Thuốc thử hữu cơ curcumin CURCUMIN và một số ỨNG DỤNG TRONG PHÂN TÍCH

Thuốc thử hữư cơ có nhiều ứng dụng trong hoá học phân tích, nó đã được sử dụng trong phương pháp trọng lượng, chuẩn độ, trắc quang và trong các phép phân tích công cụ khác. Chất curcumin là một chất chống oxy hóa tự nhiên, nó cũng được coi là một hợp chất rất hữu ích trong các vấn đề sức khỏe, và được sử dụng trong điều trị tim mạch và bệnh viêm khớp. Hiện nay, nó cũng là sử dụng như chống viêm, chống oxy hóa và chống ung thư. Như chúng ta đã biết Curcumin được sử dụng rộng rãi như một thuốc thử màu trong phương pháp so màu xác định hàm lượng vết Bo trong những vật liệu khác nhau. Sự hình thành phức được sử dụng trong phương pháp so màu. Phương pháp rosocyanin có độ nhạy cao và phương pháp rubrocurcumin có độ nhạy thấp nhất hơn nhưng tính chọn lọc cao. Việc phân tích định lượng Protein rất quan trọng trong nghiên cứu hóa sinh và kĩ thuật sinh học. Có nhiều phương pháp truyền thống như phương pháp Lowry, phương pháp Bradford, các phương pháp quang phổ… Người ta phát hiện ra rằng Protein và sodium dodecyl sulphonate (SDS) có thể làm tăng sự cộng hưởng ánh sáng tán xạ (RLS) của curcumin. Dựa trên tính chất này người ta phát triển một phương pháp định lượng Pro mới. Tuy nhiên trong bài tiểu luận này đề cập đến thuốc thử Curumin và sử dụng nó trong phân tích định tính kim loại Boron bằng phương pháp so màu, và phân tích định lượng protein bằng phương pháp trắc quang.

LỚP 4C

Tiểu luận:

CURCUMIN

VÀ MỘT SỐ ỨNG DỤNG TRONG

PHÂN TÍCH

SVTH: NGUYỄN THỊ NỮ GVHD: Th.s LÊ NGỌC TỨ

TP.HCM 10/2010

Giới thiệu 2

PHẦN A: CƠ SỞ LÝ THUYẾT 3

I THUỐC THỬ HỮU CƠ CURCUMIN 3

I.1 Công thức, tên gọi 3

I.2 Ứng dụng 3

I.3 Tính chất của thuốc thử 3

II BORON 4

II.1 Công thức, tên gọi, vị trí trong bảng HTTH 4

II.2 Tính chất vật lý 4

III PROTEIN 5

III.1 Giới thiệu chung 5

III.2 Tính chất 5

IV SỰ TẠO PHỨC CỦA CURUCUMIN 5

IV.1 Tạo phức với kim loại 5

IV.2 Tạo phức với Boron 6

Tạo phức với protein 7

PHẦN B: THỰC NGHIỆM 8

V SỬ DỤNG CURCUMIN ĐỂ XÁC ĐỊNH BORON BẰNG PHƯƠNG PHÁP SO MÀU 8

V.1 Hóa chất 8

V.2 Dụng cụ 8

V.3 Tiến hành 8

V.4 Các yếu tố ảnh hưởng 9

V.5 Kết luận 13

VI NGHIÊN CỨU SỰ TƯƠNG TÁC CỦA PROTEIN VỚI CURCUMIN VÀ SDS VÀ ỨNG DỤNG TRONG PHÂN TÍCH 14

VI.1 Giới thiệu 14

VI.2 Thiết bị dụng cụ 14

VI.3 Hóa chất 14

VI.4 Tiến hành 15

VI.5 Kết quả và thảo luận 15

VI.6 Kết luận 18

TÀI LIỆU THAM KHẢO 19

Giới thiệu

Thuốc thử hữư cơ có nhiều ứng dụng trong hoá học phân tích, nó đã được sử dụng trong phương pháp trọng lượng, chuẩn độ, trắc quang và trong các phép phân tích công

cụ khác

Chất curcumin là một chất chống oxy hóa tự nhiên, nó cũng được coi là một hợp chất rất hữu ích trong các vấn đề sức khỏe, và được sử dụng trong điều trị tim mạch và bệnh viêm khớp Hiện nay, nó cũng là sử dụng như chống viêm, chống oxy hóa và chống ung thư

Như chúng ta đã biết Curcumin được sử dụng rộng rãi như một thuốc thử màu trong phương pháp so màu xác định hàm lượng vết Bo trong những vật liệu khác nhau Sự hình thành phức được sử dụng trong phương pháp so màu Phương pháp rosocyanin có

độ nhạy cao và phương pháp rubrocurcumin có độ nhạy thấp nhất hơn nhưng tính chọn lọc cao

Việc phân tích định lượng Protein rất quan trọng trong nghiên cứu hóa sinh và kĩ thuật sinh học Có nhiều phương pháp truyền thống như phương pháp Lowry, phương pháp Bradford, các phương pháp quang phổ… Người ta phát hiện ra rằng Protein và sodium dodecyl sulphonate (SDS) có thể làm tăng sự cộng hưởng ánh sáng tán xạ (RLS) của curcumin Dựa trên tính chất này người ta phát triển một phương pháp định lượng Pro mới

Tuy nhiên trong bài tiểu luận này đề cập đến thuốc thử Curumin và sử dụng nó trong phân tích định tính kim loại Boron bằng phương pháp so màu, và phân tích định lượng protein bằng phương pháp trắc quang

PHẦN A: CƠ SỞ LÝ THUYẾT

I THUỐC THỬ HỮU CƠ CURCUMIN

I.1 Công thức, tên gọi

Danh pháp IUPAC:

(1E,6E)-1,7-bis (4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-1,6-heptadiene-3,5-dione

Tên khác:

- Natural Yellow 3 CTPT: C21H20O6

M = 368,39 đvC

I.2 Ứng dụng

Phát hiện ra: B, Ba, Ca, Hf, Mg, Mo, Ti, V, W, Zr Phản ứng đo độ sáng của Boron, cách sử dụng như xịt lên tờ giấy sắc ký

I.3 Tính chất của thuốc thử

Là bột màu vàng cam, nhiệt độ sôi 1830C, không tan trong nước, tan ít trong ether, dễ tan trong methanol, ethanol, acetone, và acid acetic băng Nó phản ứng với dung dịch kiềm cho màu vàng

Mặc dù thuốc thử có β–diketonemoiety trong cấu trúc của nó,nhưng không dữ liệu nàodiketonemoiety trong cấu trúc của nó,nhưng không dữ liệu nào phù hợp cho hằng số phân ly của enolic proton Hình 1 minh hoạ phổ hấp thụ của Curcumin ở điều kiện một vài dung dịch khác nhau

Hình 1: Minh hoạ phổ hấp thụ của Curcumin ở điều kiện một vài dung dịch khác nhau

II BORON

II.1 Công thức, tên gọi, vị trí trong bảng HTTH

Ký hiệu: B

Số hiệu nguyên tử bằng 5

Là á kim, chu kì II, phân nhóm chính nhóm 3

Hình 2: Một vài số liệu về nguyên tử Boron

II.2 Tính chất vật lý

Hình 3: Bảng các hằng số vật lý của Boron

III PROTEIN

III.1 Giới thiệu chung

Protein (Protit hay Đạm): là những đại phân tử được cấu tạo theo nguyên tắc đa phân

mà các đơn phân là axít amin Chúng kết hợp với nhau thành một mạch dài nhờ các liên kết peptide (gọi là chuỗi polypeptide) Các chuỗi này có thể xoắn cuộn hoặc gấp theo nhiều cách để tạo thành các bậc cấu trúc không gian khác nhau của protein

III.2 Tính chất

Axit amin được cấu tạo bởi ba thành phần:

- Một là nhóm amin (-NH2)

- Hai là nhóm cacboxyl (-COOH)

- Cuối cùng là nguyên tử cacbon trung tâm đính với 1 nguyên tử hyđro và nhóm biến đổi R quyết định tính chất của axit amin

Người ta đã phát hiện ra được tất cả 20 axit amin trong thành phần của tất cả các loại protein khác nhau trong cơ thể sống

Cấu trúc chung của Protein

Cấu trúc không gian của Protein

IV SỰ TẠO PHỨC CỦA CURUCUMIN

IV.1 Tạo phức với kim loại

IV.2 Tạo phức với Boron

Có hai dạng sau

Rosocyamin

Rubrocurcumin

Phổ hấp thụ của Rosocyamin và Rubrocurcumin

Tạo phức với protein

Về phúc của Củcumin và Protein thì chưa có nghiên cứu tuy nhiên người ta phát hiện rằng Protein có thể làm thay đổi sự cộng hưởng ánh sáng tán xạ của dung dịch Curcumin - sodium dodecyl sulphonate (SDS), Điều này chứng tỏ là một phức chất lớn đã hình thành trong dung dịch Curcumin-Protein-SDS

PHẦN B: THỰC NGHIỆM

V SỬ DỤNG CURCUMIN ĐỂ XÁC ĐỊNH BORON BẰNG PHƯƠNG PHÁP SO MÀU

V.1 Hóa chất

- Acetone: tinh khiết phân tích, tạp chất có thể bay hơi là 0,001%

- Pha dung dịch Boron gốc: hòa tan 0,5716 g acid boric trong 1lít nước ta có dd 1mg Boron/ 1ml hay 100Y

+ Dung dịch Boron chuẩn A: lấy 100ml dung dịch gốc trên pha thành 1lít dd bằng nước tinh khiết, ta được dung dịch 0.01mg Boron/ 1ml dd hay 10 Y

+ Dung dịch Boron chuẩn B: lấy 10ml dd gốc pha thành 1lít dung dịch bằng nước cất

ta được 0.001mg Boron/ 1ml dd, hay 1 Y

- Dung dịch Curcumin: hòa tan 0.0625g curcumin trong 5ml carbitol, sau đó pha thêm 500ml acetone Dung dịch này bền trong vòng 2, 3 tháng

- Acid chlohydric: pha 50ml dung dịch HCl (trọng lượng riêng 1,2) với 200ml nước dựng trong chai thích hợp

V.2 Dụng cụ

 Dụng cụ thủy tinh sử dụng chứa acid Boric phải là dụng cụ mới và được rửa bằng acid HCl, rồi rửa bằng acetone, sau đó tráng lại bằng nước cất

 Máy quang phổ Beckman, model DU, hoặc tương đương

 Burets thủy tinh

 Giấy lọc : Whatman no 40, size 9cm

 Phễu thủy tinh

 Pipets

 Nồi sứ chịu nhiệt 1000ml để làm bay hơi dung dịch kiềm

 Bình định mức

V.3 Tiến hành

Dùng pipet hút một lượng dung dịch chứa từ 0 –diketonemoiety trong cấu trúc của nó,nhưng không dữ liệu nào 20 μgg Boron, vào chén sứ chịu nhiệt,

và thêm 0.1 g bột sodium carbonate Làm bay hơi dung dịch đến khô, tốt nhất là thực hiện trong lò nung, ở nhiệt độ 110 –diketonemoiety trong cấu trúc của nó,nhưng không dữ liệu nào 1300C, làm lạnh, thêm 1 giọt chỉ thị phenolphthalein, chuẩn độ bằng HCl đến khi màu hồng biến mất rồi thêm 0.5 ml HCl nữa Lượng acid HCl sử dụng từ 1 –diketonemoiety trong cấu trúc của nó,nhưng không dữ liệu nào 4 ml tuy nhiên thông thường là 1ml, thêm vào đó 0,5 ml dd acid oxalic 5% và 3ml thuốc thử Curcumin, chưng cách thủy dung dịch này ở nhiệt độ 550C (±30C) Xuất hiện các tinh thể trong dung dịch sau đó làm lạnh Nhìn thấy àu đỏ trong dung dịch acetone, lọc dung dịch vào bình định mức 25ml, rửa tinh thể và giấy lọc bằng acetone, rồi định mức đến 25ml bằng acetone Lắc đều Giữ ở nhiệt độ 220C đến 250C Quan sát màu của dung dịch, hoặc tốt hơn là dùng quang kế Dùng máy đo quang phổ Beckman với khe hở 0.3 x10-6m và ở bước sóng 535nm

Phổ hấp thụ thu được từ quang phổ Beckman cho thấy mật độ quang A là 1.0cm mẫu không có Boron

V.4 Các yếu tố ảnh hưởng

 Acid oxalic Để nghiên cứu sự ảnh hưởng của lượng acid oxalic khác nhau, ta thêm một lượng acid oxalic 1ml với 1-4 ml HCl, 1 giọt phenolphthalein, 3ml hỗn hợp Curcumin –diketonemoiety trong cấu trúc của nó,nhưng không dữ liệu nào acetone

`Hình 1: Mô tả rõ ràng ảnh hưởng của axit oxalic trong việc xác định từ 0 đến 50 Y

Boron, các yếu tố khác không thay đổi Ảnh hưởng của acid oxalic tập trung ở vùng lân cận 2ml dung dịch 5%, nhưng kết quả cho thấy chỉ đạt được 0,25ml Khác biệt lớn nhất là ở 0.5ml

 Acid chlohydric: để xác định sự ảnh hưởng nếu dư HCl, cho 1ml sodium carbonate 10% cộng với 6ml là hỗn hợp: 1 –diketonemoiety trong cấu trúc của nó,nhưng không dữ liệu nào 4 ml HCl, 1giọt phenolphthalein, 0,25ml acid oxalic 5%, và 3ml dung dịch hỗn hợp Curumin –diketonemoiety trong cấu trúc của nó,nhưng không dữ liệu nào acetone

Hình3: Đồ thị cho thấy lượng dư acid HCl 5ml là môi trường acid thuận lợi nhất Lượng HCl dư (sau trung hòa) là rất quan trọng

Trong thí nghiệm nên thêm dư 0.5ml dd HCl là tốt nhất, việc thêm vào 0.5ml HCl được cho phép khi lượng Boron ít hơn 10y, nhưng kết quả không tốt khi lượng Boron lớn hơn 10y

 Ảnh hưởng qua lại giữa các loại acid

Bảng 1: Tóm tắt kết quả thu được khi thay đổi các thành phần acid

Dung dịch chỉ chứa 0-0,5 ml dung dịch axit hydrochloric và 0-1ml dung dịch axit oxalic là không đầy đủ tính axit và cho kết quả kém Dung dịch có chứa 1 ml dd hydrochloric và 0,25 ml dung dịch axit oxalic cho kết quả chính xác hơn

 Currumin Ảnh hưởng của lượng curcumin thay đổi được kiểm tra với lượng một lượng dung dịch curcumin 0.0125% với 1ml acid HCl, 1 giọt phenolphthtalein, 10ml dd acid oxalic 5%, lượng curcumin có thể thay đổi tùy ý theo hình 4, nồng độ acid oxalic cao hơn nồng độ curcumin cho phép Lượng curcumin tối thiểu cho 0 –diketonemoiety trong cấu trúc của nó,nhưng không dữ liệu nào 10 boron là 3ml Hình 4

V.5 Kết luận

Sự chính xác trong việc xác định Bo phụ thuộc vào hàm lượng của nó trong mẫu, trong khoảng từ 0 –diketonemoiety trong cấu trúc của nó,nhưng không dữ liệu nào 0,2 μgg, tổng thể tích mẫu giới hạn là 10ml, trong khoảng từ 0,2 –diketonemoiety trong cấu trúc của nó,nhưng không dữ liệu nào 2 μgg Boron thì tổng thể tích giới hạn của mẫu là 25ml, chính xác đến 0,05 μgg, trong khoảng

từ 2 –diketonemoiety trong cấu trúc của nó,nhưng không dữ liệu nào 25 μgg tổng thể tích là 25ml, với độ chính xác 95%, nếu trên 25 μgg, giới hạn là 50ml tổng thể tích cho 50 μgg Boron là 100ml… với độ chính xác 95%

Các kiểm tra cho thấy rằng phgương pháp so màu là một phương pháp tốt với lượng acid boric thấp khoảng 0- 25 μgg, cũng chính xác trong khoảng từ 25 –diketonemoiety trong cấu trúc của nó,nhưng không dữ liệu nào 100 μgg, nhưng không tốt khi hàm lượng cao hơn nữa

VI NGHIÊN CỨU SỰ TƯƠNG TÁC CỦA PROTEIN VỚI CURCUMIN

VÀ SDS VÀ ỨNG DỤNG TRONG PHÂN TÍCH

VI.1 Giới thiệu

Gần đây, kĩ thuật RLS đã trở thành một phương pháp mới và thu hút để phân tích một lượng rất nhỏ các đại phân tử sinh học, vì nó có độ nhạy cao, đơn giản và nhanh chóng Việc xác định chủ yếu dựa trên sự nhuộm màu trên các đại phân tử sinh học làm tăng mạnh RLS Huang et al, người đầu tiên sử dụng kĩ thuật cộng hưởng ánh sáng tán xạ thiết lập một phương pháp mới xác định DNA, sau đó kĩ thuật này đã được

sử dụng để xác định Protein

Bài viết này giới thiệu một phương pháp RLS mới để xác định Pro bằng Curcumin, chất hoạt động bề mặt anionic, và SDS (sodium dodecyl sulphonate)

VI.2 Thiết bị dụng cụ

- Máy cường độ RLS: Hitachi F-2500 spectrofluorometer (Nhật Bản)

- Máy đo phổ UV-4100 (Hitachi, Nhật Bản)

- Máy đo nồng độ axit PHS-2F kỹ thuật số (Leici, Thượng Hải)

- DXD IImicro dụng cụ điện di

VI.3 Hóa chất

- Dung dịch gốc của Protein được chuẩn bị bằng việc hoà tan huyết thanh súc vật (Shanghai Boao Biochemical Techology Co., China) và huyết thanh con người (Sigma) trong dung dịch nước cất (nước cất là một loại nước tinh khiết không có các ion muối khoáng như natri, canxi, sắt, đồng, clorua, và bromide.) tổng nồng độ BSA

và HAS là 100 μgg ml-1

- Dung dịch gốc Curcumin (1.00×10−3 mol l−1) được chuẩn bị bằng cách hòa tan Curcumin trong ethanol rồi pha loãng đến 5.00×10−5 mol l−1 với dung môi athanol

- Hệ dung dịch đệm Briton–diketonemoiety trong cấu trúc của nó,nhưng không dữ liệu nàoRobinson (H3PO4 +H3BO3 + HAc + NaOH) dùng để đều chỉnh pH

- SDS gốc (1.00×10−2 mol l−1) được chuẩn bị bằng cách hòa tan SDS trong nước cất sau đó pha loãng đến 5.00×10−4mol l−1 sử dụng làm dung môi

Các dung dịch trên được bảo quản ở nhiệt độ 0.0 –diketonemoiety trong cấu trúc của nó,nhưng không dữ liệu nào 4.0 0C

Tất cả các hóa chất phải đạt tinh khiết phân tích và nước sử dụng trong suốt quá trình

là nước cất 2 lần

VI.4 Tiến hành

- Lấy một ống nghiệm khô 10ml, cho các dung dịch vào theo trình tự sau đây: 2.5 ml đệm BR (pH 3.5), 1.0 ml của Curcumin (5.00 × 10-5 mol l-1), BSA chuẩn (hoặc dung dịch mẫu) và 1.5 ml SDS (5.00 × 10-4 mol l-1) Sau đó để yên trong 20 phút

Tất cả quang phổ thu được bằng cách quét RLS đồng thời các kích thích và phát xạ đơn sắc ( nghĩa là từ λ = 0 nm) của máy spectrofluorometer từ 220 đến 600 nm Cường

độ của RLS được đo ở bước sóng λ = 288 nm trong một phân tử thạch anh với một khe hở 0.5nm cho các kích thích và bức xạ đi qua Cường độ RLS tăng lên gây ra bởi Protein được tính bằng :

ΔIRLS = IRLS −I0

RLS

IRLS : cường độ RLS khi có Protein

I0 RLS : cường độ RLS khi không có Protein Tất cả các phổ UV cũng được ghi lại cùng lúc bởi máy quang đo quang phổ UV-4100

VI.5 Kết quả và thảo luận

VI.5.1 Các tính năng của phổ cộng hưởng ánh sáng tán xạ

Các đỉnh của phổ RLS và phổ UV của dung dịch nằm lân cận 288, 375, 470, và 500

nm Như có thể thấy, cường độ RLS của Curcumin, BSA là yếu Khi thêm BSA hoặc SDS thì các RLS này tăng đáng kể Điều này cho thấy đã có một sự tương tác của Curcumin với BSA hoặc SDS Hơn nữa, khi cho cùng lúc BSA và SDS vào dd, cường độ tán xạ ánh sáng cộng hưởng của dung dịch Curcumin-BSA-SDS là cao hơn nhiều hơn so với dung dịch Curcumin-BSA và Curcumin -SDS Điều này chứng tỏ là một phức chất lớn đã hình thành trong dung dịch CU-BSA-SDS Bằng cách so sánh sự tán xạ ánh sáng và quang phổ hấp thụ ta có thể được thấy rằng các đỉnh của sự tán xạ ánh sáng tại 288, 375, và 500

nm tương ứng với các đỉnh của

băng hấp thụ UV ở 250, 365 và

428 nm Theo lý thuyết của

RLS, các đỉnh của ánh sáng tán

xạ tại 288, 375, và 500 nm được

gán cho băng hấp thụ của CU ở

250, 365, và 428 nm, tương ứng

Phổ tán xạ ánh sáng không chỉ

phụ thuộc vào bản chất của

dung dịch nghiên cứu mà còn

phản ánh những đặc điểm riêng

của vật chứa Đỉnh RLS khoảng

470 nm có thể là sự phát xạ của

đèn xenon Cường độ RLS tối

đa của dd CU-protein SDS là ở

288 nm, do đó, 288 nm được lựa

chọn để nghiên cứu sâu hơn

VI.5.2 Ảnh hưởng của nồng độ Curcumin

Hình 1 (1) - (6) cho thấy quang phổ ánh sáng tán xạ của CU, CU-BSA, CU-SDS và CU-SDS-BSA

Qua hình trên ta thấy hàm lượng Curcumin 5 × 10-6 mol l-1 cho IRLS tối đa.

VI.5.3 Ảnh hưởng của các ion lạ khác

Qua bảng 3 ta thấy nồng độ các ion khác không làm ảnh hưởng đến RLS của hệ, ngoại trừ DNA, các ion này không tác động lên viêc xác định Protein, sai số cho phép là

±5%

VI.5.4 Giới hạn phát hiện

VI.5.5 So với một số phương pháp khác

VI.5.6 3.6 So với phương pháp phổ UV

Lấy mẫu là huyết thanh của người HAS, qua bảng ta thấy tính chính xác của phương pháp này

VI.6 Kết luận

Trong tác bài báo này, ta thấy được sự tương tác qua lại giữa Curcumin với protein và SDS, và sự gia tăng RLS đáng kể của dung dịch Curcumin –diketonemoiety trong cấu trúc của nó,nhưng không dữ liệu nào SDS khi có mặt một lượng rất nhỏ protein Vì vậy, đây chính là một phương pháp mới và có độ nhạy cao trong việc xác định protein ở mức nanogram được đề xuất Giới hạn phát hiện đạt 10-11

g ml-1 Phương pháp này có ưu điểm là độ nhạy cao, chọn lọc, ổn định và nhanh chóng Ngoài ra, cơ chế tương tác giữa protein và hệ SDS-CU cũng được nghiên cứu bằng cách sử dụng nhiều kỹ thuật khác nữa

\

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Thuốc thử Hữu cơ, tập 2