đánh giá hiệu quả sử dụng nano bạc và thảo dược với khả năng phòng trừ bệnh bạc lá lúa

Đánh giá tác dụng ức chế vi khuẩn in vitro của cao khô dịch chiết lá Trầu không sử dụng các dung môi tách chiết khác nhau đối với Xanthomonas oryzae.. Đánh giá tác dụng của nano bạc và c

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

VŨ THÀNH QUANG

ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ SỬ DỤNG NANO BẠC

VÀ THẢO DƯỢC VỚI KHẢ NĂNG PHÒNG TRỪ

BỆNH BẠC LÁ LÚA

Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Thanh Hải

TS Nguyễn Thanh Tuấn

NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2016

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan khóa luận này là công trình nghiên cứu của bản thân tôi dưới

sự hướng dẫn của TS Nguyễn Thanh Hải và được thực hiện tại khoa Công nghệ Sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam Các số liệu, hình ảnh và kết quả được trình bày trong khóa luận là hoàn toàn trung thực Những thông tin tham khảo trên các sách, báo hay tạp chí đều được trích dẫn cụ thể nguồn sử dụng Tôi xin chịu trách nhiệm trước nhà trường về lời cam đoan này

Hà Nội, ngày tháng năm 2016

Tác giả luận văn

Vũ Thành Quang

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành được khóa luận tốt nghiệp này, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến tập thể giáo viên trong bộ môn Chọn giống- Di truyền, Khoa Nông học – Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình chỉ dạy, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Thanh Hải, TS Nguyễn Thanh Tuấn – người đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình giúp đỡ và động viên tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thiện tốt khóa luận này

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến ban lãnh đạo, tập thể cán bộ, kỹ thuật viên của khoa Công nghệ Sinh học, khoa Nông học, Trung tâm bảo tồn đa dạng nguồn gen- Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã quan tâm và tạo điều kiện giúp tôi thực hiện đề tài nghiên cứu Tôi cũng xin chân thành cảm ơn sự hỗ trợ, giúp đỡ, động viên của gia đình và bạn bè trong suốt quá trình hoàn thành khóa luận tốt nghiệp, cũng như trong quá trình học tập vừa qua

Mặc dù đã hết sức cố gắng song khóa luận không thể tránh khó những thiếu sót, kính mong quý thầy, cô góp ý để đề tài được hoàn thiện hơn

Sau cùng, tôi xin kính chúc quý Thầy, Cô giáo sức khỏe và thành công trong sự nghiệp đào tạo thế hệ tương lai, kính chúc Khoa Nông học đạt được nhiều thành công hơn nữa

Tôi xin trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2016

Tác giả luận văn

Vũ Thành Quang

MỤC LỤC

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục các từ viết tắt vi

Danh mục bảng vii

Danh mục hình viii

Trích yếu luận văn ix

Thesis abstract xi

Phần 1 Mở đầu 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích 2

1.3 Yêu cầu 3

1.4 Ý nghĩa khoa học 3

1.5 Ý nghĩa thực tiễn 3

Phần 2 Tổng quan tài liệu 4

2.1 Cơ sở lý luận về bạc lá lúa 4

2.1.1 Lịch sử phát hiện bệnh 4

2.1.2 Triệu chứng của bệnh 4

2.1.3 Tác hại do bạc lá lúa gây ra 5

2.1.4 Nguyên nhân gây bệnh bạc lá lúa 6

2.1.5 Quy luật và các yếu tố ảnh hưởng đến phát sinh, phát triển bệnh 7

2.1.6 Vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv.oryzae 8

2.2 Tình hình nghiên cứu thảo dược trên thế giới và ở việt nam 9

2.2.1 Tình hình nghiên cứu thảo dược trên thế giới 9

2.2.2 Tình hình nghiên cứu thảo dược tại Việt Nam 11

2.3 Nano bạc 18

2.3.1 Giới thiệu về nano bạc 18

2.3.2 Đặc tính kháng khuẩn của nano bạc 19

2.3.3 Cơ chế tác động của nano bạc 20

2.3.4 Ứng dụng của nano bạc 21

Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 25

3.1 Địa điểm nghiên cứu 25

3.2 Thời gian nghiên cứu 25

3.3 Vật liệu nghiên cứu 25

3.3.1 Dược liệu nghiên cứu 25

3.3.2 Vi khuẩn nghiên cứu 25

3.3.3 Giống lúa nghiên cứu 25

3.3.4 Nano bạc 26

3.3.5 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất và môi trường 26

3.4 Nội dung nghiên cứu 26

3.5 Phương pháp nghiên cứu 27

3.5.1 Phương pháp thu hái và xử lý thực vật 27

3.5.2 Phương pháp thu dịch chiết thực vật và đánh giá hiệu suất tách chiết 27

3.5.3 Phương pháp định tính xác định một số nhóm hợp chất có trong dịch chiết thực vật 28

3.5.4 Phương pháp pha loãng dịch chiết 29

3.5.5 Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường rắn và lỏng 30

3.5.6 Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn 30

3.5.7 Phương pháp đánh giá khả năng diệt khuẩn in vitro của dịch chiết thực vật 31

3.5.8 Phương pháp pha loãng nano bạc 32

3.5.9 Phương pháp đánh giá khả năng kháng khuẩn in vitro của nano bạc đối với vi khuẩn 32

3.5.10 Phương pháp đánh giá khả năng kháng khuẩn in vitro của dịch chiết thực vật khi phối trộn với nano bạc 33

3.5.11 Phương pháp đánh giá tác dụng của dịch chiết thực vật và nano bạc đối với lúa trong điều kiện thí nghiệm in vivo 34

3.5.12 Phương pháp xử lý số liệu 35

Phần 4 Kết quả và thảo luận 36

4.1 Đánh giá hiệu suất chiết xuất và khả năng ức chế vi khuẩn in vitro của cao khô dịch chiết thực vật 36

4.1.1 Đánh giá hiệu suất dịch chiết thực vật trong dung môi ethanol 70% 36

4.1.2 Đánh giá tác dụng diệt khuẩn in vitro của cao dịch chiết thực vật với vi khuẩn

Xanthomonas oryzae pv.oryzae 39

4.2 Đánh giá hiệu suất và định tính các nhóm chất trong cao khô dịch chiết lá trầu không sử dụng các dung môi tách chiết khác nhau 43

4.2.1 Hiệu suất tách chiết cao khô dịch chiết lá trầu không sử dụng các dung môi tách chiết khác nhau 43

4.2.2 Định tính xác định một số nhóm hoạt chất hòa tan trong cao khô dịch chiết lá trầu không bằng phương pháp hóa học 47

4.3 Đánh giá tác dụng ức chế vi khuẩn in vitro của cao khô dịch chiết lá Trầu không sử dụng các dung môi tách chiết khác nhau đối với Xanthomonas oryzae pv.oryzae isolates 04 và isolates 09 50

4.4 Đánh giá khả năng kháng khuẩn in vitro của cao khô dịch chiết lá trầu không khi pha loãng 53

4.5 Đánh giá tác dụng diệt khuẩn in vitro của nano bạc đối với vi khuẩn Xanthomonas oryzae 56

4.6 Đánh giá tác dụng ức chế vi khuẩn in vitro khi phối trộn cao khô dịch chiết lá Trầu không và nano bạc với vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv.oryzae 61

4.7 Đánh giá tác dụng của nano bạc và cao khô dịch chiết lá Trầu không đối với cây lúa trong điều kiện thí nghiệm in vivo 64

Phần 5 Kết luận và kiến nghị 68

5.1 Kết luận 68

5.2 Kiến nghị 69

Tài liệu tham khảo 70

Phụ lục 76

ppm Part per million

Xoo Xanthomonas oryzae pv Oryzae

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Số nguyên tử bạc trong một đơn vị thể tích 18

Bảng 3.1 Nguồn gốc và ký hiệu các isolates vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv Oryzae gây bệnh bạc lá trên cây lúa sử dụng trong nghiên cứu 25

Bảng 3.2 Hệ số pha loãng dịch chiết và nồng độ dịch chiết tương ứng 30

Bảng 3.3: Hệ số nồng độ nano pha loãng theo cơ số ½ 32

Bảng 4.1 Hiệu suất chiết của năm loại thực vật sử dụng dung môi ethanol 70% 37

Bảng 4.2 Khả năng ức chế vi khuẩn in vitro của cao dịch chiết thực vật ở nồng độ 100mg/ml đối với vi khuẩn Xoo (isolates 04) 41

Bảng 4.3 Khả năng ức chế vi khuẩn in vitro của cao dịch chiết thực vật dịch chiết thực vật ở nồng độ 100mg/ml đối với vi khuẩn Xoo (isolates 09) 41

Bảng 4.4 Hiệu suất tách chiết lá trầu không trong các loại dung môi khác nhau 44

Bảng 4.5 Kết quả định tính sơ bộ thành phần hóa học của cao khô dịch chiết lá trầu không sử dụng dung môi khác nhau 47

Bảng 4.6 Khả năng ức chế vi khuẩn in vitro của cao khô dịch chiết lá trầu không đối với vi khuẩn isolates 04 và isolates 09 50

Bảng 4.7 Tác dụng kháng khuẩn in vitro của cao khô dịch chiết lá trầu không khi pha loãng 53

Bảng 4.8 Kết quả đánh giá tác dụng diệt khuẩn của dung dịch nano bạc đối với vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae 57

Bảng 4.9 Khả năng diệt khuẩn in vitro khi phối trộn cao khô dịch chiết lá trầu không và nano bạc với vi khuẩn Xoo 61

Bảng 4.10 Chiều dài vết bệnh sau lây nhiễm và đánh giá khả năng kháng nhiễm của giống lúa IR 24 66

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv.oryzae 8

Hình 3.1 Sơ đồ pha loãng dịch chiết 30

Hình 3.2 Sơ đồ pha loãng các nồng độ nano bạc 32

Hình 4.1 Bột và cao khô dịch chiết của 05 loại dược liệu 37

Hình 4.2 Hiệu suất tách chiết của các loại dược liệu 38

Hình 4.3 Khả năng ức chế vi khuẩn in vitro của cao dịch chiết dược liệu 42

Hình 4.4 Dịch chiết lá trầu không thu được từ các loại dung môi khác nhau 44

Hình 4.5 Hiệu suất tách chiết lá trầu không sử dụng các dung môi khác nhau 46

Hình 4.6 Phản ứng định tính xác định các nhóm hoạt chất có trong cao dịch chiết lá Trầu không 49

Hình 4.7 Khả năng ức chế vi khuẩn in vitro của cao dịch chiết lá Trầu không (100mg/ml) sử dụng các dung môi khác nhau đối với vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae (isolates 04) 52

Hình 4.8 Khả năng ức chế vi khuẩn in vitro của cao khô dịch chiết khi pha loãng đối với vi khuẩn 56

Hình 4.9 Khả năng diệt khuẩn in vitro của nano bạc khi pha loãng ở các nồng độ và thời gian ngâm khác nhau đối với isolates 04 59

Hình 4.10 Khả năng diệt khuẩn in vitro của nano bạc khi pha loãng ở các nồng độ và thời gian ngâm khác nhau đối với isolates 09 60

Hình 4.11 Khả năng diệt khuẩn in vitro khi phối trộn cao khô dịch chiết lá trầu không và nano bạc với vi khuẩn Xoo 63

Hình 4.12 Chiều dài vết bệnh trên lá lúa khi sử dụng các công thức phun khác nhau (sau 18 ngày lây nhiễm) 66

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN

Tên tác giả: Vũ Thành Quang

Tên Luận văn: “Đánh giá hiệu quả sử dung nano bạc và thảo dược với khả năng phòng trừ bệnh bạc lá lúa”

Ngành: Khoa học cây trồng Mã số: 60.62.01.10

Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt nam

Mục đích nghiên cứu:

Nghiên cứu này được tiến hành nhằm kiểm tra hiệu suât tách chiết của các loại

thảo dược trong dung môi ethanol 70% và lá cây Trầu không (Piper betle) trong 07 loai

dung môi có độ phân cực khác nhau (nước cất, methanol 80%, ethanol 70%, ethanol 96%,

n –hexan, aceton 100%, aceton nitril 100%) Đồng thời cũng đánh giá khả năng ức chế vi

khuẩn in vitro, invivo của các cao khô dịch chiết thảo dược đối với 02 chủng vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae gây bệnh bạc lá lúa

Phương pháp nghiên cứu:

Nghiên cứu sử dụng phương pháp chiết xuất các loại thảo dược trong dung môi ethanol

70%; lá Trầu không ( Piper betle ) trong 07 dung môi với phân cực khác nhau (nước

cất, methanol 80 %, ethanol 70%, ethanol 96 %, n -hexan, acetone 100 %, acetone

nitrile 100 % ) Phương pháp đánh giá khả năng ức chế vi khuẩn invitro của dịch chiết xuất từ cao khô thảo dược, các hạt nano bạc cho 02 isolates vi khuẩn Xanthomonas

oryzae oryzae pv Phương pháp đánh giá tác dụng phòng trừ vi khuẩn invivo khi sử

dụng riêng rẽ và trộn giữa các hạt nano bạc và cao khô dịch chiết đối với vi khuẩn

Xanthomonas oryzae pv oryzae gây bệnh bạc lá lúa Phương pháp bố trí thí nghiệm và các phương pháp xử lý dữ liệu bằng phần mềm Excel 2007, IRRISTART 5.0

Kết quả chính và kết luận:

Kết quả thí nghiệm cho thấy, cao khô 4 loại dược liệu trừ Sài đất, đều có khả

năng ức chế vi khuẩn in vitro đối với cả hai chủng vi khuẩn nghiên cứu (04, 09) với

đường kính vòng vô khuẩn biến đổi từ 15,67 mm (cao khô Tỏi đối với chủng vi khuẩn 09) đến đến 25,33 mm (cao khô dịch chiết Trầu không đối với chủng vi khuẩn 09) Cao

khô dịch chiết Trầu không cho kết quả ức chế vi khuẩn in vitro tốt nhất

Kết quả nghiên cứu tách chiết lá Trầu không cho thấy hiệu suất chiết xuất trong

07 loại dung môi biến đổi từ 4,00% (dung môi n-hexan) đến 19,67 % (dung môi ethanol 96%) Trừ cao khô dịch chiết sử dụng dung môi nước cât, ở nồng độ 100mg/ml các cao

khô dịch chiết đều có khả năng ức chế vi khuẩn in vitro tốt đối với 02 chủng vi khuẩn

Đối với chủng vi khuẩn 04 đường kính vòng vô khuẩn biến đổi từ 15,67 mm (dung môi methanol) đến 26,00 (dung môi Ethanol 96%) Đới với chủng vi khuẩn 09 đường kính vòng vô khuẩn biến đổi từ 16,00 mm (dung môi methanol) đến 25,67 (dung môi

Ethanol 96%) Nồng độ nhỏ nhất của Nano bạc vẫn có khả năng ức chế in vitro 02 chủng vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae là 6,25ppm Khi sử dụng phối hợp cao

khô dịch chiết lá Trầu không với nano bạc ở nồng độ 3,13 ppm làm tăng khả năng ức

chế vi khuẩn in vitro của cao dịch chiết Nồng độ nhỏ nhất của cao dịch chiết lá Trầu

không sử dụng dung môi ethanol 96% khi bổ sung vào lỗ thạch vẫn quan sát thấy vòng

vô đối với cả 02 chủng vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae là 1,56 mg/ml

Khi sử dụng cao kết hợp với nano bạc (3,13 ppm), nồng độ cao khô nhỏ nhất

vẫn có tác dụng ức chế vi khuẩn in vitro là 0,78 mg/ml Sử dụng riêng lẻ hay phối hợp

dung dịch nano bạc và cao khô dịch chiết đều làm giảm khả năng gây bệnh bạc lá trong điều kiện thí nghiệm in vivo Chiều dài vết bệnh có giảm đi rõ rệt biến đổi từ 7,55 cm

đến 13,67 cm, tức là giảm đi chỉ còn 35,85% đến 64,91% so với đối chứng

THESIS ABSTRACT

Master candidate: Vu Thanh Quang

Thesis title : “Assessment of efficiency and herbal nanosilver solution with the ability

to control rice blight”

Major: Crop Science Code: 60.62.01.10

Education organization : Vietnam National University of Agriculture (VNUA)

Research Objectives:

The present study aimed to examine the effect of 05 herbs extracted by ethanol 70%

solvents and leaf extract of Piper betle extracted by sevent different solvents (distilled

water, methanol 80%, ethanol 70%, ethanol 96%, n-hexan, aceton 100% and aceton

ntril 100%) and evaluating the anti-bacterial effect of the extract on Xanthomonas oryzae pv oryzae which cause rice blight

Materials and Methods:

The study used methods of extraction of the herb in 70% ethanol solvent; Betel leaves

no (Piper betle) in 07 solvents with different polarization (distilled water, 80% methanol, 70% ethanol, 96% ethanol, n -hexan, 100% acetone, acetone nitrile 100%) Evaluation method capable of inhibiting bacteria in vitro of herbal extracts dry high, of silver nanoparticles for the bacterium Xanthomonas oryzae isolates 02 oryzae pv Assessment methods prevent bacterial effects vivo when used separately and mixing between high and dry extract silver nanoparticles to Xanthomonas oryzae pv oryzae bacteria causing rice blight Laboratory layout methods and data processing methods using Excel 2007 software, IRRISTART 5.0

Main findings and conclusions:

The studied result showed that, except extract Wedelia calendulaceae Less, 04/05 ectracts showed good anti-bacterial effect on Xanthomonas oryzae pv oryzae,

bacterial inhibition zone was ranked from 15.67mm (Garlic extract for 09 isolate) to

25.33mm (Piper betle extract for isolate 09) The Piper betle extract showed the best

anti-bacterial efficiency

The studied result of Piper betle extracted by sevent different solvents showed

that the extracted effciency was varied from 4.00% (n-hexan solvent) to 19.67% (ethanol 96% solvent) Except extract using distilled water solvent, at the concentration

of 100 mg/ml, all the extracts showed good anti-bacterial effect on isolate 04, 09 For isolate 04, 09 respectively the bacterial inhibition zone was ranked from 15.67mm

(methanol 80% solvent) to 26.00mm (ethanol 96% solvent) and 16.00 mm (methanol 80% solvent) to 25.67mm (ethanol 96% solvent) The minimum concentration of antimicrobial nano silver is 6.25ppm The ethanol 96% extracted solution showed the

best anti-bacterial efficiency Collaborate Piper betle extract with nano silver 3.13 ppm

gives higher antibacterial activity than using only extracts This extract remained the

anti-bacterial effect to Xanthomonas oryzae pv oryzae at concentration 1.56 mg/ml and

0,78 mg/ml (with nano silver 3,13 ppm)

Used separately or mixed nano silver and Piper betle extract (using ethanol 96

% solvent) are capable of Xanthomonas oryzae pv oryzae bacteria inhibition in vivo on rice variety IR24. Length lesions was ranked from 7.55 cm to 13.67 cm, ie reduced 35.85% - 64.91% compared to controls

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Cây lúa (Oryza Sativa L) là một trong những cây trồng cũng cấp nguồn

lương thực quan trọng nhất của loài người, với 40% dân số thế giới sử dụng lúa gạo làm nguồn lương thực chính và có ảnh hưởng đến đời sống của ít nhất 65% dân số thế giới

Việt Nam là một nước xuất khẩu lúa gạo lớn đứng thứ 2 trên thế giới (FAO, 2015) Tuy nhiên sản lượng lúa gạo hàng năm của nước ta luôn bị ảnh hưởng nghiêm trọng bởi các dịch bệnh phá hoại, đặc biệt là bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn

Xanthomonas oryzae pv oryzae đã gây giảm năng suất lúa gạo ở Châu Á lên tới

60% tổng năng suất lúa hàng năm (Đỗ Tấn Dũng và Nguyễn Văn Viên, 2005)

Có rất nhiều biện pháp như cơ giới, canh tác, hóa học và biện pháp sinh học

đã được sử dụng để ngăn chăṇ sự bùng phát dịch bệnh bạc lá lúa Hiện nay, biện pháp được người dân sử dụng phổ biến nhất là phun thuốc hóa học Tuy nhiên, việc sử dụng thuốc hóa học để phòng và trị bệnh bạc lá lúa sẽ gây ra nhiều vấn đề

về môi trường, ảnh hưởng đến sức khỏe con người và vật nuôi Chính vì vậy, cần tìm ra một biện pháp mới có thể tiêu diệt được trực tiếp vi khuẩn gây bệnh mà không gây ảnh hưởng cho người sử dụng Xu hướng quay trở lại nền nông nghiệp hữu cơ với việc tăng cường sử dụng chế phẩm sinh học, phân bón hữu cơ trong canh tác cây trồng đang là xu hướng chung của Việt Nam nói riêng và thế giới nói chung

Trong khi vấn đề lạm dụng thuốc bảo vệ thực vật và phân bón hóa học đã và đang làm ảnh hưởng rất lớn đến sức khỏe của con người, vật nuôi, môi trường xung quanh, mặt khác nó còn làm ảnh hưởng đến ngành xuất khẩu nông sản của các nước.Việc sử dụng thảo dược để phòng và trị các đối tượng sinh vật gây hại trên cây trồng nói chung và cây lúa nói riêng đã và đang được nghiên cứu và áp dụng rộng rãi Thuốc thảo mộc (Botanical hoặc Plant pesticides) là loại thuốc có nguồn gốc tự nhiên có thể kiểm soát được dịch hại theo cơ chế không độc, thân thiện với môi trường sinh thái và dễ sử dụng, những loại thuốc thảo mộc này có hiệu lực tốt

Ở Việt Nam, cho đến nay có một số công trình nghiên cứu về sử dụng thực vật và chế phẩm thảo mộc trong phòng trừ sâu hại rau họ hoa thập tự đạt hiệu quả cao: Theo Nguyễn Duy Trang (1995), việc sử dụng hạt củ đậu ở 4 dạng chế phẩm khác nhau (DC1, DC2, B1 và B2) và cây thanh hao hoa vàng ở dạng chế phẩm ST3 trong phòng trừ sâu hại rau họ hoa thập tự làm cho mật độ sâu giảm 66,9 – 100,0%, cao hơn hiệu lực phòng trừ của thuốc hóa học Sherpar 25EC và Wofatox 50EC (đạt 58,5% sau phun 72 giờ) Theo Quách Thị Ngọ (2000), hiệu quả trừ rệp của dung dịch ngâm hạt củ đậu, rễ cây Derris cao hơn so với hiệu quả của thuốc hóa học Sherpa 25 EC và thuốc Sumicidin 25EC từ 17,8 – 19,5% Đu

đủ và cỏ Siam có hiệu quả cao trong phòng trừ sâu xanh bướm trắng cao (đạt 73,56% sau phun 10 ngày) Chi cục Bảo vệ thực vật Phú Thọ những năm gần đây (từ 2013 đến nay) đã và đang hướng dẫn nông dân sử dụng các loại thảo dược như gừng, tỏi, ớt phòng trừ sâu khoang, sâu tơ, bọ nhảy

Bên cạnh đó, công nghệ Nano ra đời và đang là ngành công nghệ mũi nhọn của thế giới Với đặc tính kháng khuẩn mạnh, hạt nano bạc được chú ý rất sớm trong lĩnh vực công nghệ nano Từ lâu loài người đã biết đến tác dụng sát khuẩn mạnh của bạc, những chén bát, thìa nĩa, nồi niêu của người La Mã cổ, của các vua chúa phong kiến, đã chứng minh điều đó Trong chiến tranh thế giới thứ nhất, người ta thậm chí còn sử dụng các sản phẩm từ bạc để điều trị nhiễm trùng trước khi thuốc kháng sinh ra đời Tuy nhiên, tác dụng này của bạc không được ứng dụng rộng rãi do giá thành cao Gần đây, có nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng khi ở kích thước nano (từ 1 đến 100nm), hoạt tính sát khuẩn của bạc tăng lên khoảng

50000 lần so với bạc dạng khối, như vậy 1 gam bạc nano có thể sát khuẩn cho

hàng trăm mét vuông chất nền (Rokhsareh Sadeghi et al., 2012) Việc ứng dụng

công nghệ nano và sản suất các sản phẩm từ thảo dược đang là xu hướng mới góp phần nâng tầm giá trị của cây thuốc Việt Nam hội nhập với quốc tế

Từ những thực tế trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Đánh giá hiệu quả sử

dung nano bạc và thảo dược với khả năng phòng trừ bệnh bạc lá lúa”

1.2 MỤC ĐÍCH

Đánh giá được khả năng diệt khuẩn in vitro của các loại cao dịch chiết thảo

dược sử dụng các dung môi khác nhau và nano bạc đối với các isolates vi khuẩn

Xanthomonas oryzae pv oryzae gây bệnh bạc lá lúa Từ đó có cơ sở khoa học

bước đầu để khuyến cáo để sản xuất thử nghiệm chế phẩm thuốc bảo vệ thực vật sinh học

1.3 YÊU CẦU

+ Thu được cao khô dịch chiết thảo dược và đánh giá hiệu suất tách chiết khi sử dụng các dung môi khác nhau Xác định sơ bộ các nhóm hoạt chất có trong cao khô dịch chiết

+ Đánh giá khả năng diệt khuẩn in vitro của cao dịch chiết và nano bạc đối

với vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa

+ Đánh giá khả năng diệt khuẩn in vivo của cao dịch chiết và nano bạc đối

với vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa

1.4 Ý NGHĨA KHOA HỌC

Kết quả nghiên cứu của đề tài nhằm bổ sung cơ sở lý luận về tác dụng dược lý của thảo dược, làm tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo

1.5 Ý NGHĨA THỰC TIỄN

Sự thành công của đề tài giúp mở ra một hướng đi mới trong phòng trừ bệnh

do vi khuẩn gây ra trên thực vật Sử dụng các chế phẩm từ thảo dược và nano bạc giúp cải thiện được các vấn đề về môi trường, sức khỏe con người

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 CƠ SỞ LÍ LUẬN VỀ BẠC LÁ LÚA

2.1.1 Lịch sử phát hiện bệnh

Bệnh bạc lá lúa (Bacterial leaf blight ofrice ) được phát hiện lần đầu tiên ở Fukuoka, Nhật Bản vào khoảng năm 1884 – 1885 Ban đầu người ta lầm tưởng bệnh nguyên nhân gây nên triệu chứng bệnh là do acid đất (Bokura, 1911) Nhưng không lâu sau đó, người ta đã tìm được nguyên nhân gây bệnh là do vi

khuẩn thuộc loại Bacillus oryzea gây nên (Ishiyama, 1922) Loại vi khuẩn này

sau đó được Tagami, Mizukami(1962) and Mizukami, Wakimoto (1969) đặt tên

là Pseudomonas oryzea, cuối cùng là Ezuka, 1974 đã xác định là do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae gây nên

Bệnh bạc lá đã xuất hiện ở nhiều nước khác nhau trên khắp thế giới và cuối thập kỉ 60 đến đầu thập kỉ 80 của thế kỉ XX, đặc biệt là trên các nước trồng lúa của Châu Á như: Ấn Độ (1990), Philippin (1975), Indonexia (1950), Trung Quốc (1957) và ở các nước Bắc Châu Úc, Mỹ Latin, Trung Mỹ và Caribe (1975), Pakistan (1976) Và cho đến nay, bệnh đã gây hại phổ biến ở hầu hết các nước trồng lúa trên thế giới

Ở nước ta, bệnh bạc lá đã từ lâu gây hại trên các giống lúa mùa cũ, nhưng đặc biệt biệt từ năm 1965 - 1966 tới nay có những năm bệnh gây hại một cách nghiêm trọng ở các vùng đồng bằng trên các giống lúa mới nhập nội có năng suất cao vụ xuân và nhất là trong mùa vụ Theo số liệu thông kê của cục Bảo vệ thực vật, từ năm 1999- 2003 diện tích lúa bị hại do bệnh bạc lá gây ra trong cả nước là 108.691,4 ha (Miền Bắc là 86.429,2 ha; miền Nam là 22.262,2 ha), trong đó diện tích bị hại nặng nhất là 156,76 ha và diện tích mất trắng là 80 ha

2.1.2 Triệu chứng của bệnh

Năm 1960, Goto đã chỉ ra rằng: vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae

gây ra 3 triệu chứng điển hình của bệnh bạc lá lúa ở nhiệt đới: bạc lá, héo xanh (Kresek hay Wilt ) và vàng nhợt Cho đến nay mối quan hệ giữa 3 triệu chứng này vẫn chưa được làm sáng tỏ, nhiều thí nghiệm trong nhà lưới đã chứng minh hiện tượng Kresek và bạc lá khác nhau rõ rệt mặc dù chúng đều là triệu chứng ban đầu của sự nhiễm bệnh Các giống lúa khác nhau có thể biểu hiện triệu

chứng nhiễm Kresek hoặc bạc lá Triệu chứng vàng nhợt là ảnh hưởng sau, là hậu quả của sự bạc lá hay Kresek gây nên hoặc cũng có thể là do độc tố (toxin) của vi khuẩn sản sinh ra

Theo Lê Lương Tề (1980) thì ở Việt Nam, bệnh bạc lá lúa phát sinh phá hại suốt từ thời kỳ mạ đến chín nhưng có triệu chứng điển hình là ở thời kỳ lúa cây trên ruộng từ sau đẻ - trỗ, chín sữa

Trên mạ, triệu chứng thể hiện không đặc trưng như ở trên lúa, do đó cũng

dễ nhầm lẫn với các triệu chứng khác Chủ yếu vi khuẩn hại mạ gây ra triệu chứng ở mút lá hoặc mép lá mạ những vết dài ngắn khác nhau màu xanh vàng rồi nâu bạc, lá dễ bị khô

Trên lá lúa, triệu chứng bệnh thể hiện rõ hơn, tuy có thể biến đổi ít nhiều tuỳ theo giống lúa và điều kiện bên ngoài nhưng nói chung vết bệnh có những đặc điểm điển hình sau đây:

- Vết bệnh ở mép lá, mút lá lan dần vào phiến lá hoặc lan thẳng xuống gân chính, ở một số trường hợp vết bệnh có khi bắt đầu ở ngay giữa phiến lá

- Vết bệnh lan rộng theo đường gợn sóng hoặc thẳng, mô bệnh xanh tái vàng lục, cuối cùng cháy khô có màu nâu xám

- Thông thường ranh giới giữa mô bệnh với mô khỏe trên phiến lá rất rõ rệt, có giớ hạn theo đường gợn sóng vàng hoặc không vàng, có khi chỉ một đường viền màu nâu sẫm, đứt quãng hay không đứt quãng

Có thể căn cứ vào những đặc điểm triệu chứng trên để phát hiện bệnh Tuy nhiên nhiều khi vết bệnh quá cũ hoặc biến đổi quá nhiều theo giống và điều hiện bên ngoài, nhất là ở mạ do vậy có thể nhầm lẫn với những hiện tượng khô đầu lá sinh lý (Bùi Trọng Thủy và cs., 2007)

2.1.3 Tác hại do bạc lá lúa gây ra

Bệnh bạc lá do vi khuẩn Xoo được tìm thấy ở tất cả các vùng trồng lúa trên

thế giới Hàng năm, theo thống kê năng suất lúa toàn thế giới giảm từ 10 - 20% do

các bệnh vi khuẩn, trong đó 50% là do bệnh bạc lá gây nên (Mew et a., 1982)

Ở Việt Nam bệnh đã được phát hiện từ lâu trên các giống lúa mùa cũ (Hà Bích Thu và cs., 2002) Hiện nay, bệnh gây hại trên cả lúa lai và lúa thuần, đặc biệt gây hại nặng trên các giống lúa lai nhập nội từ Trung Quốc Tác hại của bệnh nặng hay nhẹ tuỳ thuộc vào giống lúa, thời điểm cây bị nhiễm bệnh và mức độ

nhiễm nặng hay nhẹ Tác hại của bệnh chủ yếu là làm cho lá đòng sớm tàn khô xác, giảm quang hợp, tăng lượng hạt lép, dẫn đến giảm năng suất lúa Theo nghiên cứu Mew (1987) năng suất giảm chủ yếu do sự thay đổi về số nhánh, số hạt chắc trên bông và khối lượng 1000 hạt

2.1.4 Nguyên nhân gây bệnh bạc lá lúa

a Nguồn gốc của bệnh bạc lá lúa

Khi mới xuất hiện ở Nhật Bản, người ta cho rằng bệnh có nguồn gốc sinh

lý, do đất chua gây nên Đến khi Takaishi (1908) và Boukara (1911) đã tìm thấy

vi khuẩn trong giọt dịch và lây bệnh lại được cho cây thì nguyên nhân gây bệnh

đã được giải đáp Vi khuẩn gây bệnh bạc lá đã được nhiều tác giả nghiên cứu và

đã từng được đặt nhiều cái tên khác nhau:

- Pseudomonas oryzae Uyeda et Ishiyama hoặc Phytomanas oryzae Magrou

- Xanthomonas campeitris p.v oryzae

- Xanthomonas kresek Schure

- Xanthomonas oryzae (Ishiyama) Dowson

Hiện nay vi khuẩn này được biết đến với cái tên Xanthomonas oryzae

pv.oryzae (Ishiyama)

b Nguyên nhân gây bệnh

Về nguồn bệnh bạc lá, các tác giả Nhật Bản cho rằng nguồn bệnh tồn tại chủ yếu trên một số cỏ dại họ Hoà thảo, nói cách khác một số cỏ dại là ký chủ phụ

của vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv.oryzae

Ở nước ta phát hiện thấy vi khuẩn hại trên lúa và trên các ký chủ cỏ dại, tàn dư rơm rạ của cây bệnh, lúa chét, cỏ môi, cỏ lồng vực, cỏ gừng bò (Lê Lương Tề, 1980) Mỗi vùng khác nhau thì cũng có sự khác nhau về thành phần và số lượng

chủng Xanthomonas oryzae pv.oryzae: Nhật Bản đã xác định được 5 chủng,

Philippine đã xác định được 6 chủng, Indonesia đã xác định được 9 chủng, miền Bắc Việt Nam đã xác định được 4 chủng với nhiều Isolates

Về nguyên nhân gây bệnh có thể kể đến một sô nguyên nhân chính sau:

- Một số giống mẫn cảm với bệnh bạc lá như một số giống tạp giao và một

số giống chất lượng Do thời tiết nóng ẩm, mưa to gió lớn xảy ra trong thời kỳ lúa cần quang hợp cao

- Do biện pháp canh tác làm đất, cây lúa nhiễm bệnh vàng lá sau lập thu,

bón thêm phân cấp cứu vàng lá, cây lúa ra lớp rễ mới phát triển lá non nên gặp mưa dông dễ nhiễm bệnh bạc lá

- Bệnh thường mẫn cảm với lượng đạm dư trong lá, những ruộng bón đạm nhiều, bón muộn, bón lai rai, bón không cân đối giữ đạm, lân và kaly, những ruộng trũng hẩu dồn đạm cuối vụ, do biện pháp thâm canh gieo cấy, chăm bón không đúng kỹ thuật

2.1.5 Quy luật và các yếu tố ảnh hưởng đến phát sinh, phát triển bệnh

a Quy luật phát sinh, phát triển

Bệnh bạc lá phát sinh phát triển mạnh ở vụ mùa các tỉnh phía Bắc Bệnh phát triển, lây lan nhanh trong điều kiện nhiệt độ 26-29°C, ẩm độ 90%, đặc biệt khi có mưa to và gió lớn làm rập nát lá lúa tạo thuận lợi cho bệnh truyền lan (Phan Hữu Tôn, 2004) Vì thế vụ mùa bệnh thường gây tác hại nặng hơn vụ xuân Vụ chiêm xuân bệnh phát triển mạnh vào tháng 5-6, còn vụ mùa là tháng 8-9 khi có nhiều mưa bão gây tổn thương cho lá lúa

Nhìn chung, bệnh phát triển mạnh nhất vào giai đoạn lúa làm đòng đến chín sữa vì đây là giai đoạn lúa mẫn cảm nhất với bệnh bạc lá

b Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát sinh, phát triển bệnh

Có nhiều yếu tố ngoại cảnh ảnh hưởng đến sự phát sinh phát triển của bệnh Ẩm độ và lượng mưa là hai yếu tố quyết định cho sự phát sinh phát triển của bệnh bạc lá, lượng mưa lớn và nhiều kèm theo gió bão không những làm tổn thương đến lá khiến vi khuẩn dễ dàng xâm nhập mà còn tạo điều kiện cho vi khuẩn sinh sản nhanh, tạo nhiều giọt dịch vi khuẩn và lây lan nhanh chóng

Phân bón và thời kỳ bón cũng là yếu tố ảnh hưởng rõ rệt đến sự phát sinh phát triển của bệnh Lượng đạm bón lớn làm thân lá phát triển mạnh, cây mềm yếu và dễ bị tổn thương nên dễ bị nhiễm bệnh Bón sớm, tập trung sẽ giảm khả năng bị bệnh hơn so với bón muộn, rải rác Bón đạm cân đối với lân và kali cũng làm giảm khả năng nhiễm bệnh Tuy nhiên, nếu bón quá nhiều đạm (>120 kg N/ ha) thì bón thêm lân và kali cũng không còn tác dụng

Đất màu mỡ nhiều chất hữu cơ thì bệnh phát triển hơn ở chân đất cằn cỗi Những nơi đất chua, ngập úng, nhiều mùn, lúa bị che bóng bệnh cũng phát triển mạnh hơn

Giống cũng là một yếu tố ảnh hưởng đến sự phát sinh phát triển của bệnh bạc lá Các giống lúa cũ, lúa địa phương nhiễm bệnh nhẹ hơn so với các giống lúa nhập nội có thời gian sinh trưởng ngắn, phàm ăn Theo điều tra của Viện bảo

vệ thực vật thì các giống lúa lai Trung Quốc nhập nội từ năm 1993 – 1997 hầu hết đều bị nhiễm bệnh bạc lá với mức tỷ lệ bệnh 50-80%, cấp phổ biến là 5-7, nếu bệnh nặng năng suất giảm 20-50%

2.1.6 Vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv.oryzae

a Phân loại khoa học

Loài : Xanthomonas oryzae pv.oryzae

b Đặc điểm của vi khuẩn bạc lá

Vi khuẩn hình gậy hai đầu hơi tròn, có một lông roi ở một đầu, kích thước 1- 2 x 0,5-0,9 µm, sống trên môi trường có khuẩn lạc hình tròn, màu vàng sáp, rìa nhẵn, vi khuẩn nhuộm gram âm, không có khả năng khử NO3, không có dịch hoá gelatin, không tạo ra NH3, indol, có khả năng tạo H2S

Hình 2.1 Vi khuẩn Xanthomonas oryzea pv oryzea

Nhiệt độ thích hợp nhất cho vi khuẩn sinh trưởng 26 – 30oC, nhiệt độ tối thiểu 0 – 5oC, tối đa 40oC Nhiệt độ gây chết là 53oC trong 10 phút, có thể sống trong phạm vi pH 5,7 – 8,5, thích hợp nhất ở pH 6,8 – 7,2 Vi khuẩn xâm nhiễm qua thuỷ khổng, lỗ khí ở trên mút lá và đặc biệt qua vết thương xây xát trên lá Khi đã tiếp xúc với bề mặt có màng nước ướt, vi khuẩn dễ dàng di động tiến vào bên trong các lỗ khí, qua vết thương mà sinh sản nhân lên về số lượng qua các bó mạch dẫn lan rộng đi (Nguyễn Công Khoái, 2002)

Trong điều kiện mưa ẩm thuận lợi cho việc phát triển của vi khuẩn, trên mặt lá bệnh tiết ra những giọt keo vi khuẩn thông qua sự va chạm giữa các lá lúa nhờ mưa gió mà truyền lan tới các lá, các cây khác để tiến hành lây nhiễm lặp lại trong nhiều đợt sinh trưởng Cho nên tuy là một loại bệnh có cự ly truyền nhiễm lây lan hẹp, song nó còn tùy thuộc vào mưa gió, giông bão xảy ra trong vụ mùa

mà bệnh có thể truyền lan với phạm vi không gian khá rộng, giọt keo vi khuẩn với số lượng nhiều, đó chính là một nguyên nhân quan trọng làm bệnh sau những đợt mưa gió vào cuối vụ lúa xuân và trong suốt vụ mùa ở nước ta (Phan Hữu Tôn, 2004)

2.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU THẢO DƯỢC TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM

Để phòng trừ dịch bệnh hại nông sản, người ta thường sử dụng các chất hóa học, thuốc trừ sâu… Và việc sử dụng tràn lan các chất hóa học này không chỉ làm giảm hiểu quả sản xuất và sử dụng nông sản mà còn gây ra nhiều vấn đề về môi trường, ảnh hưởng đến sức khỏe con người và vật nuôi Các chất có nguồn gốc tự nhiên là nguồn lợi đáng kể để nghiên cứu và sản xuất chế phẩm thay thế

các chất hóa học tổng hợp (Cos et al., 2006; Solanki, 2010) Thảo dược được ưa

chuộng bởi tính an toàn sinh học, không có hay ít có tác dụng phụ, thậm chí chưa

tìm thấy vi khuẩn kháng thuốc (Seyyednejad et al., 2010) Vì vậy, người ta có xu

hướng sử dụng các chất có nguồn gốc thảo dược thay cho các hợp chất hóa học

2.2.1 Tình hình nghiên cứu thảo dược trên thế giới

Việc sử dụng thảo dược ở khu vực Đông Á, Trung Quốc, Nhật Bản, cùng với Ấn Độ, là các nước tiêu thụ đông dược nhiều nhất Tại Trung Quốc, đông dược chiếm khoảng 30% lượng dược phẩm tiêu thụ, doanh số đông dược sản xuất tại Trung Quốc để tiêu thụ nội địa và xuất khẩu năm 2003 ước đạt 20 tỉ đô

la Tại Nhật Bản, đông dược được gọi với tên “Kampo”, cũng được chấp nhận và

sử dụng rộng rãi, với doanh số khoảng 1 tỉ đô la mỗi năm Ở khu vực Đông Nam

Á, Indonesia là nước đứng thứ hai trên thế giới sau Brazil về đa dạng sinh học cây thuốc, có tới 90% số lượng cây thuốc trên thế giới được tìm thấy ở đây Theo

số liệu năm 1995, có 40% dân số Indonesia sử dụng đông dược, trong đó có 70% sinh sống ở vùng nông thôn Các nước Đông Nam Á khác đều có tỉ lệ sử dụng đông dược đáng kể trong cộng đồng và hệ thống y tế Ở Việt Nam, nhu cầu sử dụng đông dược cũng rất lớn Theo đánh giá của Viện Dược liệu năm 1995, nhu cầu dược liệu toàn quốc khoảng 30.000 tấn, cung cấp cho 145 bệnh viện y học cổ truyền, 242 khoa y học cổ truyền trong bệnh viên đa khoa và khoảng 30.000 lương y đang hành nghề, ngoài ra còn cần khoảng 20.000 tấn cho nhu cầu xuất khẩu Nhiều chế phẩm đông dược đã được nghiên cứu tại các viện nghiên cứu và chuyển giao kĩ thuật cho các xí nghiệp sản xuất trong nước, như thuốc viêm gan Haina, thuốc hạ cholesterol máu và hạ huyết áp Ruventat, thuốc chống đái tháo đường Morantin, thuốc nhỏ mũi Ngũ sắc, thuốc hòa tan sỏi thận Somatan, Sotinin, thuốc tăng tuần hoàn máu Angelin, thuốc viêm gan Phyllantin (Hoàng Thị Tuyết Nhung, 2012)

Về nghiên cứu, cho tới nay đã có rất nhiều cây dược liệu được nghiên cứu một cách có hệ thống về thành phần hóa học và giá trị chữa bệnh Hàng loạt các nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới về dược liệu đã được công bố Năm 1817 Pellerier, Magendie tách ra được một loại alkaloid có tên emetin Rogers, 1912 nhận thấy dung dịch muối chlohydrat emetin 1/10.000 diệt được amip, từ đó emetin được dùng rộng rãi trong điều trị lỵ cấp tính ở ruột, gan do amip Nhiều loài cây Holarrhera đã được người Ấn Độ dùng để chữa sốt rét, lao, chữa lỵ Amip và Trichomonas, trong số 20 alkaloid chiết suất từ hạt và vỏ cây nhận thấy chất conessin có tác dụng mạnh với amip, đã được ứng dụng điều trị lỵ amip có kết quả Holarrhera antidysenterica đã được Viện Dược liệu tách chiết được một chế phẩm gọi là “Holanin” thành phần chủ yếu chứa conessin và các alkaloid khác, có tác dụng điều trị lỵ amip thể cấp, được xác nhận qua nhiều công trình nghiên cứu lâm sàng

Năm 1880, Davaine đã bắt đầu nghiên cứu tính kháng khuẩn của lá hồ đào đối với Bacillus anthracis R.Koch (1887) nghiên cứu chứng minh tính kháng

khuẩn của nhiều loại tinh dầu Cũng trong thời gian này Chamberland chứng minh nhiều loại tinh dầu có tính kháng khuẩn, các thí nghiệm này được nhiều

người như: Cadeae, Mennic, Bering, Reilling,…tiếp tục nghiên cứu

Cây Hồ đào (Juglals ligra – Juglaveae) chiết xuất được chất juglon, là một

dẫn chất natoquinon, chất này tác dụng với nhiều nấm và vi khuẩn có nha bào (Gries, 1943; Largralge, 1956)

Dịch chiết từ cây xoan chịu hạn (Azadirachta indica A.Juss) được tăng hiệu quả diệt sâu hại khi phối chế với vi khuẩn diệt côn trùng Bacillus thuringiensis (Bt) tạo ra một loại thuốc diệt sâu hại đa tác dụng (Dennis Dearth, 1992)

Tại Thái Lan, Sataporn Direkbusarakom et al(1997) đã thử nghiệm thành công khả năng kháng khuẩn của 2 loại thảo dược Psidium guarava, Moimonrdica charantina đối với vi khuẩn vibrio ssp Nồng độ ức chế tối thiểu của P.guarava

là 0,625 mg/ml và M.charantina là 1,25 mg/ml

Gần đây, các nhà khoa học trên thế giới phát hiện thêm nhiều đặc tính

quý của cây nấm Linh chi (Gannodrema lucidum) trong việc chữa trị bệnh về

gan, mật, ung thư nội tạng, thậm chí cả hiệu ứng ngăn ngừa và chống căn bệnh thế kỷ AIDS (Viện Dược liệu, 2001)

Dịch chiết cây hoa mộc có khả năng kiểm soát tốt glucose máu sau ăn trên chuột đái tháo đường và chuột bình thường (Wenyi kang, 2012)

Mới đây, Fernanda Domingues (2014) đã chiết xuất tinh dầu rau mùi

(Coriandrum sativum L.) có tác dụng ức chế vi khuẩn đối với 12 loại vi khuẩn như vi khuẩn E.Coli, Salmonella, khuẩn que ở nồng độ 1.6% tinh dầu rau mùi

2.2.2 Tình hình nghiên cứu thảo dược tại Việt Nam

Nước ta là một trong những đất nước từ xa xưa đã có truyền thống sử dụng thuốc đông y để chữa bệnh cho con người Với những danh y nổi tiếng qua các triều đại như: Tuệ Tĩnh (đời nhà Trần), Hải Thượng Lãn Ông – Lê Hữu Trác (đời nhà Hậu Lê),Đặng Văn Ngữ (1956) với công trình nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn trên 500 loài cây khác nhau,…Ngoài ra với một đất nước có nhiều dân tộc, mỗi một dân tộc lại có kinh nghiệm sử dụng các loại thảo dược khác nhau

Việt Nam có nguồn tài nguyên dược liệu vô cũng phong phú và đa dạng Theo thống kê của Viên dược liệu – Cây thuốc Việt Nam, rừng Việt Nam với hơn 7.000 loài được mô tả thì có tới 3.830 loài có dược tính được sử dụng làm thuốc Từ xa xưa, ông cha ta đã biết sử dụng nguồn dược liệu quý giá để phòng

bệnh và chữa bệnh: Rau mùi (Coriandrum sativum L.) tác dụng phát tán, thúc

đậu sởi cho mọc, trừ khí, khu phong, ngoài ra còn dùng làm thuốc giúp tiêu hóa,

chữa ho, ít sữa; Cúc hoa (Flos chrysanthemi) tác dụng tán phong thấp, thanh đầu, giải độc, chữa nhức đầu, đau mắt, sốt, cao huyết áp; Bạc hà (Metha arvensis L.)

dùng chữa cảm sốt, cảm mạo, mũi ngạt, đầu nhức, còn giúp cho sự tiêu hóa, chữa

kém ăn, ăn uống không tiêu, đau bụng đi ngoài; Cây bạch chỉ (Angelica dahurica) chữa sưng vú, nhức đầu, tràng nhạc, ghẻ lở, giảm đau; Húng chanh (

Coleus aromaticus Benth.) chữa cảm cúm, ho hen (Đỗ Tất Lợi, 1970)

Từ thế kỷ XIV, Tuệ Tĩnh đã sử dụng nhiều thảo mộc như Tỏi, Hẹ, Tô Mộc, hạt Cải, Trầu Không để trị một số bệnh viêm nhiễm

Từ giữa thế kỷ XX, theo kết quả nghiên cứu của Phạm Văn Ngữ (1956) trên

500 loài cây thuốc, đã khẳng định rằng nhiều cây có tác dụng kháng khuẩn rất lớn

Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Văn Hưởng và cs (1959), trên 1.000 cây

thuốc, chỉ ra rằng kháng sinh thực vật sử dụng rất an toàn, có tác dụng mạnh, nhóm nghiên cứu đã đưa ra chế phẩm cây Tô Mộc trị bệnh tiêu chảy

Phòng đông y thực nghiệm Viện vi trùng Việt nam (1961) đã nghiên cứu

thấy nước sắc Tô mộc (Caseanpinia sappan L) có tác dụng kháng sinh mạnh với

vi trùng Staphylococus 209P (vòng vô khuẩn 1,2cm), Sighaflexnery (0,7cm), Shighella sonnei (0,2cm), Shigella dysenteria Shiga (1cm), Bacillus subttills (1cm) Tác dụng này không bị nhiệt, dịch vị và dịch tụy tạng phá hủy

Nghiên cứu thuốc lá, thuốc lào (Nicotiana tabacum) có chứa alkaloid

thực vật – nicotin và nornicotin trừ được ngoại ký sinh trùng và côn trùng hại rau, cây công nghiệp (Trần Quang Hùng, 1995)

Trần Minh Hùng và cộng sự năm 1978 đã nghiên cứu sử dụng các kháng sinh thực vật trong nuôi dưỡng và phòng trị bệnh cho lợn; đặc biệt bệnh lợn con phân trắng đạt hiệu quả cao (Bùi Thị Tho 1996)

Theo nghiên cứu của bộ môn Dược liệu trường Đại học Dược Hà Nội, trong sài đất

có rất nhiều tinh dầu, muối vô cơ, về hoạt chất đến nay cơ bản vẫn chưa xác định được Huỳnh Kim Diệu (2003) đã thử nghiệm lá Xuân Hoa đối với heo chưa cai sữa có tác dụng tăng trọng và chữa được bệnh dịch tả

Nguyễn Thanh Hải và Bùi Thị Tho (2013) nghiên cứu tác dụng ức chế vi

khuẩn của dịch chiết tỏi (Allium Sativum L.) đối với E.coli gây bệnh và E.coli

kháng ampicillin, kanamycin Kết quả nghiên cứu cho thấy dịch chiết tỏi có khả năng kháng khuẩn tốt

Từ những nghiên cứu trên có thể thấy rõ được tầm quan trọng của cây thuốc

có nguồn gốc thảo dược đối với đời sống của con người Những hiểu biết cơ bản và những nghiên cứu ban đầu về thảo dược sẽ mở ra hướng đi mới cho việc sử dụng các cây thảo dược vào phòng và trị bệnh

a Cây trầu không ( Piper betle L.)

Theo Phạm Hoàng Hộ và Nguyễn Kim Đào, họ Hồ tiêu phân bố ở Việt

Nam có 5 chi gồm: Peperomia, Zippelis, Circaeocarpus, Piper, Lepianthes Trong đó, chi Piper L có 46 loài Cây trầu không phân bố nhiều ở Tây

nguyên, một số vùng khác cũng thấy có sự xuất hiện của khá nhiều của loài này là Vườn Quốc gia Cúc Phương (Ninh Bình) và Vườn quốc gia Ba Vì (Hà Nội), đây cũng chính là hai trong số những trung tâm đa dạng sinh học của nước ta Ngoài ra, trầu không còn được trồng nhiều ở khu dân cư, ven rừng, ven đường Cây trầu không ở nước ta thường mọc trong rừng ẩm ở độ cao từ

150 – 1.500 m, thường gặp ở độ cao 600 – 1.000 m

Trầu không được trồng bằng dây vào mùa xuân, người ta thường làm giàn cho cây leo Cây ưa ẩm và chất vôi nên thường trồng sát tường, cảnh bể nước để thuận tiện cho việc tưới nước và bón thêm vôi cũ

Trầu không có chứa 23 thành phần trong tinh dầu, chủ yếu là: methoxyphenyl acetate (14.95%), Eugenol (9.03%), 4-allyl-1,2-diacetoxybenzen (8.98%), β-caryophyllylene (7.06%), Chvicol (4.57%), Linalol (1.55%)

3-allyl-6-Theo Đỗ Tất Lợi trong lá trầu không có chứa 0,8- 1,8% có khi lên đến 2,4% tinh dầu, tỉ trọng 0,958- 1,054 thơm mùi crêozôt (củi đốt), vị nóng

Theo Nguyễn Nho Dũng (2011) tinh dầu trầu không có màu vàng nhạt, hương thơm nồng, khi nếm có vị nóng và cay Nhiều nghiên cứu gần đây cho thấy lá trầu không còn chứa cả đường khử, pectin 10%, alkaloid, chất tanin, phytosterol, flavonoid, steroid, axit hữu cơ

b Tỏi ( Allium sativum L.)

Tên khoa học: Alliun satium L, hay còn có tên khác là Đại toán (Trung Quốc), Ail (Pháp), Garlic (Anh) thuộc họ Hành – Alliaceae Nơi sống và thu hái:

Cây của miền Trung châu Á, được gây trồng ở nhiều nước ôn đới Ở nước ta, cũng trồng nhiều, có những vùng trồng Tỏi có tiếng ở Quảng Ngãi, Hà Bắc, Hải Hưng Tỏi là gia vị rất quen thuộc trong đời sống của nhân dân ta Thường ta

thu hoạch vào cuối đông, đầu xuân; có thể dùng tươi hay phơi khô dùng dần

Trong các nghiên cứu và thử nghiệm các loại thuốc chiết xuất từ dịch ép

củ Tỏi (Alliun satium L) trên người bệnh đã cho thấy Tỏi có tác dụng chữa trị

nhiều căn bệnh khác nhau Trong tỏi tươi có chất allicin, nhờ tác dụng của men allinaza chuyển hóa aliin có sẵn trong tỏi thành allicin, là chất chủ yếu gây tác

dụng đối với vi khuẩn Allicin là chất kháng sinh tự nhiên có tác dụng mạnh hơn

cả penicillin Nước tỏi pha loãng 125.000 lần vẫn có dấu hiệu ức chế nhiều loại

vi khuẩn gram âm và gram dương như: Staphylococcus, Streptococcus, samonella , V cholerae, B dysenteriae, Mycobacterium tuberculosis Tỏi cũng ức

chế sự phát triển của nhiều loại siêu vi như siêu vi trái ra, bại liệt, cúm và một số loại nấm gây bệnh ở da hoặc bộ phận sinh dục nữ như candida Trong Tỏi còn có liallyl sulfide, chất này tuy không mạnh bằng allicin nhưng có thể tồn tại lâu hơn

và giữ nguyên được dược tính khi nấu Data (1948) đã phân lập từ Tỏi một chất gọi là allistalin, có tính chất giống như allicin; Machado (1948) cũng phân lập từ Tỏi chất garcin, nó là một chất kháng khuẩn màu vàng, không có mùi lưu huỳnh, không độc, có tác dụng đến cả vi khuẩn Gram (-) và Gram (+) Garcin có thể dễ dàng hấp thu qua thành ruột và có thể đi tới dịch não tủy, đã ứng dụng có kết quả trong nhiễm khuẩn Shigella hoặc do các bệnh ký sinh trùng như giun kim, giun đũa và giun tóc Các nhà khoa học Mỹ đã tìm thấy chất prostagladin A trong nước Tỏi, có khả năng hạn chế bệnh nhồi máu cơ tim, hạ huyết áp, phòng bệnh

xơ vữa động mạch Các bác sĩ Nhật Bản lại nhận xét rằng do Tỏi chứa chất allixotine nên Tỏi có tác dụng chữa đau lưng, viêm khớp Ngoài ra các nghiên cứu lâm sàng cũng cho thấy Tỏi có tác dụng chữa trị được nhiều căn bệnh như: các bệnh về tai, mũi, họng; bỏng nhiễm khuẩn và vết thương có mủ; dùng Tỏi để trị các loại giun; dùng nước ép Tỏi để trị viêm âm đạo trùng roi; chữa các bệnh

về tim mạch Theo kinh nghiệm của người dân,có thể dùng dung dịch tỏi ớt để diệt trừ một số loại sâu hại rau như: sâu xanh, sâu khoang…trên họ hoa thập tự

c Cây tô mộc (Caesalpinia sappan L)

Tô mộc còn có tên là cây gỗ vang, cây vang nhuộm, cây tô phượng thuộc

họ Vang Caesalpiniaceae Vị thuốc Tô mộc(Lignum Caesalpiniae sappari) là gỗ

phơi khô của cây gỗ vang hay cây tô mộc

Trong cây Tô mộc có tannin, axit garlic, chất sappanin, chất brazilin và tinh dầu Brasilin là một chất khí có thể màu vàng.Với kiểm tra cho màu đỏ, khi oxy hóa sẽ cho braseilin.Cấu tạo của chất brasilin và brasilein gần giống chất hematoxylin và hematein (do hemaatoxylin oxy hóa) là chất màu lấy ở gỗ cây

Hematoxy campechianum L cùng họ

Phòng đông y thực nghiệm Viện vi trùng Việt nam (1961) đã nghiên cứu thấy nước sắc Tô mộc có tác dụng kháng sinh mạnh với vi trùng Staphylococus 209P (vòng vô khuẩn 1,2cm), Sighaflexnery (0,7cm), Shighella sonnei (0,2cm),

Shigella dysenteria Shiga (1cm), Bacillus subttills (1cm) Tác dụng này không bị nhiệt, dịch vị và dịch tụy tạng phá hủy

Theo M.Gabor (1951) brasilein có tác dụng kháng hisstamin Nếu tiêm brasilein vào màng bụng chuột bạch trước thì có thể đề phòng hiện tượng thay đổi ở mắt chuột bạch do tiêm dung dịch 1,5% hístamin clohidrat

Theo M Gabor, B Horvath, L Kiss và z Dirner (1952), brasilin và brasilein đều có tác dụng làm mạnh và kéo dài tác dụng cùa hocmon thượng thận đối với mẩu ruột cô lập của chuột bạch hoặc tử cung cô lập của thỏ và đối với huyết áp của thỏ

Năm 1952 M Gabor, I Szodady và z Dirner còn báo cáo thí nghiệm trên sinh thiết (coupe microscopique) tổ chức thận và nước của tổ chức thận thấy brasilin và brasilein có tác dụng ức chế men histìdin decacboxylaza

Nhân dân dùng tô mộc làm thuốc săn da và cầm máu dùng trong các trường hợp tử cung chảy máu, đẻ mà mất máu qúa nhiều, choáng váng, hoa mắt, hay còn dùng chữa lỵ ra máu, chảy máu trong ruột, xích bạch đới Một số vùng nhân dãn dùng tô mộc nấu với nước uống thay chè Phụ nữ có thai không dùng được

d Cây sài đất (Wedelia chinensis (Osbeck) Merr)

Cây Sài đất có tên khoa học là Wedelia chinensis (Osbeck) Merr., Họ Cúc –

Asteraceae hay ở nhiều nơi gọi cây sài đất là Húng trám, Ngổ núi, Cúc nháp, Hoa múc Toàn cây có chứa wedelocation, isoflavonoid, carotene, saponin, tannin, một ít tinh dầu và rất nhiều muối vô cơ

Theo Võ Văn Chi(1999) nước ép của cây sài đất có dầu màu đen hòa tan 11,2%, chất béo 29,7%, nhựa 44,95%; đường, tanin, saponin, các chất silice, pectin, mucin, lignin và các chất có cellulose Lá có chất wedelolacton vừa là một flavonoid vừa là coumarin Ngoài ra, còn có tinh dầu và muối vô cơ Theo tài liệu Trung Quốc, sài đất chứa wedelolacton, dimethyl wedelolacton, nor-wedelic acid và một saponin triterpen tương tự saponin Ro của nhân sâm (Trung dược từ hải IV 40)

* Govindachari and Premila(1985) đã tách được 3 chất saponin có hai dây đường đính vào khung acid oleanolic từ lá sài đất tươi Cấu trúc của 2 chất được xác định là β-D-glucosyl pyranosyl-3 - O - [O - β - D - xylo pvranosyl) (1 2), β D-glucuronopyranosyloleanolat(=β-D-glucopyranosyl-3-β0[CO-β-D

xylopyranosyl) (1 -> 2) (β-D-glucuronopyranosyl)] olean- 12 -en - 28 oat)

Chất thứ hai được xác định có cấu trúc tương tự như ginsennosid Ro có trong nhân sâm

Phân tích sài đất Ấn Độ không thấy có mặt của alkaloid nhưng những nghiên cứu ở Trung Quốc lại thấy có mặt các alkaloid trong cành, lá và hoa sài đất Chất isoflavonoid trong lá sài đất có cấu trúc lacton của 5 - 6 dihydroxy -

2 - (2:6 dihydroxy 4 methoxy phenyl) benzofuran-3 carboxylic với hàm lượng 0,05% Chất này tương tự chất comestrol có tác dụng oestrogen (The Wealth of India, Vol X p 568).Trong ống nghiệm, tác dụng kháng sinh của sài đất rất thấp,

tạo vòng vô khuẩn rất bé, đốivớiStaphylococcuslà 0,3 cm Streptococcus 0,1

cm, Bacillus typhi 0,1 cm Shigella flexneri không có tác dụng Còn trên lâm

sàng, ngược lại sài đất biểu hiện tác dụng kháng sinh và chống viêm rất rõ Năm

1966, Bệnh xá Ngô Quyền - Hải Phòng đã theo dõi 21 trường hợp viêm nhiễm trùng phần mềm (viêm tấy tỏa lan hay khu trú viêm quầng, áp xe, đầu đanh, phần lớn có sốt) chỉ dùng sài đất giã nát đắp lên chỗ viêm, không cho uống và không dùng một thứ thuốc nào khác và kết luận tác dụng chống viêm của sài đất rất rõ, với những hiện tượng sưng nóng đỏ đau dần dần biến mất; Sài đất không có tác dụng đối với những trạng thái viêm đã chuyển sang mưng mủ, áp xe hóa

e Cây Huyền diệp (Polyalthia longifolia var.pendula Hort.)

Tên khoa học: Polyathia longifolia var Pendula Hort.Tên thông thường: Huyền diệp, Hoàng nam thuộc họ Na: Annonaceae, thuộc chi Nhọc: Polyalthia Chi Nhọc (Polyalthia) là một chi lớn trong họ Na (Annonaceae), có khoảng 150

loài, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới châu Phi, châu Á và miền bắc nước Úc,

số lớn các loài tập trung ở Đông Nam Á Ở việt Nam có 27 loài, phân bố khắp các vùng

Từ dịch chiết methanol của cây Huyền diệp đã phân lập được một haliman diterpen mới, 3β,5β,16α - trihydroxyhalima - 13(14) - en - 15,16 - olit và oxoprotoberberine alkaloid, (-) - 8 - oxopolyathiain trong đó có một số hợp chất

có hoạt tính kháng một số dòng ung thư

Dịch chiết n-hexan của vỏ cây Huyền diệp đã phân lập được 9 hợp chất clerodan và ent - haliman diterpen mới là: 16 - hydroxycleroda - 4(18), 13 - dien

- 16,15 - olit; axit 16 - oxocleroda - 4(18), 13E - dien - 15 - oic; cleroda - 4(18), -

13 - dien - 16,15 - olit; 16 - hydroxyl - ent - Halima - 5(10), 13 - dien - 16,15 -

olit; axit 16 - oxo - ent - Halima - 5(10), 13E - dien - 15 - oic; ent - Halima - 1(10),13E - dien - 16,15 - olit; axit 16 - oxo - ent - halima - 5(10),13E - dien - 15

- oic; ent - Halima - 5(10),13 - dien - 16,15 - olit và ent - Halima - 5(10),13E - dien - 16,15 - olit cùng với 5 clerodan diterpen đã biết

Từ cây Huyền diệp, Chen et al (2000) đã phân lập được 1 hợp chất A haliman

diterpen mới, 3β,5β,16α - trihydroxyhaliman - 13(14) - en - 15,16 - olide và oxoprotoberberin alkaloid, (-) - 8 - oxopolyalthiain, cùng với 20 hợp chất đã biết, 16α

- hydroxycleroda - 3,13 - dien - 15,16 - olit; axit 16 - hydroxycleroda - 3,13 - dien - 15

- oic; axit cleroda - 3,13E - dien - 15 - oic; axit 3,12E - lolavadien - 15 - oic - 16 - al; (4→2)- abeo - 16 (R và S)- 2,13Z - kolavadien - 15,16 - olit - 3 - al; axit labd - 13E -

en - 8 - ol - 15 - oic; (-)- stepholidin, 1 - aza - 4 - methyl - 2 - oxo - 1,2 - dihydro - 9,10

- anthracenedion; 5 - hydroxyl - 6 - methoxyonychin; 6 - hydroxyl - 7 - methoxyonychin; liriodenin; oxoxylopin; (-) - anonain; (-) - asimilobin; (-) - norboldin; (+) - norboldin; (-) - norpallidin; axit ρ - hydroxybenzoic; β - sitosterol và stigmasterol

Một clerodan diterpenoit là 16 - hydroxycleroda - 13 - en - 15,16 – olit - 3

- on được phân lập từ vỏ cây Huyền diệp cùng với 23 hợp chất đã biết và các hợp chất phytosteroit

Phân lập theo định hướng hoạt tính sinh học của dịch chiết methanol lá cây Huyền diệp cho thấy hoạt tính kháng 13 dòng Gram dương và 9 dòng Gram âm, hợp chất (3S, 4R) - 3,4,5 - rihydroxylpentanoic acid - 1,4 - lacton tạo ra hoạt tính trên Phân lập theo nghiên cứu định hướng hoạt tính sinh học của dịch chiết rễ cây Huyền diệp cho thấy hoạt tính kháng khuẩn mạnh và người ta đã phân lập 3 hợp chất mới alkaloid pendulamin A, pendulamin B và pendulin cùng với stigmasterol 3 - O - β - D - glucosid, allantoin và isoursulin

2.3 NANO BẠC

2.3.1 Giới thiệu về nano bạc

a Khái niệm và nguồn gốc của công nghệ nano

Công nghệ Nano (Nanotechnology), hay còn gọi là sản xuất phân tử, là một ngành khoa học kỹ thuật liên quan tới thiết kế và sản xuất các mạch điện tử

và thiết bị cực nhỏ ở cấp độ phân tử của vật thể Viện công nghệ Nano Anh quốc (Institute of Nanotechnology) định nghĩa Nano là “một ngành khoa học và công nghệ mà ở đó các kích thước từ 0,1nm (Nanomét) tới 100nm đóng vai trò chủ đạo” Nanomét là đơn vị đo lường vũ trụ bằng 1 phần tỷ mét Công nghệ Nano thường đi đôi với các hệ thống vi cơ điện MEMS (micro-electromechanical systems) Các hệ thống này thường sử dụng công nghệ Nano nhưng có thể bao gồm cả các công nghệ khác ở cấp độ cao hơn phân tử

Ý tưởng cơ bản về công nghệ nano được đưa ra bởi nhà vật lý học người

Mỹ Richard Feynman vào năm 1959, ông cho rằng khoa học đã đi vào chiều sâu của cấu trúc vật chất đến từng phân tử, nguyên tử vào sâu hơn nữa Nhưng thuật ngữ “công nghệ nano” mới bắt đầu được sử dụng vào năm 1974 do Nario Taniguchi một nhà nghiên cứu tại trường đại học Tokyo sử dụng để đề cập khả năng chế tạo cấu trúc vi hình của mạch vi điện tử

Số nguyên tử chứa trong đó

- Không có hại cho sức khỏe con người với liều lượng tương đối cao, không

có phụ gia hóa chất

- Có khả năng phân tán ổn định trong các loại dung môi khác nhau (trong các dung môi phân cực như nước và trong các dung môi không phân cực như benzene, toluene)

- Độ bền hóa học cao, không bị biến đổi dưới tác dụng của ánh sáng và các tác nhân oxy hóa khử thông thường

- Chi phí cho quá trình sản xuất thấp

- Ổn định ở nhiệt độ cao

2.3.2 Đặc tính kháng khuẩn của nano bạc

Bạc là một nguyên tố có hoạt tính kháng khuẩn tự nhiên mạnh nhất được tìm thấy trên trái đất Ở dạng nano hoạt tính này còn tăng lên gấp bội, vì vậy khi công nghệ nano được phát triển các nhà khoa học đã sớm tìm đến hướng nghiên cứu chế tạo nano bạc phục vụ cho mục đích khử trùng

Bạc và các hợp chất của bạc thể hiện tính độc đối với vi khuẩn, virus, tảo và nấm Nano bạc có khả năng giết chết hơn 650 loại vi khuẩn khác nhau chỉ trong vòng một phút Tất cả các vi khuẩn không bị lờn với kháng sinh bạc và vì thế, các hạt nano bạc không bị mất tác dụng Ngoài ra, các hạt nano bạc cũng sẽ giúp tạo ra các oxygen hoạt tính từ trong không khí hoặc từ trong nước và từ đó phá hủy các màng tế bào của vi khuẩn

Từ xa xưa, con người đã sử dụng bạc làm các dụng cụ chứa đồ ăn, nước uống

để trị bệnh Trong chiến tranh thế giới thứ nhất, người ta thậm chí còn sử dụng các sản phẩm từ bạc để điều trị nhiễm trùng trước khi thuốc kháng sinh ra đời Ngày nay, cùng với sự ra đời và phát triển của công nghệ nano, con người đã chế tạo được bạc ở kích thước nano Điều này làm tăng đáng kể số ứng dụng của bạc Ở kích thước nano, bạc thể hiện khả năng kháng khuẩn mạnh mà không gây ảnh hưởng tới con người và môi trường Chính vì vậy, giới khoa học đang đầu tư nghiên cứu bạc

để phục vụ cho các ứng dụng trong y học, nhất là khi hiện tượng vi khuẩn kháng kháng sinh ngày càng phổ biến như ngày nay (Nguyễn Ngọc Hùng, 2011)

Tuy nhiên, sau khi con người phát minh ra thuốc kháng sinh (khoảng giữa thế

kỷ 20) với hiệu lực mạnh hơn, keo bạc đã bị thay thế dần Nhưng chỉ 30 năm sau đó người ta đã nhận ra rằng có rất nhiều loài vi khuẩn có khả năng chống lại tác dụng của thuốc kháng sinh và hiện tượng đó ngày càng trở thành vấn đề đáng lo ngại Vì vậy bằng lịch sử phòng bệnh lâu đời của mình nguyên tố bạc đã gây lại được sự chú

ý nơi các nhà y học bởi chính khả năng không gây hiệu ứng kháng thuốc

2.3.3 Cơ chế tác động của nano bạc

Hiện nay tồn tại một số quan điểm giải thích cơ chế diệt khuẩn của bạc được nhiều người ủng hộ Các quan điểm đó chủ yếu dựa trên sự tương tác tĩnh điện giữa ion bạc mang điện tích dương và bề mặt tế bào vi khuẩn mang điện tích

âm và trên sự vô hiệu hóa nhóm thiol trong enzym vận chuyển ôxy, hoặc trên sự tương tác của ion bạc với DNA dẫn đến sự đime hóa pyridin và cản trở quá trình sao chép DNA của tế bào vi khuẩn Các nhà khoa học thuộc hãng INOVATION Hàn Quốc cho rằng bạc tác dụng trực tiếp lên màng bảo vệ của tế bào vi khuẩn Màng này là một cấu trúc gồm các glycoprotein được liên kết với nhau bằng cầu nối axit amin để tạo độ cứng cho màng Các ion bạc vừa mới được giải phóng ra

từ bề mặt các hạt nano bạc tương tác với các nhóm peptidoglican và ức chế khả năng vận chuyển oxy của chúng vào bên trong tế bào, dẫn đến làm tê liệt vi khuẩn Nếu các ion bạc được lấy ra khỏi tế bào ngay sau đó, khả năng hoạt động của vi khuẩn có thể lại được phục hồi Các tế bào động vật cấp cao có lớp màng bảo vệ hoàn toàn khác so với tế bào vi sinh vật Chúng có hai lớp lipoprotein giàu liên kết đôi có khả năng cho điện tử do đó không cho phép các ion bạc xâm nhập, vì vậy chúng không bị tổn thương khi tiếp xúc với các ion bạc

Cơ chế tác động của các ion bạc lên vi khuẩn được các nhà khoa học Trung Quốc làm việc trong hãng ANSON mô tả như sau: khi ion Ag+ tác dụng với lớp màng của tế bào vi khuẩn gây bệnh nó sẽ phản ứng với nhóm sunphohydril –SH của phân tử men chuyển hóa oxy và vô hiệu hóa men này dẫn đến ức chế quá trình hô hấp của tế bào vi khuẩn:

Ngoài ra, các ion bạc còn có khả năng ức chế quá trình phát triển của vi khuẩn bằng cách sản sinh ra ôxy nguyên tử siêu hoạt tính trên bề mặt của hạt nano bạc: 2Ag+ + O-2 > 2Ag0 + O0

Liên quan đến cơ chế khử trùng của ion bạc, một số nhà nghiên cứu nghiêng về các quá trình hóa-lý, chẳng hạn:

- Quá trình ôxy hóa nguyên sinh chất của tế bào vi khuẩn hoặc quá trình phá hủy nguyên sinh chất bởi ôxy hòa tan trong nước với vai trò xúc tác của bạc

- Quá trình vô hiệu hóa men có chứa các nhóm –SH và –COOH; bằng phá

vỡ cân bằng áp suất thẩm thấu; bằng quá trình tạo phức với axit nucleic dẫn đến thây đổi cấu trúc DNA của vi sinh vật

- Tác động gián tiếp lên phân tử DNA bằng cách tăng số lượng các gốc tự

do dẫn đến làm giảm hoạt tính của các hợp chất chứa ôxy hoạt động

- Ức chế quá trình vận chuyển các ion Na+ và Сa2+ qua màng tế bào Ngoài ra, còn có ý kiến cho rằng bạc không tác động trực tiếp lên DNA của tế bào, mà gián tiếp làm tăng số lượng các gốc tự do dẫn đến làm giảm nồng

độ các hợp chất ôxy hoạt tính trong tế bào, làm rối loạn các quá trình ôxy hóa cũng như phosphoryl hóa trong tế bào vi khuẩn Cũng có quan niệm rằng một trong những nguyên nhân của tác dụng kháng khuẩn phổ rộng là sự ức chế quá trình vận chuyển qua màng của các ion Na+ và Ca2+ bởi ion bạc Ion bạc còn thể hiện rõ khả năng diệt nhiều chủng virus và nấm

Hiện nay trong khi cơ chế tác dụng của các ion bạc lên vi sinh vật vẫn chưa hoàn toàn sáng tỏ và đang tiếp tục được nghiên cứu nhưng hầu hết các nhà nghiên cứu có quan điểm thống nhất rằng chúng phá hủy chức năng hô hấp, hoặc phá hủy chức năng của thành tế bào, hoặc liên kết với DNA của tế bào vi sinh vật

và phá hủy chức năng của chúng

2.3.4 Ứng dụng của nano bạc

a Ứng dụng của nano bạc trong đời sống

Nano bạc được sử dụng trong đời sống với mục đích khử trùng, khử mùi

Nó có thể diệt các loài vi khuẩn, virut và nấm mốc, kể cả vi khuẩn kháng thuốc

do chúng không có khả năng đề kháng chống lại tác dụng của nano bạc Nano bạc không gây kích ứng, an toàn và có hiệu quả tác dụng cao, đồng thời có khả năng chữa trị mau lành các vết thương hở, vết bỏng hoặc các vết loét khó lành do bệnh tiểu đường hoặc do nằm bất động lâu ngày tạo ra

Nano bạc được sử dụng với mục đích:

• Khử trùng các không gian khác nhau: Bệnh viện, siêu thị, trường học, quán café, rạp chiếu phim, sân vận động, trong hộ gia đình

• Các công cụ khử trùng trong giao thông vận tải: xe hơi, tàu hỏa, máy bay, tàu thủy, xe taxi, xe buýt v.v

• Khử trùng, làm lành nhanh các vết bỏng, vết cắt, vết thương, vết loét, trầy xước, phát ban, cháy nắng, vết côn trùng cắn, bệnh da liễu, bệnh nấm, viêm mũi, viêm tai, mụn nhọt …

• Thực phẩm công nghiệp: khử trùng môi trường sản xuất, khử trùng thực phẩm đóng gói, khử trùng phương tiện vận chuyển, bảo quản sản phẩm

• Vệ sinh trong gia đình: khử trùng cho bệ xí, sàn gạch, bồn rửa, tay nắm cửa, thêm vào nước rửa tay, rửa chén, nước làm sạch, ; giữ cho quần áo và khăn tắm hoặc khăn lau mặt không chua hoặc nấm mốc; khử mùi,

• Các sản phẩm ngành công nghiệp dệt và quần áo: khử trùng ga giường, chăn, gối, khăn trải, quần áo, khẩu trang, tất, đồ lót,

• Khử trùng bể bơi: sử dụng làm chất kháng khuẩn cho bể bơi công cộng và

tư nhân mà không tạo ra các sản phẩm phụ độc hại trong quá trình khử trùng, ngăn chặn sự phát triển của tảo và nấm, trong khi không ảnh hưởng đến pH và màu của nước và thân thiện với môi trường

b Ứng dụng của nano bạc trong công nghiệp

Hiện nay, các nhà sản xuất đã sản xuất các hàng tiêu dùng sử dụng tính chất kháng khuẩn của các hạt nano bạc như tủ lạnh, điều hòa và máy giặt Ngoài ra các loại đồ chơi, quần áo, hộp đựng thực phẩm, chất tẩy quần áo cũng

đã sử dụng nano bạc Một số ứng dụng tiềm năng khác của các hạt nano bạc cũng đang được xem xét áp dụng trong mô cấy sinh học, băng vết thương, v.v Ngoài ra, hiện nay nano bạc còn ứng dụng sản xuất sợi nhân tạo dùng dệt vải, khăn quần áo có chức năng kháng khuẩn, chống hôi Nano bạc không chỉ tẩm, phủ lên bề mặt mà được đưa vào trong sản phẩm qua qui trình nóng chảy dùng sản xuất tấm ga trải giường, khăn lau chén, bát, thảm trải nền nhà, túi bọc tấm đệm giường, quần áo (tạp dề, vớ (tất), t-shirts …) cũng như các sản phẩm vệ sinh khác như quần áo cho bệnh viện, quần áo bảo vệ, khẩu trang Ngoài ra, nano bạc còn dùng trong các qui trình sản xuất khác như sản xuất nhựa nhiệt dẻo, qui trình phun

ép các bộ phận, các bình chứa, chai … hoặc ống nhựa dẫn chất lỏng, nước

c Ứng dụng của nano bạc trong y tế

Công nghệ nano tạo nên bước đột phá và cuộc cách mạng trong chẩn đoán, điều trị bệnh Các sản phẩm có kích thước nano dễ dàng xâm nhập vào mô, tế bào và dịch cơ thể người Công nghệ nano giúp tăng độ tan, tăng khả năng hấp thu, duy trì nồng độ cao trong máu để tăng hiệu quả điều trị Đồng thời giảm liều lượng thuốc cho người bệnh, giảm độc tính, đặc biệt với các hoạt chất điều trị ung thư …

Các nhà khoa học còn nghiên cứu sử dụng vật liệu nano để vận chuyển phân tử và tác nhân sinh trưởng đến các vết thương, vết bỏng, giúp vết thương

mau lành mà không để lại sẹo Một ứng dụng khác đang được nghiên cứu của sợi nano là tạo thành lớp màng ngăn làm ngừng quá trình chảy máu cũng như các chất lỏng khác nhanh và hiệu quả hơn…

Ngoài ra, nano bạc còn được dùng để khử trùng trong lĩnh vực y tế như khử trùng, làm lành nhanh các vết bỏng, vết cắt, vết thương, vết loét, trầy xước, phát ban, cháy nắng, vết côn trùng cắn, bệnh da liễu, bệnh nấm, viêm mũi, viêm tai, mụn nhọt … Điều trị viêm loét nướu răng, ngâm răng giả, … Khử trùng trong phụ khoa như viêm cổ tử cung, viêm âm đạo, bệnh hoa liễu (giang mai, bệnh lậu), Vệ sinh khử trùng vật liệu: Bông, băng, ống thông, khẩu trang, áo khoác và mũ phẫu thuật

Như vậy, hiện nay nano bạc được áp dụng trong rất nhiều lĩnh vực Hầu như, các ứng dụng này đều liên quan đến tính chất kháng khuẩn của kim loại bạc Ở kích thước nano, hiệu quả diệt khuẩn của nano bạc tăng lên nên đây là một ưu thế lớn của các hạt nano bạc đối với các sản phẩm sát khuẩn khác

d.Ứng dụng của nano bạc trong nông nghiệp

Đối với thủy sản: Nano bạc khi phân tán trong môi trường ao nuôi chúng sẽ phòng và diệt nguồn bệnh trong ao nuôi, ổn định màu nước, khử mùi hôi tanh của nước, đặc biệt đối với những ao có chất thải hữu cơ từ phân gia súc và gia cầm, hạn chế cá ăn nổi và các bệnh như đốm đỏ, đốm trắng, bệnh nấm thủy my, nấm mang, nấm bào tử…

Đối với chăn nuôi: Nano bạc cũng được sử dụng như một loại thuốc sát khuẩn chuồng trại, khử mùi hôi chuồng trại, tiêu diệt mầm bệnh, các loại vi khuẩn, vi rút có hại cho vật nuôi, cực kỳ hiệu quả trong việc phòng dịch và dập dịch và hoàn toàn không độc hại cho người và vật nuôi

Đối với trồng trọt: Nano bạc giúp phòng trừ và tiêu diệt các loại vi rút, vi khuẩn, nấm bệnh gây hại cây trồng, giảm hoặc không cần dùng các loại thuốc bảo vệ thực vật độc hại, từ đó tạo môi trường thuận lợi cho cây trồng sinh trưởng phát triển, nâng cao năng suất chất lượng nông sản, góp phần bảo vệ môi trường

và sức khỏe con người, cây trồng còn tăng khả năng sinh trưởng sau khi được tưới bằng dung dịch nano bạc Nano bạc có thể sử dụng cho tất cả các loại cây trồng, như hoa mầu (rau củ quả), cây lương thực (lúa, ngô), cây công nghiệp (hồ tiêu, cà phê, ca cao, chè, mía ), các loại hoa cây cảnh Sử dụng định kỳ đối với mỗi loại cây trồng khác nhau sẽ có lịch trình phun khác nhau Ví dụ, thời kỳ cây con sức đề kháng rất yếu, nên có thể xử lý ngay từ giai đoạn ngâm hạt giống

và làm đất, thời kỳ phát triển của lá nếu được sử lý dung dịch nano bạc thì lá sẽ khỏe, cây phát triển mạnh và tăng cường khả năng quang hợp Dung dịch bạc nano có thể sử dụng để xử lý đất trước khi trồng, do trong đất có rất nhiều mầm bệnh, vì vậy trước khi gieo hạt hoặc trồng cây, sử dụng dung dịch nano bạc phun đều lên bề mặt để tiêu diệt nấm bệnh vi khuẩn, sau đó tiến hành bón lót và gieo hạt hoặc trồng cây sẽ cho hiệu quả vượt trội

PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

Các nội dung nghiên cứu được thực hiện tại Khoa Công nghệ sinh học, Trung tâm Bảo tồn và Phát triển Nguồn gen Học viện Nông nghiệp Việt Nam

3.2 THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

Thời gian nghiên cứu từ tháng 1/2015 đến tháng 1/2016

3.3 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

3.3.1 Dược liệu nghiên cứu

Sử dụng 5 loại thảo dược bao gồm:

+ Lá cây Trầu không (Piper betle L.) được thu hái ở huyện Yên Dũng,

tỉnh Bắc Giang

+ Lá cây huyền diệp (Polyalthia longifolia var pendula) thu hái tại Vườn

dược liệu Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam

+ Thân lá cây Sài đất (Wedelia calendulaceae Less) thu hái tại huyện Văn

Giang, Tỉnh Hưng Yên

+ Gỗ Tô mộc được thu mua

+ Tỏi (Allium sativum L.) thu hái ở huyện Kinh Môn, tỉnh Hải Dương

3.3.2 Vi khuẩn nghiên cứu

Bảng 3.1 Nguồn gốc và ký hiệu các isolates vi khuẩn Xanthomonas oryzae

pv Oryzae gây bệnh bạc lá trên cây lúa sử dụng trong nghiên cứu

STT Kí hiệu chủng Phân lập từ giống Địa điểm thu thập mẫu bệnh

4 4 Bắc thơm 7 Bình Giang, Hải Dương

9 9 Thục Hưng Thành phố Việt Trì, Phú Thọ

- 2 isolates vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv.oryzae gây bệnh bạc lá trên

cây lúa do Trung tâm Bảo tồn và Phát triển Nguồn gen Học viện Nông nghiệp Việt Nam cung cấp

3.3.3 Giống lúa nghiên cứu

Giống lúa IR24 là giống chuẩn nhiễm (giống không mang gen kháng) được sử dụng làm ký chủ

3.3.4 Nano bạc

- Nano bạc có nồng độ gốc 100ppm, 90% các hạt nano bạc có kích thước

20 - 25 nm do bộ môn Sinh học khoa Công nghệ sinh học cung cấp

3.3.5 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất và môi trường

a Thiết bị, dụng cụ

Các thiết bị sử dụng trong quá trình thí nghiệm gồm có: tủ sấy, lò vi sóng;

tủ ấm nuôi vi khuẩn, tủ nuôi vi khuẩn lỏng lắc; cân phân tích; nồi hấp khử trùng autoclave; box cấy vô trùng; máy đo pH, máy li tâm, máy đo quang phổ, máy cô quay chân không Một số dụng cụ cần thiết như: Bình ống nghiệm, pipet man, đĩa petri, ống nghiệm, eppendof, đèn cồn, cốc thủy tinh, giá ống nghiệm, bình định mức, ống nghiệm

b Hóa chất - môi trường

+ Hóa chất

Các dung môi chiết: axit acetic 5%, ethanol 35%, ethanol 70%, ethanol 96%, nước cất, aceton nitril 50%, aceton nitril 100%

Dung môi pha chất tan : Dimethyl sulphoxit (DMSO)

Các hóa chất định tính một số thành phần hóa học trong dịch chiết

+ Môi trường

Môi trường sử dụng để phân lập và nuôi cấy các mẫu vi khuẩn là môi trường Wakimoto Tiến hành thí nghiệm, chúng tôi sử dụng môi trường LB (Luria Bertani) ở dạng lỏng và đặc trong quá trình tiến hành thí nghiệm

3.4 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Đánh giá khả năng gây bệnh bạc lá lúa của 10 chủng vi khuẩn trên 30 mẫu giống lúa đang được lưu giữ tại Trung tâm bảo tồn và phát triển nguồn gen

- Đánh giá hiệu suất và định tính các nhóm chất có trong cao dịch chiết 05

loại thực vật

- Đánh giá tác dụng diệt khuẩn in vitro của nano bạc và dịch chiết thực vật đối với 02 chủng vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv.oryzae gây bệnh bạc lá lúa

- Đánh giá tác dụng của nano bạc và dịch chiết thực vật với cây lúa trong

điều kiện thí nghiệm in vivo

3.5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.5.1 Phương pháp thu hái và xử lý thực vật

+ Lá cây Trầu không (Piper betle L ) được thu hái ở huyện Yên Dũng, tỉnh

Bắc Giang Thu lá lành lặn, bánh tẻ, không bị sâu Thu lá sạch vào những ngày khô ráo, khoảng từ 7 – 10 giờ sáng Lá tươi thu hái về được rửa dưới vòi nước sạch (2-3 lần) rồi rửa lại với nước cất, sau đó được sấy ở 400C Mẫu khô được nghiền thành bột mịn (<0.5mm) Bột lá đựng trong túi nilong bảo quản trong bình hút ẩm

+ Lá cây huyền diệp (Polyalthia longifolia var pendula) thu hái tại Vườn

dược liệu Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam Thu lá lành lặn, bánh tẻ, không bị sâu ở độ cao >1,5m Thu lá sạch vào những ngày khô ráo, khoảng từ 7 –

10 giờ sáng Lá tươi thu hái về được rửa dưới vòi nước sạch (2-3 lần) rồi rửa lại với nước cất, sau đó được sấy ở 400C Mẫu khô được nghiền thành bột mịn (<0.5mm) Bột lá đựng trong túi nilong bảo quản trong bình hút ẩm

+ Thân lá cây Sài đất (Wedelia calendulaceae Less) thu hái tại huyện Văn

Giang, tỉnh Hưng Yên Cây tươi thu hái về được rửa dưới vòi nước sạch (2-3 lần) rồi rửa với nước cất sau đó được sấy ở 400C Mẫu khô được nghiền thành bột mịn (<0.5mm) Bột lá đựng trong túi nilong bảo quản trong bình hút ẩm

+ Gỗ Tô mộc (Lignum Caesalpiniae sappari) được thu mua Tiến hành chẻ

nhỏ với kích thước < 0,5 cm, rửa dưới vòi nước sạch (2-3 lần) rồi rửa lại bằng nước cất, sau đó được sấy ở 400C Gỗ Tô mộc sau khi được sơ chế, nghiền thành bột mịn (<0.5mm) Bột lá đựng trong túi nilong bảo quản trong bình hút ẩm

+ Tỏi (Allium sativum L.) thu hái ở huyện Kinh Môn, tỉnh Hải Dương Tỏi

được dùng là tỏi ta, củ nhỏ, mùi hắc hơn so với tỏi lai, tỏi ta có chứa nhiều chất kháng sinh Củ tỏi được bóc bỏ vỏ, rửa sạch, để ráo nước, cho vào cối nghiền nhỏ

3.5.2 Phương pháp thu dịch chiết thực vật và đánh giá hiệu suất tách chiết

+ Thu dịch chiết bột dược liệu: Bột lá dược liệu được chiết với dung môi

ethanol 70% bằng phương pháp ngâm chiết lạnh ở nhiệt độ phòng với cùng một

tỷ lệ (2g bột lá khô/20ml dung môi), mỗi ngày được lắc đảo 2 lần Sau 72 giờ, thu dịch chiết, lọc qua vải màn và giấy lọc Whatman No.1, ly tâm Thu dịch chiết đem cô quay hút chân không để loại bỏ hoàn toàn dung môi Tới khi khối lượng của ống cô quay không đổi đem cân để tính hiệu suất tách chiết của các dung môi Cao cô toàn phần đã loại bỏ hết dung môi bảo quản trong tủ mát 40C để tiến hành nghiên cứu