ứng dụng sinh học phân tử trong giám sát chủ động bệnh đốm trắng và bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm thẻ chân trắng

Ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60.42.02.01 Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Hoạt động giám sát trên tôm nuôi nước lợ tập trung thuộc xã Quỳnh Bảng, Quỳnh Lưu, Nghệ An v

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

LÊ HUY THƯỞNG

ỨNG DỤNG SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG GIÁM SÁT CHỦ ĐỘNG BỆNH ĐỐM TRẮNG VÀ BỆNH HOẠI TỬ GAN TỤY CẤP TRÊN TÔM THẺ CHÂN TRẮNG

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo

vệ lấy bất kỳ học vị nào

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám

ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc

Hà nội, ngày tháng năm 2016

Tác giả luận văn

Lê Huy Thưởng

LỜI CẢM ƠN

Sau thời gian thực tập tại Trung tâm quan trắc môi trường và bệnh thủy sản miền Bắc, Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản I, nhờ sự hướng dẫn, giúp đỡ nhiệt tình của các thầy cô giáo, các cán bộ tại phòng thí nghiệm của trung tâm và sự nỗ lực bản thân, tôi đã hoàn thành khóa luận tốt nghiệp của mình

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn và kính trọng sâu sắc tới TS Đặng Thị Lụa, phó Giám đốc trung tâm quan trắc môi trường và bệnh thuỷ sản miền Bắc và TS Nguyễn Hữu Đức, Trưởng bộ môn công nghệ sinh học Động vật, khoa Công nghệ sinh học đã hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể các phòng, ban của khoa Công nghệ sinh học, các phòng ban thuộc trung tâm quan trắc môi trường và bệnh thuỷ sản miền Bắc và toàn thể bạn bè đã giúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập cũng như thực tập

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và những người thân đã động viên, cổ vũ tinh thần giúp tôi hoàn thành khóa luận này!

Hà nội, ngày tháng năm 2016

Tác giả luận văn

Lê Huy Thưởng

MỤC LỤC

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục chữ viết tắt v

Danh mục bảng vi

Danh mục biểu đồ, hình vii

Trích yếu luận văn viii

Thesis abstract ix

Phần 1 Mở đầu 1

1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2

1.3 Phạm vi nghiên cứu 2

1.4 Ý nghĩa đề tài nghiên cứu 2

1.4.1 Ý nghĩa khoa học 2

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài 3

Phần 2 Tổng quan tài liệu 4

2.1 Tình hình nuôi tôm thẻ chân trắng trên thế giới và ở Việt Nam 4

2.1.1 Tình hình nuôi tôm thẻ chân trắng trên thế giới 4

2.1.2 Tình hình nuôi tôm thẻ chân trắng tại Việt Nam 4

2.2 Tình hình dịch bệnh ở tôm nuôi trên thế giới và Việt Nam 7

2.2.1 Tình hình dịch bệnh ở tôm nuôi trên thế giới 7

2.2.2 Tình hình dịch bệnh ở tôm nuôi tại Việt Nam 10

2.3 Thực trạng áp dụng sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh trên tôm 12

2.3.1 Kỹ thuật PCR 13

2.3.2 Kỹ thuật nested PCR (PCR mồi đôi) 13

2.3.3 Kỹ thuật real-time PCR 14

Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 15

3.1 Địa điểm nghiên cứu 15

3.1.1 Địa điểm thu mẫu 15

3.1.2 Địa điểm tiến hành phân tích mẫu 15

3.2 Thời gian nghiên cứu 15

3.3 Vật liệu nghiên cứu 15

3.4 Phương pháp nghiên cứu 15

3.4.1 Phương pháp chọn điểm giám sát tác nhân gây bệnh trên tôm và thời điểm giám sát 15

3.4.2 Thông số, tần suất giám sát và phương pháp phân tích thông số giám sát 16

3.4.3 Phương pháp thu mẫu và bảo quản mẫu 17

3.4.4 Phương pháp phân tích tác nhân gây bệnh trên tôm 17

3.4.5 Phương pháp xử lý số liệu: 22

Phần 4 Kết quả nghiên cứu và thảo luận 23

4.1 Kết quả nghiên cứu 23

4.1.1 Thông tin về ao nuôi tôm được lựa chọn để thu mẫu định kỳ 23

4.1.2 Kết quả phân tích mầm bệnh trên tôm nuôi 25

4.1.3 Một số biện pháp kỹ thuật được khuyến cáo nhằm giảm thiểu nguy cơ bùng phát dịch bệnh đốm trắng và hoại tử gan tụy cấp 35

4.2 Thảo luận 37

4.2.1 Thảo luận về bệnh WSSV 37

4.2.2 Thảo luận về bệnh AHPND 38

Phần 5 Kết luận và kiến nghị 42

5.1 Kết luận 42

5.2 Kiến nghị 42

Tài liệu tham khảo 44

Phụ lục……… 47

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt

WSSV Vi rút gây bệnh đốm trắng (white spot syndrome virus)

AHPND Vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp (Acute

Hepatopancreatic Necrosis Disease) EMS Hội chứng chết sớm (Early Mortality Syndrome)

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Vùng, điểm giám sát và thời điểm giám sát mầm bệnh WSSV và

AHPND thường xuyên trên tôm nuôi 16

Bảng 3.2 Vùng, điểm giám sát và thời điểm giám sát mầm bệnh WSSV và AHPND đột xuất trên tôm nuôi 16

Bảng 3.3 Thông số, tần suất thu mẫu tôm và phương pháp phân tích mầm bệnh trên tôm 16

Bảng 3.4 Trình tự cặp mồi VP28 dùng xác định WSSV 17

Bảng 3.5 Thành phần tham gia phản ứng PCR xác định WSSV 18

Bảng 3.6 Kết quả đọc điện di 20

Bảng 3.7 Trình tự cặp mồi (AP3) dùng xác định AHPND 20

Bảng 3.8 Thành phần tham gia phản ứng PCR xác định AHPND 21

Bảng 3.9 Kết quả đọc điện di 22

Bảng 4.1 Thông tin về ao nuôi được giám sát định kỳ tại Nghệ An 23

Bảng 4.2 Thông tin về ao nuôi được giám sát định kỳ tại Quảng Ninh 24

Bảng 4.3 Bảng tổng hợp số mẫu được phân tích định kỳ và phân tích đột xuất trên tôm 25

Bảng 4.4 Kết quả phân tích mầm bệnh WSSV trên mẫu tôm thu định kỳ tại Nghệ An 26

Bảng 4.5 Kết quả phân tích mầm bệnh WSSV trên mẫu tôm thu định kỳ tại Quảng Ninh 26

Bảng 4.6 Kết quả phân tích mầm bệnh WSSV trên mẫu tôm thu đột xuất tại Nghệ An 27

Bảng 4.7 Kết quả phân tích mầm bệnh WSSV trên mẫu tôm thu đột xuất tại Quảng Ninh 28

Bảng 4.8 Kết quả phân tích mầm bệnh AHPND trên mẫu tôm thu định kỳ tại Nghệ An 29

Bảng 4.9 Kết quả phân tích mầm bệnh AHPND trên mẫu tôm thu định kỳ tại Quảng Ninh 30

Bảng 4.10 Kết quả phân tích mầm bệnh AHPND trên mẫu tôm thu đột xuất tại Nghệ An 32

Bảng 4.11 Kết quả phân tích tác nhân gây bệnh AHPND trên mẫu tôm thu đột xuất tại Quảng Ninh (ngày 2/6/2015) 34

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Diện tích, sản lượng và năng suất tôm thẻ từ năm 2008 đến 2015 6

Hình 2.2 Đốm trắng xuất hiện trên vỏ đầu tôm 7

Hình 2.3 Tôm thẻ chân trắng có dấu hiệu nhiễm bệnh hoại tử gan tụy 10

Hình 4.1 Hình ảnh triển khai đề tài 25

Hình 4.2 Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định mầm bệnh WSSV trên mẫu tôm thu tăng cường tại Nghệ An 28

Hình 4.3 Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định mầm bệnh AHPND trên mẫu tôm thu định kỳ tại Nghệ An (ngày 16/6/2015) 29

Hình 4.4 Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định mầm bệnh AHPND trên mẫu tôm thu định kỳ tại Quảng Ninh (ngày 2/6/2015) 30

Hình 4.5 Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định mầm bệnh AHPND trên mẫu tôm thu định kỳ tại Quảng Ninh (ngày 9/6/2015) 31

Hình 4.6 Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định mầm bệnh AHPND trên mẫu tôm thu định kỳ tại Quảng Ninh (ngày 9/6/2015) 31

Hình 4.7 Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định mầm bệnh AHPND trên mẫu tôm thu đột xuất tại Nghệ An 33

Hình 4.8 Kết quả điện di sản phẩm PCR mẫu tôm thu đột xuất tại Nghệ An 33

Hình 4.9 Kết quả điện di sản phẩm PCR mẫu tôm thu đột xuất tại Quảng Ninh 34

Hình 4.10 Hình ảnh tôm trong đợt thu mẫu đột xuất tại Nghệ An 39

Hình 4.11 Dấu hiệu bệnh lý xuất hiện trên gan tụy 39

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN

Tên tác giả: Lê Huy Thưởng

Tên Luận văn: “Ứng dụng sinh học phân tử trong giám sát chủ động bệnh đốm trắng và bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm thẻ chân trắng”

Ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60.42.02.01

Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Hoạt động giám sát trên tôm nuôi nước lợ tập trung thuộc xã Quỳnh Bảng, Quỳnh Lưu, Nghệ An và phường Hải Hòa, Móng Cái, Quảng Ninh đã giúp chủ động tầm soát mầm bệnh gây bệnh AHPND, WSSV trên tôm Đề tài đã phát hiện sớm tác nhân gây bệnh AHPND, WSSV và đưa ra khuyến cáo, cảnh báo góp phần giảm thiểu tỷ

lệ tôm chết và ngăn ngừa sự bùng phát dịch bệnh Ngoài ra, đề tài cũng thực hiện một số đợt giám sát tăng cường, đột xuất vùng nuôi tôm tập trung tại phía Bắc khi tôm nuôi có dấu hiệu chết bất thường Việc thực hiện hoạt động giám sát vùng tôm nuôi tại Quảng Ninh, Nghệ An còn có ý nghĩa trong việc chủ động nắm bắt tình hình vùng nuôi và kịp thời phát hiện sự xuất hiện dịch bệnh trên tôm, góp phần xác định tác nhân gây bệnh làm cơ sở để địa phương công bố dịch Kết quả giám sát được kịp thời chuyển tải tới các hộ nuôi, cơ quan quản lý địa phương bằng hình thức điện thoại trao đổi trực tiếp, email và báo cáo Nhiệm vụ còn thể hiện vai trò trong việc tăng cường sự kết nối phối hợp giữa cơ quan nghiên cứu, cơ quan quản lý chỉ đạo sản xuất với địa phương và cơ sở/hộ nuôi

THESIS ABSTRACT

Master candidate: Le Huy Thuong

Thesis title: “Application of molecular biology technology to monitor diseases

by white spot syndrome virus and pathogenic hepato pancreatic acute necrosis in the white shrimp”

Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA) Disease monitoring in white-leg shrimp cultured in Quynh Bang, Quynh Luu, Nghe An and Hai Hoa, Mong Cai, Quang Ninh has helped to control WSSV and AHPND in shrimp actively These studies early found out WSSV and pathogens caused AHPND in shrimp and make warnings, and also give technical recommendation to local authorities and shrimp farmers in order to reduce the deaths of shrimp and prevent disease outbreaks Moreover, this study also collected shrimp samples in shrimp farms when cultured shrimp showed clinical signs and analyse pathogens caused for WSD and AHPND These results have played important roles in control of disease outbreak in shrimp as well as in reduction of mortalities caused by WSD and AHPND Moreover, based on these results, the provical authority, such as Quang Ninh province, could make officially announcement on AHPND outbreak in shrimp These results, together with some technical advices have also sent to local authorities and shrimp framers via email, telephome and documents Finally, the studies also play a role in stimulating the coorperation among research institutions, local authorities and shrimp farmers

PHẦN 1 MỞ ĐẦU1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Nguồn lợi thủy sản tự nhiên dù có phong phú và đa dạng bao nhiêu cũng không bao giờ là vô tận để đáp ứng nhu cầu cuộc sống của con người Vì thế, khai thác nguồn thủy sản tự nhiên cần phải đi liền với việc nuôi trồng thủy sản Nuôi trồng thủy sản (NTTS) đã và đang phát triển mạnh mẽ ở nhiều quốc gia nói chung và Việt Nam nói riêng NTTS được coi là ngành kinh tế mũi nhọn, chiếm một vị trí đặc biệt quan trọng trong chiến lược phát triển kinh tế, xã hội của mỗi quốc gia

Hiện nay, ở nước ta nghề nuôi tôm nước lợ đem lại hiệu quả đáng kể về kinh tế Do vậy, trong những năm gần đây, diện tích nuôi thả tôm nước lợ tăng lên nhanh chóng Tôm thẻ chân trắng là đối tượng đang được ngành thủy sản Việt Nam quan tâm và phát triển với hình thức thâm canh hoặc bán thâm canh là chủ yếu Thực tế, càng thâm canh hóa thì dịch bệnh xảy ra ngày càng nhiều

Dịch bệnh ở tôm, đã và đang là nỗi lo của người nuôi tôm, là một trở ngại lớn đối với việc thâm canh nghề nuôi tôm nước lợ và sự phát triển bền vững của ngành NTTS ở nước ta Trong đó, bệnh hoại tử gan tuỵ cấp (Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease - AHPND) và bệnh đốm trắng (white spot disease – WSD) là hai bệnh nguy hiểm, thường gặp nhất trên tôm nước lợ Vì các tác nhân này có khả năng lây lan rất nhanh, tỉ lệ tôm chết khi bị nhiễm bệnh rất cao

Tuy nhiên, đến nay chưa có thuốc đặc hiệu để trị hai bệnh WSD và AHPND nên công tác phòng ngừa tổng hợp, bao gồm: tẩy trùng ao nuôi, ngăn cản sự xâm nhập của các sinh vật mang mầm bệnh vào ao nuôi và sử dụng tôm giống sạch bệnh được khuyến cáo như một biện pháp an toàn sinh học (Escobedo Bonilla et al., 2008)

Do đó, phương pháp phát hiện sớm sự hiện diện của mầm bệnh trên đàn tôm trước khi thả và suốt quá trình nuôi trong ao nhằm hạn chế nguy cơ bùng phát dịch bệnh, giảm thiệt hại kinh tế cho người nuôi tôm Các phương pháp chẩn đoán truyền thống như: quan sát dấu hiệu bệnh hay phương pháp mô bệnh học không cho phép phát hiện sớm tác nhân gây bệnh Vì thế, nhiều phương pháp phân tử như lai in situ, western blot, PCR, nested PCR, rea-time PCR được phát triển nhằm khắc phục những nhược điểm trên (Trần Việt Tiên và cs., 2009)

Đề tài nghiên cứu đã nghiên cứu áp dụng sinh học phân tử trong việc xét nghiệm phát hiện sớm mầm bệnh trên tôm, với mong muốn mang lại những giá trị thực tiễn và những giá trị khoa học cho ngành thủy sản nói chung và ngành nuôi tôm thẻ chân trắng nói riêng

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Năm 2015, Viện nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 1 đã được Tổng cục Thủy sản giao nhiệm vụ “Giám sát chủ động vùng nuôi tôm nước lợ và ngao nuôi tập trung tại một số tỉnh phía Bắc” nhằm đảm bảo phát triển bền vững nghề nuôi tôm tại Việt Nam, gắn với việc giảm ô nhiễm môi trường và giảm thiệt hại về dịch bệnh trong nghề nuôi tôm nước lợ ở nước ta nói chung và tại miền Bắc nói riêng, mang lại giá trị kinh tế lâu dài cho người nuôi trồng thủy sản

Trong khuôn khổ nhiệm vụ trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài

“Ứng dụng sinh học phân tử trong giám sát chủ động bệnh đốm trắng và bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm thẻ chân trắng” với mục tiêu cụ thể sau:

+ Theo dõi, giám sát chủ động và phát hiện sớm mầm bệnh WSSV và AHPND trên tôm tại một số vùng nuôi tập trung thuộc Quỳnh Lưu, Nghệ An và Móng Cái, Quảng Ninh

+ Đề xuất, khuyến biện pháp xử lý kịp thời khi phát hiện tôm nhiễm mầm bệnh WSSV và AHPND để ngăn ngừa nguy cơ bùng phát bệnh

1.3 PHẠM VI NGHIÊN CỨU

Trong khuôn khổ đề tài luận văn tốt nghiệp cao học, tôi chỉ ứng dụng phương pháp PCR trong giám sát chủ động bệnh đốm trắng và bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm thẻ chân trắng, tại hai tỉnh Quảng Ninh và Nghệ An, thời gian từ tháng 4 đến tháng 7 năm 2015

Đây là một phần công việc thuộc nhiệm vụ “Giám sát chủ động vùng nuôi tôm nước lợ và ngao nuôi tập trung tại một số tỉnh phía Bắc”do Viện Nghiên cứu NTTS 1 thực hiện năm 2015 tại các tỉnh nuôi tôm phía Bắc của nước ta

1.4 Ý NGHĨA ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

+ Góp phần kiểm soát chủ động bệnh trên tôm nuôi, góp phần phát triển bền vững nghề nuôi tôm nước lợ của Quảng Ninh và Nghệ An nói riêng và của

cả nước nói chung

+ Góp phần giảm ô nhiễm môi trường do giảm thiểu dịch bệnh tôm và sử dụng hóa chất bừa bãi

+ Là cơ sở khoa học để các cơ quan quản lý chỉ đạo sản xuất

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 TÌNH HÌNH NUÔI TÔM THẺ CHÂN TRẮNG TRÊN THẾ GIỚI VÀ

Ở VIỆT NAM

2.1.1 Tình hình nuôi tôm thẻ chân trắng trên thế giới

Tôm thẻ chân trắng được nuôi vào khoảng thập niên 80, đến năm 1992, chúng đã được nuôi phổ biến trên thế giới, nhưng chủ yếu tập trung ở các nước Nam Mỹ Khi đó nhiều nước Châu Á đã tìm cách hạn chế phát triển tôm chân trắng do sợ lây bệnh cho tôm sú Nhưng từ năm 2003, các nước châu Á bắt đầu nuôi loại tôm này

Trước năm 2003, các nước có sản lượng tôm nuôi lớn nhất thế giới như Thái Lan, Trung Quốc, Inđônêxia, Ấn Độ, chủ yếu nuôi tôm sú hay tôm bản địa Nhưng sau đó, các nước này đã tập trung phát triển mạnh đối tượng tôm chân trắng Sản lượng tôm chân trắng của Trung Quốc năm 2003 đạt 600 nghìn tấn (chiếm 76% tổng sản lượng tôm nuôi tại nước này), đến năm 2008 tôm chân trắng đạt sản lượng 1,2 triệu tấn (trong tổng số 1,6 triệu tấn tôm nuôi) Inđônêxia nhập tôm chân trắng về nuôi từ năm 2002 và năm 2005 đạt 40 nghìn tấn, năm

2007 là 120 nghìn tấn (trong tổng sản lượng 320 nghìn tấn)

Năm 2004, tôm chân trắng dẫn đầu về sản lượng tôm nuôi, đóng góp trên 50% tổng sản lượng tôm nuôi trên thế giới Năm 2007, tôm chân trắng chiếm 75% tổng sản lượng tôm nuôi toàn cầu và là đối tượng tôm nuôi chính ở Thái Lan, Trung Quốc, Inđônêxia Ba nước này cũng chính là những quốc gia dẫn đầu thế giới về nuôi tôm

Sản lượng tôm trên thế giới liên tục tăng nhanh qua các năm, đến năm

2010 sản lượng tôm đạt khoảng 2,7 triệu tấn (FAO, 2011) Đến năm 2012 sản lượng tôm đạt khoảng 4 triệu tấn Các nước nuôi tôm chủ yếu trên thế giới gồm Trung Quốc, Thái Lan, Inđônêxia, Brazil, Ecuador, Mexico, Venezuela, Honduras, Việt Nam, Malaysia, Peru, Costa Rica, Panama, Hoa Kỳ, Ấn Độ, Philippines, với hình thức nuôi chủ yếu là thâm canh và siêu thâm canh

2.1.2 Tình hình nuôi tôm thẻ chân trắng tại Việt Nam

Tôm thẻ chân trắng đang nuôi ở nước ta là đối tượng ngoại nhập, có nguồn gốc từ Châu Mỹ Đây là loài có giá trị kinh tế cao đang được người tiêu

dùng ở các thị trường lớn ưa chuộng như Mỹ, Châu Âu và Nhật Bản Việt Nam

đã và đang là nhà cung cấp tôm số một cho Nhật Bản, với thị trường Mỹ Việt Nam xếp vị trí thứ tư sau Ấn Độ, Inđônêxia và Ecuador

Tôm thẻ chân trắng có thời gian sinh trưởng ngắn (3 – 3,5 tháng), năng suất cao (trên 4 tấn/ha/vụ), thâm canh có thể đạt đến 20 tấn/ha/vụ và có giá trị dinh dưỡng rất cao, dễ nuôi, lớn nhanh và sản lượng lớn (Trần Việt Mỹ, 2009)

Do vậy, loại tôm này được nhiều nước ưu tiên phát triển nhất là các nước châu Á Tôm thẻ chân trắng được đưa vào Việt Nam năm 2001 và được nuôi thử nghiệm tại Quảng Ninh, Phú Yên và Bạc Liêu Đến năm 2006, ngành thuỷ sản đã cho phép nuôi bổ sung tôm chân trắng tại một số tỉnh, nhưng vẫn cấm nuôi tại khu vực đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) Nhận thấy tôm thẻ chân trắng là đối tượng nuôi có hiệu quả kinh tế cao đồng thời nhu cầu của mặt hàng này trên thế giới đang có chiều hướng tăng nhanh do sự hấp dẫn về giá thành Đến 25/01/2008, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn ban hành Chỉ thị số 228/CT-BNN-NTTS về việc phát triển nuôi tôm thẻ chân trắng tại các tỉnh vùng ĐBSCL nhằm nâng cao sản lượng và đa dạng hoá sản phẩm thuỷ sản xuất khẩu, đáp ứng được nhu cầu tiêu dùng trong nước và xuất khẩu

Trong lĩnh vực xuất khẩu thuỷ sản, mặt hàng tôm thẻ chân trắng đang khẳng định được vị thế 7 tháng đầu năm 2013, trong khi xuất khẩu tôm sú chỉ tăng 1,3% so với cùng kỳ năm 2012 (đạt xấp xỉ 680 triệu USD) thì xuất khẩu tôm thẻ chân trắng đạt 609 triệu USD, tăng 51,5% so với cùng kỳ năm 2012, chiếm 43,7% trong tổng kim ngạch xuất khẩu tôm của Việt Nam

Từ một số mô hình nuôi thành công, tôm chân trắng đang ngày càng được các hộ nuôi trồng thuỷ sản quan tâm đầu tư phát triển Điều này được thể hiện thông qua diện tích nuôi tôm thẻ chân trắng không ngừng tăng lên nhanh chóng qua các năm (Hình 2.1)

Hình 2.1 Diện tích, sản lượng và năng suất tôm thẻ từ năm 2008 đến 2015

Nguồn: Tổng hợp từ báo cáo thống kê của Tổng cục thủy sản

2.1.2.1 Hoạt động nuôi tôm tại Nghệ An

Theo thống kê từ chi cục Nuôi trồng Thủy sản Nghệ An (nay là chi cục Thủy sản Nghệ An), diện tích nuôi tôm mặn, lợ của Nghệ An năm 2014 ước đạt 2.360 ha, trong đó diện tích nuôi tôm vụ 1 (từ tháng 4 đến tháng 7) là 1.320 ha và

vụ 2 (từ tháng 7 đến tháng 11) là 1.040 ha Mật độ thả giống bình quân đối với tôm chân trắng từ 60 – 100 con/m2 Năng suất bình quân đạt được đối với nuôi tôm chân trắng là 3,7 tấn/ha và tôm sú là 0,7 tấn/ha

Kết quả hoạt động NTTS, đặc biệt là nuôi tôm nước lợ của Nghệ An trong năm 2014 bị ảnh hưởng bởi dịch bệnh Trong năm này, Nghệ An đã công bố dịch bệnh đốm trắng trên tôm nuôi UBND tỉnh có Quyết định số 1845/QĐ-UBND về việc công bố dịch đốm trắng ở tôm trên địa bàn xã Hưng Hòa, Thành phố Vinh

và xã Nghi Thái, huyện Nghi Lộc

2.1.2.2 Hoạt động nuôi tôm tại Quảng Ninh

Theo số liệu thống kê, tổng diện tích NTTS của Quảng Ninh năm 2014 vào khoảng 21.000 ha, trong đó diện tích nuôi tôm chiếm khoảng 10.000 ha Trong những năm gần đây nghề NTTS tại Quảng Ninh đã có sự phát triển mạnh

mẽ và đã trở thành một lĩnh vực kinh tế mũi nhọn trong nông nghiệp, nhiều vùng

nuôi tôm thẻ chân trắng đạt năng suất cao từ 10-15 tấn/ha/2 vụ Tại thành phố Móng Cái, có những đơn vị, hộ gia đình nuôi đạt sản lượng trên 20 tấn/ha/2 vụ Đặc biệt, những năm gần đây, tình hình sản xuất và cung ứng giống thuỷ sản trên địa bàn đã có những chuyển biến tích cực Hiện nay, toàn tỉnh có 17 cơ sở sản xuất và kinh doanh giống thuỷ sản, các cơ sở này có thể đáp ứng được khoảng 30% nhu cầu giống thuỷ sản trên địa bàn tỉnh

Tuy nhiên, năm 2014 nghề NTTS tại Quảng Ninh cũng phải đối diện với nhiều thách thức do dịch bệnh Năm 2014, dịch bệnh thuỷ sản xuất hiện ở hầu hết các đối tượng chủ lực tại các vùng nuôi tập trung của tỉnh, gây thiệt hại lớn cho người dân, trong đó có dịch bệnh đốm trắng và hoại tử gan tụy cấp trên tôm nuôi UBND tỉnh đã có Quyết định số 1469/QĐ-UBND về việc công bố dịch bệnh đốm trắng và bệnh hoại tử gan tụy cấp tính trên tôm sú nuôi tại xã Hải Lạng (huyện Tiên Yên)

2.2 TÌNH HÌNH DỊCH BỆNH Ở TÔM NUÔI TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM

2.2.1 Tình hình dịch bệnh ở tôm nuôi trên thế giới

Tôm thẻ chân trắng được coi là loài có khả năng chống bệnh tốt hơn các loài tôm khác (Wyban 1991) Mặc dù trong thực tế cũng thường xảy ra nhiều loại bệnh, có những bệnh nguy hiểm gây thiệt hại lớn như bệnh đốm trắng (WSD) và bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND)

2.2.1.1 Bệnh đốm trắng

Hình 2.2 Đốm trắng xuất hiện trên vỏ đầu tôm

Nguồn: Viện nuôi trồng Thủy sản 1

Bệnh đốm trắng xuất hiện ở Trung Quốc vào năm 1992 sau đó là các nước Châu Á và tác nhân gây bệnh là do vi rút đốm trắng WSSV WSSV đã gây bệnh cho nhiều trang trại nuôi tôm ở Đông Nam Á (Flegel et al., 1995) và các quốc gia khác như Nhật Bản và Hàn Quốc (Inouye et al., 1994) WSSV là vi rút hình que

có vỏ protein, có nhân là phân tử ADN kiến trúc sợi đôi (Wongteerasupaya et al., 1996) và được xác định thuộc giống mới Whispovirus, họ mới Nirnaviridae có kích thước 70-150 nm x 275- 380 nm Dấu hiệu bệnh lý điển hình của bệnh là sự xuất hiện các đốm trắng tròn dưới lớp vỏ- kitin, đặc biệt các đốm trắng tập trung

ở giáp đầu ngực và đốt bụng cuối cùng (Hình 2.2)

WSSV là tác nhân gây bệnh có thể xâm nhập, gây hại trên hầu hết các cơ quan nội tạng của tôm và sở hữu cả hai phương thức lây lan ngang (sự lan truyền của bệnh qua động vật trung gian, qua ăn thịt đồng loại và qua nguồn nước) và dọc (sự lan truyền của bệnh từ tôm bố mẹ cho con cái) Với khả năng lan truyền bệnh và gây chết tôm hàng loạt, bệnh đốm trắng là một trong những tác nhân gây bệnh chính gây thiệt hại lớn đến nền công nghiệp nuôi tôm của nhiều nước trên thế giới trong đó có Việt Nam

WSSV có thể xuất hiện ở tất cả các giai đoạn phát triển của tôm, đặc biệt giai đoạn tôm 50-70 ngày tuổi, WSSV có thể làm chết 100% tôm chỉ trong vòng 3-10 ngày (Lightner, 1996)

2.2.1.2 Bệnh hoại tử gan tụy cấp AHPND

AHPND là một trong số những bệnh nguy hiểm mới xuất hiện trong mấy năm gần đây tại khu vực Châu Á, ban đầu được đặt tên là hội chứng chết sớm trên tôm (EMS) EMS lần đầu được ghi nhận tại Trung Quốc (năm 2009), đến năm 2011 được gọi là hội chứng hoại tử gan tuỵ cấp (AHPND) Bệnh đã bắt đầu gây thiệt hại nghiêm trọng đến sản lượng tôm ở phía Nam Trung Quốc từ năm

2009, đến năm 2010 dịch bệnh xảy ra trên diện rộng tại Trung Quốc, sau đó bệnh được ghi nhận có tại Việt Nam năm 2010 Dịch bệnh tương tự cũng được báo cáo

ở Malaysia năm 2011, Thái Lan vào đầu năm 2012 và Mexico năm 2013 (Schryver et al., 2014)

Nguyên nhân gây nên bệnh AHPND là do vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây ra (Lightner, 2013) Vi khuẩn V parahaemolyticus tấn công vào các tế bào biểu mô gan tụy tôm và sau đó gây chết tôm trong vòng 30 ngày sau khi thả tôm

giống Các nghiên cứu tiếp theo đã xác định được một plasmids lớn gắn vào DNA nhiễm sắc thể của V parahaemolyticus là nguồn gốc của các độc tố gây bệnh AHPND tạo ra bởi dòng vi khuẩn đặc biệt này (Lightner, 2013) Plasmids là các phân tử DNA mạch đôi dạng vòng nằm ngoài DNA nhiễm sắc thể Chúng thường hiện diện trong vi khuẩn, đôi khi cũng có ở sinh vật có nhân thật (eukaryote) Chúng có kích thước khoảng từ 1 đến hơn 400 kbp (kilobase pairs) Chúng có thể hiện diện chỉ một bản sao, đối với plasmid lớn, cho tới vài trăm bản sao trong cùng một tế bào Plasmid thường chứa các gen hay nhóm gen (gene-cassettes) mang lại một ưu thế chọn lọc nào đó cho tế bào vi khuẩn chứa nó, ví

dụ như khả năng giúp vi khuẩn kháng kháng sinh, gen gây độc

Sau khi phân lập và giải trình tự gen của plasmid này, các phương pháp PCR dùng để phát hiện chủng vi khuẩn V parahaemolyticus gây bệnh AHPND

đã được công bố rộng rãi ra công chúng vào tháng 12/2013 Hai phương pháp PCR phát hiện chủng vi khuẩn V parahaemolyticus gây bệnh AHPND dựa trên hai cặp mồi (primer) AP1 và AP2 được gọi tên là AHPND Primer set 1 và AHPND Primer set 2 Thử nghiệm với cặp mồi AP2 cho tỷ lệ dương tính chính xác 96% (Lightner, 2013) Trong một nghiên cứu khác, đã công bố một phương pháp PCR mới dựa trên cặp mồi AP3 cho kết quả dương tính chính xác 100% khi thử nghiệm trên 104 mẫu tôm nhiễm bệnh EMS/AHPND Trình tự các cặp mồi liên quan đã được công bố rộng rãi và miễn phí kể từ 18/6/2014 tại trang web của Mạng lưới các Trung tâm Nuôi trồng thủy sản ở châu Á Thái Bình Dương (NACA) (Sirkharin et al., 2014) Ngoài ra, bộ kit PCR phát hiện EMS/AHPND thương mại sử dụng công nghệ chuyển giao từ Đại học Arizona hiện cũng được bán trên thị trường (EMS-2, IQ2000)

AHPND xảy ra ở cả tôm sú và tôm thẻ chân trắng, chủ yếu ở các vùng nuôi tôm thâm canh và bán thâm canh ở giai đoạn 15 - 45 ngày sau khi thả nuôi

và tỷ lệ chết có thể lên đến 100% Tôm bệnh có biểu hiện ngừng ăn, bơi chậm, màu tôm nhợt nhạt, gan tụy có biểu hiện sưng, nhũn, teo Dịch bệnh xảy ra ở hầu hết các tháng trong năm (Schryver et al., 2014)

Hình 2.3: Tôm thẻ chân trắng có dấu hiệu nhiễm bệnh hoại tử gan tụy

(A) Gan tụy (HP) teo, màu nhợt nhạt; dạ dày (ST) và ruột (MG) không có thức ăn Hình (C, D) là tôm khỏe cho thấy HP có kích thước bình thường với màu da cam hơi tối, dạ dày và ruột đầy thức ăn Hình

(B) và (D) là mẫu lấy từ hai con tôm ở hình (A) và (C) tương ứng.

Bảng 2.1 Tổng hợp dịch bệnh WSSV trên tôm nuôi nước lợ theo các năm

Nguồn: Các báo cáo liên quan tại Hội nghị Tổng kết nuôi tôm nước lợ năm 2014 và

xây dựng kế hoạch năm 2015, Báo cáo tổng kết của Cục Thúy y (2015)

Hiện tại, thế giới vẫn chưa có vắc xin hữu hiệu cho bệnh đốm trắng trên tôm nên công tác quản lý chất lượng con giống, quản lý tốt môi trường và tầm soát tác nhân gây bệnh là giải pháp để giảm thiểu sự nhiễm và lan truyền bệnh 2.2.2.2 Bệnh hoại tử gan tụy cấp (AHPND)

Ở Việt Nam, hiện tượng tôm chết với các biểu hiện bất thường trên gan tụy đã được thông báo chính thức bằng văn bản tại tỉnh Sóc Trăng tháng 5 năm

2011, mặc dù hiện tượng tôm chết tương tự đã được ghi nhận tại một số tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long như Sóc Trăng, Bạc Liêu từ cuối năm 2010 Từ đó đến nay, dịch bệnh tiếp tục xảy ra cả mức độ nông hộ và trang trại với mức độ thiệt hại cao Dịch bệnh xảy ra trên cả tôm sú và tôm thẻ chân trắng

Trong những năm gần đây dịch bệnh AHPND diễn ra trên diện rộng, tuy tổng diện tích bị dịch bệnh trên cả nước có chiều hướng giảm, nhưng số tỉnh, số huyện, số xã bị dịch bệnh lại tăng liên tục qua các năm (Bảng 2.2)

Bảng 2.2 Tổng hợp dịch bệnh AHPND trên tôm nuôi nước lợ theo các năm

Nguồn: Các báo cáo liên quan tại Hội nghị Tổng kết nuôi tôm nước lợ năm 2014 và xây

dựng kế hoạch năm 2015, Báo cáo tổng kết của Cục Thúy y (2015)

Năm 2014, bệnh hoại tử gan tụy cấp, đã xảy ra tại 237 xã thuộc 63 huyện

ở 22 tỉnh/thành phố với diện tích tôm nuôi bị bệnh là 5.509 ha, chiếm 0,81% tổng diện tích thả nuôi của cả nước Trong đó diện tích nuôi tôm thâm canh và bán thâm canh bị thiệt hại là 5.134 ha; diện tích nuôi quảng canh, quảng canh cải tiến

và tôm lúa là 456 ha Tương tự như bệnh đốm trắng, bệnh hoại tử gan tụy cấp cũng xuất hiện trên cả tôm sú và tôm chân trắng (khoảng 10-103 ngày sau thả nuôi), nhưng diện tích thiệt hại chủ yếu xảy ra ở tôm chân trắng (3.557 ha, chiếm 63,6% tổng diện tích bị bệnh) Năm 2015 tình hình dịch bệnh có chiều hướng ngày càng gia tăng

2.3 THỰC TRẠNG ÁP DỤNG SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH TRÊN TÔM

Có nhiều phương pháp để chẩn đoán các tác nhân gây bệnh virus, vi khuẩn… trên tôm trước khi thả và trong quá trình nuôi bao gồm các kỹ thuật như mô bệnh học (Supamattaya, 1996) lai tạo tại chỗ sử dụng đầu dò gen (Wongteerasupaya et al., 1996), phương pháp PCR (Lo et al., 1996), phương pháp miễn dịch như Nitrocellulose-enzymeimmunoblot và kỹ thuật Western blot (Nadala et al., 1998)

Đối với các bệnh trên tôm nuôi, ngoài việc quan sát các dấu hiệu bệnh lý điển hình thì phương pháp mô bệnh học và sinh học phân tử đang được ứng dụng rộng rãi để chẩn đoán, xác định các tác nhân gây bệnh Trong khi phương pháp

mô bệnh học được xem là chuẩn mực đủ để chẩn đoán khi bệnh đã bùng phát thành dịch, thì phương pháp PCR lại được khuyến cáo là không cần thiết khi dịch bệnh đã bùng phát nhưng lại đặc biệt có ý nghĩa trong trường hợp chẩn đoán nhanh, kiểm dịch các nguồn tôm bị nhiễm bệnh, hay dùng để sàng lọc lựa chọn nguồn giống sạch bệnh và tầm soát mầm bệnh trong quá trình nuôi

Phương pháp PCR hiện vẫn đang được sử dụng rất rộng rãi và hiệu quả trong việc xét nghiệm phát hiện sớm một số bệnh nguy hiểm trên tôm Phương pháp PCR là phương pháp dùng để khuếch đại nhanh, tạo ra nhiều bản sao từ một

số ít đoạn DNA làm khuôn nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mồi đặc hiệu cho đoạn DNA đó mà không qua tạo dòng.Phương pháp này được Kary Mullis đưa ra năm 1985 và Saiki hoàn thiện vào năm 1988 Phương pháp được tiến hành hoàn toàn trong ống eppendoff và trong thời gian ngắn ta có thể thu được rất nhiều bản sao DNA Đây là phương pháp hoàn toàn mới trong việc nghiên cứu, phân tích gen và hệ gen Nhờ đó mà ta có thể phân tích một đoạn

DNA đơn lẻ trong hệ gen sinh vật đơn giản chỉ là phát hiện sự có mặt đoạn DNA trong cơ thể sinh vật, đã đưa lại một cuộc cách mạng trong di truyền học phân tử

Do những ưu điểm tuyệt đối trong nghiên cứu sinh học phân tử, kỹ thuật PCR được nhanh chóng áp dụng rộng rãi để chuẩn đoán các bệnh về virus, vi khuẩn, các bệnh ký sinh trùng và cho kết quả rất chính xác Mặt khác, sự phân tích thành phần và trật tự nucleotide trên phân tử DNA trong hệ gen còn có ý nghĩa to lớn trong phân loại các loài sinh vật.Chính nhờ tính thực tiễn to lớn của kỹ thuật này

mà tác giả của PCR, Kary Mulis, được tặng giải thưởng Nobel vào năm 1993 2.3.1 Kỹ thuật PCR

Kỹ thuật PCR là kỹ thuật khuếch đại phân đoạn ADN (của vi-rút, vi khuẩn gây bệnh) dựa trên tiến trình các chu kỳ nhiệt liên tiếp Tiến trình này khuếch đại lượng ADN tăng theo lũy thừa, sản phẩm chu kỳ trước làm khuôn của chu kỳ sau Sản phẩm của tiến trình là những đoạn ADN nằm giữa 2 đoạn mồi chuyên biệt (xác định đặc tính của đối tượng) Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại nối tiếp nhau Mỗi chu kỳ gồm 3 bước sau:

Bước 1: Biến tính DNA (tách đôi sợi DNA)

Bước 2: Bắt cặp các đoạn mồi vào mạch DNA đã đươc làm biến tính Bước 3: Kéo dài đoạn oligonucleotide cần tổng hợp

Một phản ứng tiêu biểu cần 20-30 chu kỳ để có đủ sản phẩm cho việc phát hiện trên bản thạch có nhuộm ethidium bromide Thành phần phản ứng bao gồm mồi, dung dịch đệm, magnesium, dNTP (mononucleotide), enzim Taq ADN polymerase và khuôn mẫu ADN

Ngày nay, dựa trên kỹ thuật PCR cổ điển, người ta đã phát triển kỹ thuật này để chẩn đoán nhanh và chính xác hơn; đang được nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới sử dụng, cụ thể như nested PCR, real-time PCR, tuy nhiên với phương pháp PCR cổ điển lại có ưu điểm là đơn giản, dễ sử dụng nên rất thích thợp dùng để phổ biến cho việc kiểm tra tôm thường xuyên ở các địa phương 2.3.2 Kỹ thuật nested PCR (PCR mồi đôi)

Kỹ thuật này sử dụng 2 cặp mồi thay vì 1 cặp mồi như kỹ thuật PCR cổ điển, trong đó cặp mồi thứ hai khuếch đại đoạn gen nằm trong đoạn gen đã được khuếch đại bởi cặp mồi thứ nhất Kỹ thuật này còn gọi là kỹ thuật PCR 2 bước.Kỹ thuật này sẽ có nhiều đoạn sản phẩm DNA hơn là kỹ thuật PCR cổ điển,

số đoạn ADN được phát hiện sẽ nói lên tính định lượng tương đối của phản ứng

(Lo et al., 1996) Tuy nhiên quy trình thực hiện phản ứng nested PCR còn phức tạp nên khó đưa ra ứng dụng đại trà

có độ chính xác cao, nhanh, không cần điện di, tránh được hiện tượng dương tính giả, tuy nhiên giá thành cho mỗi phản ứng cao, cần phải có máy chuyên dụng… nên không thích hợp cho việc dùng để phổ biến cho việc kiểm tra tôm nuôi ở địa phương

2.3.3.1 Sử dụng SYBR GREEN

Đặc tính của chất SYBR GREEN là phát huỳnh quang khi nằm chen vào sợi DNA đôi Số lượng sản phẩm ADN sinh ra càng nhiều thì cường độ huỳnh quang càng cao Tuy nhiên phương pháp dùng SYBR GREEN gặp trở ngại vì sau phản ứng có nhiều đoạn mồi bắt cặp với nhau thành những sợi ngắn ADN đôi dài 20-40 bp Do đó khi thiết kế phản ứng chúng ta phải tính toán lượng ADN vừa đủ cho các đoạn mồi không tự bắt cặp với nhau

2.3.3.2 Dùng đoạn dò TaqMan (TaqMan probe)

Đoạn dò TaqMan là đoạn oligonucleotide có trình tự bổ sung với trình tự của một đoạn DNA trên mạch khuôn, giới hạn bởi 2 trình tự bổ sung với trình tự của hai 2 đoạn mồi, trong phản ứng PCR Hai đầu của đoạn dò được gắn hai chất gọi là reporter và quencher, khi reporter và quencher ở gần nhau thì quencher làm mất màu của reporter, khi reporter và quencher ở xa nhau thì reporter phát huỳnh quang Ở mỗi chu kỳ PCR, trước hết là sự gắn vào mạch khuôn của đoạn dò và hai đoạn mồi Sau đó, Taq DNA polymerase sẽ tổng hợp mạch DNA mới dựa trên khuôn và đoạn mồi, đồng thời nó cũng phân cắt đoạn dò ra khỏi mạch khuôn khi

nó tiến đến vị trí của đoạn dò, trong quá trình này quencher sẽ tách ra khỏi reporter nên làm reporter phát quang Do đó lượng phát quang sẽ tỉ lệ thuận với lượng ADN khuếch đại lên Kỹ thuật Real time PCR dung đoạn dò TaqMan cho kết quả chính xác và có thể phát hiện nhanh vi sinh vật gây bệnh (Lightner, 1996)

PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

3.1.1 Địa điểm thu mẫu

Vùng nuôi tôm tập trung thuộc phường Hải hòa - Móng Cái - Quảng Ninh Vùng nuôi tôm tập trung thuộc xã Quỳnh Bảng - Quỳnh Lưu- Nghệ An 3.1.2 Địa điểm tiến hành phân tích mẫu

Trung tâm quan trắc môi trường và bệnh thủy sản miền Bắc, Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản 1, Đình Bảng, Từ Sơn, Bắc Ninh

3.2 THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

Thời gian giám sát tiến hành từ tháng 4 đến tháng 7 năm 2015

3.3 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

Tôm thẻ chân trắng thu tại một số hộ giám sát thuộc phường Hải Hòa - Móng Cái - Quảng Ninh và xã Quỳnh Bảng - Quỳnh Lưu - Nghệ An

Tôm thẻ thuộc hệ thống phân loại khoa học như sau:

Lớp: Malacostraca

Bộ: Decappoda

Họ: Penaeidae

Giống: litopenaeus

Loài: Litopenaeus vannamei, Boone, 1931

3.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.4.1 Phương pháp chọn điểm giám sát tác nhân gây bệnh trên tôm và thời điểm giám sát

Điểm thu mẫu giám sát tác nhân gây bệnh WSSV và AHPND của đề tài là các ao giám sát được lựa chọn bởi nhiệm vụ “Giám sát chủ động vùng nuôi tôm nước lợ và ngao nuôi tập trung tại một số tỉnh phía Bắc” được thực hiện bởi Viện Nghiên cứu NTTS 1 thực hiện tại vùng nuôi tôm thẻ chân trắng tập trung thuộc phường Hải Hòa – Móng Cái - Quảng Ninh và xã Quỳnh Bảng - Quỳnh Lưu - Nghệ An Tại mỗi vùng giám sát chọn tối thiểu 6 ao nuôi tôm thâm canh hoặc bán thâm canh để giám sát Các ao nuôi được lựa chọn ở các vị trí khác nhau thuộc nhiều hộ khác nhau (Bảng 3.1)

Bảng 3.1 Vùng, điểm giám sát và thời điểm giám sát mầm bệnh WSSV và

AHPND thường xuyên trên tôm nuôi

Đối tượng thu

mẫu

Vùng giám sát chủ

động

Điểm giám sát chủ động

Thời điểmgiám sátTôm thẻ

6 ao nuôi thâm canh và bán thâm canh

Vụ chính trong năm (từ tháng 4 đến tháng 7)

Hải Hòa, Móng Cái, Quảng Ninh

9 ao nuôi thâm canh và bán thâm canh

Vụ chính trong năm (từ tháng 4 đến tháng 7)

Khi có hiện tượng như tôm bị chết, bỏ ăn hoặc các hiện tượng bất thường khác, đề tài sẽ tiến hành thu mẫu đột xuất Vùng, điểm giám sát và thời gian (bảng 3.2)

Bảng 3.2 Vùng, điểm giám sát và thời điểm giám sát mầm bệnh WSSV và

AHPND đột xuất trên tôm nuôi

Đối tượng thu

Tại các ao nuôi bất kì trong vùng nuôi tập trung tại Nghệ An

Khi có hiện tượng bất thường (từ tháng

4 đến tháng 7)Hải Hòa, Móng Cái,

Quảng Ninh

Tại các ao nuôi bất kì trong vùng nuôi tập trung tại Quảng Ninh

Khi có hiện tượng bất thường (từ tháng

4 đến tháng 7)

3.4.2 Thông số, tần suất giám sát và phương pháp phân tích thông số giám sát

Các tác nhân gây bệnh được giám sát, tần suất giám sát và phương pháp phân tích tác nhân gây bệnh được trình bày ở bảng 3.3

Bảng 3.3 Thông số, tần suất thu mẫu tôm và phương pháp phân tích mầm

3.4.3 Phương pháp thu mẫu và bảo quản mẫu

Ưu tiên thu các con tôm có biểu hiện nghi ngờ (hoạt động không bình thường, nổi tầng mặt, dạt bờ…) trong trường hợp không có dấu hiệu gì bất thường thì thu ngẫu nhiên

Số lượng mẫu thu: Mỗi ao giám sát thu 5 mẫu (tương ứng 10 - 15 con /ao /đợt) cho mỗi chỉ tiêu phân tích

Mẫu thu được cố định trong cồn 96%

3.4.4 Phương pháp phân tích tác nhân gây bệnh trên tôm

3.4.4.1 Thực hiện phản ứng PCR xác định WSSV trên tôm

Mầm bệnh WSSV được nhận biết bằng phương pháp PCR sử dụng cặp mồi VP28 theo OIE (2009) (Bảng 3.4)

Bảng 3.4 Trình tự cặp mồi VP28 dùng xác định WSSV

(bp)

Nguồn tài liệu VP28 F: 5'-CTG CTG TGA TTG CTG TAT TT-3 '

615

OIE, 2009 VP28 R: 5'-CAG TGC CAG AGT TGA AGG C-3’

a Quy trình tách chiết DNA tôm để xác định mầm bệnh WSSV

Tách chiết DNA tôm có thể tiến hành giống như các thao tác của bộ kít IQ-2000 gồm các bước sau:

+ Thu khoảng 0.5-1g mẫu phần đầu ngực(khi tôm còn nhỏ có thể lấy cả con) cho vào ống 1.5 ml có chứa 600 μl dung dịch DTAB với tách DNA

+ Nghiền mẫu trong ống với chày nghiền dùng 1 lần

+ Ủ mẫu cần kiểm tra ở 75ºC trong 5 phút, rồi hạ xuống nhiệt độ phòng + Lắc nhẹ, rồi ly tâm nhẹ mẫu, sau đó thêm 0.7 ml chloroform, lắc thêm 20s và ly tâm ở 12000 rpm trong 5 phút

+ Chuyển 200 ul dịch nổi sang ống ly tâm 1.5 ml mới Thêm 100µl CTAB

và 900µl ddH2O Lắc nhẹ, sau đó ủ ở 75ºC trong 5 phút

+ Hạ xuống nhiệt độ phòng sau đó ly tâm tại tốc độ 12000g trong 10 phút + Gạn hết dịch nổi, hòa tan kết tủa bằng 150µl Dissolving Solution, ủ tại 75º C trong 5 phút sau đó hạ xuống nhiệt độ phòng

+ Ly tâm tốc độ 12000g trong 5 phút Chuyển dung dịch sạch sang ống ly tâm 1.5ml mới với 300µl 95% ethanol

+ Lắc nhẹ, ly tâm tốc độ 12000g trong 5 phút, sau đó rửa sạch kết tủa với

200 µl cồn ethanol 75%, ly tâm 12000 vòng trong 3 phút sau đó loại sạch nước

và hòa tan bằng dd H2O hoặc TE buffer để sử dụng

+ DNA đã được hoà tan trong dd H2O hoặc TE buffer bảo quản ở nhiệt độ

- 20ºC để làm vật liệu AND cho các phản ứng PCR

b Thực hiện phản ứng PCR xác định WSSV trên tôm

● Các bước PCR:

+ Gai đoạn 1 (Giai đoạn biến tính): Ở giai đoạn này, hỗn hợp PCR được giữ ở nhiệt độ 94 °C trong vòng 5 phút để đảm bảo sợi DNA cũng như mồi được làm nóng

+ Giai đoạn 2 (Chu kỳ luân nhiệt): Chu kỳ luân nhiệt để nhận biết WSSV được thực hiện gồm 30 chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm 3 bước:

- Bước 1 (Biến tính): Duy trì hỗn hợp PCR ở 94 °C trong 30 giây Đối với mỗi chu kì thì lượng thời gian này là đủ để biến tính DNA thành sợi đơn

- Bước 2 (Gắn mồi): Duy trì hỗn hợp PCR ở 55 °C trong 30 giây, để gắn mồi vào mạch khuôn

Bước 3 (Kéo dài): Duy trì hỗn hợp PCR ở 72 °C trong 40 giây, để tổng hợp các mạch mới cần nhân lên

+ Giai đoạn 3 (Giai đoạn kéo dài): Ở giai đoạn này hỗn hợp PCR được giữ

ở 720c trong 3 đến 5 phút sau đó giữ ở 40c Sản phẩm PCR sau đó được dùng để điện di

c Chạy điện di sản phẩm PCR

● Chuẩn bị bản gel 2%

Để chuẩn bị gel 2% agarose, lấy 2g agarose vào cốc thủy tinh miệng rộng hoặc bình cầu với 100 ml dung dịch đệm TBE 1X hoặc TAE 1X

Đun nóng hỗn hợp gel đến khi tạo thành dịch trong suốt

Giảm nhiệt độ gel xuống còn khoảng 50º C và rót chậm chậm gel vào khuân đúc gel Thể tích gel thay đổi tùy theo kích thước của bể gel Chiều cao của gel agarose từ chân lược khoảng 0.3 – 0.5 cm, chiều dày bản gel không nhỏ hơn 0.8cm

Gỡ cẩn thận lược và khuân gel khi gel đông lại, sau đó tiến hành quá trình điện di

● Điện di

Trước tiên lựa chọn dung dịch đệm là TAE 1X hoặc TBE 1X

Để gel agarose vào trong bể gel Phân tử DNA sẽ chuyển động về phía cực dương do phân tử DNA tích điện âm

Thêm dung dịch đệm nồng độ 1X vào bể gel cho đến khi mức dung dịch đệm ngập đều bản gel

Thêm 5 µl “PCR product-loading dye mixture” vào mỗi giếng Hỗn hợp dung dịch sẽ chìm xuống đáy giếng do trọng lượng nặng hơn dung dịch đệm Bước này cần phải thực hiện cần thận để tránh nhiễm

Mỗi quá trình điện di đều cần thang DNA chuẩn (DNA marker) Thể tích DNA marker khoảng 5µl

Khi tất cả mẫu đã được thêm vào, nối bể điện di với nguồn điện sau đó cho chạy dưới điện áp không đổi

Loading dye bao gồm 2 thuốc nhuộm: Bromphenol Blue màu xanh thẫm; Xylene Cyanol màu xanh nhạt Khi màu xanh thẫm được khoảng ½ đến 2/3 bản gel, kết thúc quá trình điện di Sau đó bỏ bản gel khỏi bể điện di để thực hiện quá trình nhuộm với EtBr/Gel Red

● Đọc kết quả (bảng 3.6)

Bảng 3.6 Kết quả đọc điện di

Thang DNA (marker) Phân vạch phải rõ ràng và

sáng theo kích thước sử dụng Điện di kết quả tốt

ứngcó vấn đề, cần làm lại

3.4.4.2 Thực hiện phương pháp PCR xác định AHPND

Mầm bệnh AHPND được nhận biết bằng phương pháp PCR sử dụng cặp mồi AP3 của Sirikharin et al (2014) (bảng 3.7)

Bảng 3.7 Trình tự cặp mồi (AP3) dùng xác định AHPND

(bp)

Nguồn tài liệu

al., 2014

a Quy trình tách chiết DNA tôm để xác định mầm bệnh AHPND

Quy trình tách chiết DNA tôm để xác định mầm bệnh AHPND được tiến hành giống như quy trình tách chiết DNA để xác định mầm bệnh WSSV Chỉ khác cơ quan được thu mẫu để tách chiết DNA là gan tụy của tôm