Nghiên cứu tần suất, đặc điểm thalassemia và các bệnh hemoglobin trong cộng đồng dân tộc Khmer ở đồng bằng sông Cửu Long

GS.TS. Phạm Quang Vinh – Chủ nhiệm Bộ môn Huyết học và Truyền máu, Trường Đại học Y Hà Nội; PGS.TS. Huỳnh Nghĩa – Phó chủ nhiệm Bộ môn Huyết học, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh; TS. Dương Bá Trực – Nguyên Trưởng khoa Huyết học lâm sàng, Bệnh viện Nhi Trung Ương; Prof. Suthat Fucharoen – Trung tâm nghiên cứu Thalassemia, Viện Nghiên cứu Sinh học phân tử, Đại học Mahidol, Thái Lan; những người Thầy đã luôn dành hết tâm sức hướng dẫn, truyền đạt cho tôi những kiến thức, phương pháp nghiên cứu khoa học vô cùng quý giá; động viên và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ Nệ̃I

Lấ THỊ HOÀNG MỸ

Nghiên cứu tần suất, đặc điểm thalassemia

và các bệnh hemoglobin trong cộng đồng dân tộc Khmer ở đồng bằng sông Cửu Long

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

HÀ Nệ̃I - 2018

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ Nệ̃I

Lấ THỊ HOÀNG MỸ

Nghiên cứu tần suất, đặc điểm thalassemia

và các bệnh hemoglobin trong cộng đồng dân tộc Khmer ở đồng bằng sông Cửu Long

Chuyờn ngành : Huyờ́t học và Truyờ̀n máu

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

Người hướng dõ̃n khoa học:

GS TS Phạm Quang Vinh PGS TS Huỳnh Nghĩa

HÀ Nệ̃I - 2018

Hoàn thành luận án, cho phép tôi bày tỏ lòng biết ơn và lời cảm ơn chânthành nhất tới:

- Đảng ủy, Ban Giám hiệu, Phòng Quản lý Đào tạo Sau đại học, Bộ mônHuyết học và Truyền máu - Trường Đại học Y Hà Nội đã tạo điều kiện, giúp

đỡ tôi hoàn thành luận án Tiến sĩ

- Đảng ủy, Ban Giám Hiệu Trường Đại học Y Dược Cần Thơ, Bệnh việnTrường Đại học Y Dược Cần Thơ, đã ủng hộ và tạo mọi điều kiện tốt nhấtcho tôi trong quá trình học tập và thực hiện đề tài nghiên cứu

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơncủa mình tới:

- GS.TS Phạm Quang Vinh – Chủ nhiệm Bộ môn Huyết học và

Truyền máu, Trường Đại học Y Hà Nội;

- PGS.TS Huỳnh Nghĩa – Phó chủ nhiệm Bộ môn Huyết học, Đại học

Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh;

- TS Dương Bá Trực – Nguyên Trưởng khoa Huyết học lâm sàng,

Bệnh viện Nhi Trung Ương;

- Prof Suthat Fucharoen – Trung tâm nghiên cứu Thalassemia, Viện

Nghiên cứu Sinh học phân tử, Đại học Mahidol, Thái Lan; - những ngườiThầy đã luôn dành hết tâm sức hướng dẫn, truyền đạt cho tôi những kiếnthức, phương pháp nghiên cứu khoa học vô cùng quý giá; động viên và tạođiều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án

Xin cho tôi được gửi lời tri ân đến Thầy – Cố PGS.TS Bùi Văn Viên, người Thầy đã luôn nhiệt tâm hướng dẫn, động viên tôi

trong quá trình thực hiện luận án…, ngay cả khi Thầy nằm trên giường bệnh

Viện nghiên cứu Sinh học Phân tử, Đại học Mahidol, Thái Lan; đơn vị dịch

vụ Thalassemia, Trường Đại học Khon Khaen, Thái Lan; Sở Khoa học vàcông nghệ tỉnh Sóc Trăng, Sở Y tế, trung tâm Y tế, các trạm y tế xã, phườngcác tỉnh Sóc Trăng, Trà Vinh, Bạc Liêu, Hậu Giang… đã giúp đỡ và tạo điềukiện cho tôi trong quá trình thu thập số liệu và thực hiện nghiên cứu

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, anh chị em đồng nghiệptại Trường Đại học Y Dược Cần Thơ, và bạn bè đã luôn dành cho tôi nhữngtình cảm quý mến, những lời động viên, chia sẻ, giúp tôi có thêm động lực đểhoàn thành luận án này

Hà Nội, ngày tháng năm 2018

Lê Thị Hoàng Mỹ

Tôi là Lê Thị Hoàng Mỹ, nghiên cứu sinh khóa 29 trường Đại học YHà Nội, chuyên ngành Huyết học và Truyền máu, xin cam đoan:

1 Đây là luận án do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫncủa GS.TS Phạm Quang Vinh và PGS.TS Huỳnh Nghĩa

2 Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đãđược công bố tại Việt Nam

3 Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trungthực và khách quan, đã được xác nhận và chấp thuận của cơ sở nơinghiên cứu

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này

Hà Nội, ngày tháng năm 2018

Người viết

Lê Thị Hoàng Mỹ

Lê Thị Hoàng Mỹ

α 0 -thalassemia

α + -thalassemia

α + -thal α-thal do các đột biến gây mất 1 gen globin-α

α 0 -thal α-thal do các đột biến gây mất 2 gen globin-α

gen globin α do xóa đoạn hoặc không xóa đoạn

biến có tính chất trơ

β/β E , β E /β E Bệnh lý hemoglobin E dị hợp tử, hemoglobin E đồng hợp tử

không bao gồm đột biến β E

HbCS Hemoglobin Constant Spring

HPFH Heriditary persistence of fetal hemoglobin, tồn lưu hemoglobin bào thai

MCH Mean Corpuscular Hemoglobin, lượng hemoglobin trung bình trong

hồng cầu MCHC Mean Corpuscular Hemoglobin Concentration, nồng độ hemoglobin

trung bình trong hồng cầu

MLPA multiplex ligation-dependent probe amplification, khuếch đại đa

đoạn dò phụ thuộc phản ứng nối

TPTTBMN

V

Tổng phân tích tế bào máu ngoại vi

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Đại cương về cấu trúc và chức năng của hemoglobin 3

1.2 Phân loại bệnh hemoglobin và cơ chế bệnh sinh 4

1.2.1 Phân loại bệnh hemoglobin 4

1.2.2 Cơ chế bệnh sinh 6

1.3 Đặc điểm bệnh hemoglobin 9

1.3.1 -thalassemia 9

1.3.2 Alpha thalassemia 11

1.3.3 Bệnh lý hemoglobin E 14

1.4 Các kỹ thuật sàng lọc và chẩn đoán 15

1.4.1 Các chỉ số hồng cầu 15

1.4.2 Khảo sát hình thái hồng cầu trên tiêu bản máu ngoại vi 16

1.4.3 Khảo sát sức bền thẩm thấu hồng cầu cải tiến một nồng độ 16

1.4.4 Xét nghiệm Dichlorophenolindophenol 17

1.4.5 Phân tích thành phần hemoglobin 18

1.4.6 Chẩn đoán phân tử 20

1.5 Tình hình nghiên cứu bệnh thalassemia và hemoglobin HbE trong và ngoài nước 28

1.5.1 Tại Việt Nam 28

1.5.2 Trên thế giới 31

1.6 Vài nét tổng quan về dân tộc Khmer 33

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35

2.1 Đối tượng nghiên cứu 35

2.1.1 Tiêu chuẩn chọn đối tượng 35

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ 35

2.2.2 Cỡ mẫu 35

2.2.3 Phương pháp chọn mẫu 36

2.2.4 Nội dung nghiên cứu 38

2.2.5 Phương pháp thu thập số liệu 43

2.2.6 Phương pháp hạn chế các sai số hệ thống 58

2.2.7 Phương pháp xử lý số liệu 59

2.3 Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu 59

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 61

3.1 Đặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu 61

3.2 Tần suất các thể thalassemia và bệnh Hb, tỉ lệ các kiểu đột biến gen globin trong cộng đồng dân tộc Khmer ở ĐBSCL 62

3.2.1 Tỉ lệ các thể thalassemia và bệnh Hb 62

3.2.2 Tỉ lệ mang gen thalassemia và HbE theo nơi cư trú 64

3.2.3 Tỉ lệ các kiểu ĐB gen globin trong cộng đồng dân tộc Khmer ĐBSCL 65

3.3 Đặc điểm lâm sàng và huyết học các thể thalassemia và bệnh Hb trong cộng đồng dân tộc Khmer ở ĐBSCL 69

3.3.1 Đặc điểm lâm sàng của các thể thalassemia và bệnh Hb 69

3.3.2 Đặc điểm huyết học của các thể thalassemia và bệnh Hb 70

Chương 4: BÀN LUẬN 89

4.1 Đặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu 89

4.1.1 Tuổi 89

4.1.2 Giới tính 89

4.1.3 Nghề nghiệp 90

4.1.4 Nơi cư trú 91

biến gen globin trong cộng đồng dân tộc Khmer ở ĐBSCL 92

4.2.1 Tần suất các thể thalassemia và bệnh hemoglobin 92

4.2.2 Tỉ lệ các kiểu đột biến gen globin 95

4.3 Đặc điểm lâm sàng và huyết học các thể thalassemia và bệnh Hb trong cộng đồng dân tộc Khmer ở ĐBSCL 102

4.3.1 Đặc điểm lâm sàng của các thể thalassemia và bệnh Hb 102

4.3.2 Đặc điểm huyết học của các thể thalassemia và bệnh lý Hb 103

KẾT LUẬN 131

KIẾN NGHỊ 133 CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Bảng 1.2 Ưu và nhược điểm của các phương pháp phân tích đột biến đã biết

trên gen globin 24

Bảng 1.3 Các phương pháp phân tích DNA chẩn đoán bệnh hemoglobin.27 Bảng 1.4 Tỉ lệ mang gen bệnh hemoglobin ở một số dân tộc Việt Nam .29

Bảng 1.5 Tỉ lệ mang gen thal và Hb E ở một số cộng đồng Châu Á 32

Bảng 2.1 Tiêu chuẩn chẩn đoán thiếu máu của WHO 40

Bảng 2.2 Mức độ thiếu máu phân loại theo WHO 40

Bảng 2.3 Trình tự các đoạn mồi trong phản ứng Gap-PCR 49

Bảng 2.4 Chu trình nhiệt của phản ứng Gap-PCR 50

Bảng 2.5 Thành phần phản ứng PCR khuếch đại gen globin-β trong kỹ thuật RDB 53

Bảng 2.6 Thành phần phản ứng HRM 56

Bảng 2.7 Trình tự mồi cho phản ứng HRM 56

Bảng 2.8 Chu trình nhiệt cho phản ứng HRM 57

Bảng 3.1 Đặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu 61

Bảng 3.2 Tỉ lệ các thể thalassemia và bệnh Hb trong nhóm có mang ĐB 64 Bảng 3.3 Tỉ lệ mang gen thalassemia và HbE theo nơi cư trú 64

Bảng 3.4 Tỉ lệ các kiểu gen globin-α trong nhóm có mang đột biến gen globin-α và trong cộng đồng 65

Bảng 3.5 Tỉ lệ các kiểu ĐBG globin-α trong cộng đồng 66

Bảng 3.6 Tỉ lệ kiểu gen và kiểu ĐB gen globin-β trong nhóm và trong cộng đồng 67

Bảng 3.7 Tỉ lệ các kiểu gen Hb E trong nhóm và trong cộng đồng 68

Bảng 3.8 Đặc điểm lâm sàng 69

Bảng 3.9 Chỉ số hồng cầu trong các thể -thal đơn độc 70

Bảng 3.12 Chỉ số hồng cầu trong các thể HbE đơn độc và kết hợp ở người lớn 73

Bảng 3.13 Đặc điểm hồng cầu trong các thể α-thal 74

Bảng 3.14 Đặc điểm hồng cầu trong các kiểu gen β-thal 75

Bảng 3.15 Đặc điểm hồng cầu của các kiểu gen HbE kết hợp α -thal 76

Bảng 3.16 Thành phần Hb của các thể α-thal 77

Bảng 3.17 Thành phần Hb của các thể β-thal 78

Bảng 3.18 Thành phần Hb của các thể HbE kết hợp α-thal 79

Bảng 3.19 Các chỉ số hồng cầu và thành phần Hb của các đối tượng nghiên cứu trong 2 phả hệ 73

Bảng 3.20 Độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị tiên đoán dương và giá trị tiên đoán âm của các chỉ số MCV <85 fL, MCH <27 pg riêng biệt và kết hợp trong sàng lọc thal và HbE 86

Bảng 3.21 Độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị tiên đoán dương và giá trị tiên đoán âm của OF test, DCIP test riêng biệt và kết hợp trong sàng lọc thalassemia và HbE 87

Bảng 3.22 Độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị tiên đoán dương và giá trị tiên đoán âm của DCIP test trong sàng lọc HbE 88

Bảng 3.23 Giá trị của chỉ số MCV <85fL và/hoặc MCH <27pg và kết hợp MCV <85fL và/hoặc MCH <27pg và/hoặc DCIP (+) trong sàng lọc thalassemia và HbE 88

Bảng 4.1 Các kiểu đột biến gen globin-β trong các nghiên cứu 99

tộc Khmer ĐBSCL 62Biểu đồ 3.2 Tỉ lệ mang gen thalasemia và bệnh hemoglobin trong cộng đồng

dân tộc Khmer ĐBSCL 63Biểu đồ 3.3 Đường cong ROC của chỉ số MCV và MCH trong sàng lọc

thalassemia và bệnh lý Hb 84Biểu đồ 3.4 Đường cong ROC của các chỉ số MCHC, SLHC, HCT và RDW

trong sàng lọc thalassemia và HbE 85Biểu đồ 4.1 Biến thiên SLHC trong các dạng mang đột biến gen HbE và

không mang đột biến ở người lớn 108Biểu đồ 4.2 Biến thiên MCV và MCH trong các dạng mang đột biến gen

HbE và không mang đột biến ở người lớn 110Biểu đồ 4.3 Sự biến thiên của chỉ số MCV ở nhóm không mang ĐBG và các

nhóm có mang ĐBG 112Biểu đồ 4.4 Sự biến thiên của chỉ số MCH ở nhóm không mang đột biến và

các nhóm có mang đột biến 113Biểu đồ 4.5 Sự biến thiên của HbA2 trên điện di giữa nhóm không mang

ĐBG và các nhóm có mang ĐBG 119Biểu đồ 4.6 Sự biến thiên của HbE trên điện di ở các nhóm mang đột biến

gen HbE 120

Hình 1.2 Hình ảnh hồng cầu bệnh nhân HbH trên tiêu bản máu ngoại vi

và nhuộm BCB 13

Hình 1.3 Thay đổi hình thái hồng cầu trên tiêu bản máu ngoại vi 16

Hình 1.4 Kết quả DCIP test trong các trường hợp (1) Hồng cầu người bình thường (2) HbE dị hợp tử (3) HbE/β-thalassemia và (4) HbE đồng hợp tử 17

Hình 1.5 Nguyên lý hoạt động của hệ thống điện di mao quản 19

Hình 1.6 Nguyên lý của kỹ thuật lai điểm ngược 21

Hình 1.7 Nguyên lý kỹ thuật MLPA 26

Hình 1.8 Bản đồ hành chính khu vực ĐBSCL 33

Hình 2.1 Các mất đoạn α-thalassemia và các đoạn mồi trong kỹ thuật multiplex-gap PCR 50

Hình 2.2 Kết quả mất đoạn được phát hiện bởi điện di 51

Hình 2.3 Kết quả RDB âm tính 54

Hình 2.4 Kết quả RDB dương tính với mẫu dị hợp tử 54

Hình 2.5 Kết quả RDB với đột biến đồng hợp tử 55

Hình 2.6 Kết quả RDB với đột biến dị hợp tử kép 55

Hình 2.7 Kết quả RDB dương tính giả 55

Hình 2.8 Kết quả phân tích đường cong HRM 58

Sơ đồ 3.1 Phả hệ gia đình đối tượng mang gen Hb Tak thứ nhất 80

Sơ đồ 3.2 Phả hệ gia đình đối tượng mang gen Hb Tak thứ hai 81

ĐẶT VẤN ĐỀ

Thalassemia (thal) và bệnh lý hemoglobin (Hb biến thể) là nhóm bệnh ditruyền đơn gen phổ biến nhất trên thế giới [1], [2] Bệnh gây ra do đột biếngen có vai trò kiểm soát quá trình tổng hợp chuỗi globin trong hồng cầu dẫnđến thiếu máu do tan máu bẩm sinh [3], [4] Trên thế giới, tỉ lệ mang gen ướctính khoảng 7% Hàng năm, có khoảng 300.000 - 400.000 trẻ thal thể nặngđược sinh ra [5], và khoảng 50.000 - 100.000 trẻ mắc bệnh tử vong [6] Mặc

dù được phát hiện ở khắp nơi, bệnh mang tính chất dân tộc và địa dư mộtcách rõ rệt [4], [7]

Đông Nam châu Á là một ‘vùng dịch tễ’ thalassemia và bệnh lý Hb với

4 thể phổ biến là -thal, -thal, HbE và Hb Constant Spring (HbCS) Theomột số nghiên cứu, tỉ lệ mang gen -thal trong khu vực thay đổi từ 4,5% -40%; -thal từ 1 - 9%; HbCS từ 1 - 8% Bệnh HbE có thể được xem là ‘nétđặc trưng’ của vùng Đông Nam Á, là Hb bất thường phổ biến nhất trong sốnhững người nói tiếng Môn-Khmer, Lào, Ấn Độ, Bangladesh, Sri Lanka…với tỉ lệ mang gen ở một số vùng có thể lên đến 50 - 60% [8] Hiện nay, cóhơn 200 đột biến gây -thal [9], [10] và hơn 150 đột biến gây -thal [11], sựphối hợp giữa các đột biến này gây ra hơn 60 hội chứng thal khác nhau, làmcho Đông Nam Á trở thành khu vực có kiểu gen thal phức tạp nhất trên thếgiới [8]

Biểu hiện lâm sàng của các hội chứng thal rất thay đổi, từ dạng không

có triệu chứng đến phụ thuộc truyền máu, thậm chí tử vong trong bào thainhư thể đồng hợp tử 0-thal Điều trị các thể bệnh nặng hiện nay chủ yếu làtruyền máu và thải sắt định kỳ, suốt đời, đã tạo ra gánh nặng cho gia đìnhbệnh nhân và xã hội

Dự phòng sinh ra các thể bệnh nặng với các chương trình sàng lọcngười mang gen trong cộng đồng, tham vấn di truyền và chẩn đoán trước sinh

là các bước can thiệp quan trọng nhất nhằm giảm gánh nặng do bệnh gây ra[12] Để làm được điều này, cần phải có các dữ kiện về tần suất mang genbệnh, sự phân bố các kiểu đột biến gen và đặc điểm lâm sàng, huyết học cácthể bệnh trong cộng đồng.

Tại Việt Nam, các nghiên cứu trước đaay cho thấy tần suất mang gen β-thal thay đổi từ 1,5 - 25% và HbE từ … trong cộng đồng các dân tộc ítngười, tăng dần khi đi từ bắc vào nam [13] Dân tộc Khmer là một trong cácdân tộc ít người có dân số cao nhất nước với khoảng gần 1,3 triệu người, sinhsống tập trung ở một số tỉnh vùng đồng bằng sông Cửu Long [14] Theo yvăn, tỉ lệ mang gen HbE ở người Khmer từ 20% - 30% [15]; và tỉ lệ mang genβ-thal khoảng 1,56 - 1,7% [16], do đó sẽ có nhiều nguy cơ xuất hiện nhữngthể bệnh phối hợp Nhằm góp phần cung cấp một số dữ kiện về thalassemiavà bệnh hemoglobin trong cộng đồng người Khmer, chúng tôi tiến hành đề tài

“Nghiên cứu tần suất, đặc điểm thalassemia và các bệnh hemoglobin trong cộng đồng dân tộc Khmer ở đồng bằng sông Cửu Long” với các mục tiêu sau:

1 Xác định tần suất các thể thalassemia và bệnh hemoglobin, tỉ lệ các kiểuđột biến gen globin trong cộng đồng dân tộc Khmer ở đồng bằng sôngCửu Long

2 Mô tả một số đặc điểm lâm sàng và huyết học các thể thalassemia và bệnhhemoglobin trong cộng đồng dân tộc Khmer ở đồng bằng sông Cửu Long

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Đại cương về cấu trúc và chức năng của hemoglobin

Hemoglobin là một sắc tố chứa trong hồng cầu với chức năng vậnchuyển oxy - thành phần thiết yếu cho đời sống con người Hb là một tetramergồm 4 tiểu đơn vị, mỗi tiểu đơn vị gồm một chuỗi polypeptide (chuỗi globin)và một vòng porphyrin chứa sắt gọi là hem Các chuỗi globin trong Hb giốngnhau từng đôi một [15]

Trong quá trình phát triển, 6 loại chuỗi α, -ζ (thuộc nhóm α), -ε, -γ, -β, và -δ (thuộc nhóm globin-không α) kết hợp với nhau để tạothành 6 loại Hb khác nhau

globin-Ở người trưởng thành, Hb chủ yếu là HbA (α2β2) chiếm 97 – 98%; HbA2(α2δ2) khoảng 2 – 3%, Hb chủ yếu trong thai kỳ là Hb F (α2γ2), chỉ còn vết sau

2 tuổi Ngoài ra, trong thời kỳ phôi có 3 loại Hb phôi là Hb Gower 1 (ζ2ε2),Gower 2 (α2ε2) và Hb Porland (ζ2γ2) Sự sản xuất các loại Hb khác nhau phảnánh các thay đổi sinh lý để đáp ứng nhu cầu oxy trong các giai đoạn phát triểnkhác nhau của cá thể

Trong tetramer Hb A, sự tương tác giữa các chuỗi globin-α và globin-βtạo điều kiện thuận lợi cho việc hình thành hai cấu trúc có vai trò trong quátrình vận chuyển khí oxy của Hb: trạng thái kết hợp oxy (còn gọi là trạng tháigiãn), ký hiệu là (R), và trạng thái nhả oxy (còn gọi là trạng thái căng), kýhiệu là (T)

Ngoài ra, ái lực của Hb với oxy còn bị tác động bởi những phân tử nhỏnhư 2,3 – diphosphoglycerate (2,3 – DPG) gắn vào phân tử Hb, thay đổi pHvà nồng độ ion Clor trong tế bào

1.2 Phân loại bệnh hemoglobin và cơ chế bệnh sinh

1.2.1 Phân loại bệnh hemoglobin

Bệnh Hb là nhóm bệnh được đặc trưng bởi sự khiếm khuyết trong tổnghợp chuỗi globin về mặt số lượng hoặc chất lượng Do đó, bệnh Hb có thểđược phân loại chung thành 2 nhóm lớn [17], [1]:

1.2.1.1 Hội chứng thalassemia

Hội chứng thal gồm các bệnh lý di truyền được đặc trưng bởi giảm hoặckhông tổng hợp các chuỗi globin bình thường Các bệnh thal, được gọi là α-,β-, γ-, δ-, δβ-, hoặc εγδβ-thal tùy thuộc chuỗi globin bị khiếm khuyết Trênlâm sàng, loại thal thường gây các biểu hiện đáng kể là α- và β-thal, do giảmtổng hợp một trong 2 loại chuỗi globin-α hoặc -β, thành phần tạo nên phân tử

Hb chủ yếu ở người trưởng thành bình thường (HbA, α2β2)

Hầu hết các bệnh thal do đột biến di truyền lặn, tuy nhiên cũng có một số

ít di truyền trội, mắc phải, hoặc mới mắc (de novo) Ngoài ra, còn có HPFH là

hội chứng tồn lưu HbF di truyền do bất thường trong quá trình chuyển đổi từHbF sang HbA [17]

1.2.1.2 Hemoglobin biến thể

Trong nhóm các bệnh lý có khiếm khuyết về cấu trúc chuỗi globin, 1 hay

2 acid amin trong chuỗi bị thay thế bằng acid amin khác Tùy theo vai trò,chức năng của acid amin bị thay thế sẽ gây ra biến đổi bệnh lý nặng hay nhẹ,tạo ra một Hb biến thể Cho đến nay, đã có trên 700 loại Hb bất thường về cấutrúc đã được xác định

Ở nhiều quần thể đa chủng tộc, các dạng hội chứng thal có thể kết hợp vớinhau và kết hợp với Hb biến thể tạo nên nhiều kiểu hình đa dạng trên lâm sàng

Bảng 1.1 Phân loại bệnh hemoglobin [1], [17]

β-thal kết hợp các biến thể khácthal kết hợp các biến thể khác

HbS/ β – thal, HbE/ β-thal

Khác

Phân loại về di truyền

β 0 -thal: không sản xuất chuỗi β

β + -thal: giảm sản xuất chuỗi β

-thal, -thal, -thal, -thal Gen hỗn hợp Lepore

HPFH - tồn lưu HbF di truyền

-thal di truyền trội

1.2 α-thalassemia

α-thal kết hợp các biến thể khácthal do xóa đoạn gen

Mất 1 gen globin-α (-α/αα): DHT α + -thal

Mất 2 gen globin-α: in cis ( /αα) - DHT α0-thal; in trans (-α/-α) - ĐHT α+ -thal Mất 3 gen globin- α ( /-): bệnh lý HbH

Mất 4 gen globin-α ( / ): bệnh lý Hb Bart’s

α-thal kết hợp các biến thể khácthal không xóa đoạn

Hb Constant Spring

Các loại Hb khác: Hb Quong Sze, Hb Paksé, …

1.3 α-thal mới mắc và mắc phải

α-thal kết hợp các biến thể khácthal với hội chứng chậm phát triển tâm thần

Mất đoạn lớn trên NST số 16 bao gồm các gen globin-α

Đột biến của yếu tố sao mã ATRX trên NST X

α-thal kết hợp các biến thể khácthal kết hợp hội chứng loạn sản tủy

Do đột biến của gen ATRX

2 Bệnh lý thay đổi cấu trúc chuỗi globin

2.1 Bệnh lý hồng cầu hình liềm

2.2 Hb kém bền: Hb Köln, Hb Zürich… [18]

2.3 Methemoglobin: MetHb bẩm sinh, mắc phải

2.4 Hb có ái lực với oxy thay đổi

Tăng ái lực với oxy

Đột biến trên gen α: Hb Chesapeake [18], Hb Koya, Hb Icara…

Đột biến trên gen β: Hb Tak, Hb Hekinan, Hb Helsinki

Giảm ái lực với oxy

Hb Kansas, Hb Beth Israel, Hb Bologna, Hb Bruxelles [18]

đủ bù cho sự giảm HbA Nói theo cách khác, các chuỗi globin-  và - không bao giờ đủ để kết hợp với chuỗi globin-  Các chuỗi globin- dưthừa, bị kết tủa trong tế bào tiền thân hồng cầu trong tủy xương và hồngcầu trong máu ngoại vi, dẫn đến khiếm khuyết các tế bào tiền thân hồngcầu làm tạo máu không hiệu quả và giảm đời sống hồng cầu Thiếu máukích thích tủy xương tăng sinh nhưng không hiệu quả, dẫn đến dãn rộngtủy xương, làm biến dạng khung xương, tăng trưởng và chuyển hóa bấtthường Hiện tượng pha loãng máu do tủy xương dãn rộng, lách to do bắtgiữ các hồng cầu bất thường làm nặng thêm tình trạng thiếu máu Tăng sản

tủy xương gây hấp thu sắt tăng và quá tải sắt, có thể nặng thêm do nhu cầutruyền máu thường xuyên Hậu quả là dẫn đến lắng đọng sắt ngày càngnhiều trong các mô, suy cơ quan và nếu sắt không được lấy đi sẽ dẫn đến

tử vong [2], [1]

1.2.2.2 Alpha thalassemia

Cơ chế bệnh sinh của α-thal có sự khác biệt so với β-thal Trong α-thal,hiện tượng tạo hồng cầu không hiệu quả ít hơn do sự hình thành các tetramerHbH và Hb Bart’s hòa tan Đặc biệt, HbH là một tetramer có khuynh hướngkết tủa khi tế bào trưởng thành, tạo thành các thể vùi, do đó tán huyết là đặcđiểm chính của α-thal Biểu hiện thiếu máu nặng thêm do Hb H và Hb Bart’sđều là các homotetramer và không thể trải qua những thay đổi dị lập thể cầnthiết cho quá trình phân phối oxy bình thường Do đó, nồng độ Hb H và HbBart’s càng cao, tình trạng thiếu oxy càng nặng [2]

Khác với β-thal, trong α-thal, chuỗi globin-α có vai trò quan trọng trong

cả giai đoạn bào thai lẫn giai đoạn sau sinh Do đó, các trường hợp α-thal thểnặng không tổng hợp được chuỗi globin-α, dẫn đến sự hình thành cáchomotetramer Hb Bart’s trong bào thai, gây ra nhiều biểu hiện nặng nề chothai nhi và hầu hết dẫn đến tử vong trong thai kỳ

Thời

kỳ bào thai

Thừa chuỗi

globin không-α

Thừa chuỗi globin-α

Tạo HC không hiệu quả

Tăng hấp thu sắt

Chậm phát triển thể chất Suy tim

Xơ gan Suy các tuyến nội tiết Nhiễm trùng

Phá hủy tiền thân

HC trong tủy xương

Phá hủy màng HC trong máu ngoại vi

globin-β giảm globin-α kết hợp - globin- kết hợp -

Mất cân bằng chuỗi globin-/

Biến dạng xương

Giảm oxy mô

Giảm tổng hợp chuỗi globin-α Giảm tổng hợp chuỗi globin-β

Kết tụ globin-α không hòa tan

Hình 1.1: Cơ chế bệnh sinh thalassemia [1], [2]

8

HbA ( 2  2 )

HbF ( 2  2 )

HbA2 ( 2  2 )

1.3 Đặc điểm bệnh hemoglobin

Mặc dù các số liệu thống kê về tần số và sự phân bố các bệnh Hb trênthế giới vẫn còn hạn chế, các chuyên gia khẳng định bệnh Hb sẽ tạo ra mộtgánh nặng ngày càng cao cho nguồn lực y tế toàn cầu trong tương lai

Ở khu vực Đông Nam châu Á, -thal, -thal và HbE là các nhóm bệnh

Hb chiếm ưu thế [19]

1.3.1 -thalassemia

-thal là nhóm bệnh gây ra do:

- Đột biến tác động đến tốc độ tổng hợp chuỗi globin-β: làm giảmhoặc không tổng hợp được chuỗi globin-β;

- Đột biến gây bất thường về cấu trúc của chuỗi globin-β: có thểvừa làm giảm tốc độ sản xuất chuỗi β, sản xuất chuỗi β hoặc Hb rấtkhông bền

Dựa vào diễn tiến lâm sàng, β-thal được chia làm 3 thể, mức độnặng phụ thuộc vào mức độ mất cân bằng giữa các chuỗi globin-α và -β

-thal thể nhẹ (β-thal dị hợp tử) β-thal dị hợp tử) [15]: không triệu chứng, do đó còn

được gọi là β-thal trait (vết), có thể thiếu máu nhẹ Gần đây, các nghiên cứughi nhận tỉ lệ thiếu máu tăng trong -thal thể nhẹ Khi cả cha và mẹ đều manggen, thai nhi có 25% nguy cơ mang β-thal đồng hợp tử Tổng phân tích tế bàomáu ngoại vi khá đặc trưng với nồng độ Hb bình thường hoặc giảm nhẹ, tăngSLHC, giảm MCV và MCH, RDW thường bình thường Hồng cầu trên tiêubản máu ngoại vi chỉ có kích thước nhỏ, hoặc kèm nhược sắc, thay đổi hìnhthái có thể ghi nhận gồm: hình bia, có hạt kiềm, co thắt không đều

Chẩn đoán β-thal thể nhẹ khi phân tích thành phần Hb có tăng tỉ lệHbA2 Tỉ lệ HbA2 thay đổi phụ thuộc vào bản chất của đột biến [9] Tronghầu hết trường hợp β0- hoặc β+-thal, HbA2 từ 4 – 5%; trong khi dị hợp tử β+-thal nhẹ, HbA2 thường từ 3,6 – 4,2% Tỉ lệ cao hơn có thể thấy do hậu quả

của mất đoạn phần 5’ gen globin-β, các đột biến vùng promoter (như -88CAT và -29 AAG) và những đột biến codon ở codon khởi đầu như AAG ().30% - 50% trường hợp β-thal kèm tăng HbF, có thể từ 2-7% Nồng độ HbFkhông chỉ bị ảnh hưởng bởi bản chất của đột biến gây β-thal, mà còn bởi sựđồng di truyền của các đột biến gây tăng HbF như tồn lưu HbF di truyền, β-thal [20], [21], [22].

Ngoài ra, có những trường hợp β-thal không làm thay đổi các chỉ sốhồng cầu, cũng không gây tăng HbA2 được gọi là β-thal im lặng Ví dụ, vớiđột biến CAG ở vị trí 6, phía đầu 3’ với mã bộ ba kết thúc, tỉ lệ HbA2 trungbình là 2,4% β-thal do di truyền trội có kiểu hình nặng hơn bình thường [9]

β-thal thể nặng: được Cooley và Lee mô tả đầu tiên năm 1925 Bệnh

nhân -thal thể nặng chỉ có thể duy trì cuộc sống nhờ truyền máu đều đặn.Hầu hết bệnh nhân, biểu hiện lâm sàng xuất hiện trong khoảng từ 6 – 24 thángtuổi với Hb xung quanh 8 g/dL Trẻ chậm lớn, xanh xao dần, ăn kém, tiêuchảy, sốt tái đi tái lại do nhiễm trùng, vàng da, bụng to dần do gan và lách to.Phì đại tủy tạo máu gây biến dạng xương sọ - mặt điển hình (phì đại xươngsọ, xương gò má nhô, xẹp cầu xương mũi, khuynh hướng mắt xếch dạngMông cổ, phì đại xương hàm, để lộ răng hàm trên) [23], [24]

Diễn tiến lâm sàng, quá trình tăng trưởng và phát triển của trẻ β-thalphụ thuộc vào chế độ điều trị truyền máu và thải sắt Bệnh nhân không đượctruyền máu đều đặn sẽ tử vong trước thập kỷ thứ 2 – 3 Bệnh nhân truyền máuvà thải sắt thường xuyên có thể sẽ sống qua thập kỷ thứ 4 và xuất hiện cácbiến chứng liên quan đến truyền máu: quá tải sắt, nhiễm các bệnh qua đườngtruyền máu [25]

Về cận lâm sàng huyết học [9], [26], [27]: nhìn chung, bệnh nhân β-thalthể nặng có hồng cầu nhỏ, nhược sắc nặng với giảm MCV, MCH; trên tiêubản máu ngoại vi hồng cầu nhỏ, nhược sắc, kích thước không đều, đa hình

dạng và hồng cầu có nhân (nguyên hồng cầu) Trạng thái ĐHT β0/0 không cóHbA, HbF 92-95%; trong khi β0/+ hoặc β+/+ HbA từ 10-30%, đôi khi có thểlên đến 35%, trong -thal thể nặng HbA2 có thể bình thường, tăng hoặc thậmchí giảm

β-thal thể trung gian: biểu hiện lâm sàng rất thay đổi có thể từ không

triệu chứng như β-thal thể nhẹ đến phụ thuộc truyền máu như β-thal thể nặng.Tuổi khởi bệnh là một trong những chỉ tố hữu ích nhất của diễn tiến β-thalđồng hợp tử hoặc dị hợp tử kép Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu có ghi nhậnkhác nhau: 11 - 60% bệnh nhân biểu hiện trong năm đầu đời, 29 - 30% trongnăm thứ 2, và 9 - 59% sau năm thứ 2 Tuổi khởi bệnh phụ thuộc vào nhiều

yếu tố như kinh tế, xã hội, môi trường [28], [25], [29]

1.3.2 Alpha thalassemia

Hội chứng α-thal ảnh hưởng khoảng 5% dân số thế giới, gây ra do giảmtổng hợp hoàn toàn hoặc một phần chuỗi globin-α [30] Phần lớn đột biến α-thallà các đột biến gây xóa đoạn làm mất một hoặc hai gen globin-α trên nhiễm sắcthể số 16 Tuy vậy, vẫn có thể gặp các đột biến không xóa đoạn (αTα/αα hoặc

ααT/αα), phổ biến nhất là đột biến Hb Contant Spring (HbCS) [31], [32]

Hội chứng α-thal được phân loại dựa trên số lượng gen globin-α bị mất

đi Mức độ nặng của α-thal thay đổi từ trạng thái mang gen không triệu chứnglâm sàng đến tử vong trong bào thai, phụ thuộc vào mức độ khiếm khuyếtchuỗi globin-α [30], [33]

1.3.2.1 Kiểu hình α-thal kết hợp các biến thể khácthalassemia nhẹ

Các kiểu hình nhẹ của α-thal bao gồm dị hợp tử (DHT) α+-thal (-α/ααhoặc αTα/αα, ααT/αα), đồng hợp tử (ĐHT) α+-thal (-α/-α) hoặc DHT α0-thal( /αα), thường không biểu hiện lâm sàng, có thể không được phát hiện hoặcchỉ được chẩn đoán khi khám sức khỏe định kỳ hoặc sàng lọc trước sinh [19]

Các đột biến phổ biến gây kiểu hình α+-thal gồm 2 xóa đoạn -α3.7, -α4.2, độtbiến không xóa đoạn Hb Constant Spring (αCSα) [34], [35]

Trên cận lâm sàng, DHT α+-thal hầu như không làm thay đổi các chỉ sốhồng cầu, cũng như hình thái hồng cầu hoặc chỉ làm hồng cầu nhỏ khôngđáng kể với MCV và MCH giảm rất nhẹ; một số trường hợp phân tích thànhphần Hb máu cuống rốn có 1-2% Hb Bart’s Dị hợp tử HbCS có thể thiếu máunhẹ, MCV giảm không tỉ lệ, hồng cầu có hạt kiềm có thể hiện diện trên tiêubản máu ngoại vi Đồng hợp tử α+-thal hoặc dị hợp tử 0-thal, đặc trưng bởithiếu máu rất nhẹ, giảm khoảng 1,0 – 1,5 g/dl so với người bình thường; hồngcầu nhỏ, nhược sắc với MCV, MCH và MCHC thấp; số lượng hồng cầu tăng,biểu hiện rõ hơn trong α0-thal so với kiểu gen α+-thal, Hb Bart’s khoảng 5-10% lúc sinh [33], [36]

1.3.2.2 Bệnh lý HbH

Về phương diện lâm sàng, bệnh Hb H được xếp vào nhóm thal khôngphụ thuộc truyền máu, là trạng thái hiện diện một gen globin-α chức năng duynhất ( /-α, hoặc /αTα) do xóa đoạn hoặc kết hợp với đột biến không xóađoạn [37]

Bệnh có kiểu hình rất thay đổi, từ không triệu chứng đến thỉnh thoảngcần truyền máu, hoặc thiếu máu nặng với tán huyết và gan lách to, thậm chíhội chứng phù thai (gọi là Hb H phù thai nhi) [34], [38] Phần lớn bệnh nhânHbH, đặc biệt do xóa đoạn, có thể sống không cần điều trị, tăng trưởng vàphát triển bình thường

Trong khi bệnh HbH do xóa đoạn có kiểu hình khá tương đồng, HbH

do các đột biến không xóa đoạn lại biến đổi đáng kể Nhiều bệnh nhân vớikiểu gen globin-α tương tự có thể có kiểu hình khác nhau, cho thấy có nhữngyếu tố di truyền và/hoặc môi trường chưa được xác định có thể tác động đếnbiểu hiện kiểu hình bệnh Hb H [30] Mặc dù bệnh cảnh lâm sàng nặng hơn

thường do các đột biến hiếm và nghiêm trọng như xóa đoạn codon 30, codon

31 G>A và codon 59 G> A hoặc Hb Adana [39], ngày càng nhiều dữ liệu chothấy các đột biến không xóa đoạn thông thường như poly (A), Hb Quong Szehoặc thậm chí Hb Constant Spring (HbH-CS) cũng có thể có kiểu hình nặng[40] Mức độ nghiêm trọng của bệnh Hb H tương quan với mức độ thiếu hụtchuỗi globin-α Nhìn chung, khó dự đoán các kiểu hình Hb H dựa trên kiểugen, đặc biệt là các trường hợp do đột biến không xóa đoạn [35]

Trên tổng phân tích tế bào máu ngoại vi, bệnh nhân HbH thường cóthiếu máu, MCV và MCH giảm, nhưng SLHC tăng, hồng cầu lưới tăng.Hồng cầu trên tiêu bản máu ngoại vi có kích thước nhỏ, nhược sắc, hồngcầu đa sắc với nhiều hình dạng, kích thước không đều, hồng cầu hình bia,hồng cầu có hạt kiềm, mảnh vỡ hồng cầu, có thể xuất hiện nguyên hồngcầu Một đặc điểm quan trọng của bệnh lý Hb H là sự hiện diện của thể vùiHbH trong hầu hết các tế bào hồng cầu khi nhuộm xanh cresyl sáng (BCB– Brilliant Cresyl Blue) [15]

Hình 1.2 Hình ảnh hồng cầu bệnh nhân HbH trên tiêu bản máu ngoại vi

và nhuộm BCB (β-thal dị hợp tử) Nguồn:https://oncohemakey.com/haemoglobin-thal kết hợp các biến thể khácdisorders/)

: hồng cầu hình bia; : hồng cầu thay đổi hình dạng (khác hình bia); : thể vùi HbH

Phân tích thành phần Hb nhận thấy tỉ lệ Hb Bart’s lúc sinh khoảng19-27%, giảm dần sau đó và thay thế bằng HbH, với tỉ lệ HbH thường thấphơn [33], [15].

Ngoài các hội chứng thal di truyền, còn có thể gặp các hội chứng thal mắc phải gồm hội chứng α-thal chậm phát triển tâm thần (ATR) và HbHmắc phải trong các bệnh lý tủy tăng sinh [41], [42], [43]

hoặc thiểu ối, xuất huyết trước sinh, và sinh non [15], [30] Phân tích thành phần

Hb thai có 100% Hb Bart’s

1.3.3 Bệnh lý hemoglobin E

Hemoglobin E (HbE) là một biến thể Hb quan trọng và phổ biến nhấttrong cộng đồng Đông Nam Á [44], [45] Hb E được tạo ra do sự thay thếacid glutamic bởi lysin ở vị trí codon 26 của gen globin-β Đột biến này hoạthóa một vị trí ghép nối RNA thông tin không xác định, làm giảm tổng hợpchuỗi globin-βE và dẫn đến kiểu hình thal nhẹ Hb E được xem là đặc trưngcủa khu vực Đông Nam Á với tần suất ở một số nơi có thể lên đến 50-60%[46], [47]

HbE có thể tương tác với α-, β-thal hoặc các Hb biến thể khác dẫn đếnnhiều hội chứng thal với các kiểu hình lâm sàng và huyết học phức tạp [48],

[49] Các tương tác có thể gây ra những thay đổi huyết học làm bỏ sót chẩnđoán khi khảo sát thường quy [50], [46].

Trạng thái DHT HbE đơn độc hoặc kết hợp α+-, α0-thal do các đột biếnxóa đoạn hoặc không xóa đoạn thường không biểu hiện lâm sàng, hình tháihồng cầu thay đổi tối thiểu, các chỉ số hồng cầu gần như bình thường [51] Dịhợp tử HbE (HbAE E/) kết hợp HbH gây ra bệnh lý EABart’s biểu hiện kiểuhình thalassemia thể trung gian Đồng hợp tử HbE (HbEE E/ E) có thiếu máunhẹ, thay đổi huyết học tương tự dị hợp tử β-thal, hồng cầu nhỏ, nhược sắc,khá đặc trưng với tỉ lệ hồng cầu hình bia tăng cao [46] Tỉ lệ % HbE trongdạng dị hợp tử khoảng 25-30% [52], và khoảng 85-99% trong dạng đồng hợp

tử [15], [53] Đồng di truyền α-thal làm giảm tổng hợp HbE Khi kết hợpbệnh lý HbH, HbE chiếm từ 13-15%, có thể giảm xuống đến 10%, giảm sắtcũng làm giảm HbE [44], [15] Chẩn đoán đồng di truyền với α-thal cần phântích DNA [36]

Trong khi đó, thể dị hợp tử kép HbE kết hợp β-thal (HbE/β-thal) có biểuhiện lâm sàng rất thay đổi từ nhẹ đến nặng do tác động của nhiều yếu tố [46]

Ngoài ra, HbE có thể kết hợp với các biến thể Hb khác như HbS [54],

Hb Lepore [55], Hb Tak [56], HbC [48], hoặc kết hợp β-thal [57]… dẫn đếncác kiểu hình đa dạng trên lâm sàng

1.4 Các kỹ thuật sàng lọc và chẩn đoán

1.4.1 Các chỉ số hồng cầu

Các chỉ số hồng cầu được sử dụng phổ biến trên thế giới và được xem làcông cụ hiệu quả trong sàng lọc thalassemia và bệnh lý Hb Hầu hết các quốcgia trên thế giới sử dụng tiêu chuẩn MCV <80fL hoặc MCH <27 pg Tuynhiên, cách tiếp cận này có thể bỏ sót các biến thể Hb như HbE, HbC, HbD,HbS, α+-thal do xóa đoạn và không xóa đoạn vì ở trạng thái dị hợp tử có thể

có MCV và MCH bình thường [58], [59]

Các chỉ số khác của hồng cầu như số lượng hồng cầu, nồng độ Hb (HGB)cũng được kết hợp với MCV và MCH trong nhiều công thức sàng lọc khác nhaunhư Mentzer [60], [61], Shine và Lal, England và Fraser [62]… đã được nghiêncứu và ghi nhận có giá trị nhất định trên lâm sàng Tuy nhiên, các công thức nàyphức tạp, khó nhớ, không thuận tiện cho áp dụng thường quy

1.4.2 Khảo sát hình thái hồng cầu trên tiêu bản máu ngoại vi

Thay đổi hình thái hồng cầu có thể được phát hiện trong hầu hết cáctrường hợp mang gen thalassemia, do đó, kiểm tra tiêu bản máu ngoại vi mộtcách cẩn thận có thể giúp đánh giá các trường hợp mang gen

Hình 1.3 Thay đổi hình thái hồng cầu trên tiêu bản máu ngoại vi

(β-thal dị hợp tử) Nguồn: https://oncohemakey.com/haemoglobin-thal kết hợp các biến thể khácdisorders/)

*Hình 1: hồng cầu kích thước nhỏ, nhược sắc

*Hình 2: hồng cầu đa hình dạng, kích thước không đều, có mảnh vỡ hồng cầu

Các thay đổi có thể được ghi nhận tùy theo thể bệnh và mức độ nặng,bao gồm: hồng cầu kích thước nhỏ, nhược sắc; hồng cầu hình bia, đa kíchthước, đa hình dạng; hồng cầu có hạt kiềm, co thắt không đều Tỉ lệ hồng cầuhình bia tăng cao được tìm thấy trong đồng hợp tử HbE, hội chứng HbC Hiệndiện hồng cầu đa sắc, nguyên hồng cầu trong máu ngoại vi là chỉ tố cho thấytủy xương tăng hoạt động Thể Howell-Jolly thường thấy sau cắt lách [63]

1.4.3 Khảo sát sức bền thẩm thấu hồng cầu cải tiến một nồng độ

(Osmotic fragility, gọi tắt là OF test) [63]

Khảo sát sức bền thẩm thấu hồng cầu là phương pháp đầu tiên được sửdụng cho sàng lọc người mang gen thal bởi Silvestroni và Bianco vào nhữngnăm 1940

Nguyên lý: các hồng cầu kích thước nhỏ đề kháng với hiện tượng ly

giải khi tiếp xúc với các dung dịch nhược trương

Ưu điểm: so với phương pháp cổ điển của Dacie và Lewis, OF test đơn

giản, dễ thực hiện, chi phí thấp, và không đòi hỏi trang bị dụng cụ phức tạp do

đó được khuyến cáo sử dụng sàng lọc rộng rãi trong cộng đồng, đặc biệt ở cácnước đang phát triển OF test được đặc biệt sử dụng ở những nơi các máyđếm tế bào không sẵn có

Nhược điểm: cần được chuẩn hóa cẩn thận

1.4.4 Xét nghiệm Dichlorophenolindophenol (β-thal dị hợp tử) DCIP test)

Năm 1975, Henri Fischer đã sử dụng dichlorophenol indophenol đểphân biệt HbC và Hb O-Arab [64]

Nguyên lý: đột biến HbE làm Hb không bền nhẹ và bộc lộ gốc -SH, gốc

này có thể bị oxy hóa bởi các tác nhân hóa học chứa thuốc nhuộm DCIP(dichlorophenolindophenol) ở pH trung tính (7,5), gây kết tủa HbE và nhữngphân tử Hb không bền khác như HbH khi tiếp xúc với thuốc nhuộm ở 370C [63]

Kết quả: Hb E kết tủa có thể được nhìn thấy bằng mắt thường ở đáy

ống nghiệm gây ra hiện tượng mờ hoặc phân bố dạng tinh thể DCIP test cũngdương tính trong bệnh HbH và một số biến thể Hb không bền khác

Kỹ thuật được nhận thấy có độ nhạy và độ đặc hiệu thay đổi, tuy nhiên,nhìn chung cao, với độ nhạy từ 93,2% đến 100% [45], [65] Có nghiên cứughi nhận độ nhạy có thể đạt đến 100% và độ đặc hiệu 87,1% [66], [67]

Hình 1.4 Kết quả DCIP test trong các trường hợp (β-thal dị hợp tử) 1) Hồng cầu người bình thường (β-thal dị hợp tử) 2) HbE dị hợp tử (β-thal dị hợp tử) 3) HbE/β-thalassemia và (β-thal dị hợp tử) 4) HbE đồng

hợp tử [68]

Để loại bỏ kết quả dương tính giả này, một kỹ thuật DCIP cải tiến đã được

mô tả, với độ nhạy 100% và độ đặc hiệu 99,1% tại đại học Chiang Mai [65]

1.4.5 Phân tích thành phần hemoglobin

Nhiều kỹ thuật dựa trên các nguyên lý khác nhau đã được áp dụngtrong việc phân tích thành phần Hb như điện di trên màng cellulose acetate,trên acid agarose, tập trung đẳng điện (IEF – IsoElectric Focusing), sắc kýlỏng hiệu năng cao (HPLC), điện di mao quản (CE)… Tuy nhiên, vai trò củaHPLC và CE trong phân tích định tính và định lượng thành phần Hb đượckhẳng định [69]

1.4.5.1 Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Nguyên lý: hỗn hợp đệm phosphat (pha động), được đẩy qua một cột

trao đổi ion (pha tĩnh) bằng một bơm áp suất Pha tĩnh gồm một hộp phân tíchsắc ký có hệ thống điều nhiệt chứa các hạt nhựa ion dương hoặc ion âm Trạmsắc ký phát ra một gradient tăng dần về cường độ ion và pH đã được lập trình,đến hộp phân tích sắc ký bằng 2 bơm piston kép Các loại Hb được tách ra tùythuộc vào sự tương tác ion với pha tĩnh [70], [39] Các Hb được tách ra sau đó

sẽ đi qua cốc đo dòng chảy tế bào của một quang kế Mỗi Hb được đặc trưngbởi một thời gian lưu riêng, là thời gian từ khi tiêm mẫu vào cột đến khi xuấthiện đỉnh Hb [15], [63]

Nhược điểm: không tách được Hb Lepore, HbE và HbA2 Không định

lượng được HbH và Hb Bart’s vì chúng được rửa giải trước khi tích hợp [71],kém nhạy trong phát hiện các biến thể globin-α, đặc biệt HbCS [72]

1.4.5.2 Điện di mao quản

Điện di mao quản (CE – Capillary Electrophoresis) là một công cụ tíchhợp trong nhiều phòng xét nghiệm hóa sinh lâm sàng để tách các thành phần

Hb và tính tỷ lệ của mỗi thành phần

Nguyên lý [73], [63]: CE là kỹ thuật điện di thực hiện trong những ống

mao quản silica hẹp, đường kính 25-100 m, chứa đầy dung dịch đệm Sựphân tách phụ thuộc vào tốc độ di chuyển của các ion hoặc các dung dịch,nhưng đặc điểm quan trọng nhất của CE là sự di chuyển của khối dung dịchtrong mao quản dưới tác dụng của điện trường được gọi là dòng điện thẩm(Electric Osmotic Flow – EOF) EOF là sự di chuyển của dòng chất lỏng bên

trong mao quản silica dưới tác dụng của điện trường

Trái với dòng chảy áp suất trong HPLC, dòng chảy của EOF được phânbố một cách đồng nhất dọc theo ống mao quản, không có hiện tượng giảm áp,

do đó hiệu quả phân tách cao hơn

Kết quả: máy điện di tự động nhận diện các đỉnh A, F, C và A2 Các đỉnhkhác có vị trí đặc trưng như HbS, HbD, HbE, HbH và HbJ, đều được đánhdấu là HbX Người đọc có thể gõ thêm vào tên của một Hb biến thể nghĩ đếnnhiều nhất

Ưu điểm: định lượng được HbH, Hb Bart’s và HbCS, tách được HbA2và HbE

Hình 1.5 Nguyên lý hoạt động của hệ thống điện di mao quản [15]

CỰC DƯƠNG(β-thal dị hợp tử) +)

Lớp khuếch tán

Lớp đặc (không di chuyển)

Các ion di chuyển chỉ dựa trên điện tích

1.4.6 Chẩn đoán phân tử

Hiện nay, trên thế giới, hầu hết các phương pháp chẩn đoán phân tửbệnh lý Hb đều dựa trên cơ sở phản ứng PCR Mỗi phương pháp đều cónhững ưu và nhược điểm riêng Việc lựa chọn phương pháp của mỗi phòngxét nghiệm phụ thuộc vào nhiều yếu tố: kiểu đột biến là đột biến điểm hayxóa đoạn, mức độ đa dạng của đột biến hiện diện trong cộng đồng, điều kiện

cơ sở vật chất và chuyên gia kỹ thuật có sẵn… và có thể dựa vào đặc điểmcủa đột biến đã biết hay đột biến chưa biết [48], [74], [72]

1.4.6.1 Chẩn đoán các đột biến đã biết

- Phương pháp sử dụng mẫu dò đặc hiệu alen (β-thal dị hợp tử) Allele specific oligonucleotide - ASO)

Phương pháp sử dụng mẫu dò ASO gồm lai điểm (dot blot - DB) và laiđiểm ngược (reverse dot blot - RDB) Nguyên lý của hai phương pháp này làmột phân tử DNA chuỗi đơn có trình tự đã xác định (gọi là “mẫu dòoligonucleotide”) có thể lai với một phân tử DNA thứ hai có chứa trình tự bổsung (chuỗi “đích”) với tính ổn định tùy thuộc vào độ lớn của base bắt cặp.Trong cả hai phương pháp, các đoạn DNA khuếch đại đặc hiệu (chuỗi đích)được lai với các mẫu dò được cố định trên bề mặt màng (RDB) hoặc bởi mộtmẫu dò gắn phóng xạ đối với các mẫu DNA được cố định vào màng dướidạng các điểm (DB) [63]

Lai điểm ngược (β-thal dị hợp tử) reverse dot blot)

Nguyên lý: lai điểm ngược dựa trên thiết kế và tổng hợp nhiều loại mẫu

dò ASO Có 2 loại mẫu dò: mẫu dò bình thường (normal probe - N) đặc hiệuđối với alen bình thường, và mẫu dò đột biến (mutant probe - M) đặc hiệu đốivới đột biến trên gen Mẫu dò sẽ gắn với màng nylon tích điện âm Sau đó,sản phẩm PCR đã được khuếch đại bằng PCR sử dụng các cặp mồi đánh dấu

biotin sẽ lai với mẫu dò ASO trên màng nylon Sự phát hiện màu sẽ nhờ vàostreptavidin, alkaline phosphate Alkaline phosphate (AP) là enzyme giúp pháthiện màu sẽ được sử dụng để phát hiện DNA gắn vào mẫu dò [63], [75]

Về mặt lý thuyết, RDB có thể được thiết kế để phát hiện bất kỳ đột biếnđiểm nào sau khi các điều kiện đã được thiết lập

Lai đặc hiệu alen là kỹ thuật duy nhất cho chẩn đoán các đột biến -thalđược thương mại hóa trên thị trường ViennaLab là một trong các công ty thànhcông với strip assay sử dụng các mẫu dò lai ngược với DNA gắn biotin Kỹ thuậtnày giúp phát hiện 21 đột biến -thal và 22 đột biến -thal Kỹ thuật chẩn đoánđột biến -thal được tối ưu hóa với các strip riêng biệt đối với các đột biến phổbiến ở vùng Địa Trung Hải, Trung Đông và Đông Nam Á/Ấn Độ [76]

Hình 1.6 Nguyên lý của kỹ thuật lai điểm ngược [63]

- Gap-PCR

Nguyên lý: các đoạn mồi bổ sung với trình tự DNA, không thể khuếch

đại và tạo ra sản phẩm PCR, trừ khi có một đột biến xóa đoạn xảy ra bêntrong vùng đó và nối các trình tự ở hai đầu lại với nhau Các cặp mồi đặc hiệuđược thiết kế bổ sung với 2 đầu của đột biến đã biết Nếu xóa đoạn hiện diện,sản phẩm PCR được tạo ra và được xác định bằng điện di [76]

Gap-PCR thường được ứng dụng để phát hiện các xóa đoạn phổ biếntrong -thal như: -3.7, -4.2, SEA, THAI, FIL…và một số xóa đoạn của -thal[48], [77] Gap-PCR cũng được sử dụng trong chẩn đoán xóa đoạn -thal, cácxóa đoạn -thal và HPFH …[63], [48]

- Real time PCR

Đây là một kỹ thuật thực hiện trong thời gian ngắn, sử dụng các mẫu dògắn huỳnh quang và các công cụ chuyên biệt để theo dõi sự tích tụ của cácamplicon được tạo ra trong suốt quá trình của phản ứng PCR [63-76]

- Phân tích đường cong nóng chảy độ phân giải cao (β-thal dị hợp tử) High resolution melting analysis – HRM analysis, HRMA)

HRM là kỹ thuật real time PCR, được tìm ra năm 2003 và phát triểnbởi tập đoàn công nghệ Idaho và trường Đại học Utah [78], là một kỹ thuật cógiá trị trong sinh học phân tử để xác định các đột biến và các biến đổi đa hìnhtrong các mẫu DNA chuỗi kép HRM được Prathomtanapong P sử dụng đầutiên vào năm 2008 để phát hiện xóa đoạn 3,5 kb trên gen globin- [79] Sau

đó, Pornprasert S dùng trong xác định xóa đoạn SEA và đột biến HbCS trêncác gen globin- [80], [81]

Nguyên lý [76]: HRM là một kỹ thuật sau PCR mạnh mẽ giúp xác định

các đột biến điểm dựa trên sự khác biệt nhiệt độ nóng chảy (Tm) Người dùng

sẽ thực hiện PCR trước khi phân tích HRM để khuếch đại vùng DNA có chứa

đột biến Sau giai đoạn PCR, phân tích HRM bắt đầu Nhiệt độ tăng dần từ

650C lên đến 950C Ở một số điểm trong suốt quá trình này, nhiệt độ nóngchảy của amplicon đạt được và 2 sợi DNA bị tách ra hoặc “chảy” ra Do đó,các màu huỳnh quang nhuộm xen được giải phóng và các tín hiệu huỳnhquang giảm Sự thay đổi tín hiệu được phát hiện khi kích thích laser và đườngcong nóng chảy được ghi lại Các sợi DNA kép chứa các alen kiểu dại và độtbiến có nhiệt độ nóng chảy khác nhau do sự khác nhau về thành phầnnucleotide Sự khác nhau này có thể được phân biệt dựa trên đường congnóng chảy

Điểm quan trọng của HRM là theo dõi quá trình này xảy ra ở thời gianthực bằng cách sử dụng màu nhuộm huỳnh quang Chất nhuộm huỳnh quanglà loại màu nhuộm xen và có đặc tính duy nhất Chúng gắn một cách đặc hiệuvới chuỗi DNA xoắn kép và phát màu huỳnh quang sáng khi gắn Khi không

có chuỗi DNA, chúng sẽ không gắn và chỉ cho màu huỳnh quang yếu Khi bắtđầu phản ứng, nồng độ màu huỳnh quang sẽ cao vì có hàng tỉ bản sao củaamplicon Nhưng khi mẫu được làm nóng lên và hai sợi DNA tách ra, sự hiệndiện của chuỗi DNA kép giảm và vì vậy màu huỳnh quang cũng giảm MáyHRM có một camera giám sát quá trình này bằng cách đo màu huỳnh quang,sau đó chỉ đơn giản là vẽ một biểu đồ được gọi là đường cong nóng chảy, chothấy mức độ màu huỳnh quang theo nhiệt độ [63]

Ngoài ra, còn có các kỹ thuật ARMS-PCR, enzym cắt giới hạn…cũngđược sử dụng để tìm các đột biến đã biết [77], [15], [11], [36], [82]

Các điểm thuận lợi và bất lợi của mỗi phương pháp phân tích các độtbiến đã biết được tóm tắt dưới đây:

Bảng 1.2 Ưu và nhược điểm của các phương pháp phân tích đột biến đã

biết trên gen globin [63], [76], [36]

Lai điểm (β-thal dị hợp tử) dot blot)

Ứng dụng rộng rãi

Có thể tin cậy

Sử dụng các mẫu dò gắn phóng xạ

Chỉ sàng lọc một đột biến ở cùng một thời điểm, do đó tốn thời gian

Chi phí cao

Lai điểm ngược (β-thal dị hợp tử) reverse dot blot)

Sàng lọc đồng thời nhiều đột biến

Không phóng xạ

Tương đối rẻ tiền

Đơn giản, nhanh và tin cậy

Cần mẫu chứng để chuẩn hóa các đột biến mới

Cần chuyên gia có kỹ thuật tốt trong phòng xét nghiệm để thiết lập, kiểm duyệt Chi phí cao nếu sử dụng kit thương mại

Đơn giản, nhanh và rẻ tiền

Có thể sử dụng đa mồi để phát

hiện các đột biến

Cần DNA chứng Chỉ giới hạn trong chẩn đoán các xóa đoạn với các đứt gãy DNA đã được biết Thiết kế mồi đặc hiệu với độ chính xác cao

Sự khuếch đại vùng gen globin- khó về mặt kỹ thuật, có thể làm mất alen

HRM

Không cần xử lý sau PCR

Nhanh, chi phí thấp, nhạy trong

sàng lọc các đột biến điểm

Tiến hành sàng lọc đồng thời trên

nhiều mẫu

Thiết lập quy trình đòi hỏi kỹ thuật Yêu cầu tối ứu hóa các chi tiết và áp dụng nghiêm ngặt các quy trình

Thiết bị chuyên dụng và khá đắt tiền