Nghiên cứu đặc điểm nông sinh học và khả năng kháng bệnh bạc lá của các dòng lúa bắc thơm 7 cải tiến

Trong nghiên cứu này, 10 dòng lúa Bắc thơm 7 cải tiến, thế hệ BC3F5 được chọn từ tổ hợp lai Bắc thơm 7/ IRBB62 được đánh giá sơ bộ về đặc điểm nông sinh học chính, sàng lọc bằng chỉ thị

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

ĐOÀN VĂN SƠN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM NÔNG SINH HỌC VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG BỆNH BẠC LÁ CỦA CÁC DÒNG

LÚA BẮC THƠM 7 CẢI TIẾN

Người hướng dẫn khoa học: TS Võ Thị Minh Tuyển

PGS.TS Nguyễn Việt Long

NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP – 2016

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo

vệ lấy bất kỳ học vị nào

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám

ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội ngày tháng năm 2016

Tác giả luận văn

Đoàn Văn Sơn

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được

sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình

Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng

và biết ơn sâu sắc TS Võ Thị Minh Tuyển, PGS.TS Nguyễn Việt Long đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Canh tác học, Khoa Nông học - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ viên chức tại Bộ môn Đột biến và Ưu thế lai - Viện Di truyền Nông nghiệp đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận văn./

Hà Nội ngày tháng năm 2016

Tác giả luận văn

Đoàn Văn Sơn

MỤC LỤC

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục viết tắt vi

Danh mục bảng vii

Danh mục hình viii

Trích yếu luận văn ix

Thesis abstract x

Phần 1 Mở đầu 1

1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1

1.2 Giả thuyết khoa học 2

1.3 Mục tiêu nghiên cứu 3

1.4 Phạm vi nghiên cứu 3

1.5 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn 3

Phần 2 Tổng quan tài liệu 4

2.1 Đặc điểm nông sinh học của cây lúa 4

2.1.1 Thời gian sinh trưởng 4

2.1.2 Đặc điểm hình thái 5

2.1.3 Năng suất và yếu tố cấu thành năng suất 7

2.2 Bệnh bạc lá 8

2.2.1 Nguồn gốc của bệnh bạc lá lúa 9

2.2.2 Nguyên nhân gây bệnh bạc lá lúa 9

2.2.3 Triệu chứng bệnh bạc lá 11

2.2.4 Tác hại do bệnh bạc lá lúa gây ra 12

2.2.5 Vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa 12

2.2.6 Quy luật và các yếu tố ảnh hưởng đến phát sinh, phát triển bệnh 13

2.2.7 Các gene kháng bệnh bạc lá lúa 14

2.3 Chỉ thị phân tử và ứng dụng trong chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá 16

2.3.1 Chỉ thị phân tử 16

2.3.2 Ứng dụng chị thị phân tử trong chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá 17

Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 24

3.1 Địa điểm nghiên cứu 24

3.2 Thời gian nghiên cứu 24

3.3 Vật liệu nghiên cứu 24

3.4 Nội dung nghiên cứu 25

3.4.1 Nội dung 1: Nghiên cứu đặc điểm nông sinh học của các dòng lúa Bắc Thơm 7 cải tiến, xác định dòng lúa triển vọng 25

3.4.2 Nội dung 2: Đánh giá khả năng kháng bệnh bạc lá của các dòng Bắc Thơm 7 cải tiến 26

3.5 Phương pháp nghiên cứu 26

3.5.1 Phuơng pháp 1: Nghiên cứu đặc điểm nông sinh học của các dòng lúa Bắc Thơm 7 cải tiến, xác định dòng lúa Bắc Thơm 7 cải tiến triển vọng 26

3.5.2 Phương pháp 2: Đánh giá khả năng kháng bệnh bạc lá của các dòng Bắc Thơm 7 cải tiến 28

3.6 phương pháp phân tích và xử lý số liệu 31

Phần 4 Kết quả và thảo luận 32

4.1 Nghiên cứu đặc điểm nông sinh học của các dòng lúa Bắc Thơm 7 cải tiến, xác định dòng lúa Bắc Thơm 7 cải tiến triển vọng 32

4.1.1 Các giai đoạn sinh trưởng và thời gian sinh trưởng của các dòng lúa Bắc Thơm 7 cải tiến 32

4.1.2 Một số đặc điểm hình thái của các dòng lúa Bắc Thơm 7 cải tiến 33

4.1.3 Đánh giá một số yếu tố cấu thành năng suất và năng suất của các dòng lúa Bắc Thơm 7 cải tiến 36

4.1.4 Khả năng chống chịu sâu bệnh và điều kiện ngoại cảnh 38

4.1.5 Kết quả đánh giá một số đặc điểm nông, sinh học chính của các dòng Bắc Thơm 7 cải tiến triển vọng ở vụ xuân 2016 39

4.1.6 Một số chỉ tiêu chất lượng hạt gạo của các dòng Bắc Thơm 7 cải tiến triển vọng vụ xuân 2016 42

4.2 Đánh giá về khả năng kháng bệnh bạc lá của các dòng Bắc Thơm 7 cải tiến 44

4.2.1 Kết quả đánh giá bằng chỉ thị phân tử liên kết với gene kháng bệnh bạc lá: Xa4, Xa7, Xa21 44

4.2.2 Kết quả lây nhiễm nhân tạo với vi khuẩn gây bệnh bạc lá 47

Phần 5 Kết luận và kiến nghị 51

5.1 Kết luận 51

5.2 Kiến nghị 51

Tài liệu tham khảo 52

Phụ lục 59

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt

AND Axit Deoxyribonucleic

MAS Marker Assisted Selection – Chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử

PCR Polymerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi trùng hợp

QTL/QTLs Quantity Trait Loci(s) - Locus kiểm soát tính trạng số lượng SSR Simple Sequence Repeat - Sự lặp lại của trình tự đơn giản

AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism

Đa hình chiều dài các đoạn được nhân bản chọn lọc DSBs Double strand breaks - Phá vỡ sợi đôi

HR Homologous recombination - Tái tổ hợp tương đồng

NHEJ Nonhomologous end-joining- Kết thúc không tương đồng EMS ethyl methane sulphonate

TILLING Targeting Induced Limited Lesions IN Geneomes

ĐBSCL Đồng bằng sông cửu long

CTPT Chỉ thị phân tử

dNTP Deoxynucleotide triphosphate

RAPD Random Amplification of Polymorphic DNA

Đa hình ADN được nhân bản ngẫu nhiên RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism

Đa hình chiều dài mảnh phân cắt giới hạn STS Sequence Tagged Site – Xác định vị trí trình tự đã được đánh dấu ĐBSH Đồng bằng sông Hồng

Đ/C

BT7

Đối chứng Bắc thơm 7 NSLT

NSTT

Năng suất lý thuyết Năng suất thực thu

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Chỉ thị ADN sử dụng phân tích PCR 25 Bảng 3.2 Thành phần các chất dùng cho mỗi phản ứng PCR với mồi SSR 30 Bảng 3.3 Chương trình chạy của phản ứng PCR 30 Bảng 4.1 Các giai đoạn sinh trưởng và thời gian sinh trưởng của các dòng Bắc

thơm 7 cải tiến trong vụ mùa 2015 32 Bảng 4.2 Một số đặc điểm hình thái của các dòng Bắc thơm 7 cải tiến trong vụ

mùa 2015 34 Bảng 4.3 Đặc điểm, hình dạng lá đòng của các dòng Bắc thơm 7 cải tiến trong

vụ mùa 2015 35 Bảng 4.4 Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất của các dòng Bắc thơm 7

cải tiến, vụ mùa 2015 36 Bảng 4.5 Kết quả đánh giá khả năng chống chịu của các dòng Bắc thơm 7 cải

tiến trong vụ mùa 2015 39 Bảng 4.6 Đánh giá đặc điểm hình thái của các dòng Bắc thơm 7 cải tiến triển

vọng trong Vụ xuân 2016 40 Bảng 4.7 Một số đặc điểm trỗ bông và hạt thóc của các dòng Bắc thơm 7 cải

tiến triển vọng trong vụ xuân 2016 41 Bảng 4.8 Năng suất thực thu và các yếu tố cấu thành năng suất của các dòng

Bắc thơm 7 cải tiến triển vọng trong vụ xuân 2016 41 Bảng 4.9 Một số chỉ tiêu chất lượng hạt gạo của các dòng Bắc thơm 7 cải tiến

triển vọng trong vụ xuân 2016 43 Bảng 4.10 Đánh giá chất lượng cơm của các dòng Bắc thơm 7 cải tiến triển vọng

trong vụ xuân 2016 43 Bảng 4.11 Tổng hợp kết quả đánh giá bằng chỉ thị phân tử các dòng Bắc thơm 7

cải tiến 47 Bảng 4.12 Kết quả lây nhiễm nhân tạo với vi khuẩn gây bệnh bạc lá 49

DANH MỤC HÌNH

Hình 4.1 Biểu đồ năng suất thực thu của các dòng Bắc thơm 7 cải tiến 38 Hình 4.2 Sản phẩm PCR của các dòng Bắc thơm 7 cải tiến với chỉ thị pTA248

liên kết với gene Xa21 45

Hình 4.3 Sản phẩm PCR của các dòng Bắc thơm 7 cải tiến với chỉ thị P3 liên

kết với gene Xa7 46

Hình 4.4 Sản phẩm PCR của các dòng Bắc thơm 7 cải tiến với chỉ thị Pr MP1-2

liên kết với gene Xa4 46

Hình 4.5 Phản ứng của các dòng Bắc thơm 7 cải tiến với chủng vi khuẩn số 2 49

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Đoàn Văn Sơn

Tên luận văn: Nghiên cứu đặc điểm nông sinh học và khả năng kháng bệnh bạc lá của các dòng lúa Bắc thơm 7 cải tiến

Ngành: Khoa học cây trồng Mã số: 60.62.01.10

Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Mục đích nghiên cứu

- Đánh giá các đặc tính nông sinh học của các dòng lúa Bắc thơm 7 cải tiến

- Đánh giá kết quả lây nhiễm nhân tạo và xác định chỉ thị phân tử liên kết chặt với các gene kháng bạc lá để xác định dòng mang gene kháng

Phương pháp nghiên cứu

Các giống lúa được cấy theo phương pháp khảo sát tuần tự không nhắc lại, mật

độ cấy 45 khóm/m2 được tiến hành trong vụ mùa năm 2015 và vụ xuân năm 2016 Trong nghiên cứu này, 10 dòng lúa Bắc thơm 7 cải tiến, thế hệ BC3F5 được chọn từ tổ hợp lai Bắc thơm 7/ IRBB62 được đánh giá sơ bộ về đặc điểm nông sinh học chính, sàng lọc bằng chỉ thị phân tử và lây nhiễm nhân tạo với vi khuẩn bạc lá

Kết quả chính và kết luận

Kết quả cho thấy qua đánh giá các đặc điểm nông sinh học chính trên đồng ruộng đã chọn được 3 dòng có triển vọng (BT-3, BT-6, BT-9) có thời gian sinh trưởng ngắn ngày (vụ mùa: 102-105 ngày, vụ xuân: 126-128 ngày), năng suất cao từ 63,6 - 66,1 tạ/ha và chống chịu tốt Đánh giá chất lượng cơm gạo cho thấy 3 dòng triển vọng đều có hạt gạo dài, chất lượng cơm ngon, dẻo 2 dòng BT-6 và BT-9, cơm có mùi thơm tương đương giống Bắc thơm 7 Sàng lọc bằng chỉ thị phân tử cho thấy có: 5/10 dòng

Bắc thơm 7 cải tiến mang 3 gen kháng bệnh bạc lá Xa4, Xa7 và Xa21 là các dòng BT-3; BT-4; BT-5; BT-8; BT-10, có 2 dòng Bắc thơm 7 cải tiến (BT-1 và BT-2) mang 2 gen

Xa7 và Xa4 đồng hợp , 3 dòng BT-6, BT-7 và BT-9 mang 3 gen kháng trong đó có

đồng hợp tử gen Xa4 và Xa7, dị hợp tử gen Xa21 Lây nhiễm nhân tạo với vi khuẩn gây

bệnh bạc lá cho thấy các dòng mang 2-3 gen kháng phản ứng kháng tốt hơn các dòng mang 1 gen 5 dòng BT-3; BT-4; BT-5; BT-8; BT-10 thể hiện cấp dộ kháng cao (HR)

và phổ kháng rộng với cả 2 chủng vi khuẩn lây nhiễm

THESIS ABSTRACT Master candidate: Doan Van Son

Thesis title: Reseach Agricultural anh Biological characteristics anh ability blight resistance of lines improvements Bac thom 7

Educational organization: Vietnam National University of Agricuture

Materials and Methods

The variety was grown by the method of the survey is not repeated sequentially, implants density 45 clump/m2 season and spring In this study, MAS (Marker – Assisted Selection) and greenhouse inoculation were used to screen Bacterial Blight (BB) resistance in 10 improvement Bac thom7 lines that was selected from a cross between Bac thom7/ IRBB62, BC3F5 generation

Main findings and conclusions

Three promissing lines (BT-3; BT-6; BT-9) have been selected by field agronomic traits evaluating These lines have short duration (102-105 day in summer season and 126-128 day in spring season), higher yield (6,36-6,61 tons/ha), good tolerance to stress conditions, long grain and good quality Two lines BT-6 and BT-9 have aroma and cooking qualities similar to the Bac thom7 variety The result of screening by MAS showed that: five improvement BT7 lines (BT-3; BT-4; BT-5; BT-8;

BT-10) carried 3 BB resistance genes (Xa4, Xa7, Xa21) and 2 lines (BT-1 and BT-2) carried 2 BB resistance genes (Xa4, Xa7), 3 lines (BT-6, BT-7 and BT-9) carried 3 BB resistance genes (Xa4, Xa7 and heterozygous Xa21) Greenhouse inoculation with

bacterial blight races were used to screen bacterial leaf blight resistance in improvement Bac thom7 lines The result indicated that the improvement Bac thom7 lines carried 2-3

bacterial blight resistance genes (Xa21, Xa7, Xa4) showed high resistance than it carried

1 gene Five lines (BT-3; BT-4; BT-5; BT-8; BT-10) showed high resistance and broad

spectrum with two races bacterial blight

PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Một trong những khó khăn của sản xuất nông nghiệp hiện nay là diện tích đất dành cho canh tác ngày càng bị thu hẹp Theo thống kê của Cục trồng trọt, diện tích đất trồng lúa năm 2014 đã giảm so với năm 2013 là 96.800 ha (Cục Trồng trọt, 2014) Cùng với đó là tài nguyên nước cạn kiệt, tình hình lũ lụt, hạn hán xảy ra thường xuyên và ngày càng nghiêm trọng Sâu bệnh hại thì bùng phát không theo chu kỳ nên không ít vụ mùa bị thất thu Đứng trước yêu cầu của thực tiễn nêu trên, chọn tạo giống hiện nay cần tập trung vào các giống ngắn ngày, năng suất cao; mặt khác chúng phải có tính chống chịu với điều kiện bất thuận,

ổn định năng suất, góp phần xây dựng một nền nông nghiệp bền vững, thân thiện với môi trường

Bệnh bạc lá do vi khuẩn (Xanthomonas oryzea pv Oryze ) là một trong

những bệnh gây hại nguy hiểm nhất ảnh hưởng đến năng suất lúa Hiện nay vẫn chưa có thuốc đặc hiệu để phòng trừ bệnh bạc lá nên chọn tạo giống lúa có khả năng chống chịu với bệnh bạc lá trong thâm canh lúa là biện pháp quan trọng được các nhà chọn giống quan tâm Sử dụng giống lúa kháng một mặt làm giảm thiệt hại năng suất, tiết kiệm chi phí phòng trừ, mặt khác hạn chế được việc dùng thuốc hoá học gây ô nhiễm môi trường và góp phần ổn định môi trường sinh thái

Hiện nay trên thế giới đã phát hiện và lập bản đồ 40 gene kháng bệnh bạc

lá lúa (Kim SM et al., 2015); điều này chính là cơ sở khoa học và là nền tảng cho công tác chọn tạo các giống lúa mới kháng bệnh Phương pháp chọn giống bằng chỉ thị phân tử (MAS) đang được rất nhiều nước trên thế giới quan tâm Các giống lúa kháng bệnh mang 1 hay nhiều gene kháng đã được chọn theo phương pháp này một cách dễ dàng, nhanh chóng và chính xác Đã có nhiều giống lúa mới được quy tụ từ 2 gene kháng bệnh bạc lá trở lên Các tác giả Zhang và cộng sự,(2006) đã sử dụng chỉ thị phân tử pTA248 và MP12 để đưa 2 gene kháng

Xa21 và Xa4 vào giống lúa Mianhui725…

Vi khuẩn bạc lá Xanthomonas oryzae pv Oryzae rất đa dạng về số chủng

Đối với mỗi vùng sinh thái và vào những thời điểm khác nhau trong năm tùy thuộc vào điều kiện khí hậu và các yếu tố khác, thành phần cũng như cấu trúc của quần thể vi khuẩn biến động khác nhau Ở Nhật Bản phát hiện thấy có 12 chủng, Philippine có 6 chủng, Ấn Độ có 9 chủng, trong khi đó tại Việt Nam số chủng bạc lá đã lên đến con số 15 (Bùi Trọng Thủy và cs., 2009)

Ở miền Bắc Việt Nam, hiện nay đã và đang trồng một số giống lúa nhập

nội của Trung Quốc, các giống lúa này chủ yếu đều chứa gene Xa14 - một gene

theo kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học nước ta khẳng định là bị nhiễm bởi

hầu hết các chủng bạc lá ở miền Bắc Chính vì vậy mà các giống lúa nhập nội từ

Trung Quốc vào trồng ở miền Bắc Việt Nam đều bị nhiễm rất nặng bệnh bạc lá

giống lúa mang genee kháng bệnh bạc lá chọn tạo trong nước thì (Phan Hữu Tôn,

2005) Các còn rất khiêm tốn đặc biệt là các giống lúa mang đa genee kháng Do

vây, chọn tạo các giống lúa mang các gene kháng hữu hiệu với các chủng bạc lá

ở miền Bắc Việt Nam, đặc biệt là chọn tạo các giống lúa mang đa gene kháng

bệnh bạc lá đang là nhu cầu rất cần thiết hiện nay

Giống lúa Bắc thơm 7 là giống lúa chất lượng nhập nội đang được trồng

rộng rãi tại các tỉnh đồng bằng Bắc Bộ Giống lúa chất lượng này được rất nhiều

bà con nông dân và người tiêu dùng các tỉnh phía Bắc rất ưa chuộng do giống có

khả năng thích ứng rộng, năng suất ổn định, chất lượng gạo ngon có mùi thơm,

tuy nhiên, những năm gần đây giống lúa Bắc Thơm 7 đang bị nhiễm bệnh bạc lá

rất nghiêm trọng Sử dụng phươg pháp lai trở lại và chỉ thị phân tử liên kết chặt

với gene kháng bệnh bạc lá trong cải tiến giống lúa Bắc Thơm 7 là một trong

những hướng đi đúng đắn hiện nay

Xuất phát từ những lý do nêu trên chúng tiến hành thực hiện đề tài

“Nghiên cứu đặc điểm nông sinh học và khả năng kháng bệnh bạc lá của các

dòng lúa Bắc thơm 7 cải tiến” nhằm chọn tạo ra giống lúa ngắn ngày năng suất

và kháng bệnh bạc lá cho Việt Nam phục vụ nội tiêu và xuất khẩu

1.2 GIẢ THUYẾT KHOA HỌC

Bệnh bạc lá do vi khuẩn (Xanthomonas oryzea pv Oryze ) là một trong

những bệnh gây hại nguy hiểm nhất ảnh hưởng đến năng suất lúa Sử dụng giống

lúa kháng một mặt làm giảm thiệt hại năng suất, tiết kiệm chi phí phòng trừ, mặt

khác hạn chế được việc dùng thuốc hoá học gây ô nhiễm môi trường và góp phần

ổn định môi trường sinh thái

Phương pháp chọn giống bằng chỉ thị phân tử (MAS) đang được rất nhiều

nước trên thế giới quan tâm Các giống lúa kháng bệnh mang 1 hay nhiều gene

kháng đã được chọn theo phương pháp này một cách dễ dàng, nhanh chóng và

chính xác Đã có nhiều giống lúa mới được quy tụ từ 2 gene kháng bệnh bạc lá

trở lên Các tác giả Zhang và cộng sự,(2006) đã sử dụng chỉ thị phân tử pTA248

và MP12 để đưa 2 gene kháng Xa21 và Xa4 vào giống lúa Mianhui725…

Ở đề tài này, chúng tôi sàng lọc bằng chỉ thị phân tử được 5/10 dòng BT7

cải tiến mang 3 gen kháng lá Xa4, Xa7 và Xa21 là các dòng BT-3; BT-4; BT-5;

BT-8; BT-10 Lây nhiễm nhân tạo với vi khuẩn gây bệnh bạc lá cho thấy các dòng mang 2-3 gene kháng phản ứng kháng tốt hơn các dòng mang 1 gene

1.3 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

- Đánh giá các đặc tính nông sinh học của các dòng Bắc thơm 7 cải tiến

- Đánh giá kết quả lây nhiễm nhân tạo và xác định chỉ thị phân tử liên kết chặt với các gene kháng bạc lá để xác định dòng mang gene kháng

1.4 PHẠM VI NGHIÊN CỨU

- Đề tài được tiến hành trong thời gian từ tháng 7/2015 – 6/2016(vụ mùa năm 2015 và vụ xuân năm 2016)

- Đề tài tiến hành thí nghiệm trên các dòng lúa Bắc thơm 7 cải tiến

- Địa điểm: phuờng Thượng Cát, quận Bắc Từ Liêm, thành phố Hà Nội

1.5 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI, Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN 1.5.1 Ý nghĩa khoa học

Sử dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá, đặc biệt trong chọn tạo giống lúa mang đa gene kháng đã rút ngắn thời gian chọn tạo giống tăng độ chính xác cao và giảm chi phí, công lao động trong quá trình chọn

tạo giống mới

1.5.2 Ý nghĩa thực tiễn

- Đề tài đã chọn ra các dòng lúa Bắc thơm 7 cải tiến có triển vọng có chất lượng gạo ngon, mang gene kháng bệnh bạc lá phục vụ cho sản xuất làm giảm chi phí sử dụng thuốc bảo vệ thực vật cho bà con nông dân và không gây tác hại đến môi trường

- Đề tài cung cấp nguồn vật liệu mang gene kháng bệnh bạc lá phục vụ cho nghiên cứu chọn tạo giống lúa thuần và lúa lai

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 ĐẶC ĐIỂM NÔNG SINH HỌC CỦA CÂY LÚA

Lúa là loại cây trồng trải dài trên nhiều vĩ độ do chúng đa dạng về kiểu hình mỗi giống khác nhau có những đặc điểm hình thái riêng biệt chính vì vậy chúng ta có thể dựa vào đó để phân biệt các giống qua các yếu tố như: thời gian sinh trưởng, khả năng đẻ nhánh, chiều cao cây …

2.1.1 Thời gian sinh trưởng

Thời gian sinh trưởng của cây lúa được tính từ lúc nảy mầm cho đến khi chín thường thay đổi từ: 90 - 180 ngày tùy theo giống và điều kiện ngoại cảnh (Nguyễn Hữu Tề và cs., 1997) Trong canh tác lúa hiện đại các nhà nông học hết sức quan tâm đến thời gian sinh trưởng của các giống lúa.Vì đây là yếu tố có tương quan chặt đến năng suất và việc bố trí thời vụ, cơ cấu luân canh của người nông dân trong cả một năm

Quy phạm khảo nghiệm tính khác biệt, tính đồng nhất và tính ổn định của giống lúa (DUS - 10 TCN 554-2002) của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn ban hành năm 2002 phụ lục II Tính trạng 45 (thời gian chín, giống cảm ôn): Từ gieo đến khi có 85 % số hạt chín có quy định rõ về cách phân nhóm giống như sau:

Nhóm giống lúa dài ngày (nhóm B): Đó là những giống có thời gian sinh trưởng từ 125-150 ngày (IRRI ký hiệu là M- Medium)

Nhóm giống lúa chín sớm (Nhóm A): Nhóm này bao gồm:

Nhóm A2: Nhóm trung ngày có thời gian sinh trưởng khoảng 105-125 ngày (IRRI ký hiệu là E – early)

Nhóm A1: Nhóm ngắn ngày có thời gian sinh trưởng khoảng 90-105 ngày (IRRI ký hiệu là VE – very early)

Nhóm A0: Nhóm cực ngắn ngày nhóm này bao gồm các giống lúa có thời gian sinh trưởng trong điều kiện đồng bằng sông Cửu Long khoảng 85 đến 95 ngày Đây là nhóm giống lúa mới ở Việt Nam được chọn tạo bởi Viện nghiên cứu lúa đồng bằng sông Cửu Long (các giống lúa có tên OMCS) những giống lúa

do Học viện Nông Nghiệp Việt Nam tạo ra (Việt Lai 20 TH 3-3)

Theo Yosida (1981) cho rằng thời gian sinh trưởng ở cây lúa chia làm 2 giai đoạn chính là giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng và sinh trưởng sinh thực Tuy nhiên có thể chia thành 3 giai đoạn là sinh trưởng sinh dưỡng, sinh thực và chín Thời gian sinh trưởng của cây lúa thường chiếm từ 90 - 180 ngày từ khi nảy mầm cho đến khi chín thời gian này dài hay ngắn phụ thuộc vào giống và môi trường sinh trưởng Trong điều kiện nhiệt đới giai đoạn sinh trưởng sinh thực (thời kỳ làm đòng) cần khoảng 30 ngày, thời kỳ chín chiếm 30 ngày và thời gian còn lại dành cho giai đoạn sinh trưởng dinh dưỡng Như vậy thời gian sinh trưởng của cây lúa dài hay ngắn phụ thuộc vào thời gian sinh trưởng dinh dưỡng Thời gian sinh trưởng của cây lúa còn phụ thuộc tính cảm quang hay cảm

ôn của giống Khi gieo cấy vào thời vụ khác nhau với điều kiện ngoại cảnh khác nhau tùy theo giống sẽ có thời gian sinh trưởng dài ngắn khác nhau Trong điều kiện ở miền Bắc nước ta do ảnh hưởng của của điều kiện nhiệt độ thấp ở đầu vụ Xuân, thời gian sinh trưởng của cùng một giống lúa nếu gieo cấy vào vụ Xuân thường sẽ dài hơn gieo cấy trong vụ Mùa Trong cùng một vụ nếu thời vụ gieo cấy sớm hay muộn thì thời gian sinh trưởng của một giống lúa cũng thay đổi Ngay cả trong cùng một thời vụ gieo cấy ở vụ Đông Xuân năm nào trời rét lúa trỗ muộn thời gian sinh trưởng kéo dài, năm nào ấm thì ngược lại Trong vụ Mùa nhiệt độ ít thay đổi qua các năm nên thời gian sinh trưởng của các giống lúa tương đối ổn định

2.1.2 Đặc điểm hình thái

Chiều cao cây

Chiều cao cây lúa là một chỉ tiêu hình thái có liên quan đến nhiều chỉ tiêu khá đặc biệt là tính chống đổ; cây lúa có thân ngắn và cứng có khả năng kháng

đổ tốt hơn (IRRI, 1976) Theo tiêu chuẩn đánh giá cấy lúa của IRRI 2002 chiều cao cây được đánh giá theo thang điểm như sau:

- Điểm 1: bán lùn (vùng trũng < 110cm; vùng cao < 90cm)

- Điểm 5: trung bình (vùng trũng 110-130cm; vùng cao 90-125cm)

- Điểm 9: cao (vùng trũng > 110cm; vùng cao > 125cm)

Chiều cao cây là một trong những tính trạng quan trọng liên quan đến khả

năng chống đổ khả năng hấp thụ ánh sáng mặt trời và chịu phân bón của giống Thân rạ cao dễ đổ ngã sớm bộ lá rối tăng hiện tượng bóng rợp tạo điều kiện cho sâu bệnh cư trú gây cản trở quá trình vận chuyển sản phẩm quang hợp về hạt làm cho hạt bị lép lửng và giảm năng suất Chiều cao cây lúa thích hợp từ 90-100cm

có thể cao đến 120cm trong một số điều kiện nào đó được coi là lý tưởng về năng

suất (Bahmaniar et al., 2007) Thân cây lúa dày hơn thì khả năng tích lũy chất

khô tốt hơn Thân cứng và dày có ý nghĩa rất quan trọng trong việc chống đổ ngã

và dẫn tới chỉ số thu hoạch cao hơn Nếu thân lá không cứng khoẻ không dày thì

dễ đổ ngã tán lá che khuất lẫn nhau làm gia tăng một số bệnh hại dẫn đến năng suất giảm Sự phát triển của các lóng đốt quyết định đến chiều cao cây và liên quan tới khả năng chống đổ Hiện nay các giống lúa mới thấp cây đang dần thay thế các giống lúa cao cây vì chúng có khả năng chống đổ tốt hơn khi đầu tư thâm canh để đạt năng suất cao

Khả năng đẻ nhánh

Khả năng đẻ nhánh là một đặc điểm của cây lúa đặc điểm này có ảnh hưởng đến năng suất lúa Trong quá trình sinh trưởng nhánh lúa là những cành mọc lên từ nách lá của mỗi đốt trên thân chính hoặc trên các nhánh khác trong thời gian sinh trưởng dinh dưỡng cây lúa đẻ nhánh theo quy luật chung Tuy nhiên các giống lúa khác nhau thì thời gian đẻ nhánh khác nhau Nguyễn Văn Hiển (2000), nghiên cứu các tổ hợp lai có nhận xét rằng kiểu đẻ nhánh chụm và đứng thẳng là lặn, kiểu đẻ nhánh xòe là trội Các kết quả nghiên cứu cho rằng tính đẻ nhánh khỏe là tính trạng di truyền số lượng, có hệ số di truyền từ thấp đến trung bình và chịu ảnh hưởng rõ rệt của các điều kiện ngoại cảnh Theo Bùi Huy Đáp (1970), khi nghiên cứu về đặc tính đẻ nhánh cho biết “Nhánh không bao giờ phát triển khi lá tương đương với nó vẫn chưa phát triển xong nhánh không bao giờ phát triển nữa khi lá bị khô” Những giống lúa đẻ rải rác thì trỗ bông không tập trung dẫn đến lúa chín không đều nên không có lợi cho quá trình thu hoạch

và làm giảm năng suất (Đinh Văn Lữ, 1978) Như vậy các giống lúa có khả năng

đẻ nhánh khỏe, tập trung sẽ rất cần thiết để đạt được năng suất cao vì giảm đáng

kể nhánh vô hiệu và thuận lợi cho quá trình thu hoạch Khả năng đẻ nhánh sớm

là một đặc tính tốt của cây lúa, không làm cây lúa phát triển quá mạnh ở các giai đoạn sau và gây hiện tượng che khuất lẫn nhau giữa các tầng lá Số nhánh mang đặc tính di truyền số lượng, khả năng đẻ nhánh sớm liên quan với khả năng sinh trưởng mạnh và sớm của các giống lúa lùn cải tiến nhưng nó lại di truyền độc lập với nhiều đặc tính quan trọng khác Ở giống lúa cải tiến, người ta thường chọn cá thể đẻ nhánh sớm hơn (Yoshida, 1981)

Số nhánh

Số nhánh là một tính trạng nông sinh học rất quan trọng trong sản xuất lúa gạo Số nhánh hữu hiệu trên một đơn vị diện tích quyết định số bông ảnh hưởng trực tiếp tới năng suất các thể, số hạt trên bông và khối lượng 1000 hạt Do vậy giảm số nhánh vô hiệu là một biện pháp quan trọng cải thiện năng suất lúa Theo báo lalqilla-rice nông dân Trung Quốc đã giảm được 20% lượng đạm bón và thuốc trừ sâu, tăng 10% năng suất lúa nhờ công nghệ 3 kiểm soát (3CT- three controls technology): kiểm soát lượng phân bón, số nhánh vô hiệu và sâu bệnh

Bộ lá

Theo Yosida (1981), cho rằng một lá lúa hoàn chỉnh bao gồm: bẹ lá, bản

lá, tai lá và thìa lìa Các giống lúa chín sớm và chín trung bình có từ 10 - 18 lá trên thân chính, các giống mẫn cảm với chu kỳ quang có số lá ổn định trong hầu hết các điều kiện Thông thường sự phát triển của 1 lá lúa cần khoảng 100 độ ngày ở thời kỳ trước khi phân hóa đòng và cần 170 độ ngày sau khi phân hóa đòng Thời gian sống của từng lá cũng rất khác nhau; các lá phía trên có thời gian sống lâu hơn các lá phía dưới Như vậy lá đòng có thời gian sống lâu nhất

2.1.3 Năng suất và yếu tố cấu thành năng suất

Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất lúa được tạo bởi 4 yếu tố đó là:

Số bông trên đơn vị diện tích, số hạt trên bông, tỷ lệ hạt chắc và khối lượng 1000 hạt (Yoshida, 1981)

Trong các yếu tố trên thì số bông trên đơn vị diện tích có tính quyết định

và hình thành sớm nhất yếu tố này phụ thuộc vào mật độ cấy, khả năng đẻ nhánh

và khả năng chịu phân bón Các giống lúa mới thấp cây lá đứng đẻ khỏe, chịu thâm canh có thể cấy tăng mật độ để tăng số bông trên đơn vị diện tích (Nguyễn Ngọc Đệ, 2009) Số bông có thể đóng góp 74% năng suất; trong khi đó số hạt và khối lượng hạt đóng góp 26% (Phạm Văn Cường và cs., 2015)

Số hạt trên bông là yếu tố phụ thuộc vào kiểu genee của giống, điều kiện ngoại cảnh, lượng phân bón và kỹ thuật bón phân Số hạt trên bông nhiều hay ít tùy thuộc vào số gié, số hoa phân hoá, số hoa thoái hoá Toàn bộ quá trình này nằm trong thời kỳ sinh trưởng sinh thực (từ làm đòng đến trỗ) Điều kiện nhiệt độ

và cường độ ánh sáng quá thấp ở giai đoạn này sẽ làm tăng số hạt lép và làm giảm năng suất hạt Tổng số hạt trên bông do tổng số hoa phân hoá và số hoa thoái hóa quyết định Số hoa phân hóa càng nhiều, số hoa thoái hóa càng ít thì tổng số hạt trên bông sẽ nhiều Tỷ lệ hoa phân hóa có liên quan chặt chẽ với chế

độ chăm sóc Số gié cấp 1, đặc biệt là số gié cấp 2 nhiều thì số hoa trên bông cũng nhiều Số hoa trên bông nhiều là điều kiện cần thiết để đảm bảo cho tổng số hạt trên bông lớn (Yoshida, 1981)

Tỷ lệ hạt chắc được quyết định trực tiếp bởi 3 thời kỳ là thời kỳ giảm nhiễm, trỗ và chín sữa để có tỷ lệ hạt chắc cao phải bố trí thời vụ gieo cấy hợp lý sao cho khi lúa làm đòng, trỗ bông và chín gặp điều kiện ngoại cảnh thuận lợi và cây lúa phải được cung cấp đầy đủ dinh dưỡng cũng như chế độ tưới tiêu phải hợp lý Tăng lượng vận chuyển carbohydrate không cấu trúc ở thân và bẹ lá về bông từ giai đoạn trỗ đến chín hoàn toàn làm chắc hạt (Đỗ Thị Hường và cs., 2014) Muốn có sự vận chuyển tổng hợp tốt hơn thì bộ lá có cấu tạo dày, xanh đậm hơn, tuổi thọ lá kéo dài là một đặc tính rất quan trọng và cần thiết Bộ lá thẳng đứng thì cây lúa sử dụng ánh sáng hữu hiệu tốt hơn Tỷ lệ hạt chắc trên bông được quyết định ở thời kỳ sau trỗ gặp điều kiện bất lợi ở thời kỳ này sẽ làm giảm quang hợp quần thể ruộng lúa và tăng tỷ lệ hạt lép (Phạm Văn Cường

và cs., 2015)

Khối lượng 1000 hạt chủ yếu phụ thuộc vào đặc tính của giống mà ít bị tác động của điều khiện ngoại cảnh Tuy nhiên trong thời kỳ từ lúc lúa trỗ bông cho đến chín sữa nếu cây lúa gặp điều kiện ngoại cảnh thuận lợi: đủ nước, đủ phân bón, không bị sâu bệnh gây hại, không đổ ngã, bộ lá lúa nhất là lá đòng còn xanh thì khối lượng 1000 hạt sẽ cao Khối lượng hạt phụ thuộc vào chiều dài hạt,

chiều rộng hạt, tỉ lệ dài/rộng và độ dày hạt (Tan et al., 2000) trong đó khối lượng hạt có tương quan thuận và chặt nhất với chiều dài hạt (Huang et al., 2013)

2.2 BỆNH BẠC LÁ

Bệnh bạc lá lúa tiếng Anh là Bacterial blight, tên khoa học đầy đủ là

Xanthomonas oryzae (Ishiyama) pv oryzae, Swings Năm 1922 do Ishiyama đầu

tiên định nghĩa là Bacterium oryzay Ishiyama, năm 1939 Dowson đổi tên là

Xanthomonas oryzae (Ishiyama) Dowson, năm 1978 Dye đặt tên là X.campestris

pv oryzae (Ishiyama) Dye; Năm 1990 Swings phục hồi lại tên Xanthomonas

oryzae Vi khuẩn gây bệnh bạc lá là Xanthomonas oryzae pv oryzae, viết tắt là Xoo (David et al., 2006)

Bệnh bạc lá lúa được phát hiện đầu tiên tại Nhật bản vào khoảng năm 1884-1885 Sau đó Takashi (1908) và Bokusha (1911), đã nghiên cứu và phân lập thành công vi khuẩn và tiến hành lây bệnh nhân tạo bằng vi khuẩn phân lập Tiếp sau Nhật Bản, một loạt các nước đã thông báo về bệnh bạc lá ở nước mình

Ở Việt Nam, bệnh bạc lá đã được phát hiện từ lâu trên các giống lúa mùa cũ đặc biệt từ năm 1965-1966 trở lại đây bệnh thường xuyên phá hoại một cách nghiêm trọng ở các vùng trồng lúa trên các giống nhập nội có năng suất cao cấy trong vụ Chiêm Xuân và đặc biệt ở vụ Mùa (Lê Lương Tề và cs., 2007) Mức độ tác hại của bệnh phụ thuộc vào giống, thời kỳ bị bệnh của cây sớm hay muộn và mức độ

bị bệnh nặng hay nhẹ Các nghiên cứu về mức độ thiệt hại chỉ ra rằng thiệt hại về năng suất biến động rất rộng tùy thuộc vào giai đoạn bị nhiễm bệnh, tính độc của từng chủng vi khuẩn, mức độ nhiễm của giống, điều kiện thời tiết và môi trường

khi bệnh diễn ra, biến động từ 20-30% có khi tới 50% thậm chí 80-90% (Deng et

al., 2006)

2.2.1 Nguồn gốc của bệnh bạc lá lúa

Bệnh bạc lá lúa tiếng Anh là Bacterial blight, tên khoa học đầy đủ là

Xanthomonas oryzae (Ishiyama) pv oryzae, Swings Năm 1922 do Ishiyama đầu

tiên định nghĩa là Bacterium oryzay Ishiyama, năm 1939 Dowson đổi tên là

Xanthomonas oryzae (Ishiyama) Dowson, năm 1978 Dye đặt tên là X.campestris

pv oryzae (Ishiyama) Dye; Năm 1990 Swings phục hồi lại tên Xanthomonas

oryzae Vi khuẩn gây bệnh bạc lá là Xanthomonas oryzae pv oryzae, viết tắt là Xoo (David et al., 2006), (Swings et al., 1990)

Khi mới xuất hiện ở Nhật Bản, người ta cho rằng bệnh có nguồn gốc sinh

lý, do đất chua gây nên Đến khi Takaishi (1908) và Boukara (1911), đã tìm thấy

vi khuẩn trong giọt dịch và lây bệnh lại được cho cây thì nguyên nhân gây bệnh

Xanthomonas kresek Schure

Xanthomonas oryzae (Ishiyama) Dowson

Hiện nay vi khuẩn này được biết đến với cái tên Xanthomonas oryzae

nhẵn, vi khuẩn nhuộm gram âm, không có khả năng khử NO3, không có dịch hoá gelatin, không tạo ra NH3, indol, có khả năng tạo H2S

Nhiệt độ thích hợp nhất cho vi khuẩn sinh trưởng 26 – 30oC, nhiệt độ tối thiểu 0 – 5oC, tối đa 40oC Nhiệt độ gây chết là 53oC trong 10 phút, có thể sống trong phạm vi pH 5,7 – 8,5 ; thích hợp nhất ở pH 6,8 – 7,2.Vi khuẩn xâm nhiễm qua thuỷ khổng, lỗ khí ở trên mút lá và đặc biệt qua vết thương xây xát trên lá Khi đã tiếp xúc với bề mặt có màng nước ướt, vi khuẩn dễ dàng di động tiến vào bên trong các lỗ khí, qua vết thương mà sinh sản nhân lên về số lượng qua các bó mạch dẫn lan rộng đi (Nguyễn Công Khoái, 2002)

Trong điều kiện mưa ẩm thuận lợi cho việc phát triển của vi khuẩn, trên mặt

lá bệnh tiết ra những giọt keo vi khuẩn thông qua sự va chạm giữa các lá lúa nhờ mưa gió mà truyền lan tới các lá, các cây khác để tiến hành lây nhiễm lặp lại trong nhiều đợt sinh trưởng Cho nên tuy là một loại bệnh có cự ly truyền nhiễm lây lan hẹp, song nó còn tùy thuộc vào mưa gió, giông bão xảy ra trong vụ mùa mà bệnh

có thể truyền lan với phạn vi không gian khá rộng, giọt keo vi khuẩn với số lượng nhiều, đó chính là một nguyên nhân quan trọng làm bệnh sau những đợt mưa gió vào cuối vụ lúa xuân và trong suốt vụ mùa ở nước ta (Phan Hữu Tôn, 2004)

* Nguyên nhân gây bệnh

Về nguồn bệnh bạc lá, các tác giả Nhật Bản cho rằng nguồn bệnh tồn tại chủ yếu trên một số cỏ dại họ Hoà thảo, nói cách khác một số cỏ dại là ký chủ phụ của vi khuẩn X oryzae

Ở nước ta phát hiện thấy vi khuẩn hại trên lúa và trên các ký chủ cỏ dại, tàn dư rơm rạ của cây bệnh, lúa chét, cỏ môi, cỏ lồng vực, cỏ gừng bò (Lê Lương Tề, 1980)

Mỗi vùng khác nhau thì cũng có sự khác nhau về thành phần và số lượng chủng X.oryzae: Nhật Bản đã xác định được 5 chủng, Philippine đã xác định được 6 chủng, Indonesia đã xác định được 9 chủng, miền Bắc Việt Nam đã xác định được 4 chủng với nhiều Isolates

Về nguyên nhân gây bệnh có thể kể đến một số nguyên nhân chính sau:

- Một số giống mẫn cảm với bệnh bạc lá như một số giống tạp giao và một

số giống chất lượng Do thời tiết nóng ẩm, mưa to gió lớn xảy ra trong thời kỳ lúa cần quang hợp cao

- Do biện pháp canh tác làm đất, cây lúa nhiễm bệnh vàng lá sau lập thu, bón thêm phân cấp cứu vàng lá, cây lúa ra lớp rễ mới phát triển lá non nên gặp mưa dông dễ nhiễm bệnh bạc lá

- Bệnh thường mẫn cảm với lượng đạm dư trong lá, những ruộng bón đạm nhiều, bón muộn, bón lai rai, bón không cân đối giữ đạm, lân và kaly, những ruộng trũng hẩu dồn đạm cuối vụ, do biện pháp thâm canh gieo cấy, chăm bón không đúng kỹ thuật

2.2.3 Triệu chứng bệnh bạc lá

Vi khuẩn Xoo gây ra 3 triệu chứng điển hình của bệnh bạc lá lúa là: bạc lá,

vàng nhợt, héo xanh (còn được gọi là Kresek) Cho đến nay mối quan hệ giữa 3 triệu chứng này vẫn chưa được làm sáng tỏ, nhiều thí nghiệm trong nhà lưới đã chứng minh hiện tượng Kresek và bạc lá khác nhau rõ rệt mặc dù chúng đều là triệu chứng ban đầu của sự nhiễm bệnh Các giống lúa khác nhau có thể biểu hiện triệu chứng nhiễm Kresek hoặc bạc lá Triệu chứng vàng nhợt là ảnh hưởng sau, là hậu quả của sự bạc lá hay Kresek gây nên hoặc cũng có thể là do độc tố (toxin) của vi khuẩn sản sinh ra

Theo Lê Lương Tề (1980), thì ở Việt Nam, bệnh bạc lá lúa phát sinh phá hại suốt từ thời kỳ mạ đến chín nhưng có triệu chứng điển hình là ở thời kỳ lúa cây trên ruộng từ sau đẻ - trỗ, chín sữa

Trên mạ triệu chứng thể hiện không đặc trưng như ở trên lúa do đó cũng dễ nhầm lẫn với các triệu chứng khác Chủ yếu vi khuẩn hại mạ gây ra triệu chứng ở mút lá hoặc mép lá mạ những vết dài ngắn khác nhau màu xanh vàng rồi nâu bạc,

lá dễ bị khô

Trên lá lúa triệu chứng bệnh thể hiện rõ hơn tuy có thể biến đổi ít nhiều tuỳ theo giống lúa và điều kiện bên ngoài nhưng nói chung vết bệnh có những đặc điểm điển hình sau đây:

- Vết bệnh ở mép lá, mút lá lan dần vào phiến lá hoặc lan thẳng xuống gân chính, ở một số trường hợp vết bệnh có khi bắt đầu ở ngay giữa phiến lá

- Vết bệnh lan rộng theo đường gợn sóng hoặc thẳng, mô bệnh xanh tái vàng lục cuối cùng cháy khô có màu nâu xám

- Thông thường ranh giới giữa mô bênh với mô khỏe trên phiến lá rất rõ rệt,

có giới hạn theo đường gợn sóng vàng hoặc không vàng, có khi chỉ một đường viền màu nâu sẫm, đứt quãng hay không đứt quãng

Có thể căn cứ vào những đặc điểm triệu chứng trên để phát hiện bệnh Tuy nhiên nhiều khi vết bệnh quá cũ hoặc biến đổi quá nhiều theo giống và điều hiện bên ngoài, nhất là ở mạ do vậy có thể nhầm lẫn với những hiện tượng khô đầu lá sinh lý (Bùi Trọng Thủy và cs., 2007)

2.2.4 Tác hại do bệnh bạc lá lúa gây ra

Bệnh bạc lá do vi khuẩn Xoo được tìm thấy ở tất cả các vùng trồng lúa

trên thế giới Hàng năm, theo thống kê năng suất lúa toàn thế giới giảm từ

10-20% do các bệnh vi khuẩn, trong đó 50% là do bệnh bạc lá gây nên (Mew et

al., 1982)

Ở Việt Nam bệnh đã được phát hiện từ lâu trên các giống lúa mùa cũ (Hà Bích Thu và cs., 2002) Hiện nay, bệnh gây hại trên cả lúa lai và lúa thuần, đặc biệt gây hại nặng trên các giống lúa lai nhập nội từ Trung Quốc Tác hại của bệnh nặng hay nhẹ tuỳ thuộc vào giống lúa, thời điểm cây bị nhiễm bệnh và mức độ nhiễm nặng hay nhẹ Tác hại của bệnh chủ yếu là làm cho lá đòng sớm tàn khô xác, giảm quang hợp, tăng lượng hạt lép dẫn đến giảm năng suất lúa Theo nghiên cứu Mew, 1987 năng suất giảm chủ yếu do sự thay đổi về số nhánh, số hạt chắc trên bông và khối lượng 1000 hạt

2.2.5 Vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa

Vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa được nhiều nhà nghiên cứu, phân lập nên nó được gọi với nhiều tên khác nhau Trước đây vi khuẩn bạc lá lúa có tên là

Pseudomonas oryzae Uyeda et Ishiyama, hoặc Phytomonas oryzae Magrou Đến

năm 1982 vi khuẩn được đặt tên là Xanthomonas campestris pv.oryzae (Uyeda et Ishiyama) Dowson Về sau Dowson đổi tên lại là Xanthomonas oryzae pv

Oryzae (Ishiyama) Dowson

Dựa theo hệ thống phân loại của Bergey (1939) và Gorlenco (1966) thì

loài Xanthomonas oryzae thuộc chi Xanthomonas, họ Pseudomonadaceae, bộ

Eubacteriales, lớp Schizomycetes (Eubacteria)

Tuy nhiên hệ thống phân loại này còn có nhiều tiêu chí chưa được nghiên cứu đầy đủ nên hệ thống chưa có được sự thống nhất toàn diện Trong những năm gần đây, phân loại vi khuẩn hiện đại dựa trên các nghiên cứu và phân tích trực tiếp cấu trúc ADN Các cá thể, các isolate khác nhau nhưng cùng một loài sẽ

có cấu trúc di truyền tương tự nhau Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng, hàm lượng các nucleotit G+C đặc trưng cho mỗi loài và được sử dụng làm 1 trong những chỉ tiêu phân loại Theo đó, các kế quả nghiên cứu cũng cho thấy hàm lượng G+C

của những loài trong chi Erwinia là 50-54%; Corynebacterium: 54-55%;

Pseudomonas: 58-63%; còn ở Xanthomonas là 63-69% (Vũ Triệu Mân, 2007)

Trên môi trường nhân tạo, khuẩn lạc của vi khuẩn có dạng hình tròn, màu vàng sáp, rìa nhẵn, bề mặt khuẩn lạc ướt, háo khí, nhuộm gram âm Vi khuẩn không có khả năng phân giải nitrat, không dịch hoá gelatin, không tạo NH3, indol, nhưng tạo H2S, tạo khí nhưng không tạo axit trong môi trường có đường Nhiệt độ

thích hợp cho vi khuẩn sinh trưởng là từ 26 - 30oC, nhiệt độ tối thiểu 0 - 5 oC, nhiệt

độ làm vi khuẩn chết là 53 oC Vi khuẩn có thể sống trong phạm vi pH khá rộng từ 5,7 – 8,5, thích hợp nhất là pH 6,8 – 7,2 (Lê Lương Tề và cs., 2007)

2.2.6 Quy luật và các yếu tố ảnh hưởng đến phát sinh, phát triển bệnh

a Quy luật phát sinh, phát triển

Bệnh bạc lá phát sinh phát triển mạnh ở vụ mùa các tỉnh phía Bắc Bệnh phát triển, lây lan nhanh trong điều kiện nhiệt độ 26-29°C, ẩm độ 90 %, đặc biệt khi có mưa to và gió lớn làm rập nát lá lúa tạo thuận lợi cho bệnh truyền lan (Phan Hữu Tôn, 2004) Vì thế vụ mùa bệnh thường gây tác hại nặng hơn vụ xuân Vụ chiêm xuân bệnh phát triển mạnh vào tháng 5-6, còn vụ mùa là tháng 8-9 khi có nhiều mưa bão gây tổn thương cho lá lúa

Nhìn chung, bệnh phát triển mạnh nhất vào giai đoạn lúa làm đòng đến chín sữa vì đây là giai đoạn lúa mẫn cảm nhất với bệnh bạc lá

Từ các nghiên cứu gần đây về vi khuẩn bạc lá Xoo cho thấy ở mỗi vùng,

lãnh thổ lại có một số chủng vi khuẩn bạc lá đặc trưng Sự có mặt của các chủng

vi khuẩn bạc lá phụ thuộc vào cơ cấu các giống lúa và điều kiện tự nhiên của mỗi vùng Như ở Philipin tồn tại 6 chủng, Nhật Bản 12 chủng, Ấn Độ 9 chủng

(Leung et al., 1993) Còn ở Việt Nam, theo nghiên cứu của Phan Hữu Tôn và

cộng sự năm 2002 đã phân lập và xác định được ở miền Bắc Việt Nam có 10 chủng đang tồn tại Gần đây, trong nghiên cứu về bệnh bạc lá ở 15 tỉnh miền

Bắc, Nguyễn Văn Viết và cs (2005) đã nhận thấy các nhóm chủng Xoo thường

xuất hiện đan xen, ở một địa phương có thể xuất hiện nhiều nhóm chủng, trái lại một nhóm chủng có thể hiện diện ở nhiều địa phương Trên một vết bệnh đôi khi

có thể tồn tại một hoặc một số chủng vi khuẩn nhất định

b Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát sinh, phát triển bệnh

Có nhiều yếu tố ngoại cảnh ảnh hưởng đến sự phát sinh phát triển của bệnh Ẩm độ và lượng mưa là hai yếu tố quyết định cho sự phát sinh phát triển của bệnh bạc lá, lượng mưa lớn và nhiều kèm theo gió bão không những làm tổn thương đến lá khiến vi khuẩn dễ dàng xâm nhập mà còn tạo điều kiện cho vi khuẩn sinh sản nhanh, tạo nhiều giọt dịch vi khuẩn và lây lan nhanh chóng

Phân bón và thời kỳ bón cũng là yếu tố ảnh hưởng rõ rệt đến sự phát sinh phát triển của bệnh Lượng đạm bón lớn làm thân lá phát triển mạnh, cây mềm yếu và dễ bị tổn thương nên dễ bị nhiễm bệnh Bón sớm, tập trung sẽ giảm khả năng bị bệnh hơn so với bón muộn, rải rác Bón đạm cân đối với lân và kali cũng

làm giảm khả năng nhiễm bệnh Tuy nhiên, nếu bón quá nhiều đạm (>120 kg N/ ha) thì bón thêm lân và kali cũng không còn tác dụng

Đất màu mỡ nhiều chất hữu cơ thì bệnh phát triển hơn ở chân đất cằn cỗi Những nơi đất chua, ngập úng, nhiều mùn, lúa bị che bóng bệnh cũng phát triển mạnh hơn

Giống cũng là một yếu tố ảnh hưởng đến sự phát sinh phát triển của bệnh bạc lá Các giống lúa cũ, lúa địa phương nhiễm bệnh nhẹ hơn so với các giống lúa nhập nội có thời gian sinh trưởng ngắn, phàm ăn Theo điều tra của Viện bảo

vệ thực vật thì các giống lúa lai Trung Quốc nhập nội từ năm 1993 – 1997 hầu hết đều bị nhiễm bệnh bạc lá với mức tỷ lệ bệnh 50-80%, cấp phổ biến là 5-7, nếu bệnh nặng năng suất giảm 20-50%

2.2.7 Các gene kháng bệnh bạc lá lúa

Những nghiên cứu có tính chất hệ thống về gene kháng bệnh bạc lá lúa

được thực hiện tại Nhật Bản vào đầu thập kỷ 60 (Wu et al., 2008) Cho đến

những năm 80 của thế kỷ XX, Viện Nghiên cứu Lúa Quốc tế đã xác định bản chất di truyền tính kháng bệnh là do gene quy định Điều này được khẳng định chắc chắn nhờ vào những nghiên cứu của các nhà khoa học cùng những kỹ thuật hiện đại Những gene kháng chủ lực từ nhiều nguồn tài nguyên di truyền đã được

xác định (Singh et al., 2007) Cho đến nay (năm 2015), có 40 gene (được ký hiệu theo thứ tự lần lượt từ Xa1 đến Xa40) điều khiển tính kháng bệnh bạc lá ở lúa được công bố (Yang, 2003), (Chen et al., 2011), (Kim SM et al., 2015) Các gene kháng bạc lá có thể bị kiểm tra bởi một gene đơn trội (Xa1, Xa7, Xa21 ) hoặc một gene đơn lặn (xa5, xa13, xa24 ) hoặc do hai gene liên kết với nhau như : Xa1/Xa4, Xa1/Xa7, Xa1/Xa10 Một số gene kháng có cấu trúc Protein

tương đối giống nhau, chúng có trình tự axitamin giống nhau tới 53%, các nhà khoa học kết luận là do chúng liên kết chặt hoặc do chúng allen với nhau như

Xa26 có protein gần giống Xa21, Xa22(t), Xa3 (Wang et al., 2006), (Xiang et

al., 2006) Phần lớn các gene này đã được phát hiện từ loài phụ Indica, hoặc

từ lúa hoang dại O longistaminata, O rufipogon, O minuta và O officinalis, chỉ có một số ít được phát hiện từ loài phụ Japonica hoặc được tạo ra do sự thay đổi di truyền (Zhang et al., 2009)

Một số gene kháng bạc lá và các chỉ thị phân tử liên kết gần với các gene này đã được định vị trên bản đồ nhờ sử dụng các phương pháp RFLP, RAPD,

STS, SSR (Sengsai et al., 2007) Các gene này được xác định nằm trên các nhiễm sắc thể khác nhau như: Trên nhiễm sắc thể 1 có gene (Xa29t và xa34) (Chen et al.,

2011), gene xa24 được xác định nằm trên tay dài nhiễm sắc thể số 2 (Wu et al., 2008), nhiễm sắc thể 4 có 5 gene (Xa1, Xa2, Xa12, Xa14, Xa31) (Wang et al., 2009); nhiễm sắc thể 5 có gene (xa5) (Guo et al., 2010), nhiễm sắc thể 6 có gene

(Xa7, Xa27t ), (Wu et al., 2008), nhiễm sắc thể 7 có gene (xa8), nhiễm sắc thể 8 có

(xa13) (Chu et al., 2004) Trên tay dài của nhiễm sắc thể 11 chứa nhiều gene kháng nhất, có gene (Xa3, Xa4, Xa10, Xa21, Xa22t, Xa23, Xa26(t), Xa32(t) và

Xa35 (Arif et al., 2008), nhiễm sắc thể 12 có gene (Xa25t, xa32) (Chen et al.,

2000) Hiện nay ở nhiễm sắc thể 3, 9, 10 chưa phát hiện gene kháng bệnh bạc lá

Gene Xa4 đuợc các tác giả Trung Quốc lập bản đồ trên nhiễm sắc thể số 11

Gene kháng đựoc phát hiện bằng sử dụng chỉ thị phân tử Npb181 với cặp mồi R 5’GTG CTA TAA AAG GCA TTC GGG 3’; F 5’ATC GAT CGA TCT TCA CGA GG 3’

Các gene xa5, Xa7, Xa21 là các gene kháng hữu hiệu có thể kháng được với nhiều chủng bạc lá khác nhau trên thế giới hiện nay (Lang et al., 2008)

Gene kháng bạc lá xa5 là một gene lặn, nằm trên nhiễm sắc thể số 5 Để

lập bản đồ phân giải cao cho gene này, các nhà khoa học đã tiến hành sàng lọc

quần thể F2 bao gồm 1016 cá thể từ tổ hợp lai giữa dòng NILs mang gene xa5 với dòng mẹ tái tục (recurrent parent line) Gene xa5 được định vị giữa 2 chỉ

thị RS7 và RM611 cách nhau 0,5cM, trải dài trên 1 đoạn ADN có kích thước

70 kb với 11 khung đọc mở (Blair et al., 2003) Các nghiên cứu tiếp theo cho thấy gene xa5 mang chức năng của 1 yếu tố phiên mã Cụ thể, nó mã hoá cho

1 tiểu đơn vị gamma của yếu tố phiên mã IIA Như vậy tính kháng của gene

xa5 không tuân theo cơ chế của một gene kháng điển hình Giải trình tự ADN

của gene xa5 cho thấy giữa alen trội và alen lặn chỉ có sự khác biệt bởi 2

nucleotide dẫn tới sự thay đổi 1 axit amin (Iyer and McCouch, 2004)

Gene Xa7 được phát hiện từ giống lúa DV85 của Viện Lúa Quốc tế IRRI

và được định vị trên nhiễm sắc thể số 6, sau đó được lập bản đồ trên cơ sở tổ hợp lai IR24xIRBB7 thông qua kỹ thuật AFLP Tiếp theo, các chỉ thị phân tử M1,

M3 và M4 được xác định có liên kết gần với gene Xa7, trong đó M3 và M4 nằm cách gene Xa7 với khoảng cách tương ứng là 0,5 và 1,8cM (Obert et al., 2004)

Một số tác giả Trung Quốc tiến hành lập bản đồ vật lý cho 1 gene ở giống lúa

Zhenhui 084 cùng alen với Xa7 (Zhang et al., 2009) Gene Xa7 biểu hiện tính kháng rộng đối với nhiều chủng vi khuẩn bạc lá (Gu et al., 2008) Giống lúa mang gene kháng Xa7 được thử nghiệm tính kháng bạc lá trong 11 năm (22 vụ)

liên tiếp với 1 chủng vi khuẩn bạc lá Sau 22 vụ liên tiếp, thành phần quần thể vi

khuẩn thay đổi, trong đó nhóm gây độc tăng lên Mặc dù vậy, gene Xa7 vẫn tỏ ra

kháng khá hiệu quả đối với vi khuẩn bạc lá, nhất là khi nhiệt độ môi trường tương đối cao, trong khi các gene kháng khác dường như không chịu sự ảnh

hưởng của nhiệt độ, hoặc giảm tính kháng ở nhiệt độ cao (Webb et al., 2010) Do vậy gene Xa7 được nhiều nơi sử dụng làm nguồn cho (donor) gene kháng bạc lá

Gene Xa21 nằm trên nhiễm sắc thể số 11 và là gene kháng bạc lá đầu tiên được phân lập và xác định chức năng gene Gene Xa21 là một thành viên của một

họ đa gene, mã hoá cho 1 protein tương tự kinaza thụ cảm Gene Xa21 là gene

kháng hiệu quả với nhiều chủng vi khuẩn bạc lá và được nhiều nơi sử dụng làm nguồn cho gene kháng trong chương trình chọn tạo giống lúa kháng bạc lá Gene

Xa21 cũng là gene kháng bạc lá đầu tiên được thiết kế vectơ để biến nạp vào cây

lúa Đến nay, rất nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới đã thu được cây lúa

chuyển gene kháng bạc lá Xa21(Sun et al., 2004)

Gene Xa40 là gene kháng bạc lá được phát hiện cuối cùng (tính đến thời

điểm hết năm 2015), do các nhà khoa học Hàn Quốc phát hiện từ loài lúa phụ

Japonica, được lập bản đồ cách chỉ thị RM6293 0,7cM và cách chỉ thị RM7654

1,1 cM trên NST11 Xa35 được xác định là có tính kháng cao với các chủng bạc

lá của Trung Quốc (Guo et al., 2010)

Như vậy 40 gene kháng bạc lá nói trên đã được nghiên cứu và định vị trên các nhiễm sắc thể Hầu hết đã được lập bản đồ ở mức độ phân tử Những kết quả nghiên cứu này là các công cụ hữu hiệu cho chương trình chọn giống nhờ chỉ thị phân tử, tạo điều kiện đáng kể cho việc khai thác và sử dụng gene kháng một cách có hiệu quả trong việc chọn tạo giống lúa mới kháng bệnh bạc lá

2.3 CHỈ THỊ PHÂN TỬ VÀ ỨNG DỤNG TRONG CHỌN TẠO GIỐNG LÚA KHÁNG BỆNH BẠC LÁ

2.3.1 Chỉ thị phân tử

Hiện nay cùng với sự phát triển mạnh mẽ của ngành sinh học phân tử, việc

sử dụng các chỉ thị phân tử để chọn lọc các cá thể mang kiểu gene mong muốn đã trở nên đơn giản hơn

Chỉ thị phân tử (hay chỉ thị phân tử ADN) là những chỉ thị có bản chất là đa hình ADN Nó có thể là những dòng phân tử ADN có sẵn hay dưới dạng thông tin về trình tự được lưu giữ và chuyển tải trong những tệp dữ liệu được lưu trữ trong máy tính hay trên mạng Internet Trong những năm gần đây với sự phát triển nhanh chóng của nghiên cứu geneom việc lập bản đồ các gene có sử dụng chỉ thị phân tử đã được tiến hành trên rất nhiều loại cây trồng Hiện nay người ta đã thiết lập được bản đồ chi tiết về các chỉ thị phân tử liên kết với nhiều gene quy định các

tính trạng nông sinh học quan trọng và các tính trạng kháng bệnh khác nhau

Chỉ thị phân tử là các chỉ thị phản ánh các trình tự đặc hiệu của ADN trong

hệ gene của vi sinh vật (nhiễm sắc thể, ty thể, nhân, ribosom) Có thể hiểu đơn giản chúng như các cột mốc nằm trên trình tự ADN trong hệ gene Sự hiện diện của các cột mốc và khoảng cách tương đối giữa các cột mốc này phản ánh mức

độ biến dị giữa các cá thể, giống hoặc loài trong một quần thể Sinh vật có khả năng nhân bản ADN của chúng với độ chính xác cao nhưng có nhiều cơ chế xảy

ra có thể làm thay đổi cấu trúc ADN đơn giản như sự thay đổi các cặp bazơ hoặc phức tạp hơn như sự đảo đoạn, chuyển chỗ hoặc mất đoạn Như vậy có sự biến động rất lớn về ADN trong một quần thể tự nhiên của sinh vật Chỉ thị phân tử được xem là công cụ cực kỳ hiệu quả trong việc đánh giá tính đa dạng sinh học phục vụ cho công tác chọn tạo giống cây trồng

Nhờ chỉ thị phân tử cho phép xác định được các chỉ tiêu trực tiếp của kiểu gene thông qua việc xác định các trình tự nhất định của các gene hoặc các trình

tự đặc biệt liên kết chặt với các gene mang các tính trạng mong muốn Bằng việc

sử dụng các chỉ tiêu phân tích trực tiếp kiểu gene trên, con người đã đi thẳng vào bản chất di truyền của các tính trạng, khắc phục được ảnh hưởng của các yếu tố môi trường, theo dõi và phát hiện được các gene mong muốn, sự biến đổi của chúng qua các thế hệ kể cả khi chưa có sự biểu hiện gene ra thành kiểu hình Điều này giúp cho công tác chọn tạo giống một cách chính xác, rút ngắn thời gian và chi phí Như vậy có thể định nghĩa đơn giản hơn về chỉ thị phân tử hay chỉ thị ADN là các đoạn ADN được sử dụng để phân biệt các kiểu hình, kiểu gene của các cá thể, dòng giống giúp cho sự phân loại, định danh chọn tạo giống sinh vật một cách chính xác, hiệu quả

Năm 1998 Bert Collard và David Mackill đã trình bày về chọn lọc dựa trên chỉ thị phân tử; cơ sở khoa học là tất cả cơ quan sống được hình thành từ các tế bào, các tế bào sống được điều khiển bằng vật liệu di truyền gọi là ADN Phân tử ADN được tạo thành chuỗi dài chứa các N (Adenin [A]; Cytosin [C]; Guanine [G] và Thymine [T]; chỉ mỗi phần nhỏ của chuỗi ADN tạo thành các gene mang

mã di truyền cho các protein phần còn lại chủ yếu của ADN không mã hóa

2.3.2 Ứng dụng chị thị phân tử trong chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá

Ngày nay chỉ thị phân tử được sử dụng rộng rãi như một công cụ hữu hiệu trong nghiên cứu di truyền và cho phép đánh giá một số lượng lớn locut trải khắp bộ gene của nhiều loài cây trồng cũng như nhận dạng các giống lúa kháng bệnh bạc lá

như RFLP AFLP RAPD SSR CAP (Huang et al., 1997; Yoshimura et al., 1992

Ronal et al., 1992 McCouch et al., 2002) Chọn giống bằng chỉ thị phân tử (MAS)

là một quá trình sử dụng một marker để lựa chọn gián tiếp các gene mục tiêu Việc

sử dụng MAS chọn giống thay vì sử dụng chọn lọc kiểu hình thông thường đem lại một số lợi thế lớn MAS giúp tiết kiệm thời gian, giảm chi phí chọn giống và đáng tin cậy hơn do không bị ảnh hưởng của các yếu tố môi trường

2.3.2.1 Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá trên thế giới

Từ các nghiên cứu trên cho thấy, tính kháng bệnh bạc lá là do gene quy định nên trên cơ sở đó chọn lọc các cặp bố mẹ và bằng phương pháp lai hữu tính kết hợp với chỉ thị phân tử chúng ta có thể tạo được giống kháng bệnh Bằng phương pháp này có thể tạo được những giống lúa mới vừa kết hợp được những đặc tính nông sinh học tốt của bố mẹ vừa mang gene kháng bệnh bạc lá

Ở Nhật Bản bệnh bạc lá gây hại từ năm 1884 nhưng mãi đến năm 1926 cây lúa kháng bệnh bạc lá đầu tiên mới được xác định Cây lúa kháng bệnh này được chọn ra từ giống lúa nhiễm bệnh, được đặt tên là Kono 35 Giống này cung cấp gene chống chịu cho nhiều giống lúa ở Nhật Bản (Lê Lương Tề

và cs., 2007)

Ở Viện Nghiên cứu Lúa Quốc tế, chương trình chọn giống kháng bệnh bạc lá đã đạt được nhiều kết quả Người ta đã đưa ra nhiều dòng, giống kháng bệnh và chúng được trồng rộng rãi ở Châu Á, cung cấp vật liệu kháng bệnh bạc

lá cho các nước như Philippin, Trung Quốc, Ấn Độ, Nepal, Bangladesh, Thái

Lan, Việt Nam, Indonexia, Malaysia (Chen et al., 2000)

Theo Deng Qi-ming và cs (2006) thì hầu hết các giống lúa kháng hiện

nay có phổ kháng hẹp Trên giống lúa Indica chứa gene Xa4 và giống Japonica chứa gene xa3 Theo Guang-huai Jiang et al.(2006), gene lặn xa5 có phổ kháng

rộng hơn và cao hơn so với các đơn gene kháng khác Các nhà khoa học

Philippin thì khẳng định gene xa5, Xa7, Xa21, Xa23 có phổ kháng rộng hơn với

cả 6 chủng bạc lá ở Philippin, (Chen et al., 2008) Theo Mark Mazzola và cộng

sự, gene Xa21 kháng với hầu hết các chủng bạc lá ở Ấn Độ và Philippin (Supanyika Sengsai et al., 2007), (Sun et al., 2004)

Từ cuối thế kỷ 20 đến đầu thế kỷ 21, một loạt các gene kháng bạc lá được lập bản đồ với các chỉ thị phân tử liên kết đã thúc đẩy mạnh mẽ chương trình chọn giống lúa kháng bạc lá nhờ chỉ thị phân tử Các đơn gene kháng bạc lá thường chỉ kháng được với một số chủng vi khuẩn bạc lá nhất định Vì vậy nhiều cơ sở nghiên cứu đã tiến hành quy tụ vài gene kháng bạc lá vào một giống lúa nhằm tạo giống

lúa cho năng suất cao và kháng bền vững với nhiều chủng bạc lá Công nghệ chọn giống nhờ chỉ thị phân tử (MAS) trở nên đắc lực cho việc quy tụ nhiều gene kháng vào 1 hệ gene

Viện Nghiên cứu Lúa Quốc tế đã đưa các gene kháng được với nhiều

chủng bạc lá xa5, xa13 và Xa21 vào các giống lúa “Kiểu mới” (New Plant Type)

IR65598-112, IR65600-42 và IR65600-96 nhằm tạo ra các giống lúa cho năng

suất siêu cao và kháng bền vững với bệnh bạc lá (Sanchez et al., 2000) Bằng con

đường MAS, các nhà khoa học đã quy tụ được một số dòng lúa mang 2, 3 hoặc 4… gene kháng bệnh bạc lá như các dòng mang đa gene kháng IRBB57,

IRBB62, IRBB60…của viện lúa quốc tế IRRI (Lang et al., 2008)

Các nhà khoa học Philippin đã quy tụ thành công 3 gene kháng trội vào

dòng mẹ bất dục đực phản ứng với nhiệt độ TGMS1 (Loida et al., 2008)

Ở Ấn Độ các nhà khoa học đã quy tụ kết hợp 2 gene Xa4 và Xa21 vào cùng một giống lúa Họ sử dụng phương pháp MAS để chuyển gene Pi5 và gene Xa21 vào giống lúa trồng IR50 (Narayanan et al, 2002), quy tụ gene

Xa21 và xa13 vào giống lúa Pusa Basmati1 tạo ra giống lúa mới Pusa 1460

(IET18990) kháng tốt với bệnh bạc lá Sing et al (2007), đã sử dụng MAS để quy tụ 3 gene kháng: xa5, xa13, Xa21 vào giống lúa trồng PR106 Một

chương trình MAS được thiết lập nhằm tạo giống lúa kháng bền vững với các chủng bạc lá lúa ở Ấn Độ

Các nhà khoa học Trung Quốc đã sử dụng MAS trong chọn giống lúa và

họ đã quy tụ được vài gene kháng chủ yếu như xa5, Xa7, Xa21… vào cùng một giống lúa Dòng phục hồi Shuhui 207 được quy tụ 2 gene trội kháng bạc lá Xa4,

Xa21, qua kiểm tra thấy khả năng kháng cao hơn và có phổ kháng rộng hơn so

với dòng chưa được quy tụ gene kháng ban đầu Mianhui 725 (Wang et al., 2009 Kết quả sử dụng MAS (RFLP) để chuyển gene Xa21 vào dòng phục hồi

Minghui63, tạo thành dòng Minghui (Xa21) khi lai với Zhenshan 97A tạo con lai Shanyou 63 (Xa21) kháng được với bệnh bạc lá cho trọng lượng hạt và năng suất cao hơn dòng đối chứng Shanyou 63….Các nhà khoa học Trung Quốc còn

chuyển gene BT và gene Xa21 vào giống lúa 9311 (Yuging et al., 2008)…

Các nhà khoa học Thái Lan đã sử dụng MAS chọn tạo được nhiều giống lúa mới vừa cho năng suất cao, chất lượng tốt, đặc biệt kháng được bệnh bạc lá, rầy nâu hơn hẳn giống Khoa Dok Mali truyền thống (Theerayut

Toojinda et al., 2004)

Đối với các giống lúa Japonica canh tác tại Hàn Quốc, dòng pyramid với

tổ hợp 3 gene kháng (Xa4 + xa5 + Xa21) tỏ ra kháng rất hiệu quả với tất cả các chủng vi khuẩn bạc lá, kể cả chủng độc K3a mới phân lập Tổ hợp 3 gene kháng

này dường như có biểu hiện thêm hiệu ứng kháng bổ trợ số lượng (quantitative

complementation) (Jena et al., 2007) Kết quả này đưa ra một chiến lược mới trong chọn tạo giống lúa Japonica có phổ kháng rộng đối với các chủng bạc lá

Các nhà khoa học Hàn Quốc còn sử dụng các chỉ thị phân tử STS và SNP liên kết

với các gene kháng Xa1, Xa4, xa5, xa13 và Xa21 trong chọn tạo giống lúa thơm kháng bạc lá (Kim et al., 2009)

2.3.2.2 Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá

ở Việt Nam

Bệnh bạc lá phát hiện ở Việt Nam sau năm 1954, trên các giống lúa địa phương cao cây nhưng mức độ gây hại không nghiêm trọng Khi phong trào thâm canh lúa phát triển, đặc biệt là việc gieo trồng các giống lúa địa phương năng suất cao, chịu phân tốt, kết hợp với sử dụng nhiều phân bón hóa học là nguyên nhân chính dẫn đến bệnh bạc lá phát triển lan tràn trong cả vụ xuân và vụ mùa Ví dụ: Năm 1970 trên diện tích lúa mùa cũ cấy giống nông nghiệp 8 bị bệnh ở mức độ 60 - 100%, giảm năng suất từ 30 - 60%

Về phân nhóm các chủng vi khuẩn bạc lá ở Việt Nam, theo tác giả Lê Lương Tề thì ở đồng bằng Sông Hồng có ít nhất 3 chủng bạc lá Tác giả Tạ Minh Sơn sử dụng tổng hợp bộ giống chỉ thị chủng của Nhật Bản và IRRI (dựa trên 8

dòng chỉ thị mang các gene kháng Xa2, Xa3, Xa4, xa5, Xa7, Xa10, Xa11, Xa14)

đã xác định ở Việt Nam có 10 nhóm chủng vi khuẩn đặt tên từ 1 đến 10 Tác giả còn cho biết các nhóm chủng ở Việt Nam có đặc tính khác hẳn ở Nhật Bản và Philippin (Lê Lương Tề và cs., 2007)

Tiếp theo là các nghiên cứu về thành phần nhóm chủng vi khuẩn bạc lá của tác giả Nguyễn Văn Viết và cs (2002), Bùi Trọng Thuỷ và cs (2007) Dựa

trên 11 dòng chỉ thị mang các gene kháng Xa1, Xa2, Xa3, Xa4, xa5, Xa7, Xa10,

Xa11, Xa12, Xa14, Xa21, các tác giả đã nhóm các chủng bạc lá phân lập trong

giai đoạn 2001-2005 thành 12 chủng Trong giai đoạn 2007-2008, tác giả Bùi Trọng Thuỷ và cộng sự đã phát hiện thêm 3 chủng vi khuẩn bạc lá mới ở Nam Định, Bắc Ninh và Hà Nội nâng tổng số các chủng vi khuẩn bạc lá lên con số 15 Theo kết quả nghiên cứu của Cục Bảo vệ Thực vật về sự đa dạng di truyền một

số chủng vi khuẩn gây bệnh ở miền Bắc bằng cặp mồi XOR đặc hiệu cho thấy 47 chủng phân lập vi khuẩn bạc lá được phân chia thành 13 nhóm chủng (Cục

BVTV, 2010) Khác với các tác giả khác phân nhóm vi khuẩn bạc lá trên cơ sở phản ứng kháng nhiễm của các dòng chỉ thị (tester - các dòng NIL mang các gene kháng khác nhau) đối với các chủng vi khuẩn, tác giả Nguyễn Văn Viết và cộng

sự đã sử dụng một kỹ thuật mới - đó là kỹ thuật nghiên cứu đa dạng di truyền trên cơ sở đa hình 2 gene 16S- và 13S- rDNA đặc thù cho vi khuẩn bạc lá Các

dữ liệu về đồng dạng di truyền của 60 chủng vi khuẩn bạc lá phân lập ở Miền Bắc Việt Nam được xử lý trên chương trình NTSYS cho thấy các chủng bạc lá được phân thành 13 nhóm, trong đó nhóm 2 và 3 có tần xuất lớn nhất - chiếm tới 14,89% (Nguyễn Văn Viết và cs, 2008) Điều đó chứng tỏ thành phần các chủng sinh thái ở miền Bắc Việt Nam rất đa dạng và phong phú

Năm 2005, Phan Hữu Tôn và cộng sự đã ứng dụng kỹ thuật PCR phát hiện 4 gene kháng bạc lá từ 500 giống lúa địa phương, thu được kết quả: 56

giống chứa gene Xa4, 36 giống chứa gene xa5, 16 giống chứa gene Xa7, không

có giống nào chứa gene Xa21 (Phan Hữu Tôn, 2005) Nguyễn Thị Lang và cs (2004), tìm ra liên kết với gene kháng Xa4, xa5 trên giống lúa cao sản với 2 RM144 (Xa4) là giống OM2517, OM3428 và RM122 (xa5) là các giống

OM2492, OMCS2000

Về các gene kháng và giống lúa kháng bệnh bạc lá, trong những năm

70-80 của thế kỷ 20 nước ta sử dụng nhiều giống lúa mang gene Xa4 có nguồn gốc

từ IRRI như các giống lúa: IR20, IR22, IR26, IR30, IR32, NN2A, NN3A, NN4A, NN8A, TN73-2, CN2 Trong những năm cuối thế kỷ 20 - đầu thế kỷ 21, nước ta nhập nội nhiều giống lúa lai, lúa thuần từ Trung Quốc Phần lớn những

giống lúa này mang gene kháng bạc lá Xa4 Ngoài ra, theo GS Taura và

Yoshimura, Đại học Kuyshu, Nhật Bản về phân bố của 5 gene kháng bệnh trên

thế giới (Xa3, Xa4, xa5, Xa10 và Xa14) cho thấy ở Trung Quốc và Malaixia phần lớn các giống lúa đều chứa gene Xa14, một gene theo kết quả nghiên cứu của

Phan Hữu Tôn và cs (2005), bị nhiễm bởi hầu hết các chủng bạc lá ở miền Bắc Điều này có thể giải thích tại sao các giống lúa nhập nội từ Trung Quốc vào trồng

ở miền Bắc Việt Nam đều bị nhiễm rất nặng bệnh bạc lá

Tác giả Nguyễn Văn Viết và cộng sự đã tiến hành đánh giá đặc tính kháng bệnh bạc lá, cũng như sàng lọc (bằng chỉ thị phân tử) các gene kháng bạc lá ở 89

giống lúa địa phương Kết quả cho thấy có 18 giống mang gene Xa4, có 1 giống mang gene xa5, có 4 giống mang gene Xa7, không có giống lúa nào mang gene

Xa21 (Nguyễn Văn Viết và cs., 2008)

Về tính kháng của các gene kháng bệnh bạc lá, những nghiên cứu ở Việt

Nam trước kia đã cho thấy rằng tổ hợp 2 - 3 gene trong số các gene xa5, Xa7,

Xa21 có thể chống chịu được hầu hết các chủng bạc lá ở đồng bằng Bắc Bộ

Trong nghiên cứu về “Khả năng kháng bệnh bạc lá của các dòng lúa chỉ thị

(Tester) chứa đa gene kháng với một số chủng vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv

oryzae gây bệnh bạc lá lúa phổ biến ở miền bắc Việt Nam”, tác giả Bùi Trọng

Thuỷ và Phan Hữu Tôn cũng cho thấy tổ hợp các dòng NILs mang gene xa5 và

Xa7 kháng tốt với 7 chủng vi khuẩn sử dụng trong thí nghiệm

Ở đồng bằng sông Cửu Long, các cán bộ nghiên cứu đã sử dụng 10 chủng bạc lá lây nhiễm cho 166 mẫu lúa và 25 dòng bố mẹ lúa lai Kết quả cho thấy có 5

giống lúa địa phương phản ứng tương tự dòng NIL mang gene Xa21, 3 giống - tương tự xa5 và 58 giống - tương tự xa13 (Pha et al., 2004) Các nghiên cứu sâu

hơn về phản ứng của các dòng NIL đối với vi khuẩn bạc lá lây nhiễm tự nhiên ngoài đồng ở Cần Thơ cho thấy một bức tranh khác hẳn các chủng vi khuẩn bạc lá

ở miền Bắc: các dòng NIL mang gene xa13 và Xa14 đều bị nhiễm bệnh; các gene

xa5 và Xa7: nhiễm nhẹ; các gene Xa1, Xa3, Xa4, Xa10, Xa11, Xa21: kháng vừa

Ngoài ra không có gene đơn nào kháng cao với bệnh bạc lá chỉ có tổ hợp nhiều

gene kháng Xa4+xa5+xa13+Xa21 (trong IRBB60), Xa4+Xa7+Xa21 (trong IRBB62) và xa5+Xa7+xa13 (trong IRBB63) là kháng khá cao với vi khuẩn bạc lá (Loan et al., 2006)

Như vậy hiệu lực của các gene kháng bạc lá đối với các chủng vi khuẩn bạc lá phân lập ở các vùng khác nhau là không giống nhau - một gene có thể kháng với chủng bạc lá ở vùng này nhưng lại nhiễm với chủng ở vùng khác

Từ năm 2006 đến nay đã có nhiều đề tài, dự án tại các viện nghiên cứu chuyên nghành, trường Đại học đã chọn tạo thành công các giống lúa kháng bệnh như: giống lúa DT45, DT47, DT57 (Viện Di truyền Nông nghiệp), giống N91 (Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội), giống lúa Bắc thơm 7 kháng bạc lá (Viện nghiên cứu lúa), giống lúa lai Bắc ưu 253 KBBL (Công ty giống cây trồng Miền Nam), OM2492, OMCS2000 (Viện Lúa Đồng bằng sông Cửu Long), giống lúa lai Bắc ưu 903KBBL (Công ty Giống cây trồng Miền Nam) Từ kết quả nghiên cứu của các tác giả trong nước và quốc tế cho thấy:

- Thành phần các chủng, chủng sinh thái của vi khuẩn gây bệnh bạc lá ở miền Bắc Việt Nam rất đa dạng và phong phú

- Hiện nay trong số các gene kháng có các gene xa5, Xa7, Xa21 là kháng

được với hầu hết các chủng bạc lá gây bệnh ở miền Bắc Việt Nam

- Các giống lúa mang từ 2 gene kháng trở lên sẽ cho khả năng kháng cao và có phổ kháng rộng hơn với các chủng gây bệnh bạc lá Ở nước ta đã có nhiều giống lúa kháng bệnh bạc lá đã được chọn tạo và triển khai thành công

ra sản xuất nhưng các giống lúa này chủ yếu chỉ mang đơn gene Để chọn tạo được các giống lúa kháng bền vững với bệnh bạc lá thì chọn tạo giống lúa mang từ 2 gene kháng hữu hiệu trở lên rất cần thiết hiện nay Chọn giống nhờ chỉ thị phân tử (MAS) đã giúp các nhà chọn giống rút ngắn thời gian và tăng hiệu quả của quá trình chọn giống Tuy vậy chọn giống nhờ MAS vẫn phải tuân theo quy luật hỗn gene (dị hợp tử), kỹ thuật nuôi cấy bao phấn có thể khắc phục được điều đó chỉ trong một năm Kỹ thuật này có thể tạo ra các dòng đồng hợp tử ngay từ thế hệ đầu tiên

PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

Đề tài được tiến hành trong vụ Mùa năm 2015 và vụ Xuân năm 2016 + Tiến hành các thí nghiệm về sinh học phân tử tại Bộ môn Đột biến và

Ưu thế lai - Viện Di truyền Nông Nghiệp

+ Tiến hành lây nhiễm nhân tạo với chủng bạc lá tại ruộng thí nghiệm của

bộ môn tại Phường Thượng Cát - Từ Liêm - Hà Nội

+ Đánh giá đặc điểm nông sinh học các dòng lúa: tại ruộng thí nghiệm của

bộ môn - Phường Thượng Cát - Từ Liêm - Hà Nội

3.2 THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

+ Từ tháng 7/2015 – 6/2016

3.3 ĐỐI TƯỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

3.3.1 Đối tượng nghiên cứu

- Giống lúa IRBB62: Là giống do Viện nghiên cứu Lúa quốc tế IRRI chọn

tạo ra, thời gian sinh truởng đối với Vụ mùa 105-110 ngày, vụ Xuân 125-130 ngày, năng suất ổn định, chống chịu với điều kiện thời tiết tốt Chứa 3 gene kháng

bạc lá (Xa4, Xa7, Xa21)

- Giống lúa Bắc thơm 7: Là giống lúa thơm, chất lượng cao có nguồn gốc

xuất xứ từ Trung Quốc Nhiễm nặng bệnh bạc lá đặc

- Giống lúa IR24: Là giống lúa do Viện nghiên cứu Lúa quốc tế IRRI

chọn tạo ra, là giống chuẩn nhiễm

3.3.2 Vật liệu nghiên cứu

- 10 dòng lúa Bắc thơm 7 cải tiến, thế hệ BC3F5 được chọn từ tổ hợp lai Bắc thơm 7/ IRBB62 được ký hiệu BT-1 BT-2 BT-3 BT-10

- Dòng IRBB62 chứa 3 gene kháng bạc lá (Xa4, Xa7, Xa21) của Viện

nghiên cứu Lúa Quốc tế IRRI

- Các dòng đơn gene kháng như IRBB21(mang gene kháng Xa21), IRBB7 (mang gene kháng Xa7) và IRBB4 (mang gene kháng Xa4)

- Các chỉ thị phân tử liên kết với các gene kháng (Khoảng cách ≤ 5cM)

+ Chỉ thị liên kết với gene kháng Xa4: MP1-2

+ Chỉ thị liên kết với gene Xa7: P3

+ Chỉ thị liên kết với gene Xa21: pTA248

- Nguồn vi khuẩn: sử dụng chủng vi khuẩn được viện Nghiên cứu cây trồng thu thập và phân lập

+ Chủng 1(Race5): đại diện cho các chủng vi khuẩn gây bệnh ở Đồng bằng Bắc Bộ

Địa điểm thu mẫu Đa Tốn – Gia Lâm – Hà Nội, giống lấy mẫu bệnh: TH 2-2, Ngày lấy mẫu: 12/10/2011, Ngày phân lập: 18/10/2011

+ Chủng 2(Race14): Chủng có độc tính mạnh nhất

Địa điểm thu mẫu Minh Tân – Vụ Bản – Nam Định, giống lấy mẫu bệnh: Bắc Thơm 7; Ngày lấy mẫu: 5/10/2012; Ngày phân lập: 18/10/2012

Bảng 3.1 Chỉ thị ADN sử dụng phân tích PCR Tên chỉ

Xa21 12

3.4 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

3.4.1 Nội dung 1: Nghiên cứu đặc điểm nông sinh học của các dòng lúa Bắc thơm 7 cải tiến, xác định dòng lúa triển vọng

- Đánh giá các giai đoạn sinh trưởng và thời gian sinh trưởng của các dòng Bắc thơm 7 cải tiến;

- Đánh giá một số đặc điểm hình thái của các dòng lúa Bắc thơm 7 cải tiến;

- Đánh giá một số yếu tố cấu thành năng suất và năng suất của các dòng lúa Bắc thơm 7 cải tiến;

- Đánh giá khả năng chống chịu sâu bệnh và điều kiện ngoại cảnh;

- Đánh giá một số đặc điểm nông, sinh học chính của các dòng Bắc thơm

7 cải tiến triển vọng ở vụ xuân 2016;

- Đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng hạt gạo của các dòng Bắc thơm 7 cải tiến triển vọng vụ xuân 2016

3.4.2 Nội dung 2: Đánh giá khả năng kháng bệnh bạc lá của các dòng Bắc thơm 7 cải tiến

- Đánh giá bằng chỉ thị phân tử

+ Sản phẩm PCR với cặp mồi liên kết gene kháng Xa4

+ Sản phẩm PCR với cặp mồi liên kết gene kháng Xa7

+ Sản phẩm PCR với cặp mồi liên kết gene kháng Xa21

+ Tổng hợp kết quả đánh giá các dòng lúa mang gene kháng bệnh bạc lá

- Đánh giá kiểu hình kháng bằng lây nhiễm nhân tạo với vi khuẩn gây bệnh bạc lá của dòng lúa Bắc thơm 7 cải tiến

3.5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Bố trí thí nghiệm

- Thí nghiệm được thực hiện trong 2 vụ: Vụ mùa 2015 và vụ xuân 2016

- Các giống lúa được cấy theo phương pháp khảo sát tuần tự không nhắc lại Mỗi giống cấy 100m2 (mật độ cấy 45 khóm/m2)

Lượng phân bón cho thí nghiệm:

Các chỉ tiêu và phương pháp theo dõi:

Theo dõi và đánh giá các đặc điểm nông sinh học theo tiêu chuẩn IRRI (1996)

1 Tổng thời gian sinh trưởng: tính từ khi gieo đến khi 85% số hạt chín trên tất cả các cây

2 Thời gian trỗ : tính từ khi gieo đến khi có 50% số bông nhô ra khỏi bẹ

lá đòng 5cm

3 Số nhánh tối đa trên khóm: đếm số nhánh trong giai đoạn lúa làm đòng, đếm 10 khóm lấy giá trị trung bình

4 Số nhánh hữu hiệu trên khóm: đếm số nhánh tạo thành bông, đếm 10 khóm lấy giá trị trung bình

5 Chiều cao cây cuối cùng: đo lúc thu hoạch; tính từ mặt đất đến mút đầu bông không kể râu hạt của 10 cây lấy giá trị trung bình

6 Chiều dài bông chính: đo từ cổ bông đến mút đầu bông chính không

kể râu hạt của 10 bông chính/10 khóm; lấy giá trị trung bình

7 Số bông hữu hiệu / khóm (A): đếm toàn bộ số bông có 10 hạt chắc trở lên của 10 khóm lấy giá trị trung bình

8 Tổng số hạt / bông lấy 10 bông ngẫu nhiên của 10 khóm, đếm tổng số hạt và tính trung bình

9 Số hạt chắc/ bông (B) lấy 10 bông ngẫu nhiên của 10 khóm, đếm số hạt chắc và tính trung bình

10 Khối lượng 1000 hạt (C) đếm 5 lần mỗi lần 100 hạt, chia trung bình

và nhân 10

11 Năng suất tiềm năng = A.B.C.10-4 số khóm/m2 (tạ/ha)

Phương pháp đánh giá độ thuần đồng ruộng, độ cứng cây, độ tàn lá, độ

rụng hạt

+ Các chỉ tiêu và đánh gía theo QCVN01-55-2011-BNNPTNT “ Quy phạm khảo nghiệm giá trị canh tác và sử dụng giống lúa” với các thang điểm như sau:

Phương pháp đánh giá sâu bệnh hại chính theo thang điểm của IRRI(1996)

-Bệnh đạo ôn (điểm): 0-1-3-5-7-9

-Bệnh bạc lá (điểm): 1-3-5-7-9

-Khô vằn (điểm): 0-1-3-5-7-9

-Bệnh đốm nâu (điểm): 0-1-3-5-7-9

-Sâu đục thân (điểm): 0-1-3-5-7-9

-Sâu cuốn lá (điểm): 0-1-3-5-7-9

Điểm 0: Không nhiễm; điểm 9: nhiễm nặng

Phương pháp đánh giá tính kháng theo chiều dài vết bệnh của Fuyara và Bùi

Trọng Thủy 2003 theo thang điểm

Theo thang điểm 5 cấp (Sử dụng khi lây nhiễm các dòng nhỏ được cấy trong nhà lưới) như sau:

Chiều dài vết bệnh < 4 cm Kháng cao (HR)

Chiều dài vết bệnh 4 - 8 cm Kháng (R)

Chiều dài vết bệnh 8 - 12 cm Kháng trung bình (M) Chiều dài vết bệnh 12 - 17 cm Nhiễm (S)

Chiều dài vết bệnh > 17 cm Nhiễm cao (HS)

Phương pháp đánh giá chất lượng cơm gạo theo quy chuẩn (TCVN

8373:2010)

Cân 200 g gạo trắng được chuẩn bị chính xác đến 0.01 g cho vào hộp nhôm hoặc nồi nhôm nhỏ đã biết trước khối lượng Vò nhanh hai lần bằng nước sạch trong khoảng từ 4 – 5 phút Cho hộp nhôm có chứa gạo đã vò sạch lên cân

và thêm tiếp một lượng nước cho đủ khối lượng để đạt tỉ lệ đã tính Đặt hộp nhôm có chứa gạo và nước vào trong nồi cơm điện đã có sẵn 100 ml nước đậy lại

và bật công tắc Tiến hành nấu cách thủy đến khi rơle tự ngắt và tiếp tục giữ ấm

20 phút sau khi rơle ngắt Các chỉ tiêu được đánh giá và thang điểm như sau:

Độ mềm: 1 Rất cứng 2 Cứng 3 Hơi mềm 4 Mềm 5 Rất mềm

Độ dính: 1 Rất rời 2 Rời 3 Hơi dính 4 Dính 5 Dính tốt mịn

Độ trắng: 1 Nâu 2 Trắng ngả nâu 3 Trắng hơi xám 4 Trắng ngà 5 Trắng

Độ bóng: 1.Rất mờ xỉn 2 Hơi mờ xỉn 3 Hơi bóng 4 Bóng 5.Rất bóng

Độ ngon: 1 Không ngon 2 Hơi ngon 3 Ngon vừa 4 Ngon 5 Rất ngon

Dạng hạt (D/R)

Tròn <1.5 mm Bán tròn: 1.5- 1.99 Bầu : 2.0-2.49 Thon dài ≥ 3

3.5.2 Phương pháp 2: Đánh giá khả năng kháng bệnh bạc lá của các dòng Bắc thơm 7 cải tiến

a Phương pháp đánh giá bằng chỉ thị phân tử

Phương pháp tách chiết ADN tổng số

ADN tổng số được tách chiết theo phương pháp "NaOH extraction" của

Wang (1993) Quy trình tách chiết ADN bao gồm các bước:

Bước 1: Mẫu lá non được cắt nhỏ vào ống eppendorf 2ml Thêm 200µl NaOH 0.25N Nghiền mịn mẫu lá bằng máy nghiền RETSCH Mixer Mill MM 200

Bước 2: Thêm 800µl dung dịch Tris 100mM pH7.5, trộn đều

Bước 3: Ly tâm 12.000vòng/phút trong 20 phút

Bước 4: Chuyển 200µl dung dịch vào ống eppendorf 1.5ml Lưu giữ ở -200C

Bước 8 Soi gel trên máy soi cực tím đọc và ghi nhận kết quả Nồng độ ADN được xác định dựa vào độ sáng của băng ADN so với độ sáng của băng λDNA Độ gọn của băng ADN sẽ cho biết độ nguyên vẹn của ADN đã tách chiết được

Phương pháp kiểm tra ADN trên gel agarose 2.5%