đánh giá tính kháng bệnh bạc lá ở các thế hệ lai nhập gen xa7 vào giống bắc thơm số 7 kháng bạc lá

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Đỗ Thị Thanh Minh Tên Luận văn: “Đánh giá tính kháng bệnh bạc lá ở các thế hệ lai nhập gen Xa7 vào giống Bắc thơm số 7 kháng bạc lá” Chuyên ngành: Khoa

Trang 1

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

Trang 2

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo

vệ lấy bất kỳ học vị nào

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám

ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày tháng năm 2016

Tác giả luận văn

Đõ Thị Thanh Minh

Trang 3

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện luận văn thạc sĩ, bản thân tôi luôn nỗ lực cố gắng, bên cạnh đó tôi đã nhận được sự giúp đỡ quý báu của rất nhiều thầy, cô, người thân trong gia đình và bạn bè

Trước hết, tôi xin chân thành cảm ơn Viện nghiên cứu và phát triển cây trồng đã tạo điều kiện về thời gian, vật chất và môi trường nghiên cứu để tôi thực hiện và hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS.Vũ Thị Thu Hiền - Trưởng Bộ môn Di truyền và Chọn giống cây trồng, Học Viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình hướng dẫn và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn TS Vũ Hồng Quảng, cùng toàn thể các anh, chị, em trong Viện Nghiên cứu & Phát triển cây trồng đã tận tình giúp đỡ, chỉ bảo và tạo điều kiện cho tôi trong quá trình học tập và thực hiện đề tài

Nhân dịp này, tôi xin gửi tới bạn bè, đồng nghiệp, gia đình, người thân lời cảm

ơn chân thành nhất về sự giúp đỡ và những lời động viên khích lệ nhiệt tình dành cho tôi trong suốt quá trình hoàn thành luận văn

Tôi xin trân trọng biết ơn những tình cảm cao quý đó!

Hà Nội, ngày tháng năm 2016

Tác giả luận văn

Đõ Thị Thanh Minh

Trang 4

MỤC LỤC

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục chữ viết tắt vi

Danh mục bảng vii

Danh mục hình ix

Trích yếu luận văn x

Thesis abstract xii

Phần 1 Mở đầu 1

1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2

1.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 3

1.4 Ý nghĩa khoa học 3

1.5 Ý nghĩa thực tiễn 3

Phần 2 Tổng quan các vấn đề nghiên cứu 4

2.1 Tình hình sản xuất lúa trên thế giới và Việt Nam 4

2.1.1 Sản xuất lúa trên thế giới 4

2.1.2 Sản suất lúa gạo ở Việt Nam 5

2.2 Tình hình nghiên cứu, chọn tạo và phát triển lúa thơm 7

2.2.1 Tình hình nghiên cứu, chọn tạo trong và ngoài nước 7

2.2.2 Chất tạo mùi thơm và di truyền tính trạng mùi thơm 8

2.2.3 Ảnh hưởng của môi trường đến tính thơm 8

2.2.4 Phương pháp đánh giá mùi thơm ở lúa 9

2.3 Những nghiên cứu về bệnh bạc lá lúa 10

2.3.1 Tình hình nghiên cứu bệnh bạc lá ở lúa trong và ngoài nước 10

2.3.2 Tính phổ biến và tác hại của bệnh bạc lá lúa 11

2.3.3 Triệu chứng và phương pháp chuẩn đoán bệnh bạc lá lúa 11

2.3.4 Tác hại của bệnh bạc lá lúa ở Việt Nam 14

2.3.5 Những nghiên cứu về vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa 14

2.3.6 Các chủng vi khuẩn gây bệnh 15

2.4 Các gen kháng bạc lá 16

Trang 5

2.5 Đặc điểm của các dòng lúa đẳng gen làm chỉ thị 18

2.6 Những nghiên cứu về phương pháp lây bệnh nhân tạo và đánh giá tính kháng bệnh bạc lá của các giống lúa 18

2.7 Nghiên cứu về chỉ thị phân tử và ứng dụng của chỉ thị phân tử 19

2.7.1 Khái niệm chỉ thị phân tử 19

2.7.2 Một số chỉ thị phân tử DNA được sử dụng phổ biến trong nghiên cứu di truyền và chọn tạo giống lúa 20

2.7.3 Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống lúa kháng bệnh bạc lá 21

Phần 3 vật liệu và phương pháp nghiên cứu 25

3.1 Vật liệu nghiên cứu 25

3.1.1 Các dòng, giống sử dụng làm vật liệu 25

3.1.2 Các marker sử dụng để kiểm tra sự có mặt của gen kháng bệnh bạc lá Xa7 và Xa21 26

3.1.3 Các chủng vi khuẩn bạc lá sử dụng để lây nhiễm 26

3.2 Nội dung nghiên cứu 27

3.3 Địa điểm nghiên cứu 27

3.4 Phương pháp nghiên cứu 28

3.4.1 Sơ đồ lai nhập gen Xa7 vào giống lúa BT7KBL 28

3.4.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm và biện pháp kỹ thuật 29

3.4.3 Phương pháp kiểm tra gen kháng bệnh bạc lá bằng chỉ thị phân tử 29

3.5 Phương pháp lây nhiễm, đánh giá tính kháng bệnh bạc lá trên đồng ruộng 31

3.6 Các chỉ tiêu theo dõi 32

3.6.1 Thời gian qua các giai đoạn sinh trưởng 32

3.6.2 Đặc điểm nông, sinh học chính của các dòng, giống 33

3.6.3 Đặc điểm hình thái 33

3.7 Phương pháp xửa lý số liệu 36

Phần 4 kết quả nghiên cứu và thảo luận 37

4.1 Kết quả đánh giá, chọn lọc ở thế hệ BC3F1 37

4.1.1 Kết quả đánh giá, chọn lọc kiểu hình ở giai đoạn gieo – đẻ nhánh của các cá thể ở thế hệ BC3F1 37

4.1.2 Kết quả kiểm tra gen Xa7 của các cá thể BC3F1 vụ mùa 2015 38

4.1.3 Kết quả kiểm tra tính kháng bệnh bạc lá của các cá thể BC3F1 bằng lây nhiễm nhân tạo trên đồng ruộng ở vụ Mùa 2015 tại Gia Lâm – Hà Nội 43

Trang 6

4.1.4 Kết quả đánh giá một số đặc điểm nông, sinh học chính của các cá thể

BC3F1 mang gen Xa7 ở trạng thái dị hợp tử 59

4.2.1 Kết quả đánh giá, chọn lọc kiểu hình ở giai đoạn gieo –làm đòng của các cá thể ở thế hệ BC3F2 61

4.2.2 Kết quả kiểm tra gen Xa7 của các cá thể BC3F2 vụ đông xuân

2015-2016 62

4.2.3 Kết quả kiểm tra tính kháng bệnh bạc lá của các cá thể mang gen Xa7 đồng hợp tử trội bằng lây nhiễm nhân tạo trên đồng ruộng ở thế hệ BC3F2 66

4.2.4 Kết quả đánh giá một số đặc điểm nông, sinh học chính của các cá thể BC3F2 mang gen Xa7 ở trạng thái đồng hợp tử trội 68

4.3.1 Kết quả kiểm tra tính kháng bệnh bạc lá của các dòng BT7KBL mang gen Xa7 đồng hợp tử trội bằng lây nhiễm nhân tạo trên đồng ruộng ở thế hệ BC3F3 70

4.3.2 Đánh giá độ thuần, đặc diểm nông sinh học chính của các dòng lai chuyển gen ở thế hệ BC3F3 72

4.3.3 Các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất của các dòng ở BC3F3 73

4.4 Đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng gạo của các dòng lai nhập gen thuộc thế hệ B3F3 75

4.4.1 Kết quả kiểm tra gen Xa21 của các dòng đã chọn ở BC3F3 76

4.4.2 Kết quả kiểm tra gen Xa7 của các dòng đã chọn ở BC3F3 78

Phần 5 Kết luận và kiến nghị 80

5.1 Kết luận 80

5.2 Kiến nghị 80

Tài liệu tham khảo 81

PHỤ LỤC 86

PHỤ LỤC 2 101

PHỤ LỤC 3 110

PHỤ LỤC 4 114

Trang 7

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt

cM centimorgan (đơn vị chiều dài bản đồ di truyền)

IRRI International Rice Research Institute

MAS Marker Assisted Selection ( Chỉ thị phân tử Mas) MRDHV-DNA (Moderately Repeat, Dispersed DNA Highly

Variable DNA )

hình các đoạn AND khuyếch đại ngẫu nhiên) RFLP Restriction Fragment Length Polymorphismn

SSR Simple Sequence Repeats (Chỉ thị vi vệ tinh)

Trang 8

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Tình hình sản xuất lúa gạo ở các châu lục trên thế giới năm 2013 4 Bảng 2.2 Tình hình sản xuất lúa gạo của một số nước trên thế giới năm 2013 5 Bảng 2.3 Tình hình sản xuất lúa gạo của Việt Nam qua các năm 6 Bảng 2.4 Các chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá phổ biến ở các tỉnh phía Bắc

Việt Nam 15 Bảng 3.1 Các dòng, giống được sử dụng làm vật liệu nghiên cứu 25 Bảng 3.2 Danh sách các chủng vi khuẩn bạc lá sử dụng để lây nhiễm nhân tạo 26 Bảng 4.1 Kết quả đánh giá, chọn lọc kiểu hình ở giai đoạn gieo – làm đòng của

các cá thể ở thế hệ BC3F1 vụ mùa năm 2015 tại Gia Lâm – Hà Nội 37

Bảng 4.2 Tổng hợp kết quả kiểm tra gen Xa7 của các cá thể BC3F1 vụ Mùa

2015 tại Gia Lâm – Hà Nội 43 Bảng 4.3 Kết quả kiểm tra gen kháng bệnh bạc lá và đánh giá lây nhiễm nhân

tạo của các cá thể MAS1 được nạp gen Xa7 vụ mùa 2015 tại Gia

Lâm - Hà Nội 44 Bảng 4.4 Kết quả kiểm tra gen kháng bệnh bạc lá và đánh giá lây nhiễm nhân

Lâm - Hà Nội 45 Bảng 4.5 Kết quả kiểm tra gen kháng bệnh bạc lá và đánh giá lây nhiễm nhân

Lâm, Hà Nội 47 Bảng 4.6 Kết quả kiểm tra gen kháng bệnh bạc lá và đánh giá lây nhiễm nhân

Lâm Hà Nội 51

Trang 9

Bảng 4.9 Kết quả kiểm tra gen kháng bệnh bạc lá và đánh giá lây nhiễm nhân

Lâm Hà Nội 53 Bảng 4.10 Kết quả kiểm tra gen kháng bệnh bạc lá và đánh giá lây nhiễm nhân

Lâm Hà Nội 55 Bảng 4.11 Kết quả kiểm tra gen kháng bệnh bạc lá và đánh giá lây nhiễm nhân

Lâm Hà Nội 56 Bảng 4.12 Tổng hợp kết quả kiểm tra gen kháng bệnh bạc lá và đánh giá lây

nhiễm nhân tạo của các cá thể thuộc các dòng MAS được nạp gen

Xa7 vụ mùa 2015 tại Gia Lâm - Hà Nội 58

Bảng 4.13 Kết quả đánh giá và chọn lọc các cá thể ở thế hệ BC3F1 mang gen

Xa7 ở trạng thái dị hợp vụ Mùa 2015 thông qua chọn lọc kiểu hình 60

Bảng 4.14 Kết quả đánh giá, chọn lọc kiểu hình ở giai đoạn gieo – đẻ nhánh của

các cá thể ở thế hệ BC3F2 trong điều kiện vụ Đông xuân 2015 - 2016 tại Sóc Trăng 61

Bảng 4.15 Kết quả kiểm tra gen Xa7 của các cá thể BC3F2 vụ Đông xuân

2015-2016 tại Sóc Trăng 65

Bảng 4.16 Kết quả lây nhiễm nhân tạo của các cá thể BC3F2 mang gen Xa7

đồng hợp tử trội vụ Đông Xuân 2015 – 2016 tại Sóc Trăng 66 Bảng 4.17 Kết quả đánh giá một số đặc điểm nông sinh học, yếu tố cấu thành

năng suất các cá thể BC3F2 ở vụ Đông Xuân 2015 – 2016 tại Sóc Trăng 69 Bảng 4.18 Kết quả lây nhiễm nhân tạo bệnh bạc lá của các dòng BT7KBL mang

gen Xa7 ở thế hệ BC3F3 trong vụ xuân 2016 tại Gia Lâm – Hà Nội 71

Bảng 4.19 Các đặc điểm nông sinh học chính và các yếu tố cấu thành năng suất

của các dòng thuộc thế hệ BC3F3 ở vụ Xuân 2016 72 Bảng 4.20 Các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất của các dòng ở vụ Xuân

2016 tại Gia Lâm – Hà Nội 74 Bảng 4.21 Kết quả phân tích một số chỉ tiêu chất lượng gạo của các dòng thuần

ở BC3F3 tại Gia Lâm – Hà Nội vụ xuân 2016 75

Trang 10

DANH MỤC HÌNH

Hình 4.1 Kết quả điện di các cá thể thuộc dòng MAS1 bằng chỉ thị ID7 38

Hình 4.2 Kết quả điện di các cá thể MAS3 bằng chỉ thị ID7 38

Hình 4.3 Kết quả điện di các cá thể MAS3 và MAS4 bằng chỉ thị ID7 39

Hình 4.5 Kết quả điện di các cá thể MAS5, MAS6 và MAS7 bằng chỉ thị ID7 40

Hình 4.10 Kết quả điện di các cá thể MAS9 và MA10 bằng chỉ thị ID7 42

Hình 4.12 Kết quả điện di các cá thể MAS1.11 và MAS3.24 được nạp gen Xa7 bằng chỉ thị phân tử ID7 62

Hình 4.17 Kết quả điện di các cá thể MAS10.4 được nạp gen Xa7 bằng chỉ thị phân tử ID7 65

Hình 4.18 Kết quả kiểm tra gen Xa21 của các cá thể thuộc dòng D3 và D4 bằng chỉ thị pTA248 77

Hình 4.19 Kết quả kiểm tra gen Xa21 của các cá thể thuộc dòng D3 và D4 bằng chỉ thị pTA248 77

Hình 4.20 Kết quả kiểm tra gen Xa7 của các cá thể thuộc dòng D3 và D4 bằng chỉ thị phân tử ID7 78

Hình 4.21 Kết quả kiểm tra gen Xa7 của các cá thể thuộc dòng D10 và D12 bằng chỉ thị ID7 78

Trang 11

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN

Tên tác giả: Đỗ Thị Thanh Minh

Tên Luận văn: “Đánh giá tính kháng bệnh bạc lá ở các thế hệ lai nhập gen Xa7 vào

giống Bắc thơm số 7 kháng bạc lá”

Chuyên ngành: Khoa học cây trồng Mã số: 60.62.01.10

Tên cơ sở đào tạo: Học viện nông nghiệp Việt Nam

Mục đích nghiên cứu

Chọn ra những dòng triển vọng tích hợp được cả 2 gen Xa7 và Xa21 có tính kháng cao với nhiều chủng, nòi vi khuẩn Xoo mà vẫn giữ được đặc điểm nông sinh học, năng suất, chất lượng, mùi thơm của giống Bắc thơm số 7 thông qua chọn lọc kiểu hình

và chỉ thị phân tử

Phương pháp nghiên cứu

+ Thí nghiệm được bố trí tuần tự không nhắc lại, đối chứng là: BT7, BT7KBL, IR24, IRBB7, IRBB21

+ Phương pháp kiểm tra gen kháng bệnh bạc lá bằng chỉ thị phân tử

+ Phương pháp lây nhiễm, đánh giá tính kháng bệnh bạc lá trên đồng ruộng: theo Furuya (2003) mỗi cá thể (khóm) chia thành 3 phần bằng nhau, sau đó buộc dây để đánh dấu, mỗi 1 phần buộc 1 dây màu khác nhau, mỗi 1 màu dây tương ứng với một chủng vi khuẩn sẽ lây nhiễm

+ Các chỉ tiêu theo dõi: Đánh giá đặc tính nông, sinh học theo hệ thống đáng giá nguồn gen cây lúa của IRRI 2002; thử mùi thơm theo phương pháp của Kibria 2008, chỉ tiêu chất lượng thóc gạo được phân tích tại bộ môn sinh lý, sinh hóa, Viện Cây lương thực – cây thực phẩm

+ Phương pháp xử l ý số liệu: Xử lý thống kê các chỉ tiêu hình thái, các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất bằng phần mềm EXCEL

Kết quả chính và kết luận

- Các cá thể và các dòng BT7KBL đã được nhập gen Xa7 thể hiện tính kháng

mạnh hơn, phổ rộng hơn so với giống đối chứng BT7KBL Không có cá thể hay dòng

nào mang 2 gen Xa21 và Xa7 có phản ứng nhiễm với 3 chủng vi khuẩn lây nhiễm

Giống BT7KBL được lây nhiễm ở cả 3 vụ trong các thí nghiệm đều có phản ứng kháng với chủng 3, kháng vừa với chủng 5 và nhiễm với chủng 14 Điều này khẳng định chắc chắn việc quy tụ nhiều gen kháng trong một giống cho hiệu quả kháng bệnh cao hơn một gen đơn lẻ

Trang 12

- Các dòng thuộc thể hệ BC3F3 có độ thuần khá, thuộc nhóm thấp cây, đẻ khoẻ,

tỷ lệ nhánh hữu hiệu cao, chiều dài lá, rộng lá, màu vỏ trấu, màu sắc và hình dạng lá đòng giống với đối chứng Bắc thơm số 7 Trong 16 dòng ở thế hệ BC3F3 được đánh giá

và so sánh với giống đối chứng chúng tôi chọn được 6 dàng là: D3, D4, D7, D10, D12, D15 có chiều dài bông trung bình, tỷ lệ chắc cao, thuộc nhóm hạt nhỏ và năng suất lý thuyết tương đương với giống Bắc thơm số 7

- Qua kết quả phân tích các chỉ tiêu chất lượng chọn được 4 dòng D3, D4, D10, D12 có độ bạc bụng điểm 0, mùi thơm điểm 4 và các chỉ tiêu về tỷ lệ gạo lật, tỷ lệ gạo xát, tỷ lệ gạo nguyên và hàm lượng Protein cao và bằng giống Bắc thơm số 7 Các chỉ tiêu chiều dài hạt gạo, tỷ lệ dài/rộng, độ phân hủy trong kiềm, nhiệt độ hóa hồ và độ bền thể gen tương đương với giống Bắc thơm số 7

Trang 13

THESIS ABSTRACT

Master candidate: Do Thi Thanh Minh

Thesis title: “Evaluating leaf-blight-disease resistance of progeny generations of the

Xa7-introduced Bac Thom 7 cultivar”

Major: Crop Science Code: 60.62.01.10

Education organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA)

Research Objectives

To select potential the lines of rice that integrates both Xa7 and Xa21 genes in the

genome, highly resistant to various strains of Xoo bacteria and retaining agro-biological traits, yield and quality of the Bac Thom 7 cultivar through phenotypic selection and

employing molecular markers

Materials and Methods

- The experiment was arranged sequentially with no replication; the control treatments were: BT7, BT7KBL, IR24, IRBB7, IRBB21

- Screening for rice-leaf-blight resistance genes by molecular markers:

+ DNA extraction method: the total DNA was extracted by the method of TPS

(Monna et al., 2002)

+ PCR: PCR was performed using Eppenlof 25 Master cycler personal

+ Agarose gel electrophoresis: using the method of the Plant Genome Sciences Department, Texas University of Technology, United States (2002)

+ Disease infection and evaluation of rice-leaf-blight resistance in the field: using method of Furuya (2003) in which each individual (a plant of rice) was divided into 3 equal parts, which were then marked with different-colored strings, each string color indicated a strain of bacterium infected to the plants

+ Parameters for monitoring: agro-biological traits were evaluated using the Standard Evaluation System for Rice (IRRI, 2002); testing of ice aroma using the method of Kibria 2008; grain quality indicators were analyzed at the Department of Physiology and Biochemistry (the Institute of Food Crops)

+ Data processing: the morphological parameters were statistically analyzed; parameters of yield components and yield were analyzed by EXCEL

Main findings and conclusions

- The individuals and lines of Xa7-introduced BT7KBL expressed higher

Trang 14

resistance to the disease than those of the BT7KBL control cultivar No individuals or

lines which carried both the 2 genes of Xa7 and Xa21 expressed infection with the 3

infected bacterial strains The BT7KBL cultivar infected in all 3 seasons in the experiment showed resistance response to the strain 3, medial resistance to the strain 5 and infection with the strain 14 The result indicates that presence of various disease resistance genes within a cultivar produced higher resistance to that with a single resistance gene

- The lines of BC3F3 generation achieved fair purity, with small stem length, producing many tillers with high rate of effective ones, leaf characteristics (length, width, color), husk color; color and shape of the flag leaves were similar to those of the control Bac Thom 7 Among 16 lines of the BC3F3 generation which were evaluated and compared with the control cultivar, 6 lines of D3, D4, D7, D10, D12, D15 with average panicle length, high the rate of full kernels, small kernels and theoretical yield equivalent to that of the Bac Thom 7 were selected

- Through quality analysis, 4 lines of D3, D4, D10, D12 with 0 point of chalkiness, 4 points of aromatic flavor, and the amount of brown rice, milled rice, and protein content equivalent to those of the Bac Thom 7 Parameters of kernel length, length / width ratio, decomposition in alkaline environment, gelatinization temperature and gel consistency equivalent to those of the Bac Thom 7

Trang 15

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Cây lúa (Oryza sativa L.) là một trong những loại cây lương thực chính,

cung cấp lương thực cho hơn một nửa dân số trên thế giới Đặc biệt là các quốc gia ở vùng nhiệt đới và Á nhiệt đới như Châu Phi, Châu Mỹ La Tinh và Châu Á Nhu cầu về lương thực không ngừng tăng lên, trong khi diện tích canh tác đang

có xu hướng bị thu hẹp Đây là thách thức lớn đối với vấn đề an ninh lương thực toàn cầu

Ở Việt Nam, lúa là nguồn lương thực chủ yếu cho gần 92 triệu dân Miền Bắc Việt Nam với lợi thế về điều kiện thời tiết khí hậu và đất đai là vựa lúa lớn thứ 2, sau đồng bằng sông Cửu Long về cung cấp lúa gạo cho cả nước Bên cạnh

đó nhu cầu tiêu dùng nội địa đối với gạo chất lượng ngày càng tăng cả về số lượng và chất lượng

Bộ giống lúa thơm ở Việt Nam còn khá đơn điệu, năng suất thấp, chất lượng chưa cao và khả năng thích ứng kém, đặc biệt với một số loại sâu bệnh hại chính như rầy nâu, đạo ôn, bạc lá…do vậy nên sản xuất mang tính rủi ro cao, hiệu quả kinh tế còn thấp, khó mở rộng diện tích Hiện nay, bộ giống lúa thơm chất lượng được trồng chủ yếu ở các tỉnh phía Bắc bao gồm: Bắc thơm số 7, Hương thơm số 1, T10, AC5, TL6…

Bắc thơm số 7 là giống lúa thơm, chất lượng cao có nguồn gốc từ Trung Quốc do xí nghiệp giống lúa Đông Triều – Quảng Ninh nhập về năm 1992, được công nhận giống tháng 1 năm 1998 Đây là giống cảm ôn, có thể gieo cấy được ở

cả vụ Xuân và vụ Mùa nhưng nhiễm rầy, đạo ôn, khô vằn từ nhẹ đến trung bình Đặc biệt nhiễm bạc lá nặng trong vụ mùa

Bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae (Xoo) gây ra là

một trong những bệnh nhiệt đới điển hình gây hại nghiêm trọng đối với nhiều vùng lúa trên thế giới Ở Việt Nam do có khí hậu nhiệt đới gió mùa, là điều kiện thuận lợi cho nghề trồng lúa nhưng đồng thời cũng là điều kiện tốt cho vi khuẩn

Xoo phát triển và gây hại Theo Cục Bảo vệ thực vật – Bộ Nông nghiệp và

PTNT, bệnh bạc lá lúa đang có xu hướng phát triển trong những năm gần đây với mức độ hại gia tăng nhanh trên phạm vi cả nước, đặc biệt là trong vụ mùa và các tỉnh ven biển phía Bắc Bệnh gây ở tất cả các thời kỳ và các bộ phận của cây lúa,

Trang 16

phổ biến nhất là hại bộ lá, đặc biệt là lá đòng vào giai đoạn làm đòng – chín sữa, làm giảm năng suất từ 25% - 50% thậm chí mất trắng Tuy nhiên, hiện nay bệnh bạc lá lúa chưa có thuốc đặc trị, một số thuốc hiện có trong danh mục chỉ sử dụng

để phòng là chính và thường không có hiệu quả triệt để Giải pháp quan trọng nhất để phòng, chống bệnh là sử dụng giống lúa kháng bệnh và áp dụng các biện pháp kỹ thuật canh tác để phòng tránh

Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa nói chung và giống kháng bệnh bạc lá nói riêng được gọi là chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử (MAS – marker assisted selection) MAS là sử dụng chỉ thị phân tử DNA liên kết chặt với locus mục tiêu thay cho chọn lọc đánh giá dựa trên kiểu hình Vì thế, MAS tăng hiệu quả chọn giống hơn phương pháp truyền thống, có thể chọn lọc ngay ở giai đoạn đầu, độ tin cậy cao và không bị ảnh hưởng tác động của môi trường (Collard and Mackill, 2006)

Giống Bắc thơm số 7 kháng bạc lá (BT7KBL) được chọn tạo bằng phương

pháp lai trở lại (backcross) Tuy nhiên, vi khuẩn bạc lá Xanthomonas oryzae pv

Oryzae (Xoo) rất đa dạng về chủng, nòi do vậy tính kháng của một gen là kém

bền vững Thực tế nghiên cứu gần đây cho thấy gen Xa21 đã suy giảm tính kháng tại một số nước như Phillipine, Ấn Độ, Hàn Quốc và Trung Quốc (Lee et al.,

1999, Marella et al., 2001; Xu et al., 2012)

BT7KBL chứa gen Xa21 kháng vừa với chủng số 14 và kháng cao với chủng số 5 và chủng số 3 BT7KBL có các đặc điểm nông sinh học giống như BT7, chất lượng gạo ngon, ổn định Việc tích hợp 2 hay nhiều gen kháng vi khuẩn bạc lá vào một giống lúa nhằm tạo giống lúa kháng bền vững với nhiều chủng bạc lá đang là hướng đi mới cho ngành chọn tạo giống tại Việt Nam cùng với sự hỗ trợ đắc lực của phương pháp chọn tạo giống ứng dụng chỉ thị phân tử (MAS) Xuất phát từ những yêu cầu thực tế trên và kế thừa những thành tựu của

những nghiên cứu đã có chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Đánh giá tính kháng bệnh bạc lá ở các thế hệ lai nhập gen Xa7 vào giống Bắc thơm số 7 kháng bạc lá”

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Chọn ra những dòng triển vọng tích hợp cả 2 gen Xa7 và Xa21 có tính

kháng cao với nhiều chủng, nòi vi khuẩn Xoo mà vẫn giữ được đặc điểm nông sinh học, năng suất, chất lượng, mùi thơm của giống Bắc thơm số 7 thông qua

chọn lọc kiểu hình và chỉ thị phân tử

Trang 17

1.3 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU

- Đối tượng nghiên cứu: Giống Bắc thơm số 7 kháng bạc lá (là giống Bắc

Thơm số 7 đã được tích hợp thành công gen Xa21 bằng phương pháp lai lại với

sự trợ giúp của chỉ thị phân tử)

- Phạm vi nghiên cứu: Đề tài được kế thừa nghiên cứu lai chuyển gen Xa7

vào giống BT7KBL từ thế hệ BC3F1 và đánh giá tới thế hệ BC3F3

1.4 Ý NGHĨA KHOA HỌC

- Kết quả của đề tài là nguồn tài liệu cung cấp thêm thông tin về phương pháp chọn tạo giống mang nhiều gen kháng bệnh bạc lá có sự kết hợp giữa phương pháp truyền thống và phương pháp chỉ thị phân tử ở Việt Nam

- Kết quả nghiên cứu của đề tài bổ sung thêm cơ sở cho định hướng phát triển bền vững cây lúa tại Việt Nam

- Hạn chế việc sử dụng thuốc hóa học trong quá trình sản xuất, góp phần tăng hiệu quả kinh tế trong sản xuất lúa gạo, an toàn hơn cho sức khỏe người sản xuất tiêu dùng và bảo vệ môi trường sinh thái

Trang 18

PHẦN 2 TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

2.1 TÌNH HÌNH SẢN XUẤT LÚA TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 2.1.1 Sản xuất lúa trên thế giới

Lúa là một trong những cây lương thực quan trọng cho hơn một nửa dân số thế giới Theo thống kê của FAO năm 2015, diện tích trồng lúa chiếm tới 164,7 triệu

ha, trong đó Châu Á có 146,5 triệu ha đất trồng lúa chiếm hơn 89 % diện tích, đứng đầu là Ấn Độ và Trung Quốc Châu Phi chiếm khoảng 7 %, Châu Mỹ La Tinh 4 %, Châu Âu và Châu Đại Dương chiếm diện tích rất ít (Hồ Đình Hải, 2010) Mặc dù Châu Âu có rất ít diện tích trồng lúa nhưng do áp dụng các thành tựu khoa học công nghệ tiên tiến vào trong sản xuất nông nghiệp nên năng suất của Châu Âu (6,00 tấn/ha) lại cao hơn so với Châu Á (4,61 tấn/ha) là 1,39 tấn/ha Năng

suất lúa bình quân trên thế giới đạt 4,53 tấn/ha

Bảng 2.1 Tình hình sản xuất lúa gạo ở các châu lục trên thế giới năm 2013

Trang 19

Bảng 2.2 Tình hình sản xuất lúa gạo của một số nước

trên thế giới năm 2013 Nước Diện tích (tr.ha) Năng suất (tấn/ha) Sản lượng (tr.tấn)

so với 2012-2013 do triển vọng vụ Mùa xấu đi ở Trung Quốc và Ấn Độ Dự báo tiêu thụ gạo toàn cầu 2013-2014 sẽ đạt 489 triệu tấn, tăng khoảng 2,6% hoặc 12 triệu tấn so với năm trước (Lin, 2011)

2.1.2 Sản suất lúa gạo ở Việt Nam

Việt Nam là nước có nền văn minh trồng lúa nước lâu đời trên 4.000 năm lịch sử Việt Nam nằm trong vùng địa lý – được xem là khởi nguyên của lúa nước, chạy dài từ chân núi Hi Mã Lạp Sơn cho đến bờ biển Đông, nằm trên kinh tuyến 15 và giữa vĩ độ 8oN – 23oN được chia thành 7 vùng sinh thái nông nghiệp (miền núi phía Bắc, đồng bằng sông Hồng, Bắc Trung Bộ, Nam Trung Bộ, Tây

Trang 20

Nguyên, Đông Nam Bộ và đồng bằng sông Cửu Long) Trong quá trình sản xuất lúa đã hình thành nên 2 vùng sản xuất rộng lớn – đó là vùng đồng bằng châu thổ sông Hồng và đồng bằng châu thổ sông Cửu Long (Bùi Huy Đáp, 1980; Nguyễn Văn Luật, 2001)

Theo tổng cục thống kê, tổng diện tích đất nông nghiệp thời điểm 2013 tại Việt Nam gần 26,37 triệu ha, trong đó diện tích đất sản xuất nông nghiệp gần 10,21 triệu ha, đất trồng lúa hơn 4,10 triệu ha (Tổng cục thống kê, 2013)

Trước năm 1945, diện tích trồng lúa ở 2 đồng bằng Bắc bộ và Nam bộ là 1,8 triệu và 2,7 triệu ha với năng suất bình quân 13 Tạ/ha và sản lượng thóc tương ứng 2,4 - 3,0 triệu tấn (Nguyễn Ngọc Đệ, 2008) Năm 1945 nước ta đang phải đối mặt với nạn đói của thế kỷ, khiến hơn 2 triệu người chết vì đói, nhưng đến nay, bằng mọi nỗ lực Việt Nam đã vươn lên là nước xuất khẩu lúa gạo đứng thứ hai thế giới sau Thái Lan

Bảng 2.3 Tình hình sản xuất lúa gạo của Việt Nam qua các năm

Trang 21

Theo thống kê của FAO năm 2014, trong vòng hơn 10 năm tình hình sản xuất lúa ở nước ta có nhiều diễn biến thay đổi do chiều hướng biến đổi khí hậu toàn cầu và sự thay đổi của thị trường thế giới Qua bảng 2.3 cho thấy diện tích trồng lúa cả nước năm 2000 là 7666,3 nghìn ha, sau đó giảm dần qua các năm do việc chuyển đổi cơ cấu cây trồng và hướng sử dụng đất nông nghiệp Năm 2008 diện tích

và sản lượng đã tăng lên và tới năm 2013 diện tích là 7899,4 nghìn ha, sản lượng là 44076,1 nghìn tấn Sản lượng lúa tăng do đã áp dụng các thành tựu khoa học kỹ thuật vào sản xuất một cách đúng đắn như sử dụng các giống lúa mới, kỹ thuật bón phân hợp lý, đầu tư thâm canh tốt

2.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU, CHỌN TẠO VÀ PHÁT TRIỂN LÚA THƠM 2.2.1 Tình hình nghiên cứu, chọn tạo trong và ngoài nước

Do nhu cầu sử dụng gạo thơm chất lượng cao của con người ngày càng tăng lên nên việc nghiên cứu, chọn tạo và phát triển lúa là một trong những ưu tiên hàng đầu của hầu hết các nước sản suất lúa gạo trên thế giới

Ở Mỹ và nhiều nước sản xuất lúa gạo truyền thống khác thường tập trung khai thác theo hướng năng suất cao với hệ thống tưới tiêu và tăng cường phân bón, nhưng mùi thơm và chất lượng giảm Mỹ cũng phải nhập một khối lượng gạo thơm lớn từ Thái Lan, Ấn Độ, Pakistan (Boriss, 2006)

Từ khi bắt đầu cuộc cách mạng xanh 1960 hầu hết các chương trình chọn giống lúa trên thế giới tập trung vào việc tăng năng suất hạt để đáp ứng nhu cầu lương thực Những năm gần đây, do sản lượng lúa gạo đã đáp ứng nhu cầu về lương thực, đời sống con người nâng cao, nhu cầu về gạo thơm chất lượng tăng mạnh Các nhà khoa học đang nỗ lực cho công cuộc nghiên cứu, chọn tạo và phát triển các giống lúa thơm Ngoài con đường lai tạo theo phương pháp truyền thống, một hướng đi mới với sự trợ giúp của chỉ thị phân tử đã giúp các nhà khoa học chuyển gen chống chịu vào các giống lúa thơm chất lượng có sẵn mà không mất nhiều thời gian như trước đây Mặc dù còn có những hạn chế về kết quả trong cải tiến các giống lúa thơm so với không thơm, nhưng kết quả của các chương trình chọn giống với mục đích cải tạo năng suất cho giống lúa Jasmine ở Thái Lan đã thu được kết quả đáng kể, thành công hơn so với việc cải tiến năng

suất giống lúa Basmati (Toojinda et al., 2005)

Ở khu vực Đông Á còn có nhiều nước trồng lúa chất lượng cao như Indonesia, Hàn Quốc, Đài Loan Các giống lúa ở đây có cơm dẻo, mùi thơm, và

Trang 22

hầu hết là giống bản địa hoặc giống lúa được lai tạo tại các cơ sở nghiên cứu Ấn

Độ, Bangladest, Pakistan là các nước có nguồn gen lúa chất lượng phong phú, đáng chú ý nhất là giống lúa Basmati 370 Hiện nay, các nước này đang tích cực thực hiện chương trình cải tiến giống lúa, tạo ra các giống lúa mới có năng suất, chất lượng cao và mang gen chất lượng của giống Basmati (Abbas, 1998)

Ở Việt Nam, lúa thơm được trồng trên cả 3 miền Bắc, Trung, Nam Miền Bắc đặc trưng với giống lúa Tám, Dự, Bắc thơm số 7, T10, AC5 Chọn tạo giống lúa thơm chất lượng cao phục vụ cho sản xuấ những năm qua đã có mục tiêu, định hướng rõ ràng và được tiến hành ở nhiều cơ quan nghiên cứu trên cả nước như Viện Cây lương thực – Cây thực phẩm, Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện lúa Đồng bằng song Cửu Long, Học việc Nông nghiệp Việt Nam, các công ty giống…Kết quả cũng đã đưa ra được 1 số giống lúa thơm như: HT1, Nàng Thơm, LT2, OM3536, Hương Cốm, M2031…Tuy nhiên, cho đến nay các giống lúa thơm này vẫn còn nhiều hạn chế như: chất lượng chưa cao, khả năng chống chịu sâu bệnh kém, thích ứng hẹp nên độ rủi ro cao Thực tế sản xuất hiện nay cho thấy: các giống lúa thơm được đưa ra nhiều nhưng vẫn không thể mở rộng diện tích sản xuất, chưa thể thay thế giống Bắc thơm số 7, là giống có nguồn gốc

từ Trung quốc đang bộc lộ nhiều hạn chế về năng suất và đặc biệt là khả năng kháng bệnh bạc lá trong vụ mùa Đây vẫn đang là một thách thức lớn đối với các nhà chọn giống lúa ở Việt Nam trong thời gian tới

2.2.2 Chất tạo mùi thơm và di truyền tính trạng mùi thơm

Tại Úc các nhà nghiên cứu đã ứng dụng các chỉ thị phân tử RG28, RM223, RM342 để xác định gen quy định tính trạng mùi thơm fgr trong chọn tạo giống lúa thơm và đã tạo ra được một số giống lúa thơm phát triển cho sản xuất (Garland and Henry, 2001)

Tại Việt Nam, những ứng dụng về chỉ thị phân tử liên kết với gen fgr cũng được sử dụng trong công tác chọn tạo giống lúa thơm Năm 2004, Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí Bửu đã sử dụng chỉ thị phân tử RG28 và RM223 để phát hiện gen thơm Kết quả bước đầu của công tác chọn tạo này là tạo ra được một số dòng lúa thơm triển vọng như OM4900, OM6035, NV1, NV3…

2.2.3 Ảnh hưởng của môi trường đến tính thơm

Mùi thơm phụ thuộc theo mùa vụ gieo trồng, loại đất, địa điểm và độ phì của đất Lúa thơm trồng các vùng sinh thái khác nhau sẽ có độ thơm khác nhau

Sự hình thành và duy trì mùi thơm được gia tăng nếu trong giai đoạn hạt vào

Trang 23

chắc nhiệt độ xuống thấp và phụ thuộc vào biên độ nhiệt Hàm lượng 2-AP còn

bị ảnh hưởng bởi khô hạn Khô hạn trong giai đoạn chín sữa làm tăng hàm lượng 2-AP nhưng khô hạn ở giai đoạn chín vàng thì không tăng và hàm lượng 2-AP tăng cao nhất trong khoảng 4-5 tuần sau trỗ, sau đó giảm dần (Yoshihashi, 2002)

Bahmaniar et al (2007), phân và bón phân cho lúa là cần thiết để tăng

năng suất và sản lượng, bón phân đạm cho lúa thơm sẽ ảnh hưởng đến chất lượng

và hương vị của cơm nấu Mùi thơm, độ mềm cơm, màu sáng trắng, độ dính của gạo Khao Dawk Mali 105 bị ảnh hưởng tỷ lệ cân đối phân đạm với phân khác Nếu bón nhiều kali hơn lượng dùng phổ biến để đạt năng suất tối đa thì sẽ làm tăng mùi thơm và góp phần làm cho hạt gạo sáng hơn nhưng độ mềm cơm giảm Bón tăng lượng kali cũng được nghiên cứu và cho biết đã làm độ bền thể gel cứng lên

2.2.4 Phương pháp đánh giá mùi thơm ở lúa

Mùi thơm của lúa là một trong những đặc điểm quan trọng, những nhà chọn tạo giống đã dùng nhiều phương pháp khác nhau để nhận ra và đánh giá

2.2.4.1 Xác định mùi thơm qua lá

Cắt lá ở giai đoạn 25 ngày sau khi cấy để trong chai thuỷ tinh đun nóng ở 40-500C trong 5 phút, ngửi và phân cấp mùi thơm

Xác định mùi thơm bằng cách lấy 2 lá trên cùng trước khi trổ, lá được cắt nhỏ và đặt vào đĩa petri, cho 10 ml dung dịch KOH 1,7% vào đĩa có chứa mẫu đậy lại lập tức Để đĩa petri trong 10 phút ở nhiệt độ phòng Cuối cùng thử mùi bằng cách ngửi từng đĩa chứa mẫu để xác định mùi thơm

2.2.4.2 Xác định mùi thơm qua hạt gạo

Nhai hạt gạo: lấy nửa hạt phần không chứa phôi nhai thử thơm, phần chứa phôi được đem trồng (Dhulappanavar, 1976)

Theo Jennings (1979) cho vào ống nghiệm 20-30 hạt gạo mới đã xát trắng, thêm 20 ml nước cất Đóng bằng nút cao su và đặt vào nồi chưng có nước đang sôi, để sôi 10 phút (gạo lứt cần nấu 20 phút) Đem ống nghiệm ra để nguội, ngửi

và phân hạng mùi thơm thành 3 cấp: thơm đậm, thơm, thơm nhẹ hoặc không thơm hoặc 4 cấp thơm đậm, thơm, thơm nhẹ và không thơm

Hạt gạo nghiền được xử lý với KOH 1,7% để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút Sau đó đánh giá bằng phương pháp ngửi cảm quan với 4 cấp : không thơm, thơm nhẹ, thơm và thơm đậm (Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí Bửu, 2004)

Trang 24

2.3 NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ BỆNH BẠC LÁ LÚA

2.3.1 Tình hình nghiên cứu bệnh bạc lá ở lúa trong và ngoài nước

Bệnh bạc lá lúa tiếng anh là Bacteral blight được phát triển đầu tiên ở

Nhật Bản khoảng năm 1884 – 1885 Năm 1908, Takaishi đã tìm thấy vi khuẩn trong giọt dịch và lây lại được trên cây lúa Dựa theo kết quả phân lập năm

1911, Bokura đã kết luận triệu chứng do vi khuẩn gây nên Tuy nhiên, đến năm

1926 cây lúa kháng bệnh bạc lá đầu tiên mới được xác định Cây lúa kháng bệnh này được chọn ra từ giống lúa nhiễm bệnh, được đặt tên là Kono 35 Giống này cung cấp gen chống chịu cho nhiều giống lúa ở Nhật Bản Từ đấy nhiều công

trình chọn tạo giống kháng bệnh bạc lá đã được tiến hành (Khush et al., 1989)

Ở Viện Nghiên cứu Lúa Quốc tế, chương trình chọn giống kháng bệnh bạc lá đã đạt được nhiều kết quả Người ta đã đưa ra nhiều dòng, giống kháng bệnh và chúng được trồng rộng rãi ở Châu Á, cung cấp vật liệu kháng bệnh bạc

lá cho các nước như Philippin, Trung Quốc, Ấn Độ, Nepal, Bangladesh, Thái

Lan, Việt Nam, Indonexia, Malaysia…(Khush et al., 1989)

Ở Trung Quốc, nhiều giống lúa kháng bệnh bạc lá đã được sử dụng trong chương trình chọn tạo giống từ những năm 70-80 của thế kỷ 20.Các giống lai với kiểu cây cải tiến, kháng bệnh bạc lá, năng suất cao, phẩm chất tốt đã được tạo ra Khi phân tích di truyền tính chống chịu người ta thấy phần lớn các giống

lai được đặt tên chỉ có gen kháng Xa4

Ở Indonesia, đã sử dụng giống Polita 1/1 do họ tạo ra vào năm 1971 và một số giống lúa khác của Viện Nghiên cứu Lúa Quốc tế làm vật liệu cho nhiều cặp lai kháng bệnh bạc lá Ấn Độ sử dụng nguồn gen kháng bệnh bạc lá từ các giống IR20, IR22, IR26… làm bố mẹ cho nhiều cặp lai Một số giống như IR20

được đưa vào sản suất đại trà ở Ấn Độ (Khush et al., 1989)

Ở Philippin, Reiking (1918) đã mô tả triệu chứng bệnh bạc lá vi khuẩn

nhưng lại nhầm với bệnh đốm sọc vi khuẩn do Xathomonas oryzicola gây nên

nhưng đến năm 1957 hai bệnh này mới được phân biệt với nhau rõ rệt

Như vậy, bệnh bạc lá đã lan rộng và gây hại ở tất cả các nước trồng lúa trên thế giới gồm châu Á, châu Phi và vùng Caribe Bạc lá lúa là một trong các bệnh hại nghiêm trọng nhất trên cây lúa

Công tác nghiên cứu phân lập các chủng nòi vi khuẩn bạc lá được tiến hành thường xuyên tại tất cả các quốc gia nhằm phát hiện ra các chủng vi khuẩn

Trang 25

mới và sự thay đổi độc tính của chúng theo từng quốc gia và điều kiện ngoại cảnh Viện nghiên cứu lúa quốc tế IRRI đã khẳng định được tính chuyên hóa ký

sinh của vi khuẩn Xoo Oryzae trên bộ giống chỉ thị nòi và chia chúng thành 3

nhóm I, II, III tùy theo khả năng gây bệnh của chúng trên các giống lúa nước Tại Philippines xác định được 6 nhóm nòi vi khuẩn, tại Thái lan xác định được 3 nhóm nòi,

Nghiên cứu xác định thành phần các chủng nòi sinh lý có ý nghĩa quan trọng trong công các nghiên cứu phòng chống bệnh bạc lá Nhiều thành tựu trong nghiên cứu bệnh bạc lá đã được công bố rộng rãi và được áp dụng hiệu quả trong sản xuất

2.3.2 Tính phổ biến và tác hại của bệnh bạc lá lúa

Bệnh bạc lá là một trong những đối tượng gây hại chủ yếu của cây lúa nước, có phạm vi phân bố rộng ở Châu Á, Châu Đại Dương, Châu Phi, Bắc Mỹ

và vùng Caribe, xuất hiện gây hại ở hầu hết các quốc gia sản xuất lúa nước có khí hậu nhiệt đới, Á nhiệt đới từ 23o vĩ độ Bắc đến 23o vĩ độ Nam (Ezuka, 2000) Theo Srivastava (2007), ở Ấn Độ bệnh bạc lá làm giảm năng suất lúa từ

16 – 60%, tỷ lệ giảm cao hay thấp phụ thuộc vào một số yếu tố; Trên các giống lúa nhiễm, bệnh phát sinh gây hại giai đoạn lúa làm đòng, trỗ và mưa bão thì tỷ

lệ giảm năng xuất rất cao 60 – 74%, thậm chí là mất trắng Ngược lại, các giống lúa kháng bệnh, bệnh phát sinh sớm giai đoạn lúa đẻ nhánh hoặc quá muộn sau trỗ thì tỷ lệ thiệt hại giảm năng suất rất thấp không đáng kể từ 10- 20% (Mew, 1987) Bệnh bạc lá gây hại giai đoạn lúa làm đòng, trỗ ảnh hưởng nghiêm trọng đến tất cả các yếu tố cấu thành năng suất: Trọng lượng chất khô giảm, bông lúa nhẹ, gẫy, nát, tỷ lệ hạt lép đến 75 – 80%, số hạt trên bông và trọng lượng nghìn hạt đều giảm so với đối chứng Về chất lượng: Hạt gạo dễ gãy, mủn, màu xám đen, vị đắng, hàm lượng tinh bột và protein đều giảm so với đối chứng (Verma, 1977)

2.3.3 Triệu chứng và phương pháp chuẩn đoán bệnh bạc lá lúa

Về triệu chứng bệnh bạc lá lúa: Bệnh bạc lá gây hại từ giai đoạn mạ, lúa

đẻ nhán, làm đòng trỗ, nhưng biểu hiện rõ rệt nhất ở giai đoạn lúa làm đòng trỗ bông: vết bệnh ban đầu là những chấm nhỏ, trong, dạng giọt dầu ở phiến hoặc rìa mép lá, vết bệnh kéo dài theo gân chính hoặc rìa mép lá gây ra hiện tượng héo xanh, lá chuyển dần sang màu xám trắng và co thắt ở gân chính, bộ lá lá xơ xác

kể cả lá đòng Trong điều kiện mưa nhỏ, trời âm u, trên bề mặt vết bệnh xuất hiện

Trang 26

rất nhiều giọt dịch, về sau viên keo vi khuẩn đặc lại có màu vàng trong, sau đó chuyển dần thành màu vàng đậm, màu hổ phách Viên keo có dạng hình cầu tròn, kích thước to, nhỏ rất khác nhau từ 0,5mm đến 2mm (Ezuka, 2000)

Bệnh bạc lá lúa được chia thành hai dạng hình triệu chứng: Bạc lá gợn vàng và bạc lá héo tái xanh (Kresek) Dạng bạc lá gợn vàng biểu hiện rõ nhất trên các lá bánh tẻ, rìa mép lá vùng tiếp giáp với mô bệnh phiến lá vàng đều, ít xuất hiện trên lá nõn và lá già dưới gốc Triệu chứng héo tái xanh thể hiện điển hình trên lá non kể cả lá mạ non và lá đòng, bệnh diễn ra rất nhanh chỉ sau 5-7 ngày, lá héo tái xanh như bị dội nước sôi, vết bệnh kéo dài theo gân lá, phiến lá có màu trắng xám, vết bệnh không có viền vàng, mô lá, phiến lá không bị biến vàng Hai loại hình bệnh bạc lá gợn vàng và héo tái xanh có thể xuất hiện riêng rẽ hoặc cùng xuất hiện trên đồng ruộng (Devadath, 1970)

Trên hạt: Triệu chứng thể hiện ở những vết không màu, xung quanh có viền nước, các vết bệnh còn thấy rõ khi hạt thóc còn non, xanh Khi chín vết bệnh chuyển sang màu vàng xám hoặc vàng nhạt

Theo kết quả nghiên cứu của Bộ môn Bệnh cây – Học viện Nông nghiệp Việt Nam, có hai loại hình triệu chứng của bệnh bạc lá lúa là: bạc lá gợn vàng và bạc lá tái xanh Loại hình bạc lá gợn vàng phổ biến trên hầu hết các giống vụ mùa, còn loại hình bạc lá tái xanh thường chỉ thấy xuất hiện trên một số giống lúa, đặc biệt là các giống ngắn ngày, chịu phân, phiến lá to, có thế đứng như T1, X1, NN27 Ngoài ra theo kết quả nghiên cứu của Viện khoa học Nông nghiệp Việt Nam, khi vi khuẩn xâm nhập vào cây lúa qua rễ và gốc, cây có thể biểu hiện ngay triệu chứng Kresek: lá và toàn bộ cây lúa bị héo (Viện khoa học Nông nghiệp Việt Nam, 2010) Thông thường, gianh giới giữa mô bệnh và mô khỏe được phân biệt rõ ràng, có giới hạn theo đường gợn sóng có màu vàng hoặc không vàng, có khi chỉ là một đường viền nâu đứt quãng hay không đứt quãng Trong điều kiện nhiệt độ, ẩm độ cao, trên bề mặt xuất hiện những giọt dịch vi khuẩn hình tròn nhỏ có màu vàng đục, khi keo đặc quánh có màu nâu hổ phách Bệnh bạc lá lúa thường phát sinh và gây tác hại lớn trong vụ mùa Bệnh có thể phát sinh sớm vào tháng 8, khi lúa làm đòng, trỗ, chín sữa với các trà lúa sớm Đối với các giống lúa mẫn cảm, bệnh thường bị rất sớm và khá nặng, giảm năng suất nhiều Các trà lúa cấy muộn trỗ vào tháng 10 thường bị bệnh nhẹ hơn, tác hại của bệnh cũng ít hơn Nhìn chung, bệnh phát triển mạnh vào giai đoạn cây lúa dễ nhiễm bệnh nhất là lúc lúa làm đòng và chín sữa

Trang 27

Bệnh phát sinh, phát triển mạnh và truyền lan nhanh trong điều kiện nhiệt

độ từ 26- 300C, ẩm độ cao từ 90% trở lên Nhiệt độ đảm bảo cho bệnh phát triển, còn ẩm độ có ý nghĩa quyết định đến đến mức độ bệnh, mưa gió lại tạo điều kiện cho bệnh truyền lan Vì thế mà bệnh thường phát sinh, phát triển mạnh vào khoảng tháng 7- 8, do trong thời gian này, những cơn mưa không những tạo vết thương trên lá mà còn làm cho vi khuẩn sinh sản nhanh, số lượng keo vi khuẩn hình thành nhiều, tạo điều kiện cho sự xâm nhiễm và truyền lan nhanh chóng Chân đất cũng là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự phát sinh, phát triển của bệnh Những vùng đất màu mỡ, nhiều chất hữu cơ bệnh thường phát sinh, phát triển mạnh hơn những vùng đất xấu, cằn cỗi Nơi đất chua, úng ngập hoặc mực nước sâu, đặc biệt là những vùng đất hẩu, nhiều mùn, ruộng lúa bị che bởi bóng cây sẽ bị bệnh nặng hơn

Về yếu tố dinh dưỡng, các dạng đạm vô cơ dễ làm cây lúa nhiễm bệnh mạnh hơn đạm hữu cơ; phân xanh bón vùi cũng làm cho lúa dễ nhiễm bệnh hơn bón phân chuồng ủ hoai mục Ở vụ Xuân, có thể bón đạm với số lượng cao hơn

vụ mùa Bón phân sâu, bón tập trung, bón nặng đầu nhẹ cuối, bón thúc sớm làm cho cây lúa đẻ nhánh tập trung, đẻ nhanh thì bệnh bạc lá sẽ nhẹ hơn so với bón phân rải rác và bón muộn Nếu bón đạm cân đối với lân và kali thì bệnh nhẹ hơn nhiều so với việc bón phân riêng rẽ và mất cân đối Tuy nhiên, với lượng đạm bón 120-150 kg N/ha thì dù có bón thêm lân và kali cũng không còn tác dụng Yếu tố giống: nhìn chung các giống lúa đang trồng trong sản xuất hiện nay đều nhiễm bệnh bạc lá nhưng ở các mức độ khác nhau Bệnh này cũng rất dễ phát sinh thành dịch, nhất là ở những nơi gieo cấy giống nhiễm bệnh Các giống lúa địa phương cũ như Di Hương, Tám Thơm bị bệnh rất nhẹ, còn các giống lúa mới nhập nội có năng suất cao, thấp cây, phàm ăn, phiến lá to thì hầu như nhiễm bệnh tương đối nặng như CR203, DT10 hay một số giống nhập nội từ Trung Quốc như BT7

Theo Ezuka and Kaku (2000), có một số phương pháp chuẩn đoán bệnh bạc lá lúa: Phương pháp giọt dịch chìm của Yoshimurra (1963): Cắt ngang một vài mẩu bệnh dài 5-8 cm phần tiếp giáp giữa mô bệnh và mô khỏe buộc thành một bó nhỏ nhấn chìm vào trong ống nghiệm chứa nước cất hoặc nước máy đặt

cố định trên giá ống nghiệm, sau vài giờ có thể quan sát thấy các dòng vi khuẩn màu trắng đục chảy xuống đáy ống nghiệm tạo thành một lớp màng mỏng màu hơi vàng Sự hình thành dịch vi khuẩn nhiều hay ít phụ thuộc vào lá bệnh và nhiệt độ môi trường Nếu lá bệnh mới, nặng và nhiệt độ môi trường cao 28 –

Trang 28

30oC thì chỉ sau 3-4 giờ quân sát trên bề mặt vết cắt sẽ xuất hiện rất nhiều dòng

vi khuẩn vàng sáng chảy xuống đáy ống nghiệm

Phương pháp để ấm của Tagami et al (1957), (Ezuka, 2000): cắt 3-4 mẩu

lá bệnh dài 5-6 cm đặt trong đĩa petri có chứa giấy lọc ẩm, đậy nắp hộp, sau 4-5 giờ quan sát nếu đúng là bệnh bạc lá có thể thấy sự xuất hiện các giọt dịch vi khuẩn màu trắng đục, màu vàng trong ở 2 đầu mẩu lá bệnh

Phương pháp quan sát bằng kính hiển vi quang học của OTCA, 1970: Cắt một mẩu nhỏ lá bệnh dài 5mm đặt lên lam kính, nhỏ thêm 1-2 giọt nước cất, đậy lamen để ở nhiệt độ phòng trong vài giờ sau đó quan sát bằng kính hiển vi sẽ có thể thấy nhiều chấm nhỏ màu vàng rơm nhạt xuất hiện ở hai đầu vết cắt lá bệnh

2.3.4 Tác hại của bệnh bạc lá lúa ở Việt Nam

Ở Việt Nam, bệnh bạc lá lúa đã thực sự gây tác hại từ lâu trên các giống lúa mùa cũ, nhưng đặc biệt từ những năm 1965-1966 trở lại đây, bệnh thường xuyên phá hoại nghiêm trọng trên các giống lúa mới nhập nội có năng suất cao ở vụ Xuân, nhất là vụ Mùa

Mức độ tác hại của bệnh phụ thuộc vào giống, thời kỳ cây bị bệnh sớm hay muộn và mức độ bị bệnh nặng hay nhẹ Năm 1970 trên diện tích lúa mùa cũ cấy giống Nông Nghiệp 8 bị bệnh ở mức độ 60 - 100%, giảm năng suất từ 30 - 60% Theo báo cáo của Phòng Bệnh cây thì tác hại của bệnh càng lớn khi mức độ của bệnh càng nặng (Lê Lương Tề, 1986)

Điều cần chú ý là mức độ tác hại của bệnh phụ thuộc vào thời kỳ bị bệnh, nếu cây lúa bị bệnh ngay từ khi đẻ nhánh thì mức độ của bệnh về sau thường rất nặng, ảnh hưởng rõ rệt hơn tới năng suất, có thể giảm tới 41% năng suất trở lên (Lê Lương Tề, 1987)

2.3.5 Những nghiên cứu về vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa

2.3.5.1 Đặc điểm hình thái, đặc điểm hoá sinh

Vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae có dạng hình gậy, hai đầu hơi

tròn, có một lông roi ở một đầu, kích thước 1-2 x 0,5-0,9 µm Trên môi trường nhân tạo, khuẩn lạc của vi khuẩn có dạng hình tròn, màu vàng sáp, rìa nhẵn, bề mặt khuẩn lạc ướt, háo khí, nhuộm gram âm Vi khuẩn không có khả năng phân giải nitrat, không dịch hoá gelatin, không tạo NH3, indol, nhưng tạo H2S, tạo khí nhưng không tạo axit trong môi trường có đường Nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn sinh trưởng là từ 26-30 oC, nhiệt độ tối thiểu 0-5oC, nhiệt độ làm vi khuẩn

Trang 29

chết là 53 oC Vi khuẩn có thể sống trong phạm vi pH khá rộng từ 5,7-8,5, thích

hợp nhất là pH 6,8-7,2 (Lê Lương Tề, 1987)

2.3.5.2 Đặc điểm truyền lan và bảo tồn

Vi khuẩn xâm nhập có tính chất thụ động, có thể xâm nhập qua thuỷ

khổng, khí khổng ở trên chóp lá, mép lá, đặc biệt qua vết thương cơ giới khi tiếp

xúc với bề mặt có màng nước, vi khuẩn dễ dàng di động, xâm nhập vào bên trong

và theo các bó mạch lan rộng đi Trong điều kiện mưa ẩm, thích hợp cho sự phát

triển của vi khuẩn, trên bề mặt vết bệnh tiết ra những giọt dịch vi khuẩn Thông

qua sự va chạm giữa các lá lúa, bệnh có thể truyền lan Tuy bệnh bạc lá có cự ly

truyền lan hẹp song còn tuỳ thuộc vào điều kiện mưa bão xảy ra vào cuối vụ

chiêm và trong vụ mùa mà bệnh có thể truyền lan tới phạm vi không gian tương

đối rộng Về nguồn bảo tồn của bệnh, có nhiều ý kiến khác nhau được đưa ra

Các tác giả Nhật Bản cho rằng, nguồn bệnh tồn tại chủ yếu trên một số cỏ dại họ

hoà thảo Một số tác giả Trung Quốc lại cho rằng nguồn bệnh chủ yếu của bệnh

là trên hạt giống Còn ở Việt Nam, nguồn bệnh bạc lá tồn tại ở hạt giống và tàn

dư cây bệnh là chủ yếu Ngoài ra nó cũng bảo tồn ở dạng viên keo trên các cây

cỏ dại như: cỏ lồng vực, cỏ môi, cỏ lá tre, cỏ tranh, cỏ gừng bò, cỏ gà nước (Vũ

Triệu Mân, 2007)

2.3.6 Các chủng vi khuẩn gây bệnh

Theo Phan Hữu Tôn (2005), ở các tỉnh phía Bắc Việt Nam đã thu thập và

phân lập được 7 chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá ở các giống lúa phổ biến được

trồng tại các vùng sinh thái

Bảng 2.4 Các chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá phổ biến ở các

tỉnh phía Bắc Việt Nam Chủng Ký hiệu các Isolate Thu thập từ giống Điểm thu thập mẫu bệnh

Nguồn: Phan Hữu Tôn và Bùi Trọng Thủy (2003)

Trang 30

Năm 2003, Phan Hữu Tôn và cs đã phân lập 412 chủng (isolate) vi khuẩn gây bệnh bạc lá được thu thập trên 39 giống lúa trồng ở 19 tỉnh phía Bắc Bằng

sử dụng chỉ thị phân tử XORF và XOR phản ứng với các dòng đẳng gen, nhóm tác giả đã phân lập được 12 nhóm chủng vi khuẩn Trong đó, chủng 2 và chủng 3

là chủng phổ biến nhất,chủng 3, 4, 11, 12 là chủng có độc tính mạnh nhất

2.4 CÁC GEN KHÁNG BẠC LÁ

Cùng với việc xác định nguồn vi khuẩn gây bệnh thì việc tìm ra nguồn gen kháng ở cây lúa với các chủng vi khuẩn gây bệnh đó là vô cùng cần thiết giúp cho công tác chọn tạo giống lúa kháng bệnh bền vững cho từng vùng sản xuất Những nghiên cứu có tính chất hệ thống về gen kháng bệnh bạc lá lúa được thực hiện tại Nhật Bản vào đầu thập kỷ 60 Cho đến những năm 80 của thế kỷ XX, Viện Nghiên cứu Lúa Quốc tế đã xác định bản chất di truyền tính kháng bệnh là do gen quy định (Mew, 1987)

Gen Xa21 là gen kháng trội nằm trên nhiễm sắc thể số 11 và là gen kháng bạc lá đầu tiên được phân lập và xác định chức năng gen Gen Xa21 là

một thành viên của một họ đa gen, mã hoá cho 1 protein tương tự kinaza thụ

cảm (Song et al., 1995; Song et al., 1997) Gen Xa21 là gen kháng hiệu quả với

nhiều chủng vi khuẩn bạc lá và được nhiều nơi sử dụng làm nguồn cho gen

kháng trong chương trình chọn tạo giống lúa kháng bạc lá Gen Xa21 cũng là

gen kháng bạc lá đầu tiên được thiết kế vectơ để biến nạp vào cây lúa Đến nay, rất nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới đã thu được cây lúa chuyển

gen kháng bạc lá Xa21

Một số tác giả Trung Quốc tiến hành lập bản đồ vật lý cho 1 gen ở giống

lúa Zhenhui 084 cùng alen với Xa7 (Zhang et al., 2009) Gen Xa7 biểu hiện tính kháng rộng đối với nhiều chủng vi khuẩn bạc lá (Vera Cruz et al., 2000) Giống lúa mang gen kháng Xa7 được thử nghiệm tính kháng bạc lá trong 11

năm (22 vụ) liên tiếp với 1 chủng vi khuẩn bạc lá Sau 22 vụ liên tiếp, thành phần quần thể vi khuẩn thay đổi, trong đó nhóm gây độc tăng lên Mặc dù vậy,

gen Xa7 vẫn tỏ ra kháng khá hiệu quả đối với vi khuẩn bạc lá, nhất là khi nhiệt

độ môi trường tương đối cao, trong khi các gen kháng khác dường như không chịu sự ảnh hưởng của nhiệt độ, hoặc giảm tính kháng ở nhiệt độ cao

(Webb et al., 2010) Do vậy gen Xa7 được nhiều nơi sử dụng làm nguồn cho

(donor) gen kháng bạc lá

Trang 31

Nghiên cứu về tính kháng bệnh bạc lá ở một số gen kháng thấy rằng Xa7

và Xa21 là gen kháng bền ở nhiều nước châu Á (Vera Cruz et al., 2000; Webb et

al., 2010; Zhang et al., 2009)

Ở Việt Nam, một số gen kháng bệnh bạc lá đã được tìm thấy trong các giống lúa địa phương ở các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long và các tỉnh phía Bắc

như : gen Xa2 được tìm thấy trên giống lúa Tẻ Tép, xa5 ở giống lúa Ba Túc, Giòng Đôi, xa13 tìm thấy ở giống Cà Đung, Ba Túc, Thơm Lùn, Vệ Phích, Nếp

hoa vàng, Nàng Sớm (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2000)

Về tính kháng của các gen kháng bệnh bạc lá, Trần Bích Lan và cs (2001)

cho rằng tổ hợp 2-3 gen trong số các gen xa5, Xa7, Xa21 có thể chống chịu được

hầu hết các nòi bạc lá ở Đồng bằng Bắc Bộ Các gen này đều đã được lập bản đồ phân tử và các chỉ thị liên kết chặt chẽ với gen này được sử dụng trong việc tích hợp các gen kháng bạc lá vào lúa

Phan Hữu Tôn và Bùi Trọng Thủy (2003) khi nghiên cứu khả năng kháng bệnh của các dòng chỉ thị chỉ chứa một gen kháng đối với 7 chủng vi khuẩn bạc

lá ở miền Bắc cho thấy gen Xa4 kháng được 7/7 chủng, các gen xa5, Xa7 và

Xa21 kháng tốt hoặc kháng cao với 7 chủng này Các gen còn lại kháng rất kém

hoặc không kháng với 7 chủng vi khuẩn trên

Vũ Hồng Quảng và cs (2011) đã thành công khi sử dụng các chỉ thị

RM5509 và pTA248 để phát hiện gen kháng bạc lá tương ứng ở Xa7, Xa21 ở

các dòng bố mẹ 9311BB, R308BB Kết quả cho thấy dòng bố R308BB có 90%

số cá thể mang gen kháng Xa21 đồng hợp tử, 10% số cá thể mang gen dị hợp

tử ; dòng bố 9311BB có 100% số cá thể mang gen Xa7 đồng hợp tử Các gen

này có khả năng kháng cao với các chủng vi khuẩn gây bệnh phổ biến ở các tỉnh

phía Bắc Ngoài ra, gen Xa4 và Xa7 còn có khả năng kháng tốt với các chủng vi khuẩn gây bệnh trên các giống lúa ở đồng bằng sông Cửu Long (Hoang et al., 2010) Với những kết quả này thì các gen kháng Xa4, xa5, Xa7 và Xa21 đã được

sử dụng làm gen mục tiêu trong chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá cho các tỉnh phía Bắc

Như vậy hiệu lực của các gen kháng bạc lá đối với các nòi vi khuẩn bạc

lá phân lập ở các vùng khác nhau là không giống nhau - một gen có thể kháng với nòi bạc lá ở vùng này nhưng lại nhiễm với nòi ở vùng khác Để tạo ra giống lúa kháng bền vững với bệnh bạc lá, cần thiết phải tích hợp vài gen kháng hiệu quả vào 1 giống lúa

Trang 32

2.5 ĐẶC ĐIỂM CỦA CÁC DÒNG LÚA ĐẲNG GEN LÀM CHỈ THỊ

Trên thế giới, đã có nhiều kết quả ứng dụng chỉ thị phân tử DNA thành công trong chọn tạo giống lúa kháng bệnh Việc sử dụng chỉ thị phân tử hỗ trợ xác định cá thể nhận trong lai quy tụ, lai backcross (MABC) và sử dụng chỉ thị phân tử trong chọn lọc (MAS) giúp cho tạo giống lúa mang một hay nhiều gen kháng bệnh mong muốn

Tại IRRI, sử dụng MABC trong lai quy tụ đã tạo được dòng đẳng gen mang các gen kháng trên nên di truyền của giống IR24, đây là nguồn vật liệu quý phục

vụ cho công tác chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá ở nhiều quốc gia trên thế giới Gần đây các nhà nghiên cứu thuộc IRRI đã tiến hành lai quy tụ nhiều gen

kháng vào cùng một dòng lúa, như dòng IRBB64 mang 4 gen Xa4, xa5, Xa7,

Xa21; dòng IRBB63 mang các gen xa5, Xa7 và xa13 (Le et al., 2006)

Trong bộ 12 dòng lúa chuẩn của Viện Nghiên cứu lúa quốc tế để xác định

các nhóm nòi (nòi) vi khuẩn X oryzae, trong đó có giống IR24 không chứa gen

kháng bạc lá, nó luôn luôn được sử dụng làm giống đối chứng chuẩn nhiễm Các

dòng khác đều chứa các Xa - số thứ tự (Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, 2000)

Viện nghiên cứu lúa IRRI đã xây dựng 3 bộ dòng đẳng gen kháng bệnh bạc

lá lúa chứa các gen kháng theo loài phụ như sau:

IR24 (Indica): IRBB1, IRBB2, IRBB3, IRBB4, IRBB5, IRBB7, IRBB8,

IRBB10, IRBB11, IRBB14, IRBB21

Milyang 23 (Javanica): IRBB101, IRBB111

Toyonshiki (Japonica): IRBB201, IRBB211

2.6 NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ PHƯƠNG PHÁP LÂY BỆNH NHÂN TẠO VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH KHÁNG BỆNH BẠC LÁ CỦA CÁC GIỐNG LÚA

Việc nghiên cứu các nòi (Race) vi khuẩn X oryzace gây bệnh bạc lá lúa

và đánh giá tính kháng của các giống lúa chọn lọc để sử dụng trong sản xuất là

cơ sở quan trọng gần như bắt buộc phải làm trong quá trình chọn tạo giống kháng bệnh trong sản xuất Vì vậy, từ trước đến nay việc nghiên cứu các phương pháp

để đánh giá tính kháng bệnh bạc lá của các giống lúa đã được tập trung nghiên cứu ngày càng hoàn chỉnh và có hiệu quả cao hơn

Trang 33

Ngay từ năm 1956, Phương Trung Đạt ở Trung Quốc đã sử dụng phương

pháp lây bệnh nhân tạo vi khuẩn X oryzae bằng cách phun dung dịch vi khuẩn

lên mạ Ngâm rễ mạ trong dung dịch vi khuẩn trong 3 – 6 giờ, sau này một số tác giả khác cũng đã sử dụng các phương pháp lây bệnh nhân tạo bệnh bạc lá lúa khác nhau (Zargoza and Mew, 1979) nhưng vẫn giữ nguyên tắc chung là gây vết thương cơ giới Hiện nay, tất cả các nghiên cứu về cách đánh giá tính kháng bệnh bạc lá lúa đều căn cứ vào phương pháp chuẩn của Kauffman (IRRI, 1974, 1998) Phương pháp lây bệnh nhân tạo này có thể tóm lược như sau: Lây bệnh nhân tạo bằng cắt kéo đã được nhúng trong dung dịch vi khuẩn 108 FU/ml, cắt tất

cả các đầu chóp lá dài 3-5cm giai đoạn lúa làm đòng trỗ bông hoặc tương ứng 65-70 ngày sau cấy của tập đoàn giống lúa định khảo sát và chỉ lấy 1 dảnh/khóm Đánh giá sau 18-21 ngày lây bằng chiều dài vết bệnh trung bình (cm), tỷ lệ chiều dài vết bệnh/chiều dài lá lúa từ đó phân cấp bệnh theo thang 9 cấp điểm: 0, 1, 3,

5, 7 và 9 tương ứng với mức kháng kí hiệu là: Cấp 0-1 (R); Cấp 1 (R); Cấp 3 (MR); Cấp 5 (MS); Cấp 7 (S); và cấp 9 cao nhất có kí hiệu là HS (Nhiễm bệnh rất nặng)

Để cụ thể và đơn giản hóa cách đánh giá tính kháng bệnh bạc lá của các giống lúa khảo sát, nhiều tác giả phân chia mức độ phản ứng thành 3 cấp căn cứ vào chiều dài vết bệnh trung bình (cm) giai đoạn lúa làm đòng - trỗ bông, đó là:

TT Chiều dài vết bệnh trung bình (cm) Phản ứng kháng, nhiễm bệnh K ý hiệu

2 Chiều dài vết bệnh 8,0 - 12,0cm Kháng trung bình M

2.7 NGHIÊN CỨU VỀ CHỈ THỊ PHÂN TỬ VÀ ỨNG DỤNG CỦA CHỈ THỊ PHÂN TỬ

2.7.1 Khái niệm chỉ thị phân tử

Nghiên cứu đa dạng di truyền đã được thực hiện từ khá lâu với nhiều phương pháp tiếp cận khác nhau như chỉ thị hình thái (thông qua các dữ liệu kiểu hình), chỉ thị sinh hóa (thông qua thành phần protein và hoạt chất) và chỉ thị phân

tử DNA (thông qua sự đa hình của các phân tử DNA) Trong đó, chỉ thị hình thái

Trang 34

được sử dụng sớm nhất và là cơ sở ban đầu trong đánh giá phân loại sinh vật Trong những năm gần đây, chỉ thị phân tử DNA đã được đưa vào sử dụng phổ biến trong chọn tạo giống trên nhiều đối tượng cây trồng theo các mục tiêu khác nhau: năng suất, chất lượng, ngắn ngày, chống chịu điều kiện vất thuận và sâu bệnh hại Với những kết quả đã đạt được vai trò của chỉ thị phân tử được khẳng định như là một công cụ mới giúp cho công tác chọn tạo giống cây trồng có hiệu quả cao hơn, chính xác hơn và nhanh hơn

Chỉ thị phân tử DNA là những chỉ thị có bản chất là đa hình DNA Nó có thể là những dòng phân tử DNA được lưu trữ (đoạn DNA đứng riêng hoặc nằm trong plasmid, thư viện λ, BAC, YAC ) hay dưới dạng thông tin về trình tự được lưu giữ trong máy tính hay trên mạng internet (ví dụ như trình tự các mồi SSR, STS, RAPD, AFLP )

2.7.2 Một số chỉ thị phân tử DNA được sử dụng phổ biến trong nghiên cứu

di truyền và chọn tạo giống lúa

* Chỉ thị dựa trên cơ sở lai DNA: Chỉ thị đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn - RELP (Restriction Fragment Length Polymorphism)

Ở lúa, chỉ thị RELP được sử dụng nhiều trong lập bản đồ QTLs cho các tính

trạng chất lượng và năng suất lúa (Lin et al., 1994; 1995), các gen kháng bệnh bạc lá (Yoshimura et al., 1992) và nhiều gen khác như gen kháng bệnh đạo ôn,

gen kháng rầy, gen chịu mặn, chịu hạn…

Chỉ thị RELP là chỉ thị đồng trội, có khả năng biểu hiện tất cả các alen của cùng một locus gen, do vậy có thể phân biệt được các cá thể đồng hợp tử và dị hợp tử Đây là đặc điểm ưu việt của chỉ thị RELP, nhưng hạn chế của phương pháp này là tốn nhiều thời gian, đòi hỏi nhiều trang thiết bị phòng thí nghiệm và cần một lượng lớn DNA

* Chỉ thị phân tử dựa trên kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng phân (Polymerase Chain Reaction - PCR)

Kỹ thuật PCR được Kary Mullis phát hiện năm 1985 và đã nhanh chóng được sử dụng ở hầu hết các phòng thí nghiệm trên toàn thế giới Phản ứng dựa trên nguyên tắc tổng hợp DNA nhờ enzyme DNA polymerase chịu nhiệt với sự

có mặt của đoạn DNA khuôn mẫu, DNA mồi và các nucleotit, Mg2+ Hai sợi DNA mới tạo thành sẽ trở thành khuôn cho chu kỳ tiếp theo Sau mỗi chu kỳ số lượng DNA được tăng lên gấp đôi, đến khoảng 35-40 chu kỳ thì chu trình PCR

Trang 35

kết thúc (Saiki and Gelfand, 1989) Phản ứng PCR thường được đặt từ 30-35 chu

kỳ để đảm bảo sản phẩm PCR được nhìn rõ trên các thiết bị đọc (điện di trên nền gel agarose hoặc polyacrylamide) Tùy theo bản chất của các đoạn mồi được sử dụng mà có những hệ thống chỉ thị đặc trưng gồm chỉ thị STS, RAPD, SSR, AFLP, SNP

Số locus đa hình

Khả năng tự động

Chỉ thị SSR (Simple Sequence Repeats) còn gọi là chỉ thị vi vệ tinh (microsatellite) (Litt and Luty, 1989), là chỉ thị nghiên cứu đa hình những đoạn DNA lặp lại đơn giản, đơn vị lặp từ 1-6 nucleotit Bản chất đa hình của SSR được sinh ra do sự nhân bội từ DNA tổng số của hệ gen nhờ sử dụng 2 đoạn mồi chặn biên 2 đầu với trình tự của vùng lặp lại Giá trị của SSR ở chỗ là nó sinh ra đa hình từ rất nhiều vùng tương ứng, bao phủ rộng khắp hệ gen và phân biệt được trạng thái alen khác nhau của gen (chỉ thị đồng trội), có thể phân biệt được đồng hợp tử và dị hợp tử, dễ dàng phát hiện bằng PCR Hiện nay, nghiên cứu sàng lọc (screening) thư viện genome lúa cho thấy có khoảng 25.000 chỉ thị SSR Chỉ thị này được sử dụng nhiều trong nghiên cứu đa dạng di truyền, tìm

chỉ thị liên kết và lập bản đồ gen với độ chính xác cao và tiết kiệm chi phí (Li et

al., 2001)

2.7.3 Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống lúa kháng bệnh bạc lá

Cùng với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ chỉ thị phân tử, một quy trình công nghệ chọn giống mới được ra đời, đó là quy trình chọn giống nhờ sự trợ giúp của chỉ thị phân tử (Marker-Assisted Selection - MAS) Thông thường, trong quy trình chọn tạo giống truyền thống, người ta đưa nguồn gen

Trang 36

mới có tính trạng mong muốn vào 1 giống khác bằng phương pháp hồi giao liên tục qua nhiều thế hệ, hoặc chọn lọc cá thể trong quần thể phân ly từ thế hệ F2 đến các thế hệ tiếp theo Mỗi gen chính thường chỉ kháng được với 1 chủng gây bệnh hoặc nòi gây hại nào đó, do vậy nếu tích hợp được vài gen kháng vào một dòng hoặc giống lúa thì sẽ tạo ra được 1 dòng lúa kháng được với nhiều chủng gây bệnh hoặc nhiều nòi gây hại Như vậy muốn tạo ra giống lúa kháng bền vững đối với dịch hại, người ta phải đưa được vài gen kháng hiệu quả cao vào

“genom đích” Bằng phương pháp chọn giống truyền thống, việc đưa gen lặn vào tổ hợp lai, hoặc du nhập cùng một lúc vài gen mong muốn vào “genom đích” (tích hợp nhiều gen vào 1 dòng ưu việt) thường gặp rất nhiều khó khăn hoặc đôi khi không thể thực hiện được Còn đối với quy trình MAS, nhiều tác giả cho rằng thay vì đánh giá kiểu hình các cá thể con lai để chọn ra cá thể mang gen mới du nhập, người ta xác định các cá thể mang gen mới du nhập một cách gián tiếp, thông qua chỉ thị phân tử liên kết chặt với gen đó

Chọn tạo và sử dụng giống kháng bạc lá kết hợp với chỉ thị phân tử đã được nhiều nước trên thế giới nghiên cứu và tiến hành Điểm qua một số nét về tình hình nghiên cứu bệnh bạc lá chúng ta thấy các nhà khoa học đã đạt được một số thành công đáng khích lệ

Viện Nghiên cứu Lúa Quốc tế đã đưa các gen kháng được với nhiều chủng

bạc lá xa5, xa13 và Xa21 vào các giống lúa “Kiểu cây mới” (New Plant Type)

IR65598-112, IR65600-42 và IR65600-96 nhằm tạo ra các giống lúa cho năng

suất siêu cao và kháng bền vững với bệnh bạc lá (Sanchez et al., 1997) Các nhà

khoa học ở Trường Đại học Nông nghiệp Hoa Nam đã tiến hành nghiên cứu đa

hình alen của các chỉ thị phân tử liên kết với các gen xa5, xa13 và Xa21 nhằm

mục tiêu sử dụng chúng trong chương trình chọn giống lúa kháng bạc lá

(Ramalingam et al., 2001) Các tác giả Trung Quốc (Caol et al., 2003) đã lai chuyển thành công gen kháng bạc lá Xa21 vào dòng phục hồi (lúa lai) R8006

nhờ chỉ thị phân tử Dòng lúa này cho khả năng kháng đạo ôn, kháng bạc lá tốt và đang được trồng thử nghiệm

Đối với các giống lúa Japonica canh tác tại Hàn Quốc, dòng pyramid với tổ hợp 3 gen kháng (Xa4 + xa5 + Xa21) tỏ ra kháng rất hiệu quả với tất cả các chủng vi khuẩn bạc lá, kể cả chủng độc K3a mới phân lập Tổ hợp 3 gen kháng

này dường như có biểu hiện thêm hiệu ứng kháng bổ trợ số lượng (quantitative complementation Kết quả này đưa ra một chiến lược mới trong

chọn tạo giống lúa Japonica có phổ kháng rộng đối với các chủng bạc lá Các

Trang 37

nhà khoa học Hàn Quốc còn sử dụng các chỉ thị phân tử STS và SNP liên kết

với các gen kháng Xa1, Xa4, xa5, xa13 và Xa21 trong chọn tạo giống lúa thơm kháng bạc lá (Kim et al., 2009)

Tại Việt Nam, chọn tạo giống lúa lai hai dòng kháng bệnh bạc lá của trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội với phương pháp lai giữa dòng bất dục

103S và dòng phục hồi chứa gen kháng bệnh bạc lá đã tạo ra các tổ hợp lai như Việt Lai 20, Việt Lai 24, so với đối chứng Bồi Tạp Sơn Thanh thì các giống đó

có thời gian sinh trưởng ngắn hơn từ 7 - 10 ngày, năng suất khá, kiểu cây bán

lùn, mang gen kháng bệnh bạc lá Xa21

Theo kết quả nghiên cứu của Phan Hữu Tôn năm 2005, áp dụng kỹ thuật chỉ thị phân tử đã xác định được trong 145 giống địa phương nghiên cứu có 12

giống chứa gen xa5, không có giống nào chứa gen xa13 và Xa21 Bốn gen Xa3,

Xa4, xa5 và Xa10 đều có mặt trong các giống lúa địa phương của Việt Nam với

tần suất khá ngang nhau, trong đó chỉ có xa5 là kháng được hầu hết các nòi

phân lập hiện tại (Phan Hữu Tôn, 2005) Các tác giả của Trường Đại học Nông

nghiệp Hà Nội đã điều tra sự hiện diện của gen Xa7 trong 120 giống lúa địa

phương thu từ các tỉnh vùng núi phía Bắc, kết quả phát hiện có 8 giống chứa

gen Xa7 (Phan Hữu Tôn và cs., 2005)

Tác giả Nguyễn Văn Viết và cs (2008) đã tiến hành đánh giá đặc tính kháng bệnh bạc lá, cũng như sàng lọc (bằng chỉ thị phân tử) các gen kháng bạc

lá ở 89 giống lúa địa phương Kết quả cho thấy có 18 giống mang gen Xa4, có 1 giống mang gen xa5, có 4 giống mang gen Xa7, không có giống lúa nào mang gen Xa21

R308BB có 90% số cá thể của mang gen kháng Xa21 đồng hợp tử, 10% số cá thể

mang gen dị hợp tử; dòng bố D42BB có 10% số cá thể mang gen kháng dị hợp

tử, dòng bố 9311BB có 100% số cá thể mang gen Xa7 và tất cả các cá thể này đều đồng hợp tử về gen Xa7

Về tính kháng của các gen kháng bệnh bạc lá, những nghiên cứu ở Việt

Trang 38

Nam trước kia đã cho thấy rằng tổ hợp 2-3 gen trong số các gen xa5, Xa7,

Xa21 có thể chống chịu được hầu hết các nòi bạc lá ở đồng bằng Bắc Bộ Các

gen này đều đã được lập bản đồ phân tử và các chỉ thị phân tử liên kết chặt với các gen này được sử dụng trong việc tích hợp gen kháng bạc lá vào lúa (Trần Bích Lan và cs., 2001) Các tác giả ở Đại học Nông nghiệp, khi nghiên cứu khả năng kháng bệnh bạc lá của các dòng chỉ thị (tester) chứa

đơn gen kháng (Xa1, Xa2, Xa3, Xa4, xa5, Xa7, Xa10, Xa11, Xa14, Xa21) đối với 7 chủng vi khuẩn bạc lá ở miền Bắc, cho thấy gen Xa4 kháng được với 5/7 chủng, các gen xa5, Xa7 và Xa21 kháng tốt hoặc kháng cao với tất cả 7/7

chủng Các gen còn lại kháng rất kém hoặc không kháng với 7 chủng bạc lá trên (Phan Hữu Tôn và Bùi Trọng Thuỷ, 2003) Các nghiên cứu tiếp theo về khả

năng kháng của tổ hợp 2-3 gen kháng (tổng số có 9 gen kháng Xa1, Xa2, Xa3,

Xa4, xa5, Xa7, Xa10, Xa11, Xa14 được thử nghiệm) đã được tiến hành Nếu

trong tổ hợp 2-3 gen có chứa gen xa5 hoặc Xa7, tổ hợp đó kháng cao đối với các chủng bạc lá Các tổ hợp với các gen khác ngoài xa5 hoặc Xa7 đều kháng rất

kém đối với các chủng bạc lá (Bùi Trọng Thuỷ và Phan Hữu Tôn, 2004)

Trang 39

PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

3.1.1 Các dòng, giống sử dụng làm vật liệu

Vật liệu gồm 10 dòng và 5 giống đối chứng do Viện nghiên cứu và Phát triển cây trồng cung cấp được trình bày trong bảng 3.1

Bảng 3.1 Các dòng, giống được sử dụng làm vật liệu nghiên cứu

+ Đối chứng 2 (Bắc Thơm số 7 kháng bạc lá): Đây giống Bắc thơm số 7 đã

được lai chuyển gen Xa 21 thành công bằng phương pháp lai trở lại giữa hai

giống Bắc Thơm số 7 (giống nhận gen) và dòng cho gen là dòng đẳng gen

Trang 40

IRBB21, quá trình chọn lọc có sự kết hợp với đánh giá tính kháng bạc lá bằng

phương pháp lây nhiễm nhân tạo trên đồng ruộng và sự trợ giúp của chỉ thị phân

tử Bắc Thơm số 7 KBL chỉ khác giống Bắc Thơm số 7 về đặc tính kháng bệnh

bạc lá còn các đặc điểm về hình thái, nông, sinh học, chất lượng cơm gạo tương

tự như giống Bắc Thơm số 7

+ Đối chứng 3 (IR24): là giống chuẩn nhiễm bệnh bạc lá nhập nội từ IRRI

+ Đối chứng 4 (IRBB21): là dòng đẳng gen chứa gen kháng bệnh bạc lá

Xa21

+ Đối chứng 5 (IRBB7): là dòng đẳng gen chứa gen kháng bệnh bạc lá Xa7

3.1.2 Các marker sử dụng để kiểm tra sự có mặt của gen kháng bệnh bạc lá

5’ ATA TTC ACC AAA TCA TTC CCT C 3’

Yan-chang Luo,2004

3.1.3 Các chủng vi khuẩn bạc lá sử dụng để lây nhiễm

- Các chủng bạc lá được thu thập, phân lập tại Viện nghiên cứu và Phát

triển cây trồng - Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Quá trình đánh giá chúng tôi sử dụng 3 chủng đại diện cho tính kháng tại

Địa điểm thu mẫu giống nhiễm bệnh

Ngày thu mẫu

2 Race 5 HUA 014042-3 Thái Xuyên Xã Quảng Châu-

Quảng Xương-Thanh Hóa 10/10/2014

3 Race 14 HUA 013031-1 Bắc Thơm số 7 Xã Minh Tân-

huyện Vụ Bản - Nam Định 13/09/2013

Định dạng
Số trang	129
Dung lượng	2,71 MB