được trình bày trong các bảng 2.5 và 2.6 (Cai, S.P et al, 1990; Martin, H et al, 2008)

Ngoài điện di, các nước nằm trong vành đai bệnh và các nước có y tế phát triển còn sử d ng thêm các k thuật sinh học phân tử hiện đại như PCR, giải trình tự để phát hiện bệnh Các k thuật này giúp chẩn đoán chính xác loại ĐB gây bệnh trên một hay hai chuỗi β-globin từ đó đánh giá chính xác hơn kiểu gen, cũng như thể bệnh và tình trạng thiếu máu hiện tại, mức độ cần

truyền máu của bệnh nhân (Cai, S.P et al, 1990)

Nhiều phương pháp sinh học phân tử đã được phát triển, ứng d ng vào chẩn đoán thalassemia ở người bệnh và chẩn đoán trước sinh cho thai nhi Tùy theo điều kiện của mỗi quốc gia và của phòng thí nghiệm cũng như m c đích ứng d ng mà k thuật c thể được sử d ng và điều chỉnh cho phù hợp (Bảng 2.7)

Bảng 2.7 Một số k thuật sinh học phân tử dùng trong chẩn đoán β-Thal

Tìm đột biến điểm và vi mất đoạn

Tìm đột biến điểm đã biết

- ASO (alen specific oligonucleotide hybridization) Corner, 1983

- CCA (color complementation assay) Embury, 1990

- A-RFLP (artificial-restriction fragment length

- ARMS (amplification refractory mutation system) Svasti, 2002

Tìm đột biến chƣa biết

- Chemical cleavage of mismatch Dianzani, 1991

- DGGE (Denaturing gradient gel electrophoresis) Gorakshakar, 2000

- MLPA (multiplex ligation-dependent probe

2.1.7 Điều trị bệnh Beta thalassemia

Người mang gen β-Thal (thể nhẹ) không cần điều trị đặc hiệu kể cả khi

có thiếu máu nhẹ hoặc vừa

β-Thal thể trung gian có thể truyền máu khi thiếu máu nặng, nhưng không thường xuyên Nếu phải truyền máu nhiều lần thì bệnh nhân β-Thal thể trung gian cũng có thể có nhiễm sắt và phải dùng thuốc thải sắt từng đợt Bệnh nhân mang thể bệnh này có thể sống đến tuổi trưởng thành

β-Thal thể nặng thường thiếu máu mạn tính, cần phải truyền máu thường

xuyên (Martin, H et al, 2009)

+ Truyền máu: hồng cầu lắng từng đợt để giữ ổn định tương đối hàm lượng huyết cầu tố

+ Cắt lách khi lượng máu truyền >200-250mL/Kg/năm hoặc có dấu hiệu cường lách và có chỉ định trên 5 tuổi để hạn chế nguy cơ nhiễm trùng nặng do

Pneumocoque, Meningocoque, Haemoplilus Ở trẻ nhỏ cần dự phòng bằng

kháng sinh (Penicilline) sau cắt lách Sau cắt lách, tiểu cầu, bạch cầu có thể tăng, cần dùng Aspirine liều thấp để ngừa tắc mạch

+ Giảm lượng sắt huyết thanh thường sau 10-15 lần truyền máu bằng Desferroxamine hoặc các dạng thuốc tương tự Các thuốc này thường chứa phức hợp có ái lực cao với sắt, tiêm bắp, tiêm dưới da, tĩnh mạch, liều 30- 40mg/Kg/ngày x 5-6 ngày

+ Điều trị hỗ trợ:

Acid ascorbic: làm chậm tốc độ chuyển ferritin thành hemosiderine Tuy nhiên, các acid ascorbic có thể làm tăng nguy cơ peroxidation của sắt đối với lipid của màng tế bào Liều 3mg/Kg lúc mới bắt đầu thải sắt

.Vitamin E làm bền màng tế bào, giảm nguy cơ oxid hóa màng hồng cầu Acid folic: đóng vai trò quan trọng trong tổng hợp DNA, tạo nhiều chất liệu tham gia sản xuất hồng cầu do tăng hoạt động của tuỷ xương

Ghép tủy từ người cho HLA phù hợp (kháng nguyên bạch cầu người - human leukocyte antigens) là biện pháp được cho là điều trị khỏi β-Thal thể nặng Kết quả ghép tủy tốt hơn ở trẻ em dưới 3 tuổi, mới truyền máu ít và

không biến chứng nặng (Hussey, N D et al, 2002; Jiao, Z.X et al, 2003)

Liệu pháp gen là một biện pháp tương lai, đang được nghiên cứu M c tiêu là gắn gen β-globin bình thường vào tế bào nguồn và sử d ng tế bào nguồn này để ghép tủy xương (Antonio Cao and Vilma Gabuttira, 1992)

2.1.8 Phòng bệnh Beta thalassemia

Với mức độ phân bố tương đối rộng, mang tính chất mạn tính nên bệnh β-Thal nói riêng và bệnh thalassemia nói chung là một thách thức đối với nhiều quốc gia trên thế giới Nếu bệnh được phát hiện sớm, truyền máu và thải sắt đầy đủ định kỳ, bệnh nhân β-Thal có thể phát triển gần như bình thường Các bệnh nhân này sẽ ít bị biến dạng hộp sọ và kéo dài được tuổi thọ Tuy nhiên, theo báo cáo tại Hội nghị kiểm soát mạng lưới thalassemia châu Á tổ chức ở Bangkok, Thái Lan (2005) thì tỷ lệ truyền máu và thải sắt đầy đủ rất thấp, chỉ có 10-15% ở Ấn Độ, 12,5% ở Indonesia, 56,9% ở Sri Lanka (Cao, A

et al, 1996; Cao, A et al, 1997; Angastiniotis, M et al, 2013)

Truyền máu an toàn, chi phí thải sắt cao là những thử thách lớn cho gia đình và bệnh nhân β-Thal Fucharoen, S (1997) ước tính ở Thái Lan, tổng số tiền điều trị cho bệnh nhân thalassemia thể nặng vào khoảng 220 triệu USD/năm Còn tại Cryprus, Hy Lạp, nếu tất cả các trẻ bị thalassemia đều được chào đời thì việc truyền máu và thải sắt cho các bệnh nhân sẽ chiếm toàn bộ ngân sách y tế của địa phương này Như vậy, phòng bệnh là một vấn đề hết sức cần thiết nhằm làm giảm gánh nặng điều trị cho gia đình bệnh nhân và cho

xã hội

Để phòng bệnh được hiệu quả, các chương trình tầm soát, sàng lọc phát hiện bệnh thalassemia và người mang gen ở trạng thái dị hợp tử trong lứa tuổi học đường, trước tuổi kết hôn nên được triển khai Tư vấn di truyền (TVDT) cho các gia đình có người mang gen bệnh, trong đó có tư vấn trước hôn nhân

để cho các cặp vợ chồng tự lựa chọn hạn chế sinh đẻ hoặc áp d ng chẩn đoán trước sinh cũng là biện pháp phòng bệnh quan trọng Các phương pháp chẩn đoán trước sinh thường là các xét nghiệm dựa trên DNA chiết tách từ tế bào ối hay tế bào tua rau hoặc những tế bào của bào thai lưu hành trong máu mẹ Sự

áp d ng đồng bộ các phương pháp này có thể làm giảm tỷ lệ sinh ra những trẻ

bị bệnh thalassemia (Angastiniotis et al, 1981; Antonio Cao and Yuet Wai

Kan, 2013)

Tại Việt Nam, có nhiều nghiên cứu về tầm soát bệnh β-Thal trên một số

dân tộc và một số vùng miền Theo Nguyễn Công Khanh và ctv (1993), tần

suất người mang gen β-Thal ở miền Bắc là 1,49%, miền Trung 2,55%, miền Nam 1,7% Nguyễn Thị Hồng Nga (2002), sử d ng công thức Shine và Lal trong tầm soát beta thể ẩn thì tỷ lệ dương tính thật là 92,5% Phạm Thị Ngọc Nga (2011), tỷ lệ mang gen bệnh β-Thal xác định qua điện di Hb trên dân tộc Khmer tỉnh Bạc Liêu là 33,5%, Tuy nhiên, tất cả các nghiên cứu chỉ thực

hiện trên một bộ phận dân số, nước ta chưa có chương trình phòng bệnh thalassemia thật sự hiệu quả từ các nghiên cứu

Năm 2010, chương trình quốc gia đã quan tâm đến việc quản lý bệnh nhân thalassemia, mong rằng trong tương lai không xa chúng ta sẽ có những chính sách đặc biệt để việc tầm soát, chẩn đoán trước sinh, TVDT được thực hiện một cách rộng rãi nhằm giúp cho việc phòng bệnh được hiệu quả hơn

2.2 Phương pháp lập và phân tích phả hệ bệnh Beta thalassemia

2.2.1 Ý nghĩa của phương pháp nghiên cứu phả hệ

Phương pháp nghiên cứu phả hệ dùng để phân tích một tính trạng hay một bệnh tật có di truyền hay không và thuộc quy luật di truyền nào Phương pháp này được ứng d ng rộng rãi để theo d i một tính trạng hoặc một bệnh tật qua một số thế hệ, ít nhất là ba thế hệ, từ đó có thể tiên đoán sự xuất hiện của các tính trạng hoặc một bệnh tật ở thế hệ tiếp theo Trong một số trường hợp, chúng ta có thể xác định được người mang gen bệnh Đây là cơ sở để cán bộ y

tế cho những lời khuyên về di truyền chính xác, hữu ích mà không tốn kém giúp các gia đình đang mong muốn sinh con, các cặp nam nữ thanh niên trong

độ tuổi kết hôn có các quyết định đúng khi lập gia đình

Ngoài ra, ở các gia đình có bệnh di truyền như bệnh β-Thal, phả hệ thật

sự rất có ý nghĩa Phả hệ cung cấp các thông tin về tiền sử gia đình và điều này luôn giữ yếu tố quan trọng về cuộc sống trong quá khứ và tương lai của một cá nhân có nguy cơ mắc bệnh di truyền Tiền sử gia đình có thể được sử d ng như một công c chẩn đoán và giúp bác sĩ hướng dẫn, chỉ định các xét nghiệm

di truyền cho bệnh nhân và các thành viên trong gia đình có nguy cơ

(Angastiniotis, M et al, 2013)

Trong gia đình của một bệnh nhân β-Thal, nghiên cứu phả hệ thậm chí

có thể giúp loại trừ căn bệnh di truyền này nếu gia đình kết hợp với tư vấn và thực hành tốt Việc hình thành ý thức phòng bệnh cho thế hệ sau, cách chăm sóc bệnh nhân giúp giảm biến chứng sẽ dễ dàng hình thành và đi vào ý thức của các thành viên trong phả hệ Tất cả sẽ là cơ sở quý giá cho phép cá nhân

và nhân viên y tế thực hiện các bước để giảm nguy cơ và ngăn chặn không cho bệnh xuất hiện tiếp trong gia đình

Như vậy, phương pháp phả hệ luôn là phương pháp kinh điển, nhưng nó lại được sử d ng như một phương pháp phổ thông trong nghiên cứu, tiên đoán bất cứ bệnh tật di truyền nào trong đó có cả bệnh β-Thal

2.2.2 Phương pháp lập phả hệ

Mỗi cá thể trong một phả hệ có một ký hiệu theo quy ước quốc tế, tùy theo giới tính, có bệnh tật đang cần phân tích hay không, có là người mang gen bệnh lặn hay không

Sơ đồ phả hệ thường được vẽ theo hình bậc thang từ trên xuống theo thứ

tự các thế hệ ông bà, cha mẹ, con cháu

Mỗi thế hệ là một bậc thang, các con của một cặp bố mẹ được ghi lần lượt từ trái sang phải và từ người con lớn nhất Đương sự là bệnh nhân mắc bệnh đến khám và từ đó người bác sĩ hỏi và tìm hiểu dần đến các thành viên còn lại trong phả hệ để lập sơ đồ phả hệ Đương sự được đánh dấu bằng một mũi tên bên dưới ký hiệu Phía bên trái mỗi thế hệ của phả hệ ghi các chữ số

La mã để chỉ thứ tự các thế hệ trong phả hệ Bên dưới (phía bên phải) của từng thành viên có ghi các chữ số Ả rập để chỉ số thứ tự của thành viên trong thế hệ

đó (Hình 2.6) Khi theo d i một tính trạng qua nhiều thế hệ, gồm nhiều cá thể,

sơ đồ phả hệ hình bậc thang không đủ chứa tất cả các cá thể, cho nên trường

hợp này phả hệ được lập theo hình cung (Trịnh Văn Bảo và ctv, 2008)

Hình 2.6 Một phả hệ điển hình của di truyền alen trội

nhiễm sắc thể thường

2.2.3 Phân tích phả hệ

Khi phân tích phả hệ cần biết chi tiết về tất cả mối quan hệ huyết thống của các cá thể trong sơ đồ phả hệ, sự biểu hiện bệnh liên t c hay ngắt quãng qua các thế hệ liên tiếp, mức độ biểu hiện bệnh của các cá thể nặng hay nhẹ và

biểu hiện trên cá thể nam hay nữ (Chu Văn Mẫn và ctv, 2009)

Trong một phả hệ có bệnh di truyền, tần số một số bệnh trong phả hệ giảm dần theo quan hệ huyết thống, theo hệ số di truyền: họ hàng bậc một (bố

mẹ, anh chị em ruột, con) có tỷ lệ mắc bệnh cao nhất; giảm dần ở họ hàng bậc hai (ông, bà, chú, bác, cô dì ruột, cháu ruột); rồi đến họ hàng bậc ba (anh chị

em họ)…Từ đó, kết hợp với quy luật di truyền trong phả hệ ta có thể tiên đoán khả năng xuất hiện bệnh tật cho thế hệ tiếp theo

Người chưa có thông tin hoặc thông

tin không đầy đủ về tính trạng

Người không được kiểm tra hoặc

Hôn nhân cùng huyết thống

Hôn nhân không có con

Anh chị em cùng bố mẹ

Hai hôn nhân với các con của mỗi

hôn nhân

Số con riêng không biết

Con nuôi (không cùng huyết thống)

Con sinh đôi một hợp tử

Con sinh đôi hai hợp tử

Không r kiểu sinh đôi là một hay

2.3.1 Tư vấn di truyền cho bệnh nhân Beta thalassemia

Tư vấn di truyền là quá trình mà các bệnh nhân hoặc người thân có nguy

cơ rối loạn di truyền được biết về những hậu quả của rối loạn cũng như nguy

cơ mắc bệnh và những cách có thể ngăn ngừa hay cải thiện được tình trạng

bệnh (Harper, P., 2010; Angastiniotis, M et al, 2013)

Tư vấn di truyền cần thực hiện được các yêu cầu:

+ Chẩn đoán chính xác thể bệnh ở các thành viên trong gia đình

?

+ Giải thích về bản chất của bệnh và dự báo các biểu hiện, rối loạn, cách điều trị cần thiết và nơi có thể điều trị

+ Ước lượng nguy cơ di truyền bệnh của cha mẹ và các thành viên trong gia đình Điều này đòi hỏi phải vẽ phả hệ và có thể yêu cầu điều tra thêm các thành viên khác trong dòng họ

+ Truyền đạt được các nguy cơ di truyền của bệnh và các phương án để tránh chúng, bao gồm cha mẹ của bệnh nhân và các thành viên khác khi họ muốn có con Hỗ trợ cho cá nhân hoặc cặp đôi trong việc ra quyết định phù hợp với họ

+ Những người có nguy cơ thường cần được tư vấn và hỗ trợ tại một số điểm trong cuộc đời nên TVDT cần phải tiếp cận lâu dài

Theo liên đoàn thalassemia thế giới (TIF), TVDT là một khía cạnh phức tạp nhất của công tác phòng chống bệnh hiện nay TVDT không thể tách rời khỏi chẩn đoán di truyền nhằm xác định chính xác nguyên nhân gây ra bệnh, cách chăm sóc, kiểm soát sức khỏe tốt cho người bệnh Từ đó, các thông tin này sẽ được cung cấp chính xác cho bệnh nhân, người nhà và TVDT chỉ thành công khi gia đình có được kiến thức đầy đủ đồng thời chấp nhận thực hành

đúng (Rowley, P.T et al, 1984; Cao, A et al, 1996; Cao, A and Kan, Y.W.,

2013)

Như vậy, tư vấn có vai trò đặc biệt quan trọng trong y tế cũng như di truyền học y học và cho gia đình người mắc bệnh nhằm nâng cao kiến thức, phòng bệnh tật di truyền và hạn chế sự ra đời những đứa trẻ bị khuyết tật Nhưng việc gợi ý cho các thành viên trong kết hôn, quyết định sinh con hay những lựa chọn khó khăn đôi khi phải thực hiện như cần chấm dứt thai kỳ và những vấn đề đạo đức có thể xảy ra khi chẩn đoán trước sinh luôn là những khó khăn trong tư vấn Vì vậy, tùy vào đặc điểm văn hóa, kinh tế mà mỗi quốc gia tự xây dựng một quy trình tư vấn và sàng lọc trước sinh cho phù hợp

(Phạm Việt Thanh và ctv, 2010)

2.3.2 Các phương pháp chẩn đoán trước sinh bệnh Beta thalassemia

Hiện nay, bệnh β-Thal và các bệnh Hb khác luôn được quan tâm và đưa vào danh sách các bệnh cần TVDT trên thế giới Tư vấn có kết hợp với chẩn đoán trước sinh luôn được khuyến cáo sử d ng ở các quốc gia có bệnh thalassemia lưu hành

Những k thuật sinh học phân tử luôn được chỉ dẫn c thể trong các hướng dẫn của TIF Và bên cạnh việc cung cấp kiến thức cho bệnh nhân và người nhà thì chẩn đoán trước sinh đã tạo cho TVDT một bước tiến mới và đi

đến thành công trong việc phòng bệnh β-Thal Tuy nhiên, việc thực hiện chẩn đoán trước sinh khá tốn kém ph thuộc vào tiềm lực y tế và các vấn đề đạo

đức cũng như tôn giáo ở mỗi quốc gia khác nhau (Cao, A et al, 2002; Sanchaisuriya, K et al, 2005)

Tất cả, các phương pháp chẩn đoán bệnh β-Thal đều có thể được sử d ng

để chẩn đoán trước sinh (Bảng 2.7), chỉ khác là DNA được lấy từ nguồn khác biệt vì đối tượng không phải là bệnh nhân mà là thai nhi đang ở giai đoạn đầu của sự phát triển

2.3.2.1 Các phương pháp lấy DNA thai nhi

* DNA trong máu mẹ:

DNA ở rau thai giống hệt với DNA của thai nhi Khi các tế bào rau thai già chúng sẽ chết tự nhiên và giải phóng DNA Các DNA tự do này sẽ đi vào

hệ thống tuần hoàn của người mẹ Các DNA tự do của thai lẫn với DNA tự do của người mẹ, trung bình chúng chiếm khoảng 10% tổng DNA tự do Tuy nhiên, số lượng DNA tự do của thai nhi trong máu người mẹ khác nhau giữa các thai ph và tuổi thai

Do lượng DNA trong máu mẹ rất ít nên chỉ được thực hiện sau tuần thứ

10 của thai kỳ và thích hợp nhất là tuần thứ 12 DNA được trích từ 5-10mL máu ngoại vi của mẹ được chống đông với heparin hoặc tốt hơn là EDTA vì heparin có thể gây trở ngại cho quá trình PCR

Ưu điểm của phương pháp này là không xâm lấn đến thai kỳ, do loại mẫu được sử d ng xét nghiệm chỉ là máu tĩnh mạch của mẹ nên không gây ảnh hưởng gì đến sức khỏe của em bé cũng như thai ph (Gelehrter, T D 2000)

* Chọc dò dịch ối:

Người ta có thể tiến hành chọc dò ối qua thành b ng hoặc qua đường âm đạo Ngày nay, người ta thường kết hợp với siêu âm để dẫn đường, xác định vị trí cho việc chọc dò (Hình 2.7) Chọc dò ối thường được tiến hành vào tuần thứ 15-18 vì các lý do:

Trước tuần 15 dịch ối của túi thai chưa nhiều, ít tế bào bong vào nước ối,

vì vậy khi chọc dó có thể gây sẩy thai Sau tuần 15 tử cung đã to, lượng dịch

ối khoảng 100-180mL nên việc lấy dịch ối dễ dàng hơn ở thời điểm này Số tế bào sống bong ra từ bào thai và màng ối lúc này cũng nhiều hơn, đủ để làm các xét nghiệm và nuôi cấy tế bào thành công Sau tuần 15, tần số sẩy thai tự nhiên bắt đầu giảm, cũng thuận lợi hơn cho việc làm các thủ thuật như chọc dò dịch ối