KỸ THUẬT KIỂM SOÁT CHẤT LƯỢNG sản PHẨM NECTAR QUẢ ĐÓNG hộp

TIÊU CHUẨN CHO NGUYÊN LIỆUĐể sản phẩm đạt được chất lượng tốt thì ban soạn thảo Quy chuẩn kỹ thuật quốcgia về vệ sinh an toàn thực phẩm đối với đồ uống biên soạn QCVN 6-2:2010/BYT quyđịn

LỜI CẢM ƠN

Em xin chân thành gởi lời cảm ơn đến Ban Giám Hiệu nhà trường cùng các thầy

cô trong khoa Công Nghệ Thực Phẩm trường Đại học Công Nghiệp Thực phẩm TP.HCM

đã tạo điều kiện học tập, nghiên cứu, hết lòng giảng dạy và truyền đạt cho em những kiếnthức quý báu trong suốt thời gian em học tập ở trường

Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn cô, người đã hướng dẫn, chỉ bảo cho em vàgiúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đồ án

Trong quá trình thực hiện đồ án, do hạn chế về thời gian chuẩn bị và tài liệu thamkhảo nên không thể tránh khỏi hạn chế, thiếu sót rất mong nhận được ý kiến đóng gópcủa cô và người đọc để em học thêm được nhiều kinh nghiệm và sẽ hoàn thành tốt hơnbài báo cáo tốt nghiệp sắp tới

Em xin chân thành cảm ơn!

TP.HCM, ngày 20 tháng 5 năm 2014

Sinh viên

NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN

GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN

NHẬN XÉT CỦA HỘI ĐỒNG ĐÁNH GIÁ

HỘI ĐỒNG ĐÁNH GIÁ

Bỏ

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT 5

DANH MỤC BẢNG 6

LỜI MỞ ĐẦU 7

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 9

1.1 Sản phẩm nectar quả hỗn hợp 9

1.1.1 Quy trình sản xuất nectar rau quả 11

1.1.2 Tình hình phát triển rau quả ở Việt Nam 12

CHƯƠNG 2 TIÊU CHUẨN CHO NGUYÊN LIỆU 13

2.1 Yêu cầu nguyên liệu 13

2.2 Yêu cầu kỹ thuật 13

2.2.1 Giới hạn kim loại nặng trong sản phẩm 13

2.2.2 Giới hạn độc tố vi nấm 14

2.2.3 Giới hạn các chất phụ gia được phép sử dụng 14

2.2.4 Giới hạn vi sinh vật có trong sản phẩm 14

2.2.5 Yêu cầu nước sử dụng để chế biến 15

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA CÁC CHỈ TIÊU CỦA NGUYÊN LIỆU .

16 3.1 Xác định chì, cadimi, kẽm, đồng và sắt theo TCVN 8126:2009 16

3.1.1 Phạm vi áp dụng 16

3.1.2 Nguyên tắc 16

3.1.3 Thuốc thử 16

3.1.4 Cách tiến hành 16

3.1.4.1 Phân hủy 16

3.1.4.2 Pha loãng 17

3.1.4.3 Đo quang phổ hấp thụ nguyên tử 18

3.1.4.4 Kỹ thuật FAAS 18

3.1.4.5 Kỹ thuật GFAAS 19

3.1.5 Tính và biểu thị kết quả 19

3.2 Xác định dư lượng n-metylcarbamat bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao có làm sạch bằng chiết pha rắn 21

3.2.1 Phạm vi áp dụng 21

3.2.2 Nguyên tắc 21

3.2.3 Cách tiến hành 21

3.2.3.1 Yêu cầu chung 21

3.2.3.2 Cách chiết 21

3.2.3.3 Chiết pha rắn 22

3.2.4 Đo HPLC 22

3.2.5 Tính kết quả 22

3.3 Xác định patulin theo TCVN 8161: 2009 24

3.3.1 Phạm vi áp dụng 24

3.3.2 Nguyên tắc 24

3.3.3 Cách tiến hành 24

3.3.3.1 Chuẩn bị mẫu thử 24

3.3.4 Quy trình thêm chuẩn 26

3.3.4.1 Nước táo trong 26

3.3.4.2 Nước táo đục 26

3.3.4.3 Puree táo 26

3.3.5 Xác định bằng HPLC 26

3.3.5.1 Đường chuẩn 26

3.3.6 Tính kết quả 27

3.4 Định lượng coliform theo TCVN 6848 : 2007 29

3.4.1 Phạm vi áp dụng 29

3.4.2 Coliform 29

3.4.3 Nguyên tắc 29

3.4.4 Môi trường đặc chọn lọc: Thạch lactoza mật đỏ trung tính tím tinh thể (VRBL) 30

3.4.6 Thiết bị và dụng cụ thủy tinh 31

3.4.7 Lấy mẫu 32

3.4.8 Chuẩn bị mẫu thử 32

3.4.9 Cách tiến hành 32

3.4.9.1 Phần mẫu thử, huyền phù ban đầu và dịch pha loãng 32

3.4.9.2 Cấy và ủ ấm mẫu 33

3.4.9.3 Đếm các khuẩn lạc 33

3.4.9.4 Khẳng định 34

3.5 định lượng nấm men và nấm mốc theo TCVN 8275-1:2009 35

3.5.1 Phạm vi áp dụng 35

3.5.2 Nguyên tắc 35

3.5.3 Dịch pha loãng và môi trường nuôi cấy 36

3.5.4 Dịch pha loãng 36

3.5.4.1 Thành phần của canh thang nước pepton 0,1 % (nồng độ khối lượng) 36 3.5.4.2 Chuẩn bị canh thang nước pepton 0,1% (nồng độ khối lượng) 36

3.5.5 Môi trường nuôi cấy 36

3.5.5.1 Thạch dichloran-rose bengal chloramphenicol (DRBC) [3],[4] 36

3.5.6 Thiết bị và dụng cụ thủy tinh 37

3.5.7 Lấy mẫu 38

3.5.8 Chuẩn bị mẫu thử 38

3.5.9 Cách tiến hành 38

3.5.9.1 Phần mẫu thử, huyền phù ban đầu và dung dịch pha loãng 38

3.5.9.2 Cấy và ủ 39

3.5.10 Đếm và chọn các khuẩn lạc để khẳng định 39

3.5.11 Biểu thị kết quả và giới hạn tin cậy 40

3.6 Định lượng staphylococci theo TCVN 4830-1:2005 41

3.6.1 Phạm vi áp dụng 41

3.6.2 Thuật ngữ và định nghĩa 41

3.6.2.1. Staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase

(coagulase-positive staphylococci) 41

3.6.2.2 Định lượng staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase (enumeration of the coagulase-positive staphylococci) 41

3.6.3 Nguyên tắc 41

3.6.4 Dịch pha loãng và môi trường cấy 42

3.6.4.1 Yêu cầu chung 42

3.6.4.2 Dịch pha loãng 42

3.6.4.3 Môi trường thạch Baird-Parker 42

3.6.5 Dung dịch 43

3.6.5.1 Dung dịch kali telurit 43

3.6.5.2 Dung dịch nhũ tương lòng đỏ trứng (nồng độ khoảng 20 % hoặc theo các chỉ dẫn của nhà sản xuất) 44

3.6.6 Môi trường hoàn chỉnh 45

3.6.7 Chuẩn bị các đĩa thạch 45

3.6.8 Môi trường canh thang não – tim (Brain-heart infusion broth) 46

3.6.9 Huyết tương thỏ 46

3.6.10 Thiết bị và dụng cụ thủy tinh 47

3.6.11 Lấy mẫu 48

3.6.12 Chuẩn bị mẫu thử 48

3.6.12.1 Cách tiến hành 48

3.6.13 Biểu thị kết quả 51

3.6.13.1 Trường hợp chung 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO 55

PHỤ LỤC 56

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

QCVN: Quy chuẩn Việt Nam

TCVN: Tiêu chuẩn Việt Nam

TCN: Tiêu chuẩn ngành

AOAC: Association of Official Agricultural Chemists

DANH MỤC BẢNG

LỜI MỞ ĐẦU

Việt Nam là nước nhiệt đới, nhưng trải dài trên nhiều vĩ tuyến nên hình thànhnhiều tiểu vùng khí hậu khác nhau, từ tiểu vùng có gió mùa Đông Bắc đến tiểu vùng cókhí hậu gần ôn đới như Sa Pa, Đà Lạt… và tiểu vùng có khí hậu nhiệt đới ẩm miền Nam.Với điều kiện khí hậu đa dạng như vậy nhưng rau quả Việt Nam vẫn chưa phát triển đúngmức so với những tiềm năng của mình Nguyên nhân là còn thiếu những công trìnhnghiên cứu có hệ thống về giống, kỹ thuật trồng trọt, chăm sóc trước thu hoạch và bảoquản chế biến sau thu hoạch…

Rau quả là một trong những nguồn thực phẩm quý mà thiên nhiên dành cho conngười, nó là một phần không thể thiếu cũng như không thể thay thế trong khẩu phần củachúng ta

Thành phần chủ yếu là nước chiếm khoảng (80-90%), hàm lượng lipid thấp nhưngchứa nhiều chất xơ, khoáng, acid hữu cơ, chất thơm, đặc biệt nhất là vitamine A, C, E…Những thành phần này góp phần làm tăng khả năng chuyển hoá thức ăn trong cơ thể, làmcân bằng độ acid-kiềm trong máu và dịch bào, nhờ vậy độ pH trong cơ thể luôn ổn định

Đặc điểm của rau quả là có tính thời vụ và ở dạng tươi dễ hư hỏng, vì vậy nó đượcquan tâm nghiên cứu, bảo quản, chế biến nhằm kéo dài thời gian sống, tiện dụng hơn và

dễ phân phối, vận chuyển đi xa

Rau quả được chế biến thành nhiều loại sản phẩm khác nhau như sinh tố , nước ép,nectar, … Trong đó có sản phẩm nectar, nectar quả hỗn hợp là sản phẩm trái cây đượcdung phổ biến hiện nay, trong quá trình sản xuất chúng ta cần kiểm soát kỹ các chỉ tiêu visinh vật, kim loại nặng cũng như các độc tố sinh ra trong quá trình bảo quản để sản phẩmđạt chất lượng tốt nhất

Chính vì vậy, em chọn đề tài “Tìm hiểu các kỹ thuật kiểm soát chất lượng sản phẩm nectar quả hỗn hợp” với mục đích phân tích các chỉ tiêu hóa lý, cảm quan,… để

sản phẩm đạt được chất lượng tốt nhất với hy vọng đưa sản phẩm ngày càng vươn xahơn.

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

Là sản phẩm được sản xuất bằng cách pha chế purée quả (dịch quả nghiền) vớinước đường theo những tỉ lệ nhất định Để tăng hương vị, giữ màu sắc tự nhiên cho sảnphẩm thì pha thêm acid citric hoặc acid ascorbic Hàm lượng purée quả dao động trongkhoảng 35-70% tuỳ theo tính chất nguyên liệu và sản phẩm chế biến

Puree quả trong sản xuất nectar là sản phẩm chưa bị lên men nhưng có thể lên menthu được bằng biện pháp thích hợp

Trong rau quả, những chất có giá trị dinh dưỡng cao nhất như đường, acid hữu

cơ, vitamin…đều tập trung ở dịch quả Nhờ có đầy đủ và cân đối các chất ấy nên cóhương vị rất thơm ngon

Nguyên liệu dùng để chế biến nectar cần có hàm lượng cao các chất khô hoà tan,các chất đường, acid hữu cơ, tannin, các chất thơm, chất màu, dịch quả có màu sắc vàhương vị hấp dẫn Các chỉ tiêu quan trọng nhất, đặc trưng cho phẩm chất dịch quả là khốilượng riêng, hàm lượng chất khô và độ acid Quả đưa vào chế biến cần tươi tốt, có độchin thích hợp Nếu quả chưa chín thì màng tế bào cứng, dịch bào ít nên nhiều phế liệu,cho dịch quả có hàm lượng đường thấp, hàm lượng acid cao, màu sắc, hương vị kém hấpdẫn

Nguyên liệu dùng để chế biến thường là loại quả khó tách dịch bào bằng phươngpháp ép như: chuối, mơ, mận ổi, mãng cầu… Người ta còn chế biến nectar từ một số loạirau, củ như cà chua, cà rốt,… hoặc sản xuất nectar từ hỗn hợp nhiều loại quả

1.1.1 Quy trình sản xuất nectar rau quả

1.1.2 Tình hình phát triển rau quả ở Việt Nam

Việt Nam có điều kiện khí hậu, thổ nhưỡng khá thuận lợi cho việc trồng trọt cácloại rau, hoa, quả (RHQ) để phục vụ cho nhu cầu tiêu dung trong nước và xuất khẩu hiệndiện tích trồng rau, hoa quả cả nước chiếm khoảng 780 nghìn ha, đạt giá trị 650 nghìn tỷđồng, chiếm 9% GDP của ngành nông nghiệp kim ngạch xuất khẩu có xu hướng tăngnhưng còn chậm Năm 2005 đạt 230 triệu USD và năm 2009 đạt 431 triệu USD Trongnước xuất hiện một số mô hình phát triển sản xuất và xuất khẩu RHQ đạt hiệu quả kinh tếcao, giá trị sản xuất trên 1 ha từ 400 – 500 triệu đồng/năm (cá biệt nhiều trang trại đạthơn 1 tỷ đồng), cũng có những doanh nghiệp xuất được hàng chục triệu USD/năm

Như vậy, ngành sản xuất RHQ xuất khẩu có thể mang lại thu nhập cao và là mộttiềm năng rất lớn của nền sản xuất nông nghiệp Việt Nam

Những vấn đề hạn chế xuất khẩu có tính chiến lược của ngành hàng rau, hoa đượcxác định là: thiếu hệ thống tiếp thị hợp tác, thiếu cơ sở hạ tầng hỗ trợ (kho vận lạnh, khobãi xử lý hoa, giao thông nội vùng) Thiếu những người sản xuất có năng lực xuất khẩu,chất lượng hoa thấp, không đồng đều Ngoài ra, giống là yếu tố đặc biệt quan trọng liênquan đến xuất khẩu vì hiện các giống rau, hoa đang được sản xuất chủ yếu là giống nhậpnội nên kinh danh xuất khẩu rau, hoa có những trở ngại nhất định và gặp nhiều khó khănkhi Việt Nam chính thức hội nhập WTO và tham gia UPOV (Công ước Quốc tế về Bảo

hộ Giống cây trồng mới) Phần lớn các giống rau lai F1 phải nhập khẩu từ nước ngoài,giá thành hạt giống cao và chất lượng giống bấp bênh gây ảnh hưởng tới sản xuất Mỗinăm Việt Nam phải chi tới 200 triệu USD nhập khẩu các loại hạt giống phục vụ ngànhtrồng trọt

CHƯƠNG 2 TIÊU CHUẨN CHO NGUYÊN LIỆU

Để sản phẩm đạt được chất lượng tốt thì ban soạn thảo Quy chuẩn kỹ thuật quốcgia về vệ sinh an toàn thực phẩm đối với đồ uống biên soạn QCVN 6-2:2010/BYT quyđịnh các chỉ tiêu an toàn thực phẩm và các yêu cầu quản lý đối với đồ uống không cồn,bao gồm nước rau quả, nectar rau quả và đồ uống pha chế sẵn không cồn và TCVN

6299 : 1997 do Ban Kỹ thuật Tiêu chuẩn TCVN/TC/F10 Rau quả và sản phẩm rau quảbiên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn - Đo lường - Chất lượng đề nghị và được Bộ Khoa họcCông nghệ và Môi trường ban hành để hướng dẫn cho sản phẩm nectar rau quả

Thiếu

2.2.1 Giới hạn kim loại nặng trong sản phẩm

Bảng 2.1 Giới hạn ô nhiễm kim loại nặng trong sản phẩm

Đối với độc tố vi nấm theo tiêu chuẩn chỉ cần xác định về hàm lượng Patulin không quá 50 mg/l

Hàm lượng etanola không được vượt quá 3 g/kg

2.2.3 Giới hạn các chất phụ gia được phép sử dụng

Bảng 2.2 Giới hạn các chất phụ gia trong sản phẩm

( Theo TCVN 6299 : 1997 )

2.2.4 Giới hạn vi sinh vật có trong sản phẩm

Bảng 2.3 Giới hạn vi sinh vật trong sản phẩm

Tổng số vi sinh vật hiếu khí, CFU/ml sản

phẩm

100

(Theo QCVN 6-2:2010/BYT )

2.2.5 Yêu cầu nước sử dụng để chế biến

Nước sử dụng để chế biến đồ uống không cồn phải đáp ứng các yêu cầu theoQCVN 01:2009/BYT về chất lượng nước ăn uống được ban hành kèm theo Thông tư số04/2009/TT-BYT ngày 17/6/2009 của Bộ trưởng Bộ Y tế

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA CÁC CHỈ TIÊU CỦA NGUYÊN

LIỆU

PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO CÓ LÀM SẠCH BẰNG CHIẾT PHARẮN

3.1.1 Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định dư lượng thuốc bảo vệ thực vật metylcarbamat trong ngũ cốc, rau và quả bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

N-3.1.2 Nguyên tắc

Mẫu được đồng hóa với axeton, diclometan và dầu nhẹ và mẫu đã đồng hóa được

ly tâm tạo ra hai lớp nổi phía trên Lớp nước phía trên được cho bay hơi đến khô Dịchchiết này cũng có thể được làm sạch bằng chiết pha rắn (SPE) sử dụng cột nhồi bằngsilica được gắn aminopropyl Trong dung dịch chiết, M-metylcarbamat được xác địnhbằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) pha đảo có thủy phân sau cột Metylamin tạothành được cho phản ứng với o-phthaldialdehyd và 2-mercaptoetanol và các dẫn xuấtđược phát hiện bằng detector huỳnh quang

3.1.3 Cách tiến hành

3.1.3.1 Yêu cầu chung

Chuẩn bị mẫu trắng thuốc thử và các mẫu trắng chất nền và thực hiện các phép thửthu hồi thích hợp với các giới hạn dư lượng tối đa

3.1.3.2 Cách chiết

Đồng hóa 15 g (m) thử với 30 ml axeton 30 s trong ống ly tâm Thêm 30 ml

diclometan và 30 ml dầu nhẹ và đồng hóa tiếp trong 30 s Ly tâm ống 5 min ở tốc độ

4000 min-1 Gạn lớp phía trên (hữu cơ) cho vào bình nón

Chuyển từng phần 2 ml lớp này sang ống nghiệm và thêm 50 dung dịch hãm Chobay hơi nhẹ dung môi đến gần khô

3.1.3.3 Chiết pha rắn

Hút 1 ml diclometan cho qua cột SPE được gắn với thiết bị rửa giải thích hợp, rồigạn bỏ dịch rửa giải Hòa tan phần cặn thu được trong 8.2 bằng 1 ml diclometan Chodung dịch này vào ống SPE, dùng 0,5 ml diclometan để tráng và bắt đầu thu lấy dịch rửagiải cho vào ống nghiệm Tiếp tục rửa giải bằng 1 ml hỗn hợp rửa giải SPE, thu lấy dịchrửa giải này vào cùng ống nghiệm và cho bay hơi nhẹ dung môi đến gần khô

3.1.4 Đo HPLC

Hòa tan cặn thu được trong trong 1 ml dung dịch chuẩn nội trên thiết bị siêu âm Lọc dung dịch qua màng lọc và bơm 100 lên hệ thống HPLC có cột bảo vệ như ví dụ trong và cột phân tích ví dụ trong

Áp dụng ví dụ như chương trình gradient ba yếu tố sau đây, ở tốc độ dòng 0,75 ml/min:

75% pha động A và 25 % pha động B trong 5 min, sau đó áp dụng tuyến tính từ 0

% pha động C đến 100 % pha động C trong 20 min, cuối cùng 100 % pha động C trong 5 min

Cho dịch rửa giải từ cột phân tích HPLC qua cột phản ứng như trong có chứa cột thủy phân sau cột như trong Duy trì cột phản ứng ở 120 oC

Để rửa giải cột thủy phân, thêm thuốc thử OPA với tốc độ 0,1 ml/min qua chi tiết chữ T thể tích chết thấp

Cho hỗn hợp đi qua detector huỳnh quang Các bước sóng kích thích và phát xạ được cài đặt tương ứng 340 nm và 455 nm.

3.1.5 Tính kết quả

Để nhận biết N-metylcarbamat có mặt, so sánh thời gian lưu của các pic thu được đối với các dung dịch mẫu thử thu được bằng cách trộn và pha loãng dung dịch gốc thuốcbảo vệ thực vật thích hợp

Để định lượng N-metylcarbamat đã nhận dạng, sử dụng các dung dịch chuẩn của hợp chất này có các nồng độ thích hợp, ví dụ: 0,005 đến 0,05 g/ml Trong sắc ký đồ, đo chiều cao pic (hoặc diện tích pic) thu được đối với hợp chất và trimethacarb chuẩn và tínhthương số của hai giá trị này Đối với đường chuẩn, đánh dấu các lượng của hợp chất có chứa trong 1 ml của từng dung dịch chuẩn trên trục hoành và các thương số thu được trêntrục tung

Đối với pic thu được của hợp chất đã nhận dạng từ dung dịch mẫu thử, tính thương

số như được đề cập ở trên và đọc khối lượng trong dung dịch mẫu thử từ đường chuẩn

Tính phần khối lượng, w, bằng miligam trên kilogam mẫu thử, theo công thức (1):

(1)

- Trong đó:

X là khối lượng của hợp chất đọc được từ đường chuẩn, tính bằng microgam ();

m là khối lượng phần mẫu thử, tính bằng gam (g)

Phép thử khẳng định

- Cần tiến hành các phép thử khẳng định việc nhận dạng và định lượng các dư lượngthuốc bảo vệ thực vật quan sát được, đặc biệt là trong các trường hợp cho thấy vượt quá các mức giới hạn dư lượng tối đa (MRL)

- Phương pháp cặp đôi sắc ký khí khối phổ (GC-MS) là phương pháp điển hình để khẳng định việc nhận dạng và định lượng N-metylcarbamat Đối với các hợp chất này mà không phân tích được bằng sắc ký khí, thì các kỹ thuật sử dụng sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) hoặc sắc ký lỏng detector chuỗi diot quang (LC-DAD) là thích hợp.

3.2. XÁC ĐỊNH PATULIN THEO TCVN 8161: 2009

3.2.1 Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng patulin trong nước táo vàpuree táo bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Phương pháp này đã được khảonghiệm để xác định patulin qua phân tích các mẫu bị nhiễm tự nhiên và các mẫu đã được

bổ sung lượng biết trước trong nước táo trong ở các mức từ 26 g/l đến 128 g/l, trongnước táo đục ở các mức từ 26 g/l đến 106 g/l và trong puree táo ở các mức từ 23 g/kgđến 121 g/kg

3.2.2 Nguyên tắc

Nước táo đục và puree táo được xử lý bằng enzym pectinaza Patulin được chiết rakhỏi nước táo hoặc puree đã được xử lý enzym bằng dung dịch etyl axetat Dịch chiếtbằng dung môi được làm sạch bằng chiết pha lỏng-lỏng với dung dịch natri cacbonat.Dịch chiết bằng etyl axetat được làm khô bằng natri sulfat khan Sau khi cho bay hơi etylaxetat, patulin được định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector tử ngoại(UV)

3.2.3 Cách tiến hành

3.2.3.1 Chuẩn bị mẫu thử

Nước táo trong

- Không cần chuẩn bị mẫu

Nước táo đục

- Chuyển 20 ml ± 0,1 ml nước táo đục sang ống ly tâm (5.7) và thêm 150 l dungdịch enzym (4.10) Vặn chặt nắp và lắc kỹ bình Để qua đêm ở nhiệt độ phònghoặc để 2 h ở 40 0C, sau đó cho ly tâm 5 min ở gia tốc 4500 g.

Puree táo

- Cân 10 g mẫu thử puree, chính xác đến 0,1 g cho vào ống ly tâm (5.7), thêm 150

l dung dịch enzym (4.10) và 10 ml nước Vặn chặt nắp và lắc bình bằng máyđồng hóa tùy thuộc vào mẫu, để trộn kỹ Để qua đêm ở nhiệt độ phòng hoặc để 2 h

ở 400C, sau đó cho ly tâm 5 min ở gia tốc 4500 g.

Chiết patulin

- Dùng pipet lấy 10 ml nước táo trong hoặc nước táo đục đã chuẩn bị trong 3.1.2cho vào phễu chiết 100 ml Đối với puree táo thì dùng pipet lấy 10 ml mẫu đãchuẩn bị trong 3.1.3, tương đương với 5 g puree, cho vào phễu chiết 100 ml Thêm

20 ml etyl axetat và lắc trong 1 min Để yên cho tách lớp rồi tách riêng hai pha nàyvào hai bình nón riêng rẽ Chuyển phần nước vào lại phễu chiết và chiết lại lần haibằng 20 ml etyl axetat Lại để yên cho tách lớp rồi chuyển lớp nước phía dưới vàomột bình nón rỗng và lớp phía trên vào bình nón có chứa sẵn lớp etyl axetat từ lầnchiết thứ nhất Lặp tại quy trình chiết này lần ba, nhưng sau khi tách lớp thì tháo

bỏ lớp nước phía dưới Gộp ba phần dịch chiết etyl axetat này vào phễu chiết.Tráng bình nón được dùng để đựng các dịch chiết etyl axetat bằng 5 ml etyl axetatmới và gộp nước rửa này vào dịch chiết etyl axetat trong phễu chiết

Loại bỏ các hợp chất acid gây nhiễu

- Cho 4 ml dung dịch natri cacbonat vào phễu chiết đựng dịch chiết etyl axetat vàlắc trong 30 s Đợi cho tách lớp rồi tháo lớp nước phía dưới chảy sang bình nón.Rót lớp phía trên sang bình cầu đáy tròn qua phễu chiết và giấy lọc có chứakhoảng 15 g natri sulfat khan Chuyển phần nước trở lại phễu chiết rồi tráng bìnhnón bằng khoảng 10 ml etyl axetat, cho nước tráng vào phễu chiết và lắc 30 s Đểyên cho tách lớp, tháo bỏ lớp nước phía dưới và cho lớp phía trên chảy qua natrisulfat sang bình cầu đáy tròn Tráng phễu chiết bằng 15 ml etyl axetat và cho quanatri sulfat vào bình cầu đáy tròn

- Thực hiện bước này trong vòng 3 min.

chuẩn bị dung dịch mẫu thử

- Cho bay hơi dung dịch thu được đến thể tích nhỏ (< 1 ml) trong chân không, sửdụng nồi cách thủy ở 40 0C Chuyển lượng còn lại sau khi bay hơi sang một lọthủy tinh Tránh phía trong bình cầu đáy tròn bằng etyl axetat để đảm bảo rằngchuyển được tất cả patulin sang lọ Cho bay hơi dung dịch đến khô bằng dòng nitơtrên tấm gia nhiệt hoặc trên nồi cách thủy ở 400C Hòa tan lại cặn bằng cách dùngpipet lấy 1 ml (V1) nước (500 l với mẫu puree) cho vào lọ Dùng máy trộn Vortex

để hòa tan hoàn toàn mẫu Chuyển dung dịch mẫu thử sang lọ nhỏ của HPLC Lọcqua bộ lọc xyranh dùng một lần, nếu cần

3.2.4 Quy trình thêm chuẩn

3.2.4.1 Nước táo trong

- Dùng pipet lấy 10 ml nước táo trong không chứa patulin cho vào phễu chiết 100

ml Dùng pipet lấy 50 l dung dịch chuẩn hoặc một lượng dịch lỏng tương đương với 0,5 l patulin tuyệt đối cho vào nước táo trong không chứa patulin Đậy bình

và lắc kỹ để trộn Tiến hành như trong 3.2 đến 3.4

3.2.4.2 Nước táo đục

- Dùng pipet lấy 10 ml nước táo đục cho vào ống ly tâm Dùng pipet lấy 50 l dung dịch chuẩn hoặc một lượng dịch lỏng tương đương với 0,5 g patulin tuyệt đối cho vào nước táo đục không chứa patulin Đậy bình và lắc kỹ để trộn Tiến hành như trong 3.1.2

3.2.4.3 Puree táo

- Cân 10 g puree táo không chứa patulin, chính xác đến 0,1 g, cho vào ống ly tâm Dùng pipet lấy 50 l dung dịch chuẩn hoặc một lượng dịch lỏng tương đương với

0,5 g putulin tuyệt đối cho vào puree táo không chứa patulin Sau khi thêm, lắc

kỹ để trộn dung dịch Tiến hành như trong 3.1.3

3.2.5 Xác định bằng HPLC

3.2.5.1 Đường chuẩn

Yêu cầu chung

- Dựng đường chuẩn trong ngày phân tích

Dung dịch hiệu chỉnh patulin dùng cho HPLC

- Chuẩn bị 5 dung dịch chuẩn HPLC trong các bình định mức 2 ml riêng biệt theo Bảng 1 Dùng pipet để chuyển dung dịch chuẩn patulin để hiệu chuẩn (4.14) Pha loãng từng dung dịch chuẩn đến 2 ml bằng nước có pH 4 (4.5)

Bảng 1 - Chuẩn bị các dung dịch chuẩn

Dung dịch chuẩn Nước (4.5)

(l)

Dung dịch chuẩn làm việc patulin

(l)

Nồng độ khối lượng (g/ml)

- Tốc độ dòng của pha động (cột): 1,0 ml/min;

- Bước sóng của detector UV: 276 nm;

- Thể tích bơm: 50 l

3.2.6 Tính kết quả

Đọc từ đường chuẩn khối lượng patulin trong dung dịch mẫu thử đã bơm lên cộtHPLC, bằng nanogam Tính phần khối lượng patulin, wPAT, bằng nanogam trên mililit(hoặc gam đối với puree) theo công thức (2):

(2)Trong đó:

ma là khối lượng patulin trong dung dịch thử được bơm lên cột, tính bằngnanogam (ng);

V2 là thể tích phần dung dịch thử (3.4) được bơm lên cột, tính bằng mililit (ml);

V1 là thể tích dung dịch mẫu thử (3.4), (V1 = 1,0 ml đối với nước táo, V1 = 0,5mlđối với puree) tính bằng mililit (ml);

Ms là thể tích mẫu được chiết, tính bằng mililit đối với nước táo (ms = 10 ml) hoặcgam đối với puree (ms = 5 g)

Kết quả cuối cùng có thể được biểu thị bằng microgam trên lit (hoặc kilogam đối vớipuree) và tương đương với nanogam trên mililit (hoặc gam)

3.3. ĐỊNH LƯỢNG NẤM MEN VÀ NẤM MỐC THEO TCVN 8275-1:2009

3.3.1 Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp định lượng nấm men và nấm mốc sốngtrong các sản phẩm thực phẩm hoặc trong thức ăn chăn nuôi có hoạt độ nước lớn hơn0,95 [trứng, thịt, sản phẩm sữa (trừ sữa bột), rau, quả, các loại pate tươi ] bằng kỹ thuậtđếm khuẩn lạc ở 250C ± 10C ([1], [2])

Tiêu chuẩn này không cho phép định lượng các bào tử nấm mốc Việc nhận biếtcũng như việc kiểm tra các hệ nấm của thực phẩm về độc tố không nằm trong phạm vicủa tiêu chuẩn này Phương pháp qui định trong tiêu chuẩn này không thích hợp để định

lượng các loại nấm chịu nhiệt như Byssochlamys fulva hoặc Byssochlamys nivea, có trong

rau và quả đóng hộp hoặc đóng chai

3.3.2 Nguyên tắc

Chuẩn bị các đĩa nuôi cấy bề mặt, sử dụng môi trường nuôi cấy chọn lọc qui định.Tùy chọn vào số lượng khuẩn lạc dự kiến, sử dụng lượng xác định của mẫu (nếu sảnphẩm dạng lỏng) hoặc huyền phù ban đầu (nếu sản phẩm ở dạng khác), hoặc các dungdịch pha loãng thập phân của mẫu/huyền phù

Có thể chuẩn bị các đĩa bổ sung trong cùng điều kiện, sử dụng các dung dịch thậpphân của mẫu thử hoặc các huyền phù ban đầu

Ủ các đĩa đã cấy trong điều kiện hiếu khí ở 250C ± 10C trong 5 ngày Các đĩa thạch

có thể được để trong ánh sáng khuếch tán từ 1 ngày đến 2 ngày, nếu cần

Đếm các khuẩn lạc/các chồi, khẳng định việc nhận dạng các khuẩn lạc nghi ngờbằng kính phóng đại hoặc kính hiển vi (để phân biệt các khuẩn lạc của nấm men với cáckhuẩn lạc của vi khuẩn), nếu cần

Số lượng nấm men và nấm mốc trong một gam hoặc một mililit mẫu được tính từ

số lượng khuẩn lạc/chồi/mầm thu được trên các đĩa đã chọn ở các mức pha loãng tạo racác khuẩn lạc có thể đếm được Nấm men và nấm mốc được đếm riêng, nếu cần

3.3.3 Dịch pha loãng và môi trường nuôi cấy

Về thực hành trong phòng thử nghiệm hiện hành, xem TCVN 6507 (ISO 6887) vàTCVN 6263 (ISO 8261)

3.3.4.2 Chuẩn bị canh thang nước pepton 0,1% (nồng độ khối lượng)

Hòa tan các thành phần trên trong nước, đun nóng nếu cần

Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 7,0 ± 0,2 ở 250C, nếu cần

3.3.5 Môi trường nuôi cấy

3.3.5.1 Thạch dichloran-rose bengal chloramphenicol (DRBC) [3],[4]

Thạch từ 12 g đến 15 ga

a Tùy vào sức đông của thạch

3.3.6 Thiết bị và dụng cụ thủy tinh

Có thể dùng dụng cụ sử dụng một lần để thay thế cho các dụng cụ thủy tinh sử dụng nhiều lần nếu nó có các đặc tính kỹ thuật phù hợp

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm vi sinh thông thường [xem TCVN

6404 (ISO 7218)] và cụ thể như sau:

 Tủ ấm, có thể duy trì nhiệt độ 250C ± 10C

 Pipet xả hết, vô trùng, dung dịch danh nghĩa 1 ml, được chia vạch 0,1 ml

 Nồi cách thủy, hoặc dụng cụ tương tự, có khả năng duy trì nhiệt độ ở 440C đến470C

 Máy đo pH, có độ chính xác 0,1 đơn vị pH ở 250C

 Chai, bình và ống nghiệm, để đun sôi và bảo quản môi trường nuôi cấy và phaloãng dung dịch

 Đĩa Petri vô trùng, bằng thủy tinh hoặc chất dẻo, đường kính từ 90 mm đến 100mm

 Kính hiển vi, để phân biệt nấm men với các tế bào vi khuẩn (có trường sáng, độkhuếch đại từ 250 lần đến 1 000 lần)

 Que dàn mẫu, bằng thủy tinh hoặc chất dẻo (đường kính nhỏ hơn 2 mm và dài 80mm) Đường kính không được vượt quá 2 mm để giảm thiểu lượng mẫu dính vàoque khi kết thúc dàn mẫu

 Kính khuếch đại hai thị kính, để phân biệt các khuẩn lạc/tế bào nấm men và nấmmốc (khuếch đại từ 6,5 lần đến 50 lần).

3.3.7 Lấy mẫu

Điều quan trọng là phòng thử nghiệm phải nhận được đúng mẫu đại diện và không

bị hư hỏng hoặc giảm chất lượng trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản Mẫuphòng thử nghiệm không được làm đông lạnh

Việc lấy mẫu không qui định trong tiêu chuẩn này Nên lấy mẫu theo tiêu chu ẩn

cụ thể liên quan đến sản phẩm Nếu không có tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩmthì các bên có liên quan sẽ thỏa thuận về vấn đề này

3.3.9.1 Phần mẫu thử, huyền phù ban đầu và dung dịch pha loãng

Chuẩn bị phần mẫu thử, huyền phù ban đầu (dung dịch pha loãng ban đầu) và cácdung dịch pha loãng theo TCVN 6507 (tất cả các phần), TCVN 6404 (ISO 7218), TCVN

6263 (ISO 8261) và tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm

Khuyến cáo sử dụng canh thang nước pepton 0,1% (5.1.3) làm dịch pha loãng, trừviệc chuẩn bị mẫu thử cụ thể Tốt nhất nên dùng bộ kiểu nhu động để trộn mẫu hoặc dùngmáy lắc

Do các bào tử lắng xuống nhanh trong pipet, nên để pipet (6.2) ở tư thế nằm ngang(không để đứng) khi được làm đầy bằng một thể tích của huyền phù hoặc dung dịch phaloãng thích hợp.

Lắc huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng để tránh các phần tử có chứa

Để thuận tiện cho việc định lượng các lượng nhỏ nấm men và nấm mốc, lấy các lượngđến 0,3 ml dung dịch pha loãng 10-1 của mẫu hoặc mẫu thử dạng lỏng, dàn đều trên bađĩa

Lặp lại các thao tác này với các dung dịch pha loãng tiếp theo, sử dụng pipet vôtrùng mới cho mỗi dung dịch pha loãng

Dàn đều dịch lỏng lên khắp bề mặt đĩa thạch bằng que dàn mẫu vô trùng cho đếnkhi dịch lỏng hấp thụ hết vào môi trường

Có thể sử dụng kỹ thuật cấy bằng phương pháp đổ đĩa, nhưng trong trường hợpnày sự tương đương của các kết quả phải được đánh giá bằng cách so sánh với kết quảđược cấy trên bề mặt đĩa và có thể không phân biệt sự khác nhau của nấm men và nấmmốc Phương pháp cấy bề mặt có thể cho kết quả định lượng cao hơn Kỹ thuật dàn đĩatạo điều kiện cho các tế bào tiếp xúc tối đa với oxi của không khí và tránh mọi nguy cơmất hoạt tính do nhiệt của các chồi nấm Các kết quả có thể phụ thuộc vào từng loại nấm

Ủ các đĩa đã chuẩn bị trong môi trường hiếu khí, nắp hướng lên trên, tư thế thẳngđứng trong tủ ấm ở 250C ± 10C trong 5 ngày Để yên các đĩa thạch trong ánh sáng khuếchtán từ 1 ngày đến 2 ngày, nếu cần.

Nên ủ các đĩa trong túi chất dẻo ở để không làm nhiễm bẩn tủ ấm trong trườnghợp nấm mốc lan ra ngoài đĩa

3.3.10.Đếm và chọn các khuẩn lạc để khẳng định

Đếm các đĩa trong khoảng thời gian ủ từ 2 ngày đến 5 ngày Chọn các đĩa chứa ít hơn 150 khuẩn lạc/chồi/mầm và đếm chúng Nếu trên các đĩa có nấm mốc quá nhanh thì

có thể đếm các khuẩn lạc/chồi/mầm sau khi ủ 2 ngày và đếm lại sau khi ủ 5 ngày

CHÚ THÍCH 1 Các phương pháp định lượng nấm men và đặc biệt là nấm mốc là không chính xác, vì chúng là một hỗn hợp của hệ sợi nấm và các bào tử vô tính và hữu tính Số lượng đơn vị hình thành khuẩn lạc phụ thuộc vào mức độ phân đoạn của sợi nấm và tỷ lệ các bào tử có thể mọc trên môi trường đổ đĩa

CHÚ THÍCH 2: Thường xuất hiện sự không tuyến tính của các số đếm từ các đĩa dung dịch pha loãng; nghĩa là các dung dịch pha loãng 10 lần của mẫu thường không cho các kết quả nhỏ hơn 10 lần về số đếm khuẩn lạc thu được trên các môi trường đổ đĩa Điều này là do sự phân đoạn của hệ sợi nấm và việc tách các cụm bào tử trong quá trình pha loãng làm ức chế cạnh tranh khi các lượng lớn khuẩn lạc có mặt trên các đĩa

CẢNH BÁO - Các bào tử nấm mốc phân bố trong không khí rất mạnh, nên cần thao tác với các đĩa Petri cẩn thận để tránh làm phát triển các khuẩn lạc vệ tinh mà

có thể cho ước tính kết quả quá cao.

Tiến hành kiểm tra bằng kính khuếch đại hai thị kính (6.9) hoặc bằng kính hiển vi (6.7)

để phân biệt giữa các tế bào nấm men hoặc nấm mốc và vi khuẩn từ các khuẩn lạc, nếucần

Đếm các khuẩn lạc nấm men và các khuẩn lạc/chồi nấm mốc riêng rẽ, nếu cần

Để nhận biết nấm men và nấm mốc, chọn các vùng phát triển nấm và lấy ra để kiểm trabằng kính hiển vi hoặc cấy trên môi trường phân lập hoặc nhận dạng thích hợp.

3.3.11.Biểu thị kết quả và giới hạn tin cậy

Ghi lại các khuẩn lạc nấm men và các khuẩn lạc/chồi nấm mốc riêng rẽ, nếu cần

3.4. ĐỊNH LƯỢNG STAPHYLOCOCCI THEO TCVN 4830-1:2005

3.4.1 Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp định lượng staphylococci có phản ứngdương tính với coagulase trên đĩa thạch có mặt trong các sản phẩm dùng cho con ngườihoặc thức ăn chăn nuôi, bằng cách đếm số khuẩn lạc thu được trên môi trường đặc (môitrường Baird-Parker) sau khi ủ trong điều kiện hiếu khí ở 35 C đến 37 C

3.4.2.2 Định lượng staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase (enumeration of the coagulase-positive staphylococci)

- việc xác định số lượng staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase tìmthấy được trong một mililit hoặc trong một gam mẫu khi tiến hành thử nghiệmtheo phương pháp quy định trong tiêu chuẩn này

3.4.3 Nguyên tắc

Cấy lên bề mặt của môi trường cấy đặc chọn lọc, sử dụng hai đĩa, dùng một lượngmẫu thử quy định nếu sản phẩm ở dạng lỏng, hoặc với một lượng huyền phù ban đầu quyđịnh nếu sản phẩm ở dạng khác

Trong cùng một điều kiện, cấy các dung dịch pha loãng thập phân của mẫu thửhoặc của huyền phù ban đầu, dùng hai đĩa cho mỗi độ pha loãng

Ủ các đĩa trong điều kiện hiếu khí ở 35 C hoặc 37 C 1) và kiểm tra sau 24h và48h.

Tính số lượng staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase trong mộtmililit, hoặc trong một gam mẫu từ số lượng khuẩn lạc điển hình và/ hoặc không điểnhình trên các đĩa ở các bộ phận pha loãng đã chọn sao cho kết quả có ý nghĩa và đượckhẳng định bằng kết quả thử coagulase dương tính

3.4.4 Dịch pha loãng và môi trường cấy

3.4.4.1 Yêu cầu chung

Đối với thực hành trong phòng thí nghiệm, xem TCVN 6404 (ISO 7218)

3.4.4.2 Dịch pha loãng

Xem TCVN 6507 (ISO 6887-1) và tiêu chuẩn riêng liên quan đến sản phẩm cần kiểm tra

3.4.4.3 Môi trường thạch Baird-Parker 2)

CHÚ THÍCH: Có thể sử dụng môi trường bán sẵn, trong trường hợp này phải theo đúng các chỉ dẫn của nhà sản xuất

Nước vừa đủ

12 g đến 22 g 1)

1 000 ml1) Phụ thuộc vào sức đông của thạch

 Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước bằngcách đun sôi

Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng, pH là 7,2 ± 0,2 ở 25 C, nếu cần

Chuyển các lượng 100 ml môi trường vào các bình hoặc các lọ (6.5) có dung tíchthích hợp

Hòa tan hoàn toàn kali telurit trong nước bằng cách đun nóng rất nhẹ

Bột phải dễ tan Nếu có mặt chất không hòa tan màu trắng trong nước thì loại bỏbột đó

Lọc qua màng lọc cỡ lỗ 0,22 µm để khử trùng

Dung dịch có thể được bảo quản tối đa một tháng ở nhiệt độ + 3 C ± 2 C.

Loại bỏ dung dịch, nếu có kết tủa màu trắng

3.4.5.2 Dung dịch nhũ tương lòng đỏ trứng (nồng độ khoảng 20 % hoặc theo các chỉ dẫn của nhà sản xuất).

CHÚ THÍCH: Có thể sử dụng dung dịch bán sẵn, nếu có

Sử dụng trứng gà tươi còn nguyên vẹn Dùng bàn chải, rửa trứng trong dung dịchtẩy rửa Tráng sạch dưới dạng nước chảy, sau đó khử trùng vỏ bằng cách ngâm trongetanol (70 % thể tích) trong 30 giây và để cho đến khô trong không khí, hoặc bằng cáchphun cồn sau đó tiệt trùng bằng ngọn lửa

Tiến hành ở điều kiện vô trùng, đập vỡ từng quả trứng và tách lỏng ra khỏi lòngtrắng bằng cách chuyển lòng đỏ từ nửa vỏ quả này sang nửa vỏ quả còn lại nhiều lần.Cho lòng đỏ vào trong bình vô trùng và thêm bốn phần thể tích nước vô trùng Trộn kỹ.Đun nóng hỗn hợp này trong nồi cách thủy đặt ở nhiệt độ 47 C trong 2 h và để ở nhiệt

độ + 3C ± 2 C từ 18 h đến 24 h để tạo kết tủa Trong điều kiện vô trùng, thu phần chấtlỏng nổi phía trên và bình vô trùng để sử dụng

Dịch nhũ tương này có thể bảo quản ở nhiệt độ + 3 C ± 2 C tối đa 72 h