khảo sát nguồn gen kháng bệnh đạo ôn trên một số giống lúa bằng chỉ thị phân tử

Cơ sở di truyền tính kháng đạo ôn trên lúa Đã có nhiều nghiên cứu về tính kháng, cơ chế kháng và di truyền tính kháng bệnh đạo ôn ở cây lúa đối với các chủng nấm gây bệnh.. Dựa vào sự ki

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

Người hướng dẫn khoa học: TS Phạm Thiên Thành

TS Nguyễn Văn Giang

NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2016

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Kết quả nghiên cứu trong luận văn là kết quả lao động của chính tác giả Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất cứ công trình nào khác

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày tháng năm 2016

Tác giả luận văn

Dương Thị Thưởng

Tôi xin được cám ơn chân thành các Anh, Chị trong bộ môn Công nghệ sinh học - Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới các Thầy, Cô trong Bộ môn Công nghệ Vi sinh – Khoa Công nghệ sinh học – Học viện Nông nghiệp Việt Nam những người đã trực tiếp giảng dạy, trang bị những kiến thức bổ ích trong suốt khoảng thời gian tôi học tập và nghiên cứu

Cuối cùng, với tất cả lòng kính trọng và biết ơn vô hạn, tôi xin gửi lời cảm ơn tới ông, bà, bố, mẹ, anh chị em và bạn bè, những người luôn bên cạnh động viên giúp đỡ tôi vượt qua những khó khăn trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Hà Nội, ngày tháng năm 2016

Tác giả luận văn

Dương Thị Thưởng

MỤC LỤC

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục chữ viết tắt v

Danh mục bảng vi

Danh mục hình vii

Trích yếu luận văn viii

Thesis abstract x

Phần 1 Mở đầu 1

1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1

1.2 Mục đích và yêu cầu 2

1.3 Ý nghĩa của đề tài 2

Phần 2 Tổng quan tài liệu 3

2.1 Cây lúa và bệnh đạo ôn trên lúa 3

2.1.1 Nguồn gốc và phân loại 3

2.1.2 Bệnh đạo ôn trên lúa 5

2.1.3 Cơ sở di truyền tính kháng đạo ôn trên lúa 9

2.2 Chỉ thị ADN sử dụng trong chọn tạo giống lúa kháng đạo ôn 11

2.2.1 Chỉ thị RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) và SCAR (Sequence Characterized Amplified Region) 11

2.2.2 Chỉ thị STS (Sequence Tagged Sites) 12

2.2.3 Chỉ thị SSR (Simple Sequence Repeates) 12

2.2.4 Chỉ thị SNP (Single Nucleotide Polymorphism) 13

2.2.5 Chỉ thị CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequences) 14

2.3 Các gen kháng đạo ôn và chỉ thị phân tử liên kết 14

2.4 Nghiên cứu lúa kháng đạo ôn trên thế giới 24

2.4.1 Đa dạng di truyền nguồn gen kháng bệnh đạo ôn 24

2.4.2 Sử dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống lúa kháng bệnh đạo ôn 25

2.4.3 Chọn giống lúa kháng bệnh đạo ôn bằng QTL 27

2.5 Nghiên cứu lúa kháng đạo ôn ở Việt Nam 27

2.5.1 Đa dạng di truyền quần thể nấm đạo ôn 28

2.5.2 Xác định gen kháng hiệu quả và quy tụ gen kháng vào các giống lúa 29

2.5.3 Nghiên cứu lai tạo trong chọn tạo giống lúa kháng bệnh đạo ôn 30

Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 32

3.1 Địa điểm nghiên cứu 32

3.2 Thời gian nghiên cứu 32

3.3 Đối tượng/vật liệu nghiên cứu 32

3.4 Nội dung nghiên cứu 35

3.5 Phương pháp nghiên cứu 35

Phần 4 Kết quả và thảo luận 41

4.1 Đánh giá đặc điểm nông sinh học 41

4.1.1 Thời gian sinh trưởng 41

4.1.2 Khả năng đẻ nhánh, chiều cao cây 44

4.1.3 Đặc điểm hình thái của các dòng/giống lúa thí nghiệm 46

4.1.4 Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất 49

4.2 Kết quả lây nhiễm nhân tạo 52

4.3 Kết quả khảo sát nguồn gen kháng bệnh đạo ôn của các dong/giống lúa nghiên cứu 53

4.4 So sánh kết quả PCR với kết quả lây nhiễm nhân tạo 56

Phần 5 Kết luận và đề nghị 61

5.1 Kết luận 61

5.2 Đề nghị 61

Tài liệu tham khảo 62

Phụ lục 71

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Phân loại chi Oryza 4

Bảng 2.2 Gen kháng bệnh đạo ôn 15

Bảng 2.3 Chỉ thị ADN liên kết với gen kháng đạo ôn 20

Bảng 3.1 Danh sách các dòng, giống lúa thí nghiệm 33

Bảng 3.2 Trình tự mồi liên kết gen kháng bệnh đạo ôn 35

Bảng 4.1 Thời gian sinh trưởng của các dòng/giống lúa nghiên cứu 42

Bảng 4.2 Khả năng đẻ nhánh, chiều cao cây các dòng/giống lúa thí nghiệm 44

Bảng 4.3 Một số đặc điểm hình thái của các dòng/giống lúa thí nghiệm 47

Bảng 4.4 Các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất 49

Bảng 4.5 So sánh kết quả xác định gen kháng bằng PCR và lây nhiễm nhân tạo 56

Bảng 4.6 Các giống lúa có triển vọng 60

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Đạo ôn gây hại trên lá, cổ lá, cỏ bông 6

Hình 2.2 Ruộng lúa bị bệnh đạo ôn hại nặng 6

Hình 2.3 Nấm sinh sản vô tính tạo cành bào tử 6

Hình 2.4 Bào tử nấm 6

Hình 2.5 Quá trình xâm nhiễm gây bệnh của bào tử nấm đạo ôn 7

Hình 4.2 Kết quả khảo sát chỉ thị RM527 liên kết gen kháng Piz5 trên 50 dòng/giống lúa nghiên cứu 53

Hình 4.3 Kết quả khảo sát chỉ thị RM7102 liên kết gen kháng Pita trên 50 dòng/giống lúa nghiên cứu 54

Hình 4.4 Kết quả khảo sát chỉ thị RM1233 liên kết gen kháng Pik-p trên 50 dòng/giống lúa nghiên cứu 55

Hình 4.5 Hình ảnh thể hiện tính kháng, nhiễm của một số giống lúa trong thí nghiệm 59

viii

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN

Tên tác giả: Dương Thị Thưởng

Tên Luận văn: “Khảo sát nguồn gen kháng bệnh đạo ôn trên một số giống lúa bằng chỉ thị phân tử”

Ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60.42.02.01

Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Lúa (Oryza sativa L.) là cây lương thực quan trọng trên thế giới, là nguồn cung cấp lương thực cho hơn 50% dân số thế giới Ở Việt Nam, lúa là cây trồng truyền thống gắn bó lâu đời với người nông dân Việt Nam, vừa cung cấp nguồn lương thực chính, vừa là nông sản xuất khẩu có kim ngạch lớn ở nước ta Tuy nhiên, bệnh đạo ôn đã gây tác hại nghiêm trọng ở một số nước như Nhật Bản, Ấn Độ, Philippin và Việt Nam Mỗi năm bệnh đạo ôn làm thế giới mất một lượng lúa đủ để nuôi sống hơn 60 triệu người Ở Việt Nam, bệnh đạo ôn xuất hiện ở cả ba miền Bắc, Trung và Nam Năm 1992, trong tổng số 5 triệu ha diện tích trồng lúa có tới 600.000 ha nhiễm bệnh đạo ôn, 1/4 trong số diện tích này đã bị nhiễm bệnh trầm trọng Năng suất lúa trên diện tích bị nhiễm đã giảm từ 15-30% Trong chiến lược phòng chống bệnh đạo ôn, việc tìm ra các gen kháng nhằm tạo ra các giống lúa kháng bệnh đạo ôn vẫn được coi là biện pháp hiệu quả và bền vững Tuy nhiên chủng nấm đạo ôn rất đa dạng tại các vùng sinh thái khác nhau và dễ phát sinh chủng mới, trong khi đó, mỗi gen kháng chỉ có khả năng chống được một số chủng nhất định Bởi vậy, luôn phải nỗ lực tìm ra gen kháng mới hoặc gen kháng trên nguồn vật liệu mới để chống lại các chủng mới phát sinh

Mục đích nghiên cứu

Dùng chỉ thị phân tử liên kết gen kháng đạo ôn để khảo sát sự có mặt của gen kháng ở một số giống lúa vật liệu

Phương pháp nghiên cứu

Trong nghiên cứu này, thí nghiệm 1 được bố trí theo phương pháp quan sát vườn dòng không nhắc lại của IRRI, diện tích ô 5m2 Đánh giá các chỉ tiêu nông sinh học Thí nghiệm 2: Đánh giá khả năng kháng nhiễm của các mẫu dòng/giống với nguồn nấm đạo

ôn Thí nghiệm 3: tiến hành lấy mẫu, tách chiết ADN, chạy PCR với ba cặp mồi: RM527, RM1233, RM7102 và điện di trên gel polyacrylamide để kiểm tra sự có mặt của gen kháng trong các mẫu giống

Kết quả chính và kết luận

Kết quả đánh giá đặc điểm nông sinh học cho thấy: các mẫu giống có đặc điểm nông sinh học rất đa dạng, một số mẫu giống có kiểu hình đẹp, năng suất khá, chất lượng cao có thể sử dụng để làm vật liệu trong chọn tạo giống lúa chất lượng

Trong 50 mẫu giống lúa lây nhiễm nhân tạo đạo ôn có 26 mẫu giống thể hiện tính kháng tốt, 20 mẫu giống nhiễm nhẹ, 4 mẫu giống nhiễm nặng

Kết quả kiểm tra gen kháng nhận thấy có 12 mẫu giống mang 2 gen kháng, 31 giống mang 1 gen kháng, 7 giống không có gen kháng nào

Trong 13 mẫu giống có chứa 2 gen kháng có 5 mẫu giống thể hiện tính kháng mạnh với chủng vi khuẩn nấm đạo ôn, 6 mẫu giống thể hiện tính kháng vừa (nhiễm nhẹ), 2 mẫu giống nhiễm nặng

Trong những mẫu giống thể hiện tính kháng tốt có những giống chứa 2 gen kháng,

có giống chứa 1 gen kháng hoặc không có gen kháng nào Như vậy, có thể những giống

đó chứa gen kháng nào khác, cần xác định thêm những gen kháng khác để có kết luận chính xác hơn về tính kháng

Trong 13 mẫu giống có chứa 2 gen kháng có 11 mẫu giống thể hiện tính kháng mạnh hoặc kháng vừa với chủng vi khuẩn nấm đạo ôn sử dụng lây nhiễm nhân tạo Đây

là nguồn vật liệu tốt trong chọn tạo lúa kháng đạo ôn

x

THESIS ABSTRACT

Master candidate: Duong Thi Thuong

Thesis title: "Using molecular marker to screen blast resistance gene in rice germplasm" Major: Biotechnology Code: 60.42.02.01

Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA)

Rice (Oryza sativa L.) is an important food crop in the world It is also a source of food for more than 50% of the world population In Vietnam, the rice crop is a long tradition of sticking with the farmers Not only has it provided the main source of food for Vietnamese, but it also can be exported with a large turnover for the country However, blast disease threats rice production It caused serious damage in some countries such as Japan, India, Philippines and Vietnam Each year the yield loss by blast in the world counted enough to feed more than 60 million people In Vietnam, the blast occurred in the whole country In 1992, we planted a total of 5 million hectares of rice In which, 600,000 hectares had been infected by blast disease and 1/4 of this area was severely infected Rice yield in the infected area has decreased by 15-30% One of strategies to prevent effects of rice blast is finding resistance genes to create new rice varieties This is still considered to be effective method and sustainable However, rice blast fungus strains varied in different ecological zones and easy to generate new strains Moreover, a resistance gene has effective with only certain strain Therefore, breeders struggle to find new resistance genes or resistance genes from the new resources to combat new arising strains

Main findings and conclusions

The results of assessment of agricultural characteristics showed that their characteristics are very diverse Some of them have good plant type, quite productive and high quality These can be used as material for breeding high quality rice

In fifty varieties were inoculated with blast, twenty six varieties shown high resistance, twenty varieties shown medium resistance and four varieties were susceptible The results of screening marker shown that there are twelve varieties bringing two resistance genes, thirty one varieties carrying one resistance gene and seven varieties do not have the resistance gene

In thirteen varieties carrying two resistance genes, five varieties shown high resistance with rice blast fungus strains, six varieties have medium resistance and two varieties is infection

The rice varieties gave highly resistance In which, some varieties possess two resistance genes, some varieties carry a single resistance gene and some do not have any

of checked genes Thus, it is possible that these varieties may contain another resistant gene It is necessary to identify other resistance genes in order to have more accurate conclusions for these varieties

In thirteen varieties carrying two resistance genes, eleven varieties showed high or medium resistance to rice blast fungus strain using in inoculation This is a good resource for breeding rice blast resistance variety

1

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Lúa (Oryza sativa L.) là cây lương thực quan trọng trên thế giới, được trồng phổ biến ở 112 nước trên thế giới Lúa là nguồn cung cấp lương thực cho hơn 50% dân số thế giới và là lương thực chính cho phần lớn các quốc gia ở Châu Á, một số nước ở Châu Phi và Mỹ Latinh (Chang, 2000) Ở Việt Nam, lúa là cây trồng truyền thống gắn bó lâu đời với người nông dân Việt Nam, vừa cung cấp nguồn lương thực chính, vừa là nông sản xuất khẩu có kim ngạch lớn ở nước ta (Trần Văn Đạt, 2008) Năng suất và sản lượng lúa của nước ta không ngừng tăng lên, năm 1990 năng suất lúa của nước ta đạt 31,8 tạ/ha; năm 2000: 42,4 tạ/ha; năm 2010: 53 tạ/ha, năm 2014: 57,6 tạ/ha Sản lượng lúa năm 1990 là 19,2 triệu tấn; năm 2000: 32,5 triệu tấn; năm 2010: 39,9 triệu tấn và năm 2014: 44,9 triệu tấn (Bui Ba Bong, 2010; Tổng cục Thống kê)

Tuy nhiên nhiều bệnh hại thường xuyên xuất hiện, gây tổn thất lớn về sản lượng lúa như: bệnh đạo ôn (do nấm Pyricularia oryzae), bạc lá (do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv Oryzae), khô vằn (do nấm Zhizoctonia sonani) Trong

đó bệnh đạo ôn do nấm Pyricularia oryzae gây ra làm thiệt hại lớn về sản lượng lúa gạo toàn cầu và là bệnh có ý nghĩa quan trọng nhất đối với nghề trồng lúa trên toàn thế giới Hiện nay, bệnh đạo ôn đã gây tác hại nghiêm trọng ở một số nước như Nhật Bản, Ấn Độ, Philippines và Việt Nam (Valent and Chumley, 1991; Gheysen, 2004) Mỗi năm bệnh đạo ôn làm thế giới mất một lượng lúa đủ

để nuôi sống hơn 60 triệu người (Roxanne Khamsi, 2005) Ở Việt Nam, bệnh đạo

ôn xuất hiện ở cả ba miền Bắc, Trung và Nam Tuy nhiên mức độ bệnh xảy ra ở miền Bắc và miền Trung thường trầm trọng Dịch bệnh xảy ra có thể gây thiệt hại cho lúa vào khoảng 10-25% Năm 1992, trong tổng số 5 triệu ha diện tích trồng lúa có tới 600.000 ha nhiễm bệnh đạo ôn, 1/4 trong số diện tích này đã bị nhiễm bệnh trầm trọng Năng suất lúa trên diện tích bị nhiễm đã giảm từ 15-30%

Trong chiến lược phòng chống bệnh đạo ôn, việc tìm ra các gen kháng nhằm tạo ra các giống lúa kháng bệnh đạo ôn vẫn được coi là biện pháp hiệu quả

và bền vững Khoảng hơn 100 Pi loci và 350 QTL liên quan đến tính kháng bệnh đạo ôn ở cây lúa đã được phát hiện (Tanweer et al., 2015), tạo cơ sở cho việc chọn tạo giống mang gen kháng bệnh Tuy nhiên chủng nấm đạo ôn rất đa dạng

tại các vùng sinh thái khác nhau và dễ phát sinh chủng mới, trong khi đó, mỗi gen kháng chỉ có khả năng chống được một số chủng nhất định Bởi vậy, các nhà khoa học luôn phải nỗ lực tìm ra gen kháng mới hoặc gen kháng trên nguồn vật liệu mới để chống lại các chủng mới phát sinh

Xuất phát từ những vấn đề thực tiễn nêu trên, chúng tôi tiến hành thực hiện

đề tài: “Khảo sát nguồn gen kháng bệnh đạo ôn trên một số giống lúa bằng chỉ thị phân tử”

 Kết hợp chỉ thị phân tử trong đánh giá khả năng kháng bệnh đạo ôn ở lúa giúp xác định chính xác hơn nguồn vật liệu khởi đầu trong chọn tạo lúa chất lượng, năng suất cao có khả năng kháng đạo ôn

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn

 Kết quả của đề tài đã góp phần bổ sung nguồn vật liệu khởi đầu là các dòng/giống lúa có khả năng kháng đạo ôn, năng suất khá, chất lượng gạo tốt sử dụng để lai cải tạo các giống lúa thuần đang trồng phổ biến ở Đồng bằng sông Hồng, nhằm mục đích cải tạo chất lượng lúa gạo ở khu vực miền Bắc

 Việc sử dụng chọn giống bằng chỉ thị phân tử (MAS) giúp tiết kiệm thời gian, giảm chi phí chọn giống và đáng tin cậy hơn do không bị ảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường

3

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 CÂY LÚA VÀ BỆNH ĐẠO ÔN TRÊN LÚA

2.1.1 Nguồn gốc và phân loại

Cây lúa trồng thuộc họ Poaceae, trước đây gọi là họ Hoà thảo (Gramineae),

họ phụ Pryzoideae, tộc Oryzae, chi Oryza, loài Oryza sativa và Oryza glaberrima Loài Oryza sativa là lúa trồng ở Châu Á và Oryza glaberrima là lúa trồng ở Châu Phi Năm 1753, Lineaeus là người đầu tiên đã mô tả và xếp loài lúa sativa thuộc chi Oryza Dựa vào mày hạt và dạng hạt tác giả đã phân chi Oryza thành bốn nhóm là sativa, granulata, coarctala, rhynchoryza và chi Oryza gồm tất cả 19 loài (Trần Văn Đạt, 2005)

Morinaga là người đầu tiên đã sử dụng kỹ thuật phân tích genome để định danh các loài lúa dại Công trình nghiên cứu dựa trên cơ sở khoa học này đã giúp phân tích các loài lúa được chính xác hơn (Trần Văn Đạt, 2005)

Hội nghị di truyền lúa Quốc tế tổ chức họp tại Viện nghiên cứu lúa Quốc tế, Philippines năm 1967 đã khẳng định chi Oryza có 22 loài trong đó có 20 loài lúa dại và hai loài lúa trồng (Chang and Vaughan, 1991)

Sau này, Vaughan phát hiện thêm một loài lúa dại mới ở Papua New Ginea

là loài Oryza rhizomatis, đưa số loài của chi Oryza lên 23 loài và chia thành bốn nhóm genome Danh sách các loài, số lượng nhiễm sắc thể, bộ gen của từng loài được ghi ở Bảng 2.1 (Vaughan, 1994)

Ngày nay, các nhà phân loại học đều nhất trí là chi Oryza có 23 loài, trong

đó 21 loài hoang dại và hai loài lúa trồng là Oryza sativa và Oryza glaberrima thuộc loại nhị bội 2n = 24 có bộ gen AA Loài Oryza glaberrima phân bố chủ yếu

ở Tây và Trung Phi còn loài Oryza sativa được gieo trồng khắp thế giới và được chia thành hai loài phụ là Indica và Japonica Trong quá trình tiến hoá của cây lúa, ngoài hai loài phụ Indica và Japonica còn có nhiều loại hình trung gian như Javanica v.v (Nguyễn Văn Hoan, 2006; Trần Văn Minh, 2004)

Tác giả Tang et al (2004) so sánh bộ gen lục lạp của giống lúa 93 - 11 (đại diện loài phụ Indica) và giống lúa Peiai'64S (giống lúa lai thuộc loài phụ Indica, nhưng nguồn gốc mẹ thuộc loài phụ Japonica) cho thấy sự phân chia bộ gen lục lạp của hai loài phụ Indica và Japonica xảy ra cách đây khoảng 86.000 - 200.000 năm trước

Bảng 2.1 Phân loại chi Oryza

sắc thể Bộ gen

I Nhóm O sativa

III Nhóm O ridleyi

IV Nhóm O meyeriana

21 O meyeriana (Zoll et Mor ex

Nguồn: Vaughan (1994)

5

Tác giả Vitte et al (2004) cũng cho rằng hai loài phụ Indica và Japonica được phân hoá độc lập với nhau, cách đây khoảng 200.000 năm Trong khi đó, tác giả Jianxin phân tích ADN nhân tế bào và cho rằng lúa Indica và Japonica được tách ra từ một tổ tiên chung, cách đây khoảng 440.000 năm (Jianxin and Bennetzen, 2004)

Jason et al (2006) nghiên cứu biến đổi trình tự ADN của ba vùng gen bằng phương pháp địa lý - thực vật để khảo sát quá trình thuần hoá lúa trồng Kết quả cho thấy, cây lúa trồng đã được thuần hóa ít nhất là hai lần từ các quần thể khác nhau của loài Oryza rufipogon và sản phẩm của hai lần biến đổi này đã tạo ra hai loài phụ là Indica và Japonica

Tác giả Zhu et al (2007) trên cơ sở giải mã trình tự ADN của 10 gen ở nhân

tế bào của lúa cho rằng, quá trình thuần hoá liên quan chặt chẽ với quá trình giảm

đa dạng di truyền của các giống lúa dại Đa dạng di truyền của lúa Japonica thấp hơn 2 lần so với đa dạng di truyền của lúa Indica

2.1.2 Bệnh đạo ôn trên lúa

Nấm gây bệnh đạo ôn trên cây lúa ở giai đoạn vô tính được đặt tên là P oryzae (syn Pyricularia oryzae), ở giai đoạn hữu tính được đặt tên là Magnaporthe grisea và gần đây dựa vào các nghiên cứu phân tử, được đặt tên là

M oryzae (Hà Viết Cường, 2008) Ở luận văn này, chúng tôi sử dụng tên gọi Pyricularia oryzae

Bệnh đạo ôn do nấm Pyricularia oryzae gây ra, là một trong những bệnh gây hại quan trọng nhất trên cây lúa Bệnh đạo ôn được phát hiện tại Italia năm

1560, sau đó là ở Trung Quốc năm 1637, Nhật Bản năm 1760, Mỹ năm 1906 và

Ấn Độ năm 1913, … Ở nước ta, Vincens (người Pháp) đã phát hiện nguồn bệnh ở Nam Bộ vào năm 1921 Năm 1951, Roger (người Pháp) cũng đã xác định sự xuất hiện và gây hại của bệnh ở vùng Bắc Bộ (Vũ Triệu Mân và cs., 2007) Bệnh đạo

ôn đã được tìm thấy ở ít nhất 85 quốc gia và chưa có nơi nào báo cáo là tiêu diệt được hoàn toàn mầm bệnh Thiệt hại về năng suất do bệnh đạo ôn gây ra có thể lên tới 75% hoặc cao hơn nữa nếu gặp điều kiện thuận lợi cho bệnh phát triển

Triệu chứng:

Nấm có thể xâm nhiễm gây bệnh ở tất cả các bộ phận trên mặt đất gồm: lá, đốt thân, cổ lá, cổ bông, cổ gié Các nghiên cứu gần đây cho thấy mức độ mẫn cảm của lá tỷ lệ thuận với mức độ mẫn cảm trên cổ bông (Hà Viết Cường, 2008)

Tính mẫn cảm của cây đối với nấm phụ thuộc nhiều vào yếu tố môi trường cũng như các yếu tố liên quan đến phát triển của cây Tính mẫn cảm thường giảm theo tuổi cây và tuổi lá; tính mẫn cảm tăng mạnh khi bón thừa đạm Trái lại bón Si làm giảm tính mẫn cảm Ngoài ra, đặc điểm vết bệnh thay đổi đáng kể theo mức

Hình 2.3 Nấm sinh sản vô tính

tạo cành bào tử

Hình 2.4 Bào tử nấm

Xâm nhiễm gây bệnh:

Nấm đạo ôn là nấm bán sinh dưỡng (hemibiotroph) với pha sinh dưỡng biotroph ở giai đoạn sớm của quá trình xâm nhiễm

7

Hình 2.5 Quá trình xâm nhiễm gây bệnh của bào tử nấm đạo ôn

Giai đoạn sớm của quá trình xâm nhiễm bao gồm pha tiền xâm nhập (prepenneration): bào tử nấm tiếp xúc trên bề mặt lá, đỉnh bào tử nứt vỡ và tiết ra một giọt chất nhầy gắn kết chặt bảo tử và bề mặt lá Lớp chất nhày này chứa các hợp chất cacbohydrat và glycoprotein (Hà Viết Cường, 2008)

Tiếp theo bào tử nấm nảy mầm tạo ống mầm, hình thành một tế bào ở đỉnh ống mầm và phát triển thành vòi áp (appressorium) Vòi áp của nấm là một cấu trúc dạng vòm, có vách dày, màu đậm do bị melanin hóa Sự melanin hóa làm vách vòi áp trở nên chắc chắn hơn Bên trong vòi áp, nấm tích lũy nhiều glycerol

và do vậy áp lực trương của vòi áp nấm đạo ôn rất lớn, có thể tới 80 at (Hà Viết Cường, 2008)

Tiếp theo quá trình tiền xâm nhập là xâm nhập của bào tử: Từ vòi áp sẽ hình thành một sợi nấm nhỏ gọi là đế xâm nhập (infection peg) để xâm nhập trực tiếp qua tầng cutin và vào bên trong tế bào biểu bì Bên trong tế bào biểu bì, đỉnh

đế xâm nhập sẽ phình to tạo thành vòi hút Nấm sẽ tiết các enzyme và các effector qua màng vòi hút vào tế bào ký chủ để hấp thu dinh dưỡng, dần dần vách

tế bào ký chủ sụp đổ và nấm tiếp tục phát triển sang tế bào bên cạnh (Hà Viết Cường, 2008)

Bệnh đạo ôn là một trong số các loại bệnh phổ biến và nguy hại nhất đối với lúa, có hơn 85 quốc gia trồng lúa trên thế giới phát hiện dịch bệnh Bệnh có khả năng thích nghi cao với các điều kiện của môi trường, nơi có khí hậu ôn hòa,

độ ẩm cao, hay ở những vùng đất thấp và những vùng núi cao nhiệt đới Bệnh có

thể làm cho cây lúa cháy rụi hoàn toàn nếu bị nhiễm bệnh sớm ở giai đoạn mạ Nếu nhiễm muộn ở giai đoạn trổ, bệnh làm thối đốt thân, thối cổ gié làm cây đổ gãy, hạt lép hay làm giảm trọng lượng hạt Theo báo cáo, năng suất lúa bị giảm

do đạo ôn gây ra có thể lên tới 80% ở vùng dịch (Awoderu and Esuruoso, 1974)

và ước tính, cứ 10% gié bị nhiễm bệnh thì năng suất thất thu 6% và tỷ lệ hạt kém phẩm chất (gạo xay ra thường bị nát, tỷ lệ tấm cao, không đủ tiêu chuẩn xuất khẩu) tăng 5% (Phạm Văn Kim, 2002) Với những tác hại gây ra, bệnh đạo ôn là một trong những bệnh có sức tàn phá mạnh nhất trong các bệnh hại lúa, nó đe dọa nghiêm trọng tới nguồn an ninh lương thực của thế giới (hàng năm mất khoảng 157 triệu tấn) Ở Việt Nam, bệnh được phát hiện ở vùng Nam Bộ rất sớm, từ thời Pháp thuộc năm 1921 do Vincens (người Pháp) Hiện nay, bệnh đạo

ôn đã gây tác hại nghiêm trọng ở một số nước như Nhật Bản, Ấn Độ, Philippin

và Việt Nam (Gheysen, 2004)

Theo thống kê của Cục Bảo vệ thực vật, vụ đông Xuân 2003 - 2004 tổng diện tích lúa bị nhiễm đạo ôn ở miền Bắc là 202.998 ha, trong đó diện tích bị nhiễm đạo ôn lá là 178.147 ha (diện tích bị nặng là 4.348 ha), diện tích bị nhiễm đạo ôn cổ bông là 24.752 ha Hầu hết các giống phổ biến trong sản xuất đều bị nhiễm đạo ôn với mức độ khác nhau: Khang dân 18, Q5, Bắc thơm, VN10, DT10, DT11 v.v Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) là vùng trồng lúa lớn nhất Việt Nam, khi bị nhiễm bệnh đạo ôn thiệt hại cho năng suất lúa ước tính giảm tới 20% Một vài năm trở lại đây, trước những biến đổi bất lợi của điều kiện ngoại cảnh bệnh đạo ôn có nguy cơ bùng phát triên diện rộng và có thể phát triển thành dịch nếu không được phát hiện kịp thời, hầu hết các giống chất lượng đang trồng phổ biến (OM149, OMCS2000) đều bị nhiễm đạo ôn với các mức độ khác nhau Trong vụ đông Xuân 2005 - 2006 bệnh gây thiệt hại lớn ở hầu hết các địa phương (An Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ) trên giống lúa OM1490, thiệt hại cho năng suất ước tính giảm từ 20 - 80% Để phòng trừ bệnh đạo ôn, nông dân thường sử dụng thuốc hóa học như một phương thức hữu hiệu, ở một số nơi khác nông dân thường tiến hành phun nhiều lần và trộn nhiều loại thuốc với nhau, điều này đã gây ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức khỏe của chính người nông dân đồng thời môi trường xung quanh cũng bị ảnh hưởng

Đến nay, bộ gen của nấm đạo ôn đã được giải trình tự đầy đủ do nhóm nghiên cứu của Ralph (Đại học Bắc Carolina, Mỹ) tiến hành Kết quả giải trình tự gen đã xác định Pyricularia oryzae có hơn 11000 gen và tiết ra gần 800 protein để

9

xâm nhập và lây nhiễm sang lúa Những thụ thể này nằm trên bào tử của nấm (bào

tử được phát tán nhờ gió) Theo nhóm nghiên cứu, nhận dạng các thụ thể này là một bước tiến lớn trong quá trình chống bệnh đạo ôn (Ralph et al., 2005)

Những nghiên cứu miễn dịch học đã chỉ ra rằng lúa có hai hệ thống miễn dịch bẩm sinh, có thể bảo vệ chúng trước sự tấn công của nhiều nguồn bệnh khác nhau Các receptor trên màng phát hiện ra tính chất không chuyên biệt của chủng gây bệnh được gọi là PAMPs (pathogen associated molecular pattern) Hệ thống miễn dịch đầu tiên được kích hoạt là PTI (PAMP - triggered immunity) Trong phản ứng này nguồn bệnh có nhiều phân tử “effector” nhằm tránh né hệ thống miễn dịch PTI Nếu một nguồn bệnh tránh né được hệ thống bảo vệ thứ nhất, nó phải vượt qua hệ thống bảo vệ thứ hai để gây bệnh cho lúa Hệ thống tự bảo vệ thứ hai được gọi là ETI (effector triggered immunity: miễn dịch nhờ kích hoạt effector) ETI bị kích hoạt bởi các protein của gen kháng bệnh (R) Chúng hoạt động như những receptor trong tế bào, ghi nhận trực tiếp hoặc gián tiếp các effector của nguồn bệnh Người ta gọi các effector của nguồn bệnh là protein không chứa độc tính (Avr proteins), mã hoá cho các protein này là các gen Avr tương ứng (gen không độc) (Chisholm et al., 2006)

Khả năng kháng bệnh đạo ôn của lúa do các gen kháng chịu trách nhiệm và được đặt tên theo tên nấm Pyricularia (Pi) Hiện nay, các nhà khoa học trên thế giới đã xác định được 96 gen kháng đạo ôn chính Ngoài ra, việc giải mã xong trình tự gen cây lúa năm 2002 đã mở ra nhiều triển vọng cho việc ứng dụng công nghệ sinh học trong chọn tạo các giống lúa kháng bệnh đạo ôn (Yu et al., 2002) 2.1.3 Cơ sở di truyền tính kháng đạo ôn trên lúa

Đã có nhiều nghiên cứu về tính kháng, cơ chế kháng và di truyền tính kháng bệnh đạo ôn ở cây lúa đối với các chủng nấm gây bệnh

Năm 2000, Tsunematsu et al đã giới thiệu bộ giống đơn gen trên nền di truyền của giống LTH, bộ này gồm 31 dòng mang 24 gen kháng bệnh đạo ôn khác nhau Hai vấn đề quan trọng là sự đa dạng của quần thể nòi sinh lý bệnh trong từng vùng và đơn gen nào còn hiệu lực trong quá trình đồng tiến hóa (co-evolution) của sự tương tác Như vậy, nghiên cứu chọn tạo các giống lúa kháng bệnh đạo ôn, đặc biệt là các giống lúa kháng bền vững luôn được xem như là biện pháp hữu hiệu, ít tốn kém và ít ảnh hưởng đến môi trường trước nguy cơ dịch bệnh luôn có khả năng bùng phát, các nòi nấm bệnh mới luôn có khả năng hình thành Trên thực tế, có rất nhiều cách gọi tên cho tính kháng bệnh, nhưng

xét về bản chất nhiều cách gọi khác nhau là một Dựa vào sự kiểm soát của gen kháng đạo ôn đối với cây chủ, người ta chia tính kháng bệnh đạo ôn ở lúa thành

ba kiểu chính: kháng định lượng, hay kháng ngang đối với rất nhiều nòi nhưng kháng không cao; kháng định tính, hay kháng dọc đối với một hoặc hai nòi và kháng rất cao; kháng bền vững (durable resistance), không có qui định về bao nhiêu gen điều khiển nhưng kháng trong thời gian rất dài, giống kháng được trồng trên diện rộng (Johnson, 1983)

Tính kháng đa gen hay kháng ngang cũng được gọi là kháng bền vững, hay kháng định lượng Tính kháng bền vững là do sự kết hợp của nhiều gen kháng tạo nên, còn được gọi là đặc tính kháng đa gen (Bonman and Mackill, 1988; Johnson and Bonman, 1991) Đặc tính kháng đa gen được thể hiện rất rõ ở giống lúa có tính kháng bền Moroberekan, giống này có hơn 10 gen kháng chính và nhiều gen kháng phụ khác Đặc tính kháng đa gen cũng được tìm thấy ở một số giống lúa như: OS6, Lac23, BL123, Tẻ Tép, IR24

Gen kháng đạo ôn ở lúa chia thành: gen kháng chính và gen kháng phụ Gen kháng chính biểu hiện thông qua hiệu quả chất lượng, di truyền đơn giản và chuyên tính về nòi Gen kháng phụ là những gen mà hoạt động của chúng mang tính hỗ trợ đóng góp vào khả năng kháng của cây chủ, nhờ những gen này mà phạm vi phát triển của bệnh được giới hạn Những gen kháng phụ ngày càng được quan tâm hơn khi những cá thể mang gen kháng chính có sự biểu hiện kém bền về tính kháng Những gen kháng phụ được quan tâm gồm các gen kháng theo locus kiểm soát tính trạng số lượng QTLs của bệnh đạo ôn

Tính kháng bệnh đạo ôn ở cây lúa được quy định bởi hệ thống các gen có trong cây lúa Hiện nay, các nhà khoa học đã phát hiện được khoảng 96 gen kháng đạo ôn, trong đó đa số đều là gen trội, chỉ một số ít là gen lặn (pi-21, pi55) (Jeung et al., 2007) Hiện nay có 7 gen đã được tách dòng: Pi-b, Pi-ta, Pi9, Pi36, Pi2, Pid2, Piz-t (Liu et al., 2005) Một số gen kháng được xác định thuộc một locus hoặc liên kết rất chặt với nhau Ví dụ locus Pi-k của NST số 11 có 5 gene kháng (Pik-s, Pik-p, Pik-m, Pik-h, Pik-g), Pi31(t) ở NST 12 liên kết với gen Pi-6(t), Pi-157 và Pi-ta (Mackill and Bonman, 1992; McCouch and Doege, 1995; Naqvi and Chattoo, 1996)

Hiện có khoảng 40 gen kháng chủ đối với nấm P.oryzae đã được xác đinh trên lúa với khoảng gần 10 gen đã được chọn Trong số các gen này, Pi-ta là gen kháng được nghiên cứu nhiều nhất Pi-ta là gen nằm ở vùng trung tâm của nhiễm

Tính kháng của gen Pi-ta được hình thành khi nó tương tác hiệu quả với gen AVR-Pita của P.oryzae, gen AVR-Pita nằm trên NST số 3, mã hóa cho metalloprotease, mang tín hiệu kích thích bài tiết, có đầu tận cùng N và các chuỗi pro-protein Khi nấm P.oryzae ký sinh trên cây ký chủ thì protein AVR-Pita sẽ đi vào trong tế bào sau đó cắt bỏ 47 aa ở đầu N thành AVR-Pita176 LRD của protein Pi-ta liên kết đặc hiệu với AVR-Pita176, từ đó kích hoạt tính kháng của cây

2.2 CHỈ THỊ ADN SỬ DỤNG TRONG CHỌN TẠO GIỐNG LÚA KHÁNG ĐẠO ÔN

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) được Kary Mullis phát minh ra vào năm 1985 Bản chất của kỹ thuật PCR là sự tổng hợp nhân tạo ADN, tạo ra

số lượng lớn các đoạn ADN mới, với sự tham gia của các thành phần chính gồm: ADN khuôn, dNTP, mồi (chỉ thị), enzyme polymerase tổng hợp ADN (Taq), MgCl2 và đệm PCR Kỹ thuật PCR hiện đã được hoàn thiện tới mức tự động hóa trên cơ sở tìm ra enzyme tổng hợp ADN có khả năng chịu nhiệt cao từ vi khuẩn Thermus aquaticus và việc chế tạo thành công máy chu kỳ nhiệt

2.2.1 Chỉ thị RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) và SCAR (Sequence Characterized Amplified Region)

RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) nghĩa là đa hình các đoạn ADN được nhân bản ngẫu nhiên RAPD là một kỹ thuật được xây dựng dựa trên

kỹ thuật PCR, với những mồi được thiết kế ngẫu nhiên có chiều dài khoảng 10 nucleotide (Williams et al., 1990) Khi phản ứng diễn ra, các mỗi RAPD gắn ngẫu nhiên vào khuôn ADN ở bất kỳ vị trí nào mà có trình tự bổ sung với nó Phản ứng sau đó xảy ra với sự tham gia của enzyme Taq, dNTP và các thành phần khác

RAPD là một kỹ thuật được sử dụng rộng rãi để xác định các chỉ thị liên kết với gen kháng đạo ôn Naweed et al (1995) sử dụng kỹ thuật RAPD với 468 mồi ngẫu nhiên đã xác định được 2 chỉ thị liên kết với gen Pi-10t ở giống lúa Tongil

Sandhu et al (2003) đã sử dụng 7 mồi RAPD để phân tích đa hình giữa các dòng kháng và dòng nhiễm đạo ôn của 3 giống lúa trồng ở Braxin Kết quả

đã chỉ ra sự khác biệt rõ ràng giữa các dòng kháng và dòng nhiễm, 9 băng ADN khuếch đại bởi 7 mồi đã được xác định như các chỉ thị trội cho chọn các dòng lúa kháng đạo ôn

Do chỉ thị RAPD có hạn chế là độ nhạy bị phụ thuộc vào điều kiện của phản ứng, đôi khi kết quả không lặp lại được, nên người ta đã khắc phục bằng cách nhân dòng những băng RAPD đặc hiệu, xác định trình tự của chúng rồi thiết

kế những đoạn mồi dài khoảng 20bp từ cả hai đầu và gọi là chỉ thị SCAR (Sequence - Characterized Amplified Region) Các chỉ thị SCAR ưu điểm hơn các chỉ thị RAPD bởi chúng ít ảnh hưởng bởi các điều kiện phản ứng, mức độ lặp lại cao, tiến hành nhanh và cho các sản phẩm đặc hiệu Tác giả Sobir et al (2005) đã sử dụng 2 chỉ thị SCAR để xác định sự có mặt của 2 gen kháng Pi-b và Pi-ta trên 28 kiểu gen ở lúa (gồm 22 dạng trồng trọt và 6 dạng hoang dại) kết quả phân tích chỉ ra, 15 kiểu mang cả 2 gen trong đó có Oryza rufipogon, 6 kiểu mang gen Pi-b trong đó có Oryza glumaepatula, Oryza officialis, Oryza latifolia

và Oryza malapuzhaensis

2.2.2 Chỉ thị STS (Sequence Tagged Sites)

Loại chỉ thị này được đưa ra nhờ việc xác định trình tự 2 đầu mỗi đoạn của mẫu dò dùng trong RFLP phát hiện được đa hình liên kết gen, chọn một đoạn đặc hiệu để thiết kế mồi dùng cho phản ứng PCR Đây là loại chỉ thị đồng trội có thể phân biệt được gen ở trạng thái đồng hợp tự và dị hợp tử Trình tự mồi STS phát hiện sự biến đổi ở mức allen của gen trong phân tử ADN Nhược điểm chỉ thị STS là đòi hỏi phải biết trước được một vài trình tự ADN của gen Ở lúa, sử dụng các chỉ thị STS trong tìm kiếm các gen kiểm soát hoặc liên quan đến tính kháng đạo ôn được tiến hành một cách dễ dàng Qua phân tích di truyền trên quần thể con lai F3 của cặp lai C101LAC (giống cho gene kháng Pi-1) và CO39 (giống dễ mắc bệnh đạo ôn) bằng kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), tác giả Wu et al (2004) đã thiết kế được một cặp mồi STS cho chọn lọc các dòng lúa mang gene kháng Pi-1 Tác giả Masahiro et al (2008) cũng đã phát triển được một chỉ thị STS sử dụng cho chọn các dòng lúa mang gen kháng Pi-b trong 7 giống lúa nội địa của Hàn Quốc

2.2.3 Chỉ thị SSR (Simple Sequence Repeates)

SSR là chỉ thị nghiên cứu đa hình những đoạn ADN lặp lại đơn giản, đơn vị

lặp từ 1 – 6 nucleotide Bản chất đa hình của SSR được sinh ra do sự nhân bội từ ADN tổng số của hệ gen nhờ sử dụng 2 đoạn mồi chặn biên 2 đầu với trình tự của vùng lặp lại Giá trị của SSR là ở chỗ nó sinh ra đa hình từ rất nhiều vùng tương ứng, bao phủ rộng khắp hệ gen và phân biệt được trạng thái alen khác nhau của gen (chỉ thị đồng trội), có thể phân biệt được đồng hợp tử và dị hợp tử, dễ dàng phát hiện bằng PCR Đối với các nghiên cứu về bệnh lúa, SSR là một trong những kỹ thuật di truyền được xem là rất thích hợp trong lập bản đồ liên kết di truyền, phân tích đa dạng và trong các chương trình chọn giống kháng đạo ôn Tác giả Fjellstrom et al (2004) đã phân tích trình tự genome gần locus Pi-z của dạng lúa Nipponbare, đã phát hiện một lượng lớn các đoạn SSR có thể sử dụng làm chỉ thị Trong đó ba chỉ thị SSR gồm: AP5659-1, AP5659-3 và AP5659-5 liên kết rất chặt với locus Pi-z đã được phát triển để chọn giống lúa mang gene kháng Pi-z

2.2.4 Chỉ thị SNP (Single Nucleotide Polymorphism)

Những thay đổi một nucleotide trong trình tự genome của các cá thể trong quần thể được gọi là đa hình nucleotide đơn (SNP) Ở thực vật, SNP đang được thay thế cho SSR như chỉ thị cho các ứng dụng trong di truyền và chọn giống SNP có số lượng lớn, ổn định, hiệu quả, cho phép tự động hóa và ngày càng kinh

tế hơn (Duran et al., 2009; Edwards and Batley, 2010) Hơn nữa, SNP xảy ra cả ở các vùng mã và không mã của DNA nhân và lục lạp Nguồn SNP hiện đang được phát triển và thông tin rộng rãi cho nhiều ứng dụng ở lúa Các nguồn này bao gồm cơ sở dữ liệu SNP, phương tiện để xác định các SNP mang nhiều thông tin cho các mục đích ứng dụng và bộ SNP cho đánh giá được thiết kế theo đặt hàng phục vụ mục đích chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử

Có rất nhiều phương pháp để phát hiện SNP bao gồm các phương pháp lai (lai allele đặc biệt, SNP microarray), các phương pháp sử dụng các emzyme (RFLP, PCR, phương pháp kéo dài mồi, sử dụng 5’- nuclease v.v.), các phương pháp dựa trên tính chất vật lý của DNA đối với các sản phẩm PCR (SSCP, điện

di gradient nhiệt độ, sắc ký lỏng cao áp biến tính v.v.) và phương pháp giải trình tự SNP được sử dụng trong lập bản đồ di truyền (Raman et al., 2014; Wu et al., 2014), trong nghiên cứu đa dạng di truyền (Kaur et al., 2014; Frascaroli et al., 2013), trong nhận biết giống và trong chọn giống (Ha et al., 2007)

2.2.5 Chỉ thị CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequences)

Kỹ thuật các chuỗi đa hình nhân bản được cắt CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequences) Kỹ thuật chỉ thị CAPS là giải pháp sử dụng các chuỗi DNA của chỉ thị RFLP đã được lập bản đồ để phát triển chỉ thị PCR nhằm tránh bước lai Southern phức tạp Vì thế, kỹ thuật CAPS còn được gọi là kỹ thuật PCR-RFLP (Konieczny and Ausubel, 1993)

Kỹ thuật CAPS được tiến hành bằng cắt hạn chế sản phẩm PCR của các locus đặc thù với một hoặc nhiều enzyme cắt hạn chế và phân tách các đoạn DNA được cắt trên gel agarose hoặc polyacrylamide Các cặp mồi được thiết kế dựa trên thông tin về trình tự của DNA hoặc cDNA trên ngân hàng gen hoặc trình tự các băng RAPD được tách dòng Chỉ thi CAPS là chỉ thị đồng trội và là các locus đặc thù được dùng để phân biệt đồng hợp tử và dị hợp tử ở các loài thực vật (Konieczny and Ausubel, 1993)

Kỹ thuật CAPS có hạn chế vì sự đột biến có thể làm mất hoặc tạo thêm các

vị trí nhận biết của các enzyme cắt hạn chế Để khắc phục hạn chế này, Michaels and Amasino (1998) đưa ra kỹ thuật biến thể khác gọi là dCAPS Trong phân tích dCAPS, vị trí nhận biết của enzyme cắt hạn chế có SNP được đưa vào sản phẩm PCR bằng mồi chứa một hoặc nhiều điểm bất hợp (mis-match) với khuôn DNA Sản phẩm PCR cải tiến này sau đó được cắt bằng enzyme cắt hạn chế và sự có mặt hay vắng mặt của SNP được xác định bằng mẫu cắt hạn chế tạo ra CAPS và dCAPS là phương pháp xác định SNP cắt sản phẩm PCR đặc biệt bằng các enzyme cắt hạn chế Đây là kỹ thuật dễ thực hiện, ít tốn kém so với bất kỳ phương pháp nào Kỹ thuật này rất hữu ích cho việc theo dõi các đột biến đã biết trong quần thể phân ly và để phát triển chỉ thị, đặc biệt là chỉ thị SNP liên kết với gen/QTL phục vụ cho chọn giống (Lee et al., 2009; Dissanayaka et al., 2014) 2.3 CÁC GEN KHÁNG ĐẠO ÔN VÀ CHỈ THỊ PHÂN TỬ LIÊN KẾT Hiện nay, các nhà nghiên cứu trên thế giới đã xác định được khoảng hơn

100 Pi loci và 350 QTL liên quan đến tính kháng bệnh đạo ôn ở cây lúa (Tanweer et al., 2015) Các gen kháng nằm trên hầu hết các nhiễm sắc thể, ngoại trừ nhiễm sắc thể số 3 Nhiều báo cáo đề cập đến phần lớn các gen kháng bệnh đạo ôn cùng nằm trên các nhiễm sắc thể số 6, 11 và 12 Các gen kháng và vị trí được thể hiện trong Bảng 2.2

Bảng 2.2 Gen kháng bệnh đạo ôn

Chromosome 1

Fukuta et al., 2004 Chromosome 2

Hayasaka et al., 1995; Wang et al., 1999; Fjellstrom et

al., 2004

Chromosome 4

111(Haonaihuan) Japonica Terashima et al., 2008

Chromosome 5

Naqbi and Chatto, 1996 Chromosome 6

Gen kháng Giống mang gen

al., 1988; Hayashi et al., 2006

Pan et al., 1996

Ballini et al., 2008

Wu et al., 2005

(Acc100882)

Oryza australiensis Jeung et al., 2007 Chromosome 7

Iwata, 1996 Chromosome 8

Chromosome 9

Kiyosawa, 1997 Pi5(t)

RIL125, RIL249, RIL260 (Moroberekan)

Chromosome 10

Chromosome 11

2002

2002

Hayashi et al., 2006

1996; Li et al., 2007

Gen kháng Giống mang gen

et al., 2004

Chromosome 12

et al., 2006

Iwata, 1997

Li et al., 2008

Koizumi, 2007

1996

Theo Hayashi et al (2006) cho rằng 3 alen Pik, Pik-p, Pik-m được định vị trên cùng một vị trí Lei et al (2010) đã phát hiện gen Pi93-1(t) trên giống lúa indica Chỉ thị OMG-01 và OMG-02 liên kết với gen kháng ngang Pi34 và có bốn gen chưa xác định được vị trí trên bản đồ gồm Pi67(t), Piis2, Pise2 và Pise3 (Zenbayashi et al., 2010)

Năm 2011, Hossein et al đã sử dụng marker phân tử để xác định và lập bản

đồ gen của cả hai loại gen kháng đạo ôn là kháng hoàn toàn và kháng một phần Một vài gen kháng chất lượng đã được nghiên cứu và lập bản đồ trong hệ gen của lúa Ngoài ra, bốn gen Pi-14(t), Pi-16(t), Pi-d(t) và Pi-25(t) đã được lập bản đồ trên nhiễm sắc thể số 2 (Sallaud et al., 2003) Các tác giả cũng chỉ ra rằng, khả năng kháng đạo ôn ở lá được kiểm soát bởi 2 gen và sự có mặt của các alen kháng ở bất kỳ locus nào cũng tạo ra tính kháng Hai gen Pi24(t) và Pi25(t) được xác định lần lượt trên nhiễm sắc thể 12 và 6 Mặt khác, Zhuang et al (2002) đã lập bản đồ di truyền tính kháng trên bộ gen lúa Hầu hết trong số các gen này được liên kết với các gen chất lượng đã được báo cáo trước đây

Tuy nhiên, một số trong những gen kháng này có thể là giống nhau hoặc có quan hệ alen Ví dụ: Gen Pi-29(t) nằm trên nhiễn sắc thể số 8 được xác định liên kết chặt với gen Pi11(t) (Zhu et al., 1993); Gen Pi30(t) nằm trên nhiễm sắc thể số

11 liên kết chặt với gen Pia (Goto et al., 1981), Gen Pi31(t) nằm trên nhiễm sắc thể số 12 liên kết chặt với 3 gen Pi31(t), Pitq-6 và Pi21(t) (Fukuoka and Okuno, 2001) Theo Sallaud et al (2003) một số gen nhiều alen như gen Pi-z có các alen Piz-t, Piz-5; gen Pita có 2 alen; gen Pik có 5 alen Lin et al (2007) chỉ ra rằng trên nhiễm sắc thể số 1 gen Pi37 có 4 alen: Pi37-1, Pi37-2, Pi37-3, Pi37-4

Bản đồ của các gen Pi1, Pita (Pi-4t) Pi5(t), Piz và Pik-m đã được thiết lập

và công bố trên trang web: http://www.gramene.org

Bảng 2.3 Chỉ thị ADN liên kết với gen kháng đạo ôn

Gen kháng Kiểu chỉ thị Tên chỉ thị Khoảng cách (cM) Nguồn tham khảo Chromosome 1

Gen kháng Kiểu chỉ thị Tên chỉ thị Khoảng cách (cM) Nguồn tham khảo

Chromosome 9

Pi5(t)

Chromosome 11

PiCO39(t)

Pik

(*: Marker được thiết kế để phát hiện sự đa hình trong các gen kháng

**: Marker được thiết kế để phát hiện sự đa hình ở đầu 5' UTR của gen kháng

***: Marker được thiết kế để phát hiện sự đa hình ở đầu 3' UTR của gen kháng.)

2.4 NGHIÊN CỨU LÚA KHÁNG ĐẠO ÔN TRÊN THẾ GIỚI

2.4.1 Đa dạng di truyền nguồn gen kháng bệnh đạo ôn

Đã có nhiều nghiên cứu về tính kháng, cơ chế kháng và di truyền tính kháng bệnh đạo ôn ở cây lúa đối với các chủng nấm gây bệnh Cở sở di truyền tính kháng đạo ôn đã được nghiên cứu rộng rãi từ rất lâu Năm 1967, IRRI đã thiết lập một hệ thống phân biệt các chủng sinh lý race/pathotype của nấm dựa trên một bộ giống chỉ thị (8 giống) theo thứ tự là: Raminad, Zenith, Np-125, Usen, Dular, Kanto 51, Sha-tiao-tsao, Caloro Tuy nhiên, bộ giống chỉ thị này chứa ít gen kháng (5 gen) nên không thể đánh giá được đúng mức độ đa dạng của quần thể nấm Hiện nay, ở các quốc gia khác nhau đã phát triển bộ giống chỉ thị riêng sử dụng các dòng đẳng gen (Near Isogenic Lines - NILs) chứa một hoặc một vài gen kháng Gần đây với sự trợ giúp của kỹ thuật sinh học phân tử (RFLP, AFLP, CAP, RGA, SSR,…) các nhà khoa học đã xác định được khoảng 40 gen kháng chính (Sallaud et al., 2003) Các gen kháng này được qui tụ vào các dòng/giống lúa khác nhau phát triển các dòng/giống lúa kháng Tuy nhiên, tính kháng đơn gen thường chỉ kháng trong giới hạn các chủng địa lý nhất định và thường bị mất hiệu lực sau trồng một thời gian (thường từ 1 - 5 năm), bởi sự xuất hiện của chủng mới trong phân bố vùng địa lý đó Năm 2005, Padmavathi et al

đã dựa trên cơ sở tính kháng của các giống lúa Zenith (Pi-Z + Pia + Pi-i), Dular (Pi-ka), Tetep (Pi-kh), Tadukan (Pi-ta) đã tiến hành lai qui tụ các gen kháng vào giống lúa Co39 Kết quả đã tạo ra được dòng lúa mang gen kháng hiệu quả với các chủng nấm đạo ôn

Như vậy, nghiên cứu chọn tạo các giống lúa kháng bệnh đạo ôn, đặc biệt là các giống lúa kháng bền vững luôn được xem như là biện pháp pháp hữu hiệu, ít tốn kém và ít ảnh hưởng đến môi trường trước nguy cơ dịch bệnh luôn có khả năng bùng phát, các nòi nấm bệnh mới luôn có khả năng hình thành Tính kháng bệnh, trên thực tế, có rất nhiều cách gọi tên cho tính kháng bệnh, nhưng xét về bản chất nhiều cách gọi khác nhau là một Dựa vào sự kiểm soát của gen kháng đạo ôn đối với cây chủ, người ta chia tính kháng bệnh đạo ôn ở lúa thành ba kiểu chính: kháng định lượng, hay kháng ngang đối với rất nhiều nòi nhưng kháng không cao; kháng định tính, hay kháng dọc đối với một hoặc hai nòi và kháng rất cao; kháng bền vững (durable resistance), không có qui định về bao nhiêu gen điều khiển nhưng kháng trong thời gian rất dài, giống kháng được trồng trên diện rộng (Johnson, 1983)

2.4.2 Sử dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống lúa kháng bệnh đạo ôn

Chọn giống bằng ứng dụng chỉ thị phân tử (MAS) là một quá trình sử dụng marker để lựa chọn gián tiếp các gen mục tiêu Việc sử dụng MAS chọn giống thay vì sử dụng chọn lọc kiểu hình thông thường đem lại một số lợi thế lớn MAS giúp tiết kiệm thời gian, giảm chi phí chọn giống và đáng tin cậy hơn do không

bị ảnh hưởng của các yếu tố môi trường Các loại chỉ thị bao gồm RFLP, RAPD, SSR, SCAR và STS đã được các nhà khoa học trên thế giới phát triển

RAPD là một kỹ thuật được sử dụng rộng rãi để xác định các chỉ thị liên kết với gen kháng đạo ôn Naweed et al (1995) sử dụng kỹ thuật RAPD với 468 mồi ngẫu nhiên đã xác định được 2 chỉ thị liên kết với gen Pi-10t ở giống lúa Tongil SCAR là một loại chỉ thị phát triển từ chỉ thị RAPD, được sử dụng cho chọn giống kháng đạo ôn Các chỉ thị SCAR ưu điểm hơn so với chỉ thị RAPD bởi chúng ít bị ảnh hưởng bởi các điều kiện phản ứng, mức độ lặp lại cao, tiến hành nhanh và cho các sản phẩm đặc hiệu Năm 2005, Sobir et al đã sử dụng 2 chỉ thị SCAR để xác định sự có mặt của gen kháng Pi-b và Pi-ta trên 28 kiểu gen

ở lúa (gồm 22 dạng trồng trọt và 6 dạng hoang dại) Kết quả phân tích chỉ ra, 15 kiểu mang cả hai gen trong đó có Oryza rufipogon, 6 kiểu mang gen Pi-b trong

đó có Oryza glumaepatula, Oryza officialis, Oryza latifolia và Oryza malapuzhaensis

Chỉ thị STS được phát triển từ các chỉ thị RFLP và AFLP, nó cho phép xác định những vị trí đánh dấu bằng cách sử dụng các trình tự nucleotit biết trước của các ADN chỉ thị Ở lúa, các STS được coi như các mốc chuẩn, nhờ vậy việc tìm kiếm các gen kiểm soát hoặc liên quan đến tính kháng đạo ôn được tiến hành một cách dễ dàng Qua phân tích di truyền trên quần thể con lai F3 của cặp lai C101LAC (giống cho gen kháng Pi-1) và CO39 (giống dễ mắc bệnh đạo ôn) bằng kỹ thuật RFLP Wu et al (2004) đã thiết kế được một cặp mồi STS cho chọn lọc các dòng lúa mang gen kháng Pi-1 (Wu et al., 2004) Năm 2008, Masahiro et al cũng đã phát triển được một chỉ thị STS sử dụng cho chọn các dòng lúa mang gen kháng Pi-b trong bảy giống lúa nội địa của Hàn Quốc

Đối với các nghiên cứu về bệnh lúa, SSR là một trong những kỹ thuật di truyền được xem là rất thích hợp trong việc lập bản đồ liên kết di truyền, phân tích đa dạng và trong các chương trình chọn giống kháng đạo ôn

Năm 2004, Chen et al đã sử dụng giống lúa Digu, kháng bền với đạo ôn,

đây còn là một nguồn giống quan trọng cho việc chọn tạo giống lúa kháng bệnh đạo ôn ở Trung Quốc Gen kháng đạo ôn của giống lúa này đã được phân lập để xác định vị trí gen kháng trên nhiễm sắc thể bằng các marker phân tử Ngoài ra, còn một số lớn các giống khác, mỗi giống chứa một gen kháng bệnh đạo ôn như gen: Piks,Pia, Pik, Pi-b, Pi-kp, Pi-ta2, Pi-ta, Pi-z, Pi-i, Pi-km,Pi-zt, Pi-t và Pi-11 và các thế hệ con lai giữa Digu và mỗi giống này đều được phân tích với các chủng kháng đạo ôn của Trung Quốc Kết quả cho thấy, tính kháng của Digu với hai chủng kháng của Trung Quốc là ZB13 và ZB15 đều được kiểm soát bởi hai gen đơn trội, riêng biệt Hai gen kháng này khác biệt với các gen kháng đã biết, vì vậy, chúng được thiết kế như Pi-d(t)1 và Pi-d(t)2 Bằng cách sử dụng marker phân tử RFLP: G1314A và G45 phân tích ở quần thể F2, Pi-d(t)1 được xác định nằm trên nhiễm sắc thể số 2 với khoảng cách giữa 1,2 và 10,6 cM, Pi-d(t)2 được xác định nằm trên nhiễm sắc thể số 6 với khoảng cách giữa 3,2 và 3,4 cM bằngcác marker SSR là RM527 và RM3 Những kết quả này cung cấp thông tin cần thiết, khi sử dụng nhiều hơn nữa các gen kháng đạo ôn của giống lúa Digu cho mục đích chọn giống và nhân dòng các gen kháng bệnh đạo ôn ở lúa

Năm 2008, Wei et al đã phân lập 160 chủng Magnaporthe oryzae (trước đây là Magnaporthe grisea) và xác định được Gen Pi20(t) có phổ kháng đạo ôn rộng ở Trung Quốc, trong đó, chủng 98095 có thể phân biệt sự có mặt của gen Pi20(t) trong IR24 Ba marker SSR được sử dụng để nhận biết gen Pi20(t) được nằm gần vùng tâm động của nhiễm sắc thể 12 và cũng nhận ra 526 dòng dễ bị ảnh hưởng ở thế hệ F2 mà có nguồn gốc từ việc lai giữa giống Asominori (một giống rất nhạy cảm) với giống kháng IR24 Marker SSR OSR32 đã lập bản đồ ở khoảng cách 0,2 cM từ Pi20(t) và Marker SSR RM28050 đã lập bản đồ từ sườn khác của Pi20(t) ở khoảng cách 0,4 cM Ba marker SSR khác là RM1337, RM5364 và RM7102 đồng phân biệt Pi20(t) Như vậy, đây là một trong những phương pháp hữu ích trong chương trình chọn giống dựa vào dấu chuẩn marker

để đưa Pi20(t) vào những dòng lúa chất lượng

Năm 2011, Kei et al đã nghiên cứu khả năng kháng bệnh đạo ôn của giống lúa Chumroo, đây là giống lúa thường được trồng ở các vùng cao của Bhutan, Nhật Bản Trong hơn 20 năm qua, giống lúa này được xem là kháng bền với đạo

ôn và chưa có bằng chứng nào chứng tỏ chúng bị nhiễm Chumroo đã được lây nhiễm với 22 chủng đạo ôn được chọn lọc theo tiêu chuẩn về các chủng khác nhau của Nhật Bản Kết quả cho thấy, giống lúa Chumroo có khả năng kháng tất

cả các chủng này Để xác định các gen kháng, Chumroo được lai với giống lúa Koshihikari dễ bị nhiễm bệnh, các cây thu được ở thế hệ F1 có khả năng kháng bệnh Phân tích sự khác biệt của 300 dòng F3 cho thấy sự khác biệt theo tỷ lệ 1:2:1 và chỉ ra rằng một gen đơn trội kiểm soát tính kháng đạo ôn với chủng Ao 92-06-2 Một locus của Chumroo (Pi46 (t)) được lập bản đồ giữa hai marker SSR

là RM6748 và RM5473, nằm ở phần cuối của cánh tay dài nhiễm sắc thể số 4, sử dụng phân tích liên kết với các marker SSR Marker gần nhất RM5473 đã liên kết với locus kháng giả định ở khoảng cách 3,2 cM Trên nhiễm sắc thể, không xác định được gen nào kháng hoàn toàn, trong khi đó, lại có mặt 2 gen kháng một phần là Pi39(t) và Pikahei-1(t) được đặt trên phần cuối của nhiễm sắc thể số 4 và liên kết chặt chẽ với RM5473 (Terashima et al., 2008) Vì vậy, Kei et al đã thiết

kế Pi46(t) như là một locus lạ kháng đạo ôn (Kei et al., 2011)

2.4.3 Chọn giống lúa kháng bệnh đạo ôn bằng QTL

Fuluoka and Okuno (2001) phát hiện 5 QTLs trên nhiễm sắc thể 2, 4, 9 và

12 mà đã liên kết QTL với một marker RFLP, G271, ở giữa nhiễm sắc thể 4 Trước đây, Ballini et al (2009) đã đưa ra 1.000 gen kháng, 88 gen kháng đã được lập bản đồ, 341 và 165 meta QTLs, điều này đã cung cấp thông tin cập nhật hữu ích về các gen kháng đạo ôn cũng như những hiểu biết mới để giúp xây dựng giả thuyết về các chức năng phân tử của QTL đạo ôn Vì vậy mà trong những năm qua, nhiều gen kháng chính đối với đạo ôn đã được lập bản đồ thông qua các marker phân tử Mặc dù các phân tích QTL cho các giống lúa ở Iran có một sự đa dạng tốt, nhưng chưa có nhiều thông tin về việc xác định QTL và sự liên kết của chúng với tính kháng đạo ôn trong các nguồn gen lúa Vì vậy, trong nghiên cứu này hai giống lúa địa phương là Khazar và Tarom Mahalli đã được chọn lọc Khazar (KHz) là một giống thấp cây, đẻ nhánh tốt, năng suất cao và kháng đạo

ôn tốt Ngược lại, Tarom Mahalli (TAM) là giống cao cây hơn, hạt dài và nhạy cảm với đạo ôn Một bản đồ liên kết ở lúa có kích thước 1231.50 cM được xây dựng bằng việc sử dụng 74 marker đa hình SSR Tổng số, 7 QTLs độc lập đã được phát hiện thông qua việc lập bản đồ kết hợp với tính kháng đạo ôn trên nhiễm sắc thể 1, 3, 4, 5 và 11 Những QTL này có thể được sử dụng hỗ trợ chương trình chọn giống bằng chỉ thị phân tử (MAS) để cải thiện tính kháng đạo

ôn ở các giống thơm, chất lượng (Hossein et al., 2011)

2.5 NGHIÊN CỨU LÚA KHÁNG ĐẠO ÔN Ở VIỆT NAM

Chọn tạo các dòng/giống lúa kháng đạo ôn bền vững được xem là biện pháp

đem lại hiệu quả cao trước nguy cơ hình thành chủng nấm mới và bùng phát dịch bệnh Để có đủ cơ sở dữ liệu và nguồn vật liệu cần thiết phục vụ cho công tác chọn tạo các giống lúa kháng đạo ôn, đáp ứng được yêu cầu của thực tế sản xuất chúng ta cần phải tiến hành nghiên cứu một cách toàn diện hơn nữa trong giai đoạn hiện nay Triển khai giống kháng luôn tỏ ra là một trong những biện pháp hiệu quả trong quản lý bệnh đạo ôn Tuy nhiên, các giống đơn gen thường bị mất hiệu lực rất nhanh sau khi xuất hiện các chủng mới do chỉ kháng được một vài chủng địa lý nhất định Nghiên cứu qui tụ đa gen kháng đã được tiến hành ở Việt Nam và đã đạt được những hiệu quả nhất định trong công tác phát triển giống lúa kháng đạo ôn

2.5.1 Đa dạng di truyền quần thể nấm đạo ôn

Nghiên cứu về đa dạng di truyền của quần thể nấm đạo ôn giúp tạo ra giống kháng bệnh bền vững, là một trong những giải pháp quản lý dịch bệnh cho vùng lúa thâm canh cao mang lại hiệu quả kinh tế nhất Bên cạnh đó, sự phát triển của sinh học phân tử đã hổ trợ tích cực trong nhận dạng DNA đang mở ra con đường mới trong phân tích quần thể P oryzae ở mức độ phân tử

Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử để nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể nấm đạo ôn ở Việt Nam, Don et al (1999) thu thập 78 mẫu từ ĐBSH và ĐBSCL và dùng probe MAGGY để phân nhóm nòi, phía bắc có 4 nhóm nòi, phía Nam chỉ có 1 nhóm nòi; tuy nhiên khi phân nòi, có tất cả 15 nòi, nòi 000.0 phổ biến ở ĐBSH và nòi 102.0 phổ biến ở ĐBSCL, không có nòi nào xuất hiện ở

cả hai vùng, ¼ mẫu ở phía Nam vô hiệu lực gen Pik-s và tất cả mẫu phân lập tấn công gen Pita, nhưng không có hoặc một vài mẫu phân lập ở phía Bắc tấn công các gen này Kết quả trên cho thấy rằng, quần thể nấm gây bệnh đạo ôn hoàn toàn khác nhau ở hai vùng đồng bằng, khả năng gây mất hiệu lực các gen kháng khác nhau, quấn thể nấm ở phía Bắc đa dạng hơn phía Nam, có lẽ do sự khác nhau về cơ cấu giống hoặc do điều kiện khí hậu khác nhau ở hai vùng, kết quả cũng cho thấy số lượng nhóm nòi nấm ở Việt Nam ít hơn ở các quốc gia khác như Philippine (10 nhóm nòi), Thái Lan (50 nhóm nòi) và ở Trung Quốc (54 nhóm nòi)

Theo báo cáo của Lã Tuấn Nghĩa và cs.(1999) cho thấy ở miền Bắc và miền Trung có tất cả 88 nòi chia làm 24 nhóm, trong đó năm nhóm 2, 7, 9, 12, 17 và

ba nòi 2-3, 7-10, 17-1 rất phổ biến Sự đa dạng của ký chủ ảnh hưởng hoặc quyết định đến sự đa dạng của quần thể gây bệnh hơn là vùng địa lý Nguyễn Thị Ninh