Phân lập, xác định cấu trúc và đánh giá hoạt tính ức chế tế bào ung thư một số hợp chất hóa học từ loài thực vật tri mẫu (anemarrhena asphodeloides )

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊNTRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM ĐÀO MAI PHƯƠNG PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH ỨC CHẾ TẾ BÀO UNG THƯ MỘT SỐ HỢP CHẤT HÓA HỌC TỪ LOÀI THỰC VẬT TRI MẪU Anemarrh

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

ĐÀO MAI PHƯƠNG

PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH ỨC CHẾ TẾ BÀO UNG THƯ MỘT SỐ HỢP CHẤT

HÓA HỌC TỪ LOÀI THỰC VẬT TRI MẪU

(Anemarrhena asphodeloides )

Ngành: Hóa hữu cơ

Mã số: 8.44.01.14

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS PHẠM VĂN KHANG

THÁI NGUYÊN - 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu, kết quả nêu trong luận văn này là trung thực chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác.

Học viên

Đào Mai Phương

G DẪN

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành bày tỏ lòng kính trọng và lời cảm ơn sâu sắc của mình

tới TS Phạm Văn Khang - người thầy đã tin tưởng giao đề tài, tận tình hướng

dẫn, động viên và tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong suốt quá trình họctập, nghiên cứu và thực hiện luận văn Đồng thời tôi xin gửi lời cảm ơn tới cácthầy cô giáo và các học viên cao học K24 trong phòng thí nghiệm Hóa hữu cơ

đã tạo môi trường nghiên cứu khoa học thuận lợi giúp đỡ tôi hoàn thành các

kế hoạch nghiên cứu

Tôi xin chân thành cảm ơn các em sinh viên nghiên cứu đề tài khoa họchợp chất thiên nhiên đã cùng cộng tác với tôi trong trong việc tiến hành cácthí nghiệm thuộc đề tài luận văn

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường, Ban lãnh đạokhoa Hóa và phòng Đào tạo sau đại học - trường Đại học Sư phạm TháiNguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận văn này

Thái nguyên, tháng 5 năm 2018

Học viên

ĐÀO MAI PHƯƠNG

Trang bìa phụ

MỤC LỤC

Trang

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục chữ viết tắt dùng trong luận văn iv

Danh mục các bảng v

Danh mục các hình vi

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Khái quát về loài Tri mẫu (Anemarrhena asphodeloides Bunge) 3

1.1.1 Đặc điểm thực vật học 3

1.1.2 Công dụng của loài Tri mẫu[1] 5

1.2 Tình hình nghiên cứu về hoạt tính sinh học loài Tri mẫu 5

1.3 Tình hình nghiên cứu thành phần hóa học của loài Tri mẫu

14 1.3.1 Nhóm hợp chất saponin 14

1.3.2 Nhóm hợp chất phenolic 21

Chương 2 THỰC NGHIỆM 25

2.1 Hóa chất và thiết bị phân lập 25

2.1.1 Hóa chất 25

2.1.2 Hóa chất và tế bào dùng để thử hoạt tính sinh học 25

2.1.3 Thiết bị 25

2.2 Phương pháp xử lý mẫu thực vật, chiết tách và xác định cấu trúc các chất phân lập được 26

2.2.1 Xử lý mẫu thực vật 26

2.2.2 Chiết tách các chất 26

2.2.3 Xác định cấu trúc các chất 26

2.3 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào ung thư

26 2.3.1 Vật liệu và hóa chất 26

2.3.2 Phương pháp xác định tính độc tế bào ung thư (cytotoxic assay) 27

2.4 Chiết xuất hợp chất từ thân rễ Tri mẫu 28

2.4.1 Chiết xuất cao etanol từ thân rễ của loài Tri mẫu 28

2.4.2 Phân lập, tinh chế các hợp chất 28

2.4.3 Các giá trị phổ 1H, 13C-NMR của AA1, AA2 và AA3 31

2.4.4 Xác định hoạt tính độc tế bào trên dòng tế bào HeLa ( tế bào ung thư cổ tử cung) và tế bào A549 (tế bào ung thư gan) 32

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

3.1 Kết quả phân lập các hợp chất 34

3.2 Kết quả xác định cấu trúc của hợp chất 34

3.2.1 Phân tích cấu trúc hợp chất AA1 34

3.2.2 Phân tích cấu trúc hợp chất AA2 41

3.2.3 Phân tích cấu trúc hợp chất AA3 47

3.3 Kết quả nghiên cứu hoạt tính độc tế bào trên dòng tế bào ung thư HeLa (cổ tử cung) và A549 (tế bào ung thư gan) 52

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55

TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 PHỤ LỤC

: Phổ tương quan hai chiều H-HDEPT : Distortionless Enhancement by Polarisation Tranfer

: Phổ DEPTESI-Ms : Electron Impact Mass Spectroscopy

: Phổ khối lượngHMBC : Heternuclear multiple - Bond Corelation

: Phổ tương quan hai chiều H-C

e Chromatography

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Kết quả hạ đường huyết của dịch chiết nước Tri mẫu [3] 11

Bảng 1.2 Kết quả hạ đường huyết của cao Tri mẫu chiết bằng cồn 80o [3] 11

Bảng 3.1: Mốt số tín hiệu cộng hưởng trên 1H-NMR của chất AA1 và Sarsasapogenin 35

Bảng 3.2 Giá trị phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H và 13C 37

Bảng 3.3 Sự tương quan giữa HC của chất AA3 50

Bảng 3.4: Tác động gây độc tế bào ung thư của các mẫu nghiên cứu 53

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Hình vẽ mô tả loài Tri mẫu 4

Hình 1.2 Hình ảnh loài Tri mẫu 4

Hình 2.1 Sơ đồ sắc kí cột silicagel từ cao chiết n-butanol 29

Hình 3.1 Phổ 1H-NMR của chất AA1 34

Hình 3.2 Phổ 13C-NMR của chất AA1 36

Hình 3.3 Phổ DEPT-135 của chất AA1 36

Hình 3.4 Phổ HSQC của chất AA1 39

Hình 3.5 Sự tương quan giữa HC của chất AA1 (HMBC) 39

Hình 3.6 Phổ MS của chất AA1 40

Hình 3.7 Công thức cấu tạo của AA1 41

Hình 3.8 Phổ 1H-NMR của chất AA2 42

Hình 3.9 Phổ 13C-NMR của chất AA2 43

Hình 3.10 Phổ DEPT-135 của chất AA2 43

Hình 3.11 Phổ HSQC của chất AA2 45

Hình 3.12 Sự tương quan giữa HC của chất AA2 (HMBC) 45

Hình 3.13 Phổ MS của chất AA2 46

Hình 3.14 Công thức cấu tạo của AA2 47

Hình 3.15 Phổ 1H-NMR của chất AA3 48

Hình 3.16 Phổ 13C-NMR của chất AA3 48

Hình 3.17 Phổ HSQC của chất AA3 49

Hình 3.18 Sự tương quan giữa HC của chất AA3 (HMBC) 50

Hình 3.19 Phổ khối lượng của AA3 51

Hình 3.20 Công thức cấu tạo của AA3 51

Hình 3.21 Hình ảnh ức chế tế bào A549 54

Hình 3.22 Hình ảnh ức chế tế bào Hela 54

MỞ ĐẦU

Ngành hóa học các hợp chất thiên nhiên đang ngày càng khẳng định đượcvai trò quan trọng trong nghiên cứu và sử dụng thuốc Các nghiên cứu từ hợpchất thiên nhiên tạo tiền đề và là nguồn cung cấp nguyên liệu cho các ngànhcông nghiệp, nông nghiệp, mĩ phẩm, dược phẩm Các hợp chất tìm thấy trongthiên nhiên có hoạt tính sinh học tốt có thể được dùng trực tiếp trong y học.Ngày nay, hợp chất thiên nhiên và dẫn xuất của chúng chiếm 50% lượng thuốcđiều trị lâm sàng

Việt Nam ta có nguồn hợp chất thiên nhiên vô cùng phong phú đa dạng,phân bố trên toàn đất nước Từ nhiều thế kỉ trước, con người đã nghiên cứu

sử dụng trực tiếp các cây thuốc, con thuốc từ thiên nhiên để chữa n hiều bệnh

rất hiệu quả Tuy nhiên ngày nay, sự ô nhiễm môi trường, thực phẩm bẩn,

thói quen sinh hoạt xấu đã làm gia tăng ngày càng nhiều loại bệnh nghiêmtrọng như: ung thư, tiểu đường, béo phì, tim mạch, tiêu hóa Vì vậy việc tìmhiểu và nghiên cứu sâu hơn các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính tốt là vôcùng quan trọng

Trong số nguồn thảo dược phong phú chúng tôi đặc biệt chú ý loài Tri mẫu

(Anemarrhena asphodeloides Bunge) thuộc họ Thùa (Agavaceae) Loài

này thường mọc hoang và được trồng phổ biến tại vùng núi phía Bắc nước ta.Trên thế giới, có nhiều công trình nghiên cứu về loài Tri mẫu đã chứng minhdịch chiết và các hợp chất được phân lập từ các loài thực vật này có khả năng ứcchế nhiều dòng tế bào ung thư, có khả năng bảo vệ tế bào và nhiều tác dụngkhác Ở Việt Nam chưa có nhiều công trình nghiên cứu về thành phần hóahọc của loài Tri mẫu, việc khai thác và sử dụng thực vật trên chưa được quantâm đúng mức

Dó đó chúng tôi đề xuất đề tài: „„Phân lập, xác định cấu trúc và đánh giá hoạt tính ức chế tế bào ung thƣ một số hợp chất hóa học từ loài thực

vật Tri mẫu (Anemarrhena asphodeloides)”

Đề tài này khi hoàn thành sẽ cung cấp các thông tin khoa học giá trị làm

cơ sở khoa học quan trọng để sử dụng loài thực vật này làm thuốc chữa bệnh vàsàng lọc các hợp chất có hoạt tính tốt để tiến hành nghiên cứu tiếp theo Đồngthời góp phần vào đào tạo nguồn nhân lực cho vùng núi phía Bắc và cả nước

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Khái quát về loài Tri mẫu (Anemarrhena asphodeloides Bunge)

1.1.1 Đặc điểm thực vật học

1.1.1.1 Tên khoa học

- Tên khoa học: Anemarrhena asphodeloides Bunge Họ: Thùa (Agavaceae).

- Tên Việt Nam: Tri mẫu

- Tên khác: Zhi mu (Trung Quốc), Chimo (Nhật Bản), Ji mo (Hàn Quốc).

1.1.1.2 Đặc điểm thực vật

Cây Tri mẫu (Anemarrhena asphodeloides ) là cây thân rễ Tri mẫu vốn

tên là chi mâu do chi mâu là trứng con kiến, vì lúc mầm cây này mọc lên trônggiống trứng con kiến Sau này đọc lệch thành Tri mẫu (Lợi, 1997)[2]

Thân: Thân rễ mọc ngang ở dưới mặt đất hơi phẳng và tròn, bề mặt trênmọc nhiều rễ nhỏ màu vàng dài và rậm rạp [11].thẳng, hình trụ, cao khoảng 33-

36 cm, mọc thành bụi[1]

Rễ: mọc ngang trên mặt đất, tạo thành vòng hơi phẳng, bề mặt phía trên cónhững sợi dài màu vàng mọc rậm rạp Thân rễ hình khúc dẹt hoặc trụ, hơi congqueo, có khi phân nhánh, dài 3 – 15 cm, đường kính 0,8 – 1,5 cm Một đầu cònsót lại gốc thân và vết cuống lá màu vàng nhạt Mặt ngoài có màu vàng nâu đếnnâu Mặt trên của thân rễ có một rãnh lớn và có nhiều đốt vòng xếp sít nhau,trên đốt có nhiều gốc lá còn sót lại màu nâu vàng mọc ra 2 bên, mặt dưới cónếp nhăn và nhiều vết rễ nhỏ hình chấm tròn lồi lõm Mặt gẫy màu vàng nhạt.Mùi nhẹ Vị hơi ngọt, đắng, nhai có chất nhớt[1]

Lá: dài từ 15- 70 cm, rộng 3- 6 mm với nhiều gân lá song song và không

có gân chính rõ ràng[1]

Hoa: Nhành hoa mọc thẳng đứng, không phân nhánh, trên đó mọc ra lábắc đuôi nhọn, gai thưa thớt và hẹp 2-3 hoa mọc thành một cụm, phát triểntrên đỉnh và tạo thành một cành, không cuống hoặc rất ngắn khoảng 3 mm

Hoa màu xanh lá cây hoặc màu tím violet, sắp xếp thành hai vòng, thuôn, dài

7-8 mm[1]

Quả: thuôn dài, sáu cạnh dọc, dài 10-15 mm, nứt dọc trên các khe bụng

khi trưởng thành; mỗi quả chứa 1 -2 hạt, hạt hình lăng trụ, hai đầu nhọn cómàu đen[1]

- Hạt: hình thoi, nhọn ở cả hai đầu, màu đen [11]

Vào tháng 3 - 4 người ta đào lấy thân rễ rửa sạch phơi hay sấy khô[2]

A: Thân rễ B: Cành hoaC: HoaD: Tràng hoaE: Nhị hoaF: QuảG: Hạt

Hình 1.1 Hình vẽ mô tả loài Tri mẫu

Hình 1.2 Hình ảnh loài Tri mẫu

1.1.1.3 Phân bố

- Trên thế giới: Tri mẫu được trồng hoặc mọc hoang trên sườn núi ở MãnChâu, Mông Cổ và miền Bắc của Trung Quốc

- Ở Việt Nam: Tri mẫu mọc hoang ở miền núi phía Bắc và được trồng nhỏ

lẻ ở các tỉnh: Tuyên Quang, Bắc Kạn, Yên Bái

1.1.2 Công dụng của loài Tri mẫu [1]

Tri mẫu có vị đắng, tính lạnh, không độc, có tác dụng tu thận, bổ thủy, táhỏa, thường được dùng chữa bệnh tiêu khát (đái đường), hạ thủy, ích khí Hiện

nay Tri mẫu dùng làm thuốc chữa ho tiêu đờm, chữa sốt, sốt do viêm phổi.

Một số đơn thuốc kinh nghiệm có Tri mẫu:

- Chữa bụng chướng to, rất cứng rắn, chân tay nhỏ, ăn uống không

được: Uống thuốc gì cũng không khỏi, sau uống bài ngũ linh tâm gồm các vị

Tri mẫu, đan sâm, độc hoạt, hải tảo, qui vũ tiến, tần bông (hai vị sau chưaxác định) thì thấy lợi tiểu tiện, ăn uống được bệnh dần dần khỏi (theo sáchthiên kim ngoại đài)

- Chữa bệnh viêm phổi: Tri mẫu 5g, tang bạch bì 10g, mạch môn đông 8g,

nước 600ml, sắc còn 200ml, chia 3 lần uống trong ngày.

- Dương vật cường luôn: Tri mẫu, hoàng bá, xa tiền, mộc thông, thiên môn

đông, sinh thảo (cam thảo sống) các vị bằng nhau, mỗi vị 4g sắc uống.

- Có mang động thai: Tri mẫu 80g, tán nhỏ, viên với mật bằng hạt ngô,mỗi ngày uống 20 viên, chiêu với nước cháo

- Hắc lào: Tri mẫu mài với dấm bôi lên

1.2 Tình hình nghiên cứu về hoạt tính sinh học loài Tri mẫu

Như đã trình bày ở trên, trong loài thực vật này thì thành phần hóa học chủyếu là các saponin, các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của hai loài này cũngđịnh hướng theo tác dụng sinh học của loại hợp chất đó Dịch chiết tổng số của

loài thực vật tri mẫu (Anemarrhena asphodeloides Bunge) chỉ ra khả năng bảo

vệ tế bào não và cải thiện trí nhớ trên chuột thực nghiệm với tác nhân gây tổn

thương amyloid β-peptide và một số tác nhân khác [10-17] Đồng thời thể hiệnkhả năng ức chế các dòng tế bào ung thư HeLa, HepG2, BC, MKN45, vàKATO-III với liều lượng IC50 khoảng µM [14-15, 31]

Trong đó, gây được sự quan tâm lớn nhất là hoạt tính của Timosaponin III (TA3), đây là một saponin được phân lập từ rễ của cây tri mẫu, có khả năng khả năng ức chế enzym acetyl cholinesterase để cải thiện trí nhớ [13-16] Cơ chế của quá trình bảo vệ tế bào não của chất này có thể được giải thích bằng sự chống viêm của nó [21] Nó cũng thể hiện khả năng ức chế sự truyền dẫn tín hiệuNF-kappaB trong tế bào BV-2 và trong tế bào não SK-N-SH trên mô hình

A-chuột thực nghiệm, đây là những phần có ảnh hưởng lớn đến sự mất trí nhớ [21].Bên cạnh đó chất này cũng thể hiện khả năng ức chế nhiều tế bào ung thư như: ung thư biểu bì (SUNE-1), ung thư gan (HepG2), ung thư biểu mô cổ (HeLa), ung thư vú (MCF-7), đồng thời cũng thể hiện ức chế nhiều dạng tế bào ung thưkhác và một số hoạt tính sinh học như hoạt tính chống oxi hóa, kháng viêm,bảo vệ gan,… [12-17].

Bảng 1.1: Kết quả hạ đường huyết của dịch chiết nước Tri mẫu [3]

% g

Nhận xét: Tác dụng hạ đường huyết của cao Tri mẫu chiết bằng nước là tương

đối yếu, chỉ giảm được 18.45% với P=0.25

Bảng 1.2 Kết quả hạ đường huyết của cao Tri mẫu chiết bằng cồn 80o [3]

% g i P

1.3 Tình hình nghiên cứu thành phần hóa học của loài Tri mẫu

Cho đến nay người ta đã phát hiện loài Tri mẫu (Anemarrhena

asphodeloides Bunge) có thành phần hóa học phong phú và đa dạng Các nghiên

cứu đã chỉ ra, thành phần hóa học chính của Tri mẫu là hợp chất saponin và

phenolic, ngoài ra cũng có một vài hợp chất flavonoid, lignans, anemarans

và xanthones đã được phân lập [2-11, 30]

1.3.1 Nhóm hợp chất saponin

Các khung aglycon cơ bản trong các hợp chất saponin được tóm tắt dướiđây, các hợp chất này có thể liên kết với một hoặc nhiều phân tử đường, tồn tạirất ít ở dạng aglycon Về mặt phân loại, dựa theo cấu trúc hoá học có thể chiara: saponin triterpenoid và saponin steroid

a, Nhóm 1: Saponin acid (triterpenoid saponin) Phần genin của loại này có 30

carbon cấu tạo bởi 6 nhóm hemiterpen

Gl c O R

Gl c O HO

O O

(1): R=OH: Timosaponin H1[1] (3): Prototimosaponin A III [7](2): R= OCH3: Timosaponin H2[11]

O

R1

R2Gal O

O

Gal O

2 H

Gl c

(6): Timosaponin B- II [9]

Gl c O OH

Gl c(7): Timosaponin E1[10] (8): Timosaponin E2[10]

OH OCH3

O O OH

Gal O

2

Gl c

OH Gal O

R3O

O

R1

R2Gal O

2

Gl c

(11): R1=OH ,R2=H ,R3=H: Timosaponin N[20](12): R1=OH ,R2=H ,R3=CH3: Timosaponin O[20]

O Gl c

OH

O

Gal O 2

Gl c

(13): Anemarsaponin B- II[35]

Gl c

O

Gl c O O

O O

O OGal O

2

Gl c

Gal O 2

Gl c

(14): Anemarnoside A[29] (15): Anemarnoside B[29]

Gl c O OH

O

Gal O 2

Gl c

(16): Timosaponin J[29]

O OCH3

Gl c

Gl c O OH

Gl c O

O

O Gal O

2

Gl c

Gal O 2

Gl c

(19): Timosaponin B[29] (20): Anemarsaponin C[ 35]

Gl c

O

Gl c O

O O

Gl c

(25): Anemarsaponin B[8] (26): 25S-timosaponin

có 27 carbon như cholesterol, nhưng mạch nhánh từ C 20-27 tạo thành 2 vòng

O

Gl c Gal O

2

Gl c(28): R1=R3=H, R2=OH: Anemarrhena saponin III[9](29): R1=R3=R2=H: Timosaponin A-III[9]

(30): R1= R2=H, R3=OH: Marcogenin diglycoside[9]

O O

O O

(31): Anemarsaponin F[8] (32)

O O

O O

O O

O O

HO

Gal O

2

Gl c

Gal O 2

Gl c 2

Gal O

2

(40): Timosaponin A IV[49] (41): Anemarsaponin F[8]

O

R3 R1

R2Gal O

2

Gl c

(42): R1= R2=H, R3=OH: Marcogenin diglycoside[9]

HO OH O

OH O

OH Gal O

Trong loài Anemarrhena asphodeloides , bên cạnh các hợp chất saponin và

sapogenin trong loài thực vật Tri mẫu có các hợp chất phenolic chủ yếu có bộkhung cacbon: C6-C3-C6, C6-C4-C6, C6-C5-C6, C6-C1-C6 trong đó các dẫnxuất nyasol và isoflavonoid chiếm tỷ lệ lớn

- Nhóm cấu trúc C6-C3-C6: gồm 1 mạch 3 carbon liên kết với 2 nhân thơm.

H3CO OH

HO OMe HO

OH

(44): broussonin B[22] (45): broussonin A

O O OCH3

HO OH HO OH

(46): 2'-O-methylphlorethin (47): 1,3-bis-diphydroxyphenyl -4-penten-1-one

- Nhóm cấu trúc C6-C4-C6: gồm 1 mạch 4 carbon liên kết với 2 nhân thơm.