đánh giá và phát hiện gen kháng bệnh bạc lá xa4, xa5 và xa7 của tập đoàn nguồn gen lúa địa phương

Phương pháp nghiên cứu Trong nghiên cứu này chúng tôi đã sử dụng chỉ thị phân tử DNA phát hiện gen kháng bệnh bạc lá hữu hiệu Xa4, xa5 và Xa7, đánh giá khả năng kháng nhiễm của 136 mẫu g

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

NGUYỄN THỊ LƯƠNG

ĐÁNH GIÁ VÀ PHÁT HIỆN GEN KHÁNG BỆNH BẠC LÁ Xa4, xa5 VÀ Xa7 CỦA TẬP ĐOÀN

NGUỒN GEN LÚA ĐỊA PHƯƠNG

Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Phan Hữu Tôn

NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2016

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực

và chưa sử dụng để bảo vệ một học vị nào

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cảm

ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đều được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày tháng năm 2016

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Lương

Tôi cũng xin được cám ơn ThS Tống Văn Hải cùng các thầy cô trong Bộ môn Sinh học phân tử và CNSH ƯD, các thầy cô trong Khoa Công nghệ sinh học cũng như các cán bộ nghiên cứu của Trung tâm Bảo tồn & Phát triển Nguồn gen Cây trồng đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện để tôi hoàn thành tốt luận văn

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, những người luôn bên cạnh động viên tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận văn

Hà Nội, ngày tháng năm 2016

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Lương

MỤC LỤC

Lời cam đoan ii

Lời cảm ơn iii

Mục lục iv

Danh mục chữ viết tắt vi

Danh mục bảng vii

Danh mục hình viii

Trích yếu luận văn ix

Thesis abstract xi

Phần 1 Mở đầu 1

1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1

1.2 Mục đích nghiên cứu của đề tài 2

1.3 Phạm vi nghiên cứu của đề tài 2

1.4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài 2

Phần 2 Tổng quan tài liệu 3

2.1 Khái quát về bệnh bạc lá 3

2.1.1 Nguyên nhân, triệu chứng của bệnh bạc lá 3

2.1.2 Các chủng vi khuẩn gây bệnh 5

2.1.3 Phương pháp phân lập và lây nhiễm 6

2.2 Gen kháng và nguồn gen kháng bệnh bạc lá 8

2.2.1 Gen kháng bệnh bạc lá và chỉ thị liên kết với gen kháng 8

2.2.2 Di truyền tính kháng bệnh bạc lá 12

2.2.3 Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá 14

2.3 Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống kháng bệnh bạc lá 17

2.3.1 Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá trên thế giới 17

2.3.2 Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá ở Việt Nam 19

Phần 3 Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu 22

3.1 Vật liệu nghiên cứu 22

3.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 25

3.3 Nội dung nghiên cứu 25

3.4 Phương pháp nghiên cứu 25

3.4.1 Sử dụng chỉ thị phân tử DNA phát hiện các gen kháng bệnh bạc lá 25

3.4.2 Đánh giá khả năng kháng bệnh bạc lá bằng lây nhiễm nhân tạo 27

3.4.3 Phân loại loài phụ, nếp tẻ, đặc điểm nông sinh học năng suất 27

3.4.4 Xử lý số liệu 30

Phần 4 Kết quả nghiên cứu 31

4.1 Kết quả phát hiện gen kháng bệnh bạc lá bằng chỉ thị phân tử DNA 31

4.1.1 Kết quả phát hiện gen kháng bạc lá Xa4 31

4.1.2 Kết quả phát hiện gen kháng bạc lá Xa7 31

4.1.3 Kết quả phát hiện gen kháng bạc lá xa5 32

4.2 Kết quả đánh giá khả năng kháng nhiễm bệnh bạc lá bằng lây nhiễm nhân tạo 35

4.3 Phân loại loài phụ, nếp tẻ, đánh giá đặc điểm nông sinh học, năng suất, chất lượng của các mẫu giống nghiên cứu 45

4.3.1 Kết quả phân loại loài phụ, nếp tẻ 45

4.3.2 Kết quả đánh giá đặc điểm nông sinh học, năng suất và chất lượng 48

4.3.3 Chiều cao cây 54

4.3.4 Khả năng đẻ nhánh, nhánh hữu hiệu và kiểu đẻ nhánh 54

4.3.5 Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất 55

4.3.6 Kết quả đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng gạo 62

Phần 5 Kết luận và đề nghị 75

5.1 Kết luận 75

5.2 Đề nghị 75

Tài liệu tham khảo 76

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Nghĩa đầy đủ

AFLP : Amplified Fragment length Polymorphism BAD2 : Enzyme betaine aldehyde dehydrogenase 2 DNA : Deoxiribo Nucleic Acid

ĐBSCL : Đồng bằng sông Cửu Long

IRRI : International Rice Research Institue

GBSS : Grainule bound starch synthase -

enzyme tổng hợp amylose IFAP : Internal fragrant antisense primer -

mồi nội biên của cặp mồi phát hiện gen fgr INSP : Internal non-fragrant sense primer-

mồi nội biên của cặp mồi phát hiện gen fgr PCR : Polymerase Chain Reaction

QTLs : Quantitative Trait Locus

RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism RAPD : Random Amplified Polymorphic DNA SRFA : Selective Restriction Fragment Amplication SSR : Simple Sequence Repeates hay Microsatellite

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Danh sách các giống lúa địa phương sử dụng trong nghiên cứu 22

Bảng 3.2 Danh sách 10 chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá 24

Bảng 3.3 Thành phần của dung dịch chiết tách DNA 25

Bảng 3.4 Thành phần dung dịch TE để bảo quản DNA 25

Bảng 3.5 Chỉ thị phát hiện gen kháng bệnh bạc lá Xa4, xa5, Xa7 24

Bảng 4.1 Kết quả sử dụng chỉ thị phân tử phát hiện gen kháng bạc lá Xa4, xa5, Xa7 33

Bảng 4.2 Phản ứng của các giống lúa đối với 10 chủng vi khuẩn lây nhiễm nhân tạo 38

Bảng 4.3 Phân loại nguồn gen nghiên cứu 45

Bảng 4.4a Đặc điểm nông sinh học cơ bản của các mẫu giống lúa nếp 49

Bảng 4.4 b Đặc điểm nông sinh học cơ bản của các mẫu giống lúa tẻ 52

Bảng 4.5a Các yếu tố cấu thành năng suất của các giống lúa thuộc nhóm nếp 56

Bảng 4.5b Các yếu tố cấu thành năng suất của các giống lúa thuộc nhóm tẻ 59

Bảng 4.6a Kết quả đánh giá các tính trạng chất lượng gạo nếp 63

Bảng 4.6b Kết quả đánh giá các tính trạng chất lượng gạo tẻ 66

Bảng 4.7a Kết quả đánh giá mùi thơm các giống lúa nếp 68

Bảng 4.7b Kết quả đánh giá mùi thơm các giống lúa tẻ 70

Bảng 4.8a Hàm lượng amylose của các mẫu giống lúa nếp 71

Bảng 4.8b Hàm lượng amylose của các mẫu giống lúa tẻ 73

Bảng 4.9 Đặc điểm của 20 mẫu giống tốt đã được lựa chọn 74

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Một số hình ảnh điển hình về biểu hiện triệu chứng của bệnh bạc

lá lúa 4

Hình 2.2 Bản đồ phân bố các chủng bạc lá ở các tỉnh miền Bắc 6

Hình 2.3 Một số gen kháng bệnh bạc lá định vị trên NST 10

Hình 2.4 Gen kháng Xa4 trên NST11 với chỉ thị Npb181 11

Hình 2.5 Gen kháng xa5 trên NST 5 với chỉ thị liên kết RG556, RM122 11

Hình 2.6 Gen kháng Xa7 trên NST số 6 12

Hình 4.1 Kết quả điện di sản phẩm PCR phát hiện gen kháng Xa4 31

Hình 4.2 Kết quả điện di sản phẩm PCR phát hiện gen kháng Xa7 32

Hình 4.3 Điện di phát hiện gen kháng bệnh bạc lá xa5 33

Hình 4.4a Phản ứng của IR24 với 10 chủng vi khuẩn 36

Hình 4.4b Phản ứng của IRBB4 với 10 chủng vi khuẩn 36

Hình 4.4c Phản ứng của IRBB5 với 10 chủng vi khuẩn 36

Hình 4.4d Phản ứng của IRBB7 với 10 chủng vi khuẩn 36

Hình 4.5 Lây nhiễm nhân tạo trên các mẫu giống lúa nghiên cứu 37

Hình 4.6 Phản ứng phenol 48

Hình 4.7 Phân loại nhóm nếp/tẻ 48

Hình 4.8 Màu sắc vỏ lụa các mẫu giống nếp 63

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN

Tên tác giả: Nguyễn Thị Lương

Tên Luận văn: “Đánh giá và phát hiện gen kháng bệnh bạc lá Xa4, xa5 và Xa7 của tập đoàn nguồn gen lúa địa phương”

Mục đích nghiên cứu

Đánh giá được các đặc điểm nông sinh học, khả năng kháng và chứa các gen kháng bệnh bạc lá hữu hiệu Xa4, xa5 và Xa7 của nguồn gen lúa phục vụ cho công tác bảo tồn và khai thác hiệu quả nguồn gen lúa

Phương pháp nghiên cứu

Trong nghiên cứu này chúng tôi đã sử dụng chỉ thị phân tử DNA phát hiện gen kháng bệnh bạc lá hữu hiệu Xa4, xa5 và Xa7, đánh giá khả năng kháng nhiễm của 136 mẫu giống lúa địa phương bằng lây nhiễm nhân tạo với 10 chủng vi khuẩn bạc lá, đồng thời đánh giá một số đặc điểm nông sinh học, năng suất và chất lượng nhằm chọn lựa ra những mẫu giống lúa năng suất cao, chất lượng tốt, chứa gen kháng bệnh bạc lá vụ công tác lai, chọn tạo giống lúa mới

Kết quả chính và kết luận

Áp dụng chỉ thị phân tử ADN phát hiện được 15 mẫu giống chứa gen kháng Xa4, 7 mẫu giống chứa gen xa5, 25 mẫu chứa gen Xa7 và 2 mẫu giống chứa đồng thời 2 gen Xa4 và Xa7

Bằng lây nhiễm nhân tạo nhận thấy các mẫu giống chứa gen kháng Xa4 kháng được 6/10 chủng, các mẫu giống chứa gen xa5 kháng được 9/10 chủng, các mẫu giống

chứa gen Xa7 kháng được 8/10 chủng Qua lây nhiễm nhân tạo cũng xác định được chủng bệnh số 5 có độc tính mạnh nhất mà không gen kháng nào kháng được

Đánh giá được một số đặc điểm nông sinh học, năng suất, chất lượng của 136 mẫu giống lúa từ đó chọn được 20 mẫu giống năng suất cao, chất lượng và chứa gen kháng bệnh bạc lá Đây là nguồn vật liệu quý cho các chương trình chọn tạo giống lúa mới năng suất cao, chất lượng tốt và kháng bệnh bạc lá

THESIS ABSTRACT

Master candidate: Nguyen Thi Luong

Thesis title: "Evaluation and indentifying resistance gen to Bacterial Leaf Light Xa4, xa5 and Xa7 of local rice gene resources"

Major: Biotechnology Code: 60.42.02.01

Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA) Introduction

Bacterial leaf blight (BLB) caused by Xanthomonas oryzae rice bacterial pv oryzae is a destructive diseases of rice in Asia and Vietnam The BLB disease reduces productivity 10- 80 percent, even lost all Use resistant rice varieties is the most effective method to bring about economic efficiency and environmental protection In order to rice breeding success, the genetic resources play very an important role Rice genetic resources of Vietnam is very diversity and abundant To use these genetic resources in rice breeding program, the first work is to evaluate genetic resources Research Objectives

Evaluation of agronomic biological characteristics, resistance ability and containing effective resistance genes to BLB disease (Xa4, xa5 and Xa7 gene) of rice genetic resources serve for the conservation and effective exploitation

Methodology

In this study we have used DNA molecular markers to identify effective resistance genes to bacterial leaf blight (Xa4, xa5 and Xa7 gene), testing ability to resistance and susceptible of 136 rice accessions with 10 bacterial leaf blight strains by artificial inoculation, simultaneously evaluate agronomic biological characteristics, yield and quality to select good varieties with high yield, good quality and resistance to BLB diseases serve for new rice breeding

Main findings and conclusions

Application DNA molecular marker we identified 15 varieties contain Xa4 gene,

7 varieties contain xa5 gene, 25 varieties contain Xa7 and two varieties with both Xa4 and Xa7 gene

By artificial inoculation found that, rice varieties contain Xa4, xa5 and Xa7 gene resistant to 6/10, 9/10 and 8/10 strains respectively Through artificial inoculation we also identified number 5 strain was the most powerful toxicity that have not any gene can resistant

Evaluated agronomic biological characteristics, yield and quality of 136 rice accessions, through that we selected 20 accessions that showed good quality, high yield potential, contain resistance gene to bacterial leaf blight These materials can be used for rice breeding program with high yield, good quality and bacterial leaf blight resistance

PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Bệnh bạc lá do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv Oryzae (Xoo) gây ra là một trong những bệnh hại nguy hiểm nhất đối với cây lúa ở khu vực châu Á (Mew et al, 1993) Bệnh có thể làm ảnh hưởng 10-80% đến năng suất, thậm chí mất trắng ( Singh et al, 1977) Trước đây bệnh thường gây hại nặng trong vụ mùa

ở miền Bắc Việt Nam, nhưng trong những năm gần đây do sự biến đổi của khí hậu mà bệnh gây hại nặng trong cả điều kiện vụ xuân (Phan Hữu Tôn và, 2012)

Để phòng trừ người ta đã sử dụng một số biện pháp xử lý như: xử lý hạt giống trước khi gieo, bón phân cân đối, bón sớm tập trung, sử dụng thuốc bảo vệ thực vật hóa học Các thuốc trừ sâu bệnh được sử dụng thường có độ độc tính cao, diệt sâu bệnh nhanh, phổ tác dụng rộng Tuy nhiên, việc lạm dụng thuốc hóa học để trừ sâu bệnh đã lên tới mức báo động, để lại nhiều hậu họa như làm tồn dư thuốc trên nông sản, gây hiện tượng côn trùng kháng thuốc, phá vỡ thế cân bằng sinh thái trên ruộng lúa do thuốc hóa học diệt cả côn trùng thiên địch và gây ô nhiễm môi trường Cho đến nay, biện pháp sử dụng giống kháng bệnh vẫn được coi

là hướng có hiệu quả về cả mặt kinh tế và môi trường

Để chọn tạo thành công giống lúa kháng bạc lá phụ thuộc nhiều vào số lượng và chất lượng vật liệu khởi đầu Việt Nam được coi là cái nôi của nhiều loài cây lương thực quan trọng, trong đó có cây lúa Thành phần các giống lúa này rất đa dạng và phong phú Phần lớn các giống lúa địa phương có đặc điểm như: bông to,cơm thơm mềm, khả năng chống chịu với điều kiện ngoại cảnh, sâu bệnh tốt Nắm bắt được tình hình đó, thời gian vừa qua Trung tâm Bảo tồn và Phát triển Nguồn gen Cây trồng, Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tiến hành thu thập, lưu giữ được hơn 3.500 mẫu giống lúa trong và ngoài nước Để sử dụng và khai thác hiệu quả nguồn gen này thì đánh giá cũng như phát hiện gen kháng bệnh rất cần thiết

Hiện nay, công nghệ sinh học ngày càng đạt được những thành tựu to lớn

Sử dụng chỉ thị phân tử DNA trong việc phát hiện gen kháng bệnh trên cây lúa được áp dụng rộng rãi trên thế giới Các nhà khoa học trên thế giới đã xác định được 42 gen kháng bệnh bạc lá khác nhau Ở miền bắc Việt Nam theo Phan Hữu Tôn và cs, 2004; Taura et al., 2004; Lã Vĩnh Hoa và cs., 2010 có 4 gen Xa4, Xa5,

Xa7, Xa21 kháng được hầu hết các chủng vi khuẩn gây bênh bạc lá Xuất phát từ thực tế đó chúng tôi tiến hành làm đề tài “Đánh giá và phát hien gen kháng bệnh bạc lá Xa4, xa5, và Xa7 của tập đoàn nguồn gen lúa địa phương” Đề tài được thực hiện sẽ đáp ứng nhu cầu cấp bách cả về lý luận khoa học và thực tiễn sản xuất chọn tạo giống kháng bạc lá hiện nay

1.2 MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI

Đánh giá các đặc điểm nông sinh học, khả năng kháng và chứa các gen kháng bệnh bạc lá hữu hiệu Xa4, xa5 và Xa7 của nguồn gen lúa phục vụ cho công tác lưu giữ và khai thác hiệu quả nguồn gen

1.3 PHẠM VI NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI

Đánh giá và phát hiện gen kháng bạc lá của 136 mẫu giống lúa địa phương Việt Nam

1.4 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

* Ý nghĩa khoa học

Kết quả của đề tài là đánh giá được nguồn gen, phát hiện và chọn lọc được những mẫu giống lúa có nhiều đặc tính quý từ đó mở ra khả năng sử dụng, khai thác hiệu quả nguồn gen trong các chương trình chọn tạo giống lúa năng suất, chất lượng và kháng bệnh bạc lá, đáp ứng nhu cầu xã hội và ứng phó với biến đổi khí hậu hiện tại và tương lai

* Ý nghĩa thực tiễn

Trong tập đoàn 136 mẫu giống lúa nghiên cứu chúng tôi đã chọn được 20 mẫu giống lúa triển vọng có thể sử dụng trực tiếp nguồn gen này phát triển trong sản xuất đáp ứng được nhu cầu của thực tế, tăng hiệu quả kinh tế cho nông dân

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 KHÁI QUÁT VỀ BỆNH BẠC LÁ

2.1.1 Nguyên nhân, triệu chứng của bệnh bạc lá

Vi khuẩn Xoo có hình gậy ngắn, hai đầu tròn, là vi khuẩn gram (-) và không hình thành bào tử, có thể sống trong môi trường có độ pH 4,0 – 8,8 nhưng thích hợp nhất là pH = 6,8 – 7,2 Nhiệt độ thích hợp với vi khuẩn Xoo từ 260C –

300C, tối thiểu là 50C tối đa là 400C Vi khuẩn Xoo thâm nhập thụ động, qua khí khổng, đặc biệt qua vết thương xây xát trên lá Trong điều kiện mưa ẩm, trên bề mặt lá sẽ tiết ra những giọt dịch vi khuẩn và thông qua sự va chạm, tiếp xúc giữa các lá lúa bệnh có thể lây lan từ lá này sang lá khác để tiến hành xâm nhiễm lặp lại nhiều lần trong suốt thời kỳ sinh trưởng và phát triển của cây lúa

mô khỏe có ranh giới rõ ràng theo gợn sóng màu vàng hoặc khô vàng, có khi có một đường chỉ viền màu nâu sẫm đứt quãng hay không đứt quãng

Hình 2.1 Một số hình ảnh điển hình về biểu hiện triệu chứng

của bệnh bạc lá lúa 2.1.1.3 Tác hại của bệnh bạc lá

Mức độ hại của bệnh phụ thuộc vào giống, thời kỳ nhiễm bệnh sớm hay

muộn và mức độ bệnh nặng hay nhẹ Mức độ nặng hay nhẹ phụ thuộc vào tính

độc của từng chủng vi khuẩn, mùa vụ, đặc tính của giống Cây lúa có thể bị giảm

năng suất tới 20 - 25% khi bệnh phát triển và xuất hiện trên lá đòng Bệnh bạc lá

phát sinh phá hại suốt thời kỳ mạ đến khi lúa chín

Ở Việt Nam, bệnh bạc lá đã được phát hiện từ lâu trên các giống mùa cũ

Trong những năm gần đây, bệnh gây hại trên cả hai loại lúa lai và lúa thuần, đặc

biệt gây hại nặng trên các giống lúa lai nhập nội từ Trung Quốc Bệnh làm lá úa,

lúa đòng sớm tàn, nhanh chóng bị khô chết, bộ lá úa xơ xác ảnh hưởng đến hiệu

quả quang hợp tích lũy chất khô dẫn đến giảm khối lượng nghìn hạt, tỉ lệ lép cao,

năng suất sút kém (Nguyễn Văn Viết và cs., 2005)

2.1.1.4 Các biện pháp phòng trừ bệnh bạc lá

Biện pháp canh tác: Sử dụng kết hợp với các kỹ thuật trong canh tác nhằm

hạn chế nguồn bệnh và sự phát triển của bệnh Bao gồm các kỹ thuật : vệ sinh

đồng ruộng, diệt trừ cỏ dại, xử lý hạt giống trước khi gieo trồng, bón phân cân

đối, tăng cường bón phân hữu cơ, bón đạm sớm và tập trung

Biện pháp hóa học: dùng các loại thuốc hợp chất đồng, chất kháng sinh

Streptomycin hoặc các chất như MBMAT Các chất này có bản chất kháng vi

khuẩn gram âm

Biện pháp sinh học: Sử dụng giống kháng bệnh và sử dụng vi sinh vật đối kháng với vi khuẩn Xoo Các nhà khoa học đã được tìm thấy Pseudomomas fluorescens và một số chủng Bacillus được phân lập từ các mẫu đất vùng rễ lúa

có khả năng ức chế sự phát triển của X.oryzae.pv.oryzae trong phòng thí nghiệm (Gnanamanickam et al.,1999) hay chủng Lysobacter APMus được phân lập từ rễ lúa của tỉnh Yunnan, Trung Quốc có khả năng ức chế phát triển của nhiều loại nấm và vi khuẩn gây bệnh thực vật, trong đó có X.oryzae pv.oryzae (Jin et al.,2008) Đây là hướng đi mới trong chiến lược phòng chống bệnh bạc lá mang lại hiệu quả cao

2.1.2 Các chủng vi khuẩn gây bệnh

Theo Ogawa et al (1986) và Noda et al (1999) nghiên cứu giống kháng chủng bạc lá cho thấy ở Nhật Bản có 8 giống chứa gen kháng là Kinmaze, Kogyoku, Rantai- Emas, Wase Aikoku, Java Elwee, Hene Dikwee tương ứng phát hiện 9 chủng vi khuẩn gây bệnh khác nhau là IA, Ib, II, IIIA, IIIB, IV, V,

VI, VII (Zhang Qi, 2007)

Các nhà khoa học IRRI đã tạo ra được các dòng đẳng gen kháng bệnh bạc

lá là IRBB4, IRBB10, IRBB5, IRBB7, IRBB14, IRBB21, đồng thời xác định có

10 chủng vi khuẩn Xoo: Race 1 (PXO61), Race 2 (PXO86), Race 3 (PXO79), Race 4 (PXO71), Race 5(PXO112), Race 6 (PXO99)¸ Race 7 (PXO145), Race 8 (PXO280) , Race 9 (PXO330), Race 10 (PXO341) (Zhang Qi, 2007)

Theo nghiên cứu của Fang Zhong Da et al (1991) Trung Quốc có 5 giống kháng bệnh bạc lá là Java14, Nam Geng 15, Jin Gang 30 tương ứng đã xác định 7 chủng vi khuẩn bạc lá kí hiệu là I, II, III, IV, V, VI, VII Miền Bắc Trung quốc vùng trồng lúa Japonica chủ yếu tồn tại là chủng I, II, miền Nam khu vực trồng lúa Indica chủ yếu tồn tại chủng 4, 5, rất ít chủng 2

Phan Hữu Tôn và Bùi Trọng Thủy (2004) đã phân lập 10 chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá và bảo quản tại phòng thí nghiệm Học viện Nông nghiệp Việt Nam Miền Bắc Việt Nam chủ yếu tồn tại chủng 1, 2, 3, 4, 5, 7 trong đó miền Nam chủ yếu tồn tại chủng 2, 5, 10 (Phan Hữu Tôn, 2004; Naruto Furuya, et al, 2002) Gần đây nhóm tác giả cũng đã phân lập 412 vi khuẩn gây bệnh bạc lá thu thập trên 39 giống lúa trồng phổ biến tại 19 tỉnh thuộc các tỉnh phía Bắc (Phan Hữu Tôn, Tống Văn Hải và cs, 2012) Bằng lây nhiễm nhân tạo trên dòng đẳng gen và bằng chỉ thị phân tử đã phân loại 412 isolate thành 12 chủng bệnh Từ đó tác giả cũng vẽ được phân bố của từng chủng ở miền Bắc Việt Nam Đây là dữ liệu cực kỳ quý giá cho các nhà khoa học khi chọn tạo giống kháng bệnh bạc lá

Hình 2.2 Bản đồ phân bố các chủng bạc lá ở các tỉnh miền Bắc

Nguồn: Phan Hữu Tôn và

cs (2012)

Tại phía Nam, Nguyễn Thị Liên và cs (2012) , trường Đại học Cần Thơ đã

sử dụng căp mồi XO290R-F được thiết kế khuếch đại đoan gen rhs có kích thước 290bp của vi khuẩn Xoo, kết quả đã nhận diện được 5 dòng vi khuẩn là OM66-1, OM98-1, OM98,TL6 và AG11 Đặc biệt một trong số đó có chứa gen rhs, một gen gây bệnh có độc tính cao mới được phát hiện có trong vi khuẩn Xoo

2.1.3 Phương pháp phân lập và lây nhiễm

2.1.3.1 Phân lập vi khuẩn

Vi khuẩn Xoo so với các loại vi khuẩn khác thường phát triển chậm hơn khi nuôi cấy ở môt trường nhận tạo, việc phân lập sẽ khó hơn đặc biệt từ hạt giống và đất Để phân lập thông thường người ta chọn những vết bệnh còn tươi Môi trường thích hợp để vi khuẩn sinh trưởng PH = 6,5 – 7,0 nhiệt độ thích hợp khoảng 280C

Khi phân lập, bằng kinh nghiệm thì vi khuẩn lạc của vi khuẩn bạc lá có màu vàng rơm, bề mặt phồng lên và bóng Dựa vào đặc điểm này mà phân lập được các isolate bệnh bạc lá mà không bị nhầm lẫn với các loài vi khuẩn khác

1

4 4

4 3 4 3

4 3

7 8

2 2 3

3

7 8 4 3 4 3

3 3 1

2

3 3 5 5

2 3 3 2 5 5 2 3 3 2 5 5

2 3

335 5

3 3

101010 3 3

3 3

114

2 2

2 3

33

55

2 2

2 3

33

55

11 12

9 9 6

6 6

12 6

2 3 4

Chủng

12

3 3

10 2

* T.Quang

* T.Nguyên

6 6

9

3 4

Để khẳng định các khuẩn lạc đã được phân lập các nhà khoa học còn sử dụng chỉ thị phân tử để xác định Để phân biệt vi khuẩn gây bệnh bạc lá với các

vi khuẩn khác chỉ thị 16S và 23S được sử dụng Qua đó là vi khuẩn gây bệnh bạc

lá (Xoo) thì nhân lên đoạn DNA có kích thước 470 bp, là vi khuẩn khác thì không có đoạn ADN này được nhân lên (Furuya N và cs., 2000)

- Môi trường nuôi vi khuẩn bệnh bạc lá

Có rất nhiều loại môi trường để nuôi vi khuẩn Xoo nhưng môi trường PSA (Potato semi – synthetic agar) là thích hợp nhất cho vi khuẩn phát triển Gần đây môi trường nuôi cấy vi khuẩn thường được dùng là môi trường Wakimoto,

do chính Wakimoto tìm ra Môi trường này được coi là môi trường thích hợp hơn

cả dùng để phân lập và nuôi vi khuẩn phát triển Với môi trường Wakimoto khi nuôi cấy vi khuẩn sau 48 giờ, dùng farafilm lỏng đổ ngập bề mặt vi khuẩn, đặt ở điều kiện phòng có thể bảo quản được vi khuẩn 6-8 tháng mà không gây ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triển cũng như độc tính của vi khuẩn

2.1.3.2 Phương pháp lây nhiễm và đánh giá khả năng kháng bệnh

+ Vi khuẩn gây bệnh lây nhiễm qua vết thương: lỗ khí khổng, vết thương sây sát trên lá, rễ lúa và thân lúa nên có rất nhiều phương pháp lây nhiễm được

đề xuất như: phương pháp phun vi khuẩn; phương pháp ngâm tưới; phương pháp ngâm rễ mạ; phương pháp châm kim và phương pháp cắt đầu lá

a Phương pháp phun

Trước khi nhổ mạ cấy 1-2 ngày, phun đều vi khuẩn cho lúa, giữ ẩm độ sau lây nhiễm, phương pháp này giống với phương pháp lây nhiễm tự nhiên

b Phương pháp ngâm tưới

Phương pháp này tiếp cận xâm nhiễm tự nhiên Phương pháp ngâm do Fang Zhong Da et al (1956) đề xuất, dùng nước vi chứa khuẩn ngâm tưới luống

mạ, phương pháp này thường sử dụng gieo mạ trên khay hoặc diện tích nhỏ (Zhang Qi, 2007)

c Phương pháp ngâm rễ mạ

Khi cây mạ bị tổn thương rễ khi nhổ cấy hoặc người ta cắt một phần rễ trước khi lây nhiễm, ngâm rễ vào trong nước chứa vi khuẩn với thời gian 3-6 giờ Watanabe (1975) đã cải tiến phương pháp bằng cách trộn vi khuẩn lẫn vào đất, sau đó gieo hạt giống trên đất khô, làm như vậy sẽ tạo cơ hội xâm nhiễm đồng nhất khi hạt giống nảy mầm (Zhang Qi, 2007)

d Phương pháp châm kim

Chuẩn bị bọc xốp đã được thấm dung dịch vi khuẩn, đặt lá lên trên bọc xốp, sử dụng kim đơn hoặc kim kép đâm xuyên qua lá để tạo điều kiện cho vi khuẩn xâm nhập (Mukoo H, Yoshid K,1951), (Yoshida K, Mukoo H, 1961)

e Phương pháp cắt đầu lá

Do Kauffman et al (1973) đề xuất, dùng kéo vô trùng nhúng vào nước chứa vi khuẩn sau đó cắt một lát cắt cách đầu lá 1-3 cm (tùy theo thời kỳ sinh trưởng của cây lúa), vi khuẩn sẽ xâm nhập vào vị trí vết thương Hiệu quả xâm nhiễm của phương pháp này giống với phương pháp bấm kim Hệ số tương quan giữa hai phương pháp tương ứng r = 0,728 – 0,753 (Wu et al 1983) Các nhà khoa học IRRI khi tiến hành lây nhiễm nhân tạo trên quy mô diện tích lớn đều chủ yếu sử dụng phương pháp cắt đầu lá

Hiện nay phương pháp cắt đầu lá ở giai đoạn lúa từ trỗ đến làm đòng là phương pháp được sử dụng rộng rãi để đánh giá khả năng kháng nhiễm của giống Phương pháp này đơn giản, dễ làm và cùng một lúc có thể đánh giá được phản ứng của một hay nhiều giống với một hay nhiều chủng vi khuẩn (Furuya N

và cs., 2000)

2.2 GEN KHÁNG VÀ NGUỒN GEN KHÁNG BỆNH BẠC LÁ

2.2.1 Gen kháng bệnh bạc lá và chỉ thị liên kết với gen kháng

Cùng với việc xác định được các chủng bệnh và phân bố của của các chủng bệnh bạc lá việc tìm ra nguồn gen kháng ở cây lúa với các chủng vi khuẩn gây bệnh đó là rất cần thiết Cho đến nay đã có 42 gen kháng chính đã được phát hiện trên các giống lúa trồng và lúa hoang dại trên thế giới trong đó phần lớn tập trung ở các nước Đông Nam Á Các gen kháng được tìm ra trên các giống khác nhau được ký hiệu từ Xa1 – Xa42 ( Chun et al., 2012;) Trên NST số 1 có 2 gen:

Xa 29 và xa34; NST số 2 có 1 gen là Xa24; NST số 3 có 1 gen là xa11; NST số 4

có 7 gen : Xa1, Xa2, Xa 12, Xa14, Xa25(t), Xa30(t), Xa31(t); NST số 5 có 1 gen

là xa5; NST số 6 có 3 gen là Xa7, Xa27, Xa33(t); NST số 7 có 1 gen là Xa8, NST

số 8 có 1 gen là xa13, NST số 11 có 10 gen Xa10, Xa23, Xa30(t), Xa3/Xa26, Xa22(t), Xa4, Xa32(t), Xa35(t) và Xa36(t); NST số 12 có 1 gen xa32

Như vậy trên tổng số 12 NST ở lúa thì có 10NST có chứa locus/gen quy định tính kháng với các chủng khác nhau của vi khuẩn gây bệnh bạc lá Ở Việt Nam các tác giả Phan Hữu Tôn và cs, 2012; Bùi Trọng Thủy và cs, 2004 đã có

những kết luận là gen Xa4, xa5, Xa7 và Xa21 là những gen kháng rất tốt đối với các chủng vi khuẩn bạc lá miền Bắc Việt Nam Tuy nhiên gen kháng Xa21 không có mặt trong các giống lúa trồng mà chỉ có mặt ở các giống lúa hoang dại Nên trong nghiên cứu này 3 gen kháng Xa4, xa5 và Xa7 được quan tâm và phát hiện trong gập đoàn 136 mẫu giống lúa địa phương Việt Nam Ba gen này đã xác định được các chỉ thị liên kết, như vậy bằng kỹ thuật PCR có thể dễ dàng phát hiện sự hiện diện của gen này trong nguồn vật liệu nghiên cứu, các chỉ thị liên kết với các gen được tổng hợp ở bảng 2.1

Ở Việt Nam một số gen kháng bệnh đã được tìm thấy trong các giống lúa địa phương ở các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long và các tỉnh phía Bắc như gen Xa2 được tìm thấy ở giống lúa tẻ Tép, xa5 có ở giống lúa Ba Túc, Giòng Đôi, Kio Bo Teng, xa13 có ở giống Cà Đung, Thơm Lùn, Vệ Phích , Nếp Hoa Vàng, Nàng Sớm ( Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004)

Bảng 2.1 Các chỉ thị phân tử liên kết với một số gen kháng bạc lá

Gen Nguồn

cho NST

Kiểu

di truyền

Loại Chỉ thị

Chỉ thị liên kết

Khoảng cách

Tài liệu tham khảo

Xa4 TKM6 11 Trội SSR

RFLP

RM224 Npb181

1,0 1,7

Sun et al., 2004 Wang et al.,2003

xa5 Aus Boro

Lines 5 Lặn

RFLP SSR

RG556 RM122

<0,5 1,0

Yer and Mc Couch, 2004 Blair and Mc Couch, 2003

Xa7 DV85 6 Trội

STS SSR

P3 RM5509

2,5

-

Lee et al.,2000 Taura A et al.,2004

Nhóm tác giả nghiên cứu tại trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội nay là Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tiến hành phân lập các chủng bệnh vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa trên các giống lúa phổ biến tại vùng trồng lúa từ Hà Tĩnh trở

ra và đánh giá khả năng kháng của các dòng lúa mang gen kháng với các chủng

vi khuẩn đã được phân lập Kết quả nghiên cứu của nhóm tác giả công bố rất phù hợp Các dòng lúa mang gen Xa4, xa5, Xa7 có khả năng kháng tốt với hầu hết

các chủng vi khuẩn gây bệnh ở các tỉnh phía Bắc (Phan Hữu Tôn và cs, 2004; Taura et al., 2004; Lã Vĩnh Hoa và cs., 2010) Các tổ hợp chứa gen xa5, Xa7 đều kháng mạnh với các chủng vi khuẩn gây bệnh ở các tỉnh phía Bắc ( Phan Hữu Tôn, Bùi Trọng Thủy, 2004), Gen Xa7, gen Xa21 có khả năng kháng cao với các chủng gây bệnh phổ biến của các tỉnh phía Bắc (Vũ Hồng Quảng và cs., 2011) Ngoài ra gen Xa4, Xa7 còn có khả năng kháng tốt với các chủng gây bệnh trên các giống ở ĐBSCL (Hoang et al.,2010) Các chỉ thị được các tác giả sử dụng phát hiện gen kháng là Npb181 (Xa4), RG556 (xa5), P3 (Xa7)

Bản đồ di truyền và chỉ thị liên kết của các gen kháng Xa4, xa5, Xa7 được đưa ra như sau:

Hình 2.3 Một số gen kháng bệnh bạc lá định vị trên NST

Hình 2.4 Gen kháng Xa4 trên NST11 với chỉ thị Npb181

Nguồn: Wang (2003)

Hình 2.5 Gen kháng xa5 trên NST số 5 với chỉ thị liên kết RG556, RM122

Nguồn: Blair and Mc Couch (2003)

Hình 2.6 Gen kháng Xa7 trên NST số 6

Nguồn: Porter B.W et al (2003)

Các dòng lúa mang gen kháng chuẩn như IRBB4 gen Xa4, IRBB5 gen xa5, IRBB7 gen Xa7 được sử dụng làm nguồn gen trong nghiên cứu và lai tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá

2.2.2 Di truyền tính kháng bệnh bạc lá

Người ta có thể chia tính kháng sâu bệnh thành hai nhóm:

+ Tính kháng dọc (vertical resistance) còn được gọi là tính kháng chuyên đối với một vài nòi sinh lý nhất định, hay tính kháng không đồng nhất, tính kháng chất lượng, tính kháng này thường không bền vững Nhược điểm là nòi sinh lý thay đổi sẽ làm mất tính kháng

Cơ sở và đặc điểm của tính kháng nhiễm này là:

- Sự chuyên tính của một nòi nào đó cho phản ứng kháng hoặc nhiễm đối với cây ký chủ

- Tính kháng nhiễm được kiểm soát bởi một hoặc một vài gen

- Tính kháng ít chịu ảnh hưởng của môi trường

- Rất hiệu quả đối với một số ít nòi, nhưng không hiệu quả đối với nhiều nòi khác

+ Tính kháng ngang (horizontance resistance) là phản ứng kháng tương đương nhau với hầu hết các nòi và được kiểm soát bởi nhiều gen Tính kháng này còn được gọi là tính kháng toàn phần, tính kháng đồng nhất, tính kháng đa gen

Cơ sở tính kháng này là do:

- Sự không chuyên tính của các nòi cho phản ứng kháng với nhiều nòi không nhất thiết có cùng mức độ

- Được kiểm soát bởi đa gen

- Chịu ảnh hưởng tương tác với môi trường

- Có hiệu quả kháng ở một mức độ nhất định với nhiều nòi cho dù không cùng mức độ như nhau

- Có suy giảm ảnh hưởng nhất định sau khi hình thành quần thể ký sinh đủ mạnh trên cây chủ

Do bản chất di truyền khác nhau nên khả năng kháng ngang, kháng dọc không giống nhau Kháng dọc có tác dụng làm giảm nguồn bệnh ban đầu và trì hoãn sự bùng nổ của dịch bệnh Thời gian tồn tại khả năng kháng dọc phụ thuộc vào sự đa dạng di truyền trong quần thể ký sinh Kháng ngang không làm giảm bớt nguồn bệnh ban đầu nhưng lại làm giảm tốc độ phát triển của dịch bệnh Do đó, kháng ngang có tính kháng bệnh bền vững hơn kháng dọc (Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, 2004)

Di truyền tính kháng bệnh lạc lá, theo Zhang, 2007, tính kháng của giống với

độ độc tính của chủng có quan hệ điển hình, tính kháng của giống do gen chính trong nhân khống chế Biểu hiện di truyền tính kháng của giống là số lượng phụ thuộc vào tính kháng của hai bố mẹ chứa gen chính kháng bệnh, bao gồm gen trội/lặn, tác dụng giữa các gen, liên kết gen, loại hình tính kháng (kháng suốt trong thời gian sinh trưởng hoặc kháng khi cây đã lớn)

Theo Zhu và cs (2000) để nghiên cứu mối quan hệ giữa tính kháng bệnh bạc lá ở lúa lai do nhân hay do tế bào chất Họ đã sử dụng 8 dòng bất dục đực, dòng duy trì (tế bào chất khác nhau) với 9 dòng phục hồi sử dụng để lai tạo con lai

F1, sau đó sử dụng chủng vi khuẩn IV và II (của Trung Quốc) xác định tính kháng Kết quả cho thấy, tính kháng của con lai F1 do gen trong nhân điều khiển và không

có quan hệ với tế bào chất (Zhang Qi, 2007)

Di truyền tính kháng là di truyền số lượng bệnh bạc lá: Theo nghiên cứu của Wan và Zhen (2007) cho biết, tính kháng bệnh bạc lá là tính trạng chất lượng di truyền do gen chính khống chế, đồng thời cũng có thể là tính trạng số lượng di truyền do đa gen khống chế; gen kháng bệnh liên kết với gen không lây nhiễm thì biểu hiện hiệu ứng kháng của gen chính, nếu liên kết với gen độc tính thì biểu hiện kháng một phần hoặc tính kháng số lượng; gen chính với QRL (Quantitative Resistance Loci) tác dụng cấu thành phức tạp mang di truyền tính kháng bệnh bạc lá

Tính kháng của giống: các giống khác nhau có tính kháng khác nhau rất

lớn, thông thường lúa nếp và các giống lúa thuộc loài phụ Japonica có tính kháng cao hơn loài phụ Inidca; Giống có dạng lá hẹp và đứng tính kháng cao hơn lá to

và nằm ngang; giống có thủy khổng lá ít sẽ kháng mạnh hơn giống có thuỷ khổng

lá nhiều; giống chịu phân tốt sẽ có tính kháng cao hơn giống không chịu phân bón (Lã Vĩnh Hoa và cs., 2010)

2.2.3 Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá

Trong những năm gần đây, chỉ thị phân tử DNA đã được đưa vào sử dụng phổ biến trong chọn tạo giống cây trồng Trong đó cây lúa là cây trồng được các nhà nghiên cứu quan tâm.Với những kết quả đạt được, vai trò của chỉ thị DNA đã được khẳng định là công cụ hữu ích giúp các nhà chọn tạo giống rút ngắn thời gian tạo giống mới theo mục tiêu chất lượng, năng suất, chống chịu sâu bệnh Một số chỉ thị được sử dụng trong chọn tạo giống

2.2.3.1.Chỉ thị dựa trên cơ sở lai DNA: Chỉ thị đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn - RFLP ( Restriction Fragment Length Polymorphism):

Chỉ thị này được các nhà di truyền học lần đầu tiên giới thiệu trong nghiên cứu lập bản đồ gen liên quan đến bệnh ở người (Bostein, et al, 1980) Nguyên lý

kỹ thuật của RFLP dựa trên phân tử DNA được cắt thành các đoạn bởi enzyme cắt giới hạn, sau đó phân tách các đoạn DNA theo chiều dài băng diện di Nếu số đoạn ít thì có thể nhận biết ngay bằng điện di trên nền gel Nếu bộ gen lớn các đoạn cắt quá nhiều và chênh nhau không nhiều về kích thước khó phát hiện thì cần phải lai DNA để xác định

Đối với thực vật chỉ thị này lần đầu tiên được áp dụng trong nghiên cứu gen kiểm soát tổng hợp rRNA trong vùng cấu trúc nhân của lúa mì (Apple and Dvorak, 1982) Ở lúa chỉ thị RFLP được sử dụng nhiều trong lập bản đồ QTLs cho các tính trạng chất lượng và năng suất lúa (Lin et al,1994,1995), các gen kháng đạo ôn (Hittalmani et al, 1995), gen kháng rầy nâu (Hirabayashi and Ogawa, 1995), các gen kháng bệnh bạc lá (Yoshimura et al, 1992; 1998; Yer and

Mc Couch , 2004; He et al, 2006) và nhiều tính trạng khác như khả năng chịu hạn, mặn Chỉ thị RFLP là chỉ thị đồng trội, có khả năng biểu hiện tất cả các alen của cùng một locus gen, do vậy có thể phân biệt được các cá thể đồng hợp

tử và dị hợp tử Đây là điểm ưu việt của loại chỉ thị RFLP Hạn chế của phương pháp này là tốn thời gian, cần có mẫu dò đánh dấu và enzyme cắt giới hạn, đòi hỏi trang thiết bị phòng thí nghiệm nhiều, và đặc biệt cần một lượng lớn DNA

2.2.3.2 Chỉ thị phân tử dựa trên kỹ thuật chuỗi trùng phân (Polymerase Chain Reaction - PCR)

Chỉ thị phân tử dựa trên kỹ thuật phản ứng trùng phân, được Kary Mullis phát minh năm 1985 và đã nhanh chóng được sử dụng hầu hết các phòng thí nghiệm trên toàn thế giới Phản ứng dựa trên nguyên tắc tổng hợp DNA nhờ enzyme DNA polymerase chịu nhiệt (Taq, Pfu) với sự có mặt của DNA khuôn mẫu, DNA mồi, các dNTP (A,C,G,T) và ion Mg2+ hoạt động như chất xúc tác Hai sợi mới DNA tạo thành sẽ trở thành DNA khuôn cho chu kỳ tiếp theo Sau mỗi chu kỳ số lượng các sợi DNA được tăng lên gấp đôi Đến khoảng 35-50 chu

kỳ phụ thuộc vào nguồn dNTP, số bản sao của phân tử DNA phản ứng PCR sẽ không tăng ( gọi là điểm tới hạn) và chu trình PCR kết thúc (Saiki and Gelfand, 1989) Tùy theo bản chất của những đoạn mồi sử dụng mà có những hệ thống chỉ thị đặc trưng bao gồm STS, RADP, SSR, AFLP, SNP, cụ thể như sau:

a Chỉ thị STS (Sequence Tagged Sites) chỉ thị dựa trên phản ứng PCR, lần đầu tiên được nêu ra bởi Olson năm 1989 để nghiên cứu lập bản đồ gen ở người ngay sau khi kỹ thuật PCR ra đời ( Olson et al., 1989) Loại chỉ thị này được đưa

ra nhờ việc xác định trình tự 2 đầu mỗi đoạn của mẫu dò dùng trong RFLP phát hiện được đa hình liên kết gen, chọn một đoạn đặc hiệu để thiết kế mồi dùng cho phản ứng PCR Đây là loại chỉ thị đồng trội có thể phân biệt được gen ở trạng thái đồng hợp tử và dị hợp tử Trình tự mồi STS phát hiện sự biến ddooriowr mức allen của gen trong phân tử DNA Nhược điểm của chỉ thị STS đòi hỏi phải biết trước được một vài trình tự DNA của gen

b Chỉ thị RAPD (Radom Amplified Polymorphic DNA): Lọai chỉ thị này dựa trên phản ứng PCR, nhân bội những đoạn ADN trong hệ gen, sử dụng đoạn mồi đơn lẻ, ngẫu nhiên (radom primer) dài khoảng 9- 10 Nucleotit dưới nhiệt độ kết cặp thấp (khoảng 370C ) (Williams et al, 1990) Sản phẩm của phản ứng gồm các đoạn DNA có 2 đầu chặn biên được nhân lên bởi cùng mồi đơn nhưng ngược chiều, được phân tách bằng điện di trên gel agarose Vì vậy không phân biệt được thể dị hợp tử Đây là hạn chế của loại chỉ thị này so với chỉ thị đồng trội RFLP Mặc dù vậy chỉ thị này vẫn là công cụ hữu hiệu trong việc lập bản đồ di truyền ở những dòng nhị bội, những dòng cận phối hay các quần thể lai trở lại Lợi thế của chỉ thị này là không cần biết những thông tin về trình tự (Williams et

al, 1990) Do chỉ thị RAPD có hạn chế là độ nhạy bị phụ thuộc vào điều kiện phản ứng, đôi khi kết quả không lặp lại được, nên người ta khắc phục bằng cách

nhân dòng những băng RAPD đặc hiệu, xác định trình tự của chúng rồi thiết kế những đoạn mồi dài khoảng 20bp từ cả hai đầu va gọi là chỉ thị SCARs( Sequence- Characterized Amplified Region)

c AFLP (Amplified Fragment length Polymorphism) đây là loại chỉ thị được

sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu lập bản đồ gen và xác định chỉ thị phân tử liên kết gen Kỹ thuật tạo ra các loại chỉ thị này gọi là nhân chọn lọc những đoạn cắt giới hạn (SRFA) Phương pháp này có thể phát hiện sự có mặt của những đoạn cắt giới hạn bất kỳ (Vos et al,1995) Nguyên lý SRFA gồm 3 bước cơ bản như sau:

- Bước 1: DNA hệ gen được cắt bằng một hoặc hai loại enzyme sinh ra các mảnh cắt có một đầu là trình tự cắt hiếm và một đầu là trình tự cắt thường

- Bước 2: Nhân bội những đoạn cắt giới hạn với mồi đặc hiệu bổ sung với trình tự của bộ thích ứng và trình tự giới hạn của enzyme

- Bước 3: Điện di các sản phẩn của phản ứng PCR nhờ hệ thống chạy điện

di trên gel Thông thường 50-100 mảnh cắt giới hạn được nhân lên

Kỹ thuật AFLP có thể tạo ra số lượng chỉ thị di truyền nhiều nhất so với các kỹ thuật khác đối với mỗi tổ hợp mồi Lượng DNA tổng số tiêu tốn cho kỹ thuật này lại rất ít Đây là phương pháp có hiệu quả cả trong nghiên cứu đa dạng

di truyền và tìm chỉ thị liên kết, lập bản đồ gen

d SSR (Simple Sequence Repeates hay Microsatellite) nghiên cứu đa hình những đoạn DNA lặp lại đơn giản, đơn vị lặp 1-6 Nu Bản chất đa hình SSR được sinh ra do sự nhân bội từ DNA tổng số của hệ gen nhờ sử dụng 2 đoạn mồi chặn biên 2 đầu với trình tự của vùng lặp lại Chỉ thị được nghiên cứu lần đầu tiên trên người (Hamada and Kakunaga, 1982) Ở thực vật tần số và số lượng SSR đã được xác định trên cây rừng nhiệt đới, cây bắp cải (Lagercrantz et al, 1993), lúa mì (Roder et al, 1995) và 34 giống cây trồng khác (Morgante and Oliveri, 1993) Hiện nay nghiên cứu sàng lọc thư viện genome lúa cho thấy có khoảng 25.000 chỉ thị SSR Chỉ thị này được sử dụng nhiều trong nghiên cứu đa dạng di truyền, tìm chỉ thị liên kết và lập bản đồ gen với độ chính xác cao, đơn giản và rẻ tiền (Mc Couch et al., 2002)

e Chỉ thị SNP (Single Nucleotide Polymorphisms): chỉ thị đa hình nucleotide đơn có thể phân biệt sự khác nhau trong phân tử DNA ở mức độ từng nucleotide: A, T hoặc G trong cấu trúc di truyền giữa các cá thể hoặc NST Chỉ thị SNP được tìm ra đầu tiên ở bộ gen người, khoảng 1250bp là sàng lọc được 1

SNP ( Liu,2007) và cứ ở lúa 200- 700bp xuất hiện 1 SNP (Nasu et al.,2002) Hiện nay, ứng dụng của chỉ thị SNP đang rất phổ biến trong lĩnh vực nghiên cứu

về di truyền, lập bản đồ gen và xem xét tương quan cua các gen liên kết trên toàn

bộ genome tới các tính trạng nghiên cứu

2.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU CHỌN TẠO GIỐNG KHÁNG BỆNH BẠC LÁ

2.3.1 Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá trên thế giới

Đã có nhiều kết quả ứng dụng chỉ thị DNA thành công trong chọn tạo giống lúa Việc sử dụng chỉ thị phân tử hỗ trợ xác định cá thể nhân trong lai quy tụ, lai backcross (MABC) và sử dụng chỉ thị phân tử trong chọn lọc (MAS) giúp cho tạo giống lúa mang một hay nhiều gen kháng với vi khuẩn gây bệnh bạc lá

Tại IRRI, sử dụng MABC trong lai quy tụ đã tạo được dòng đẳng gen mang các gen kháng từ nền di truyền của giống IR24, đây là nguồn vật liệu quý để tiến hành nghiên cứu và chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá ở các quốc gia trên thế giới Gần đây, các nhà nguyên cứu thuộc IRRI cũng đã tiến hành lai quy tụ nhiều gen kháng vào cùng một giống lúa, đặc biệt như IRBB64 mang 4 gen kháng Xa4, xa5, Xa7 và Xa21, dòng IRBB63 mang các gen xa5, Xa7, xa13 (Lee et al., 2006) Tại Trung Quốc, sử dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá, đặc biệt trong chọn tạo giống lúa lai Luo et al., (2012) sử dụng phương pháp MABC trong lai quy tụ để chuyển gen kháng Xa4, Xa21, Xa27 và dòng phục hồi Mianhui725 và 9311 Kết quả tạo được dòng phục hồi mới 9311 mang gen kháng Xa27, dòng WH421, XH2431 trên nền di truyền của dòng Mianhui725 mang các gen kháng Xa4 và Xa21 Huang et al., (2012) sử dụng 10 chỉ thị liên kết trong lai tạo và chọn lọc đã quy tụ được 4 gen Xa7, Xa21, Xa22, Xa23 và dòng phục hồi Huahui1035 Kết quả đã đưa ra được một số dòng phục hồi mang gen kháng như HBQ809 và HBQ810 mang gen kháng Xa23 kháng được 11 chủng vi khuẩn bạc lá ở Trung Quốc Dòng phục hồi HBQ807, HBQ808 mang gen kháng Xa22 kháng được 6/11 chủng

Tại Hàn Quốc, tác giả Jeong et al., (2009) đã sử dụng chỉ thị SNP và STS

để khảo sát gen kháng bạc lá trong tập đoàn vật liệu trong các giống lúa thơm phục vụ cho lai tạo giống lúa thơm kháng bệnh bạc lá Kết quả cho thấy dòng lúa thơm TALLI và IRRIM46 mang gen kháng Xa4, xa5, xa13 và Xa21.dòng hyangmibyeolhos, Ir841-85-1-2 và Jasmine85 mang gen Xa1, Xa4, xa5; dòng

Yekywin Yinkya Hmwe và Khao dawk Mali 105 mang các gen Xa1, Xa4 và Xa21 Kết quả là cơ sở cho việc xây dựng các tổ hợp lai trong chương trình chọn tạp giống lúa thơm mang nhiều gen kháng bệnh bạc lá tại Hàn Quốc

Tại Ấn Độ, sử dụng chỉ thị phân tử cải tạo tính kháng bệnh bạc lá và khả năng chống đổ của giống Basmati Type 3, tác giả Rajpurohit et al., (2010) đã tiến hành chuyển gen kháng bệnh bạc lá xa13, Xa2, gen bán lùn sd-1 và giống lúa này thông qua backcross Kết quả chọn lọc kiểu gen bằng chỉ thị phân tử cùng với đánh giá kiểu hình tại thế hệ BC2F5 đã chọn lọc được dòng T3-4, T3-5, T3-6, T3-

7 mang đồng hợp tử các gen xa13, Xa21 sd-1 Tác giả Bharani et al., (2010) đã

sử dụng giống lúa có năng suất cao nhưng mẫn cảm với bệnh bạc lá đang được trồng ở Ấn Độ là ADT43 và ADT47 lai với dòng IRBB60 mang 3 gen kháng xa5, xa13 và Xa21 Bằng sử dụng chỉ thị phân tử liên kết với gen kháng trên, nhóm tác giả đã chon được 89 cá thể ở thế hệ F3 ở tổ hợp lai ADT43 x IRBB60 mang cả 3 gen kháng trên và thể hiện tính kháng tốt với 2 chủng vi khuẩn gây bệnh phổ biến ở Ấn độ trong điều kiện đánh giá nhân tạo và điều kiện đòng ruộng Tác giả Lalitha et al (2010, 2013) đã sử dụng chỉ thị phân tử trong lai quy

tụ và chọn lọc để cải tiến khả năng kháng bệnh bạc lá của giống Mahsuri và dòng

bố mẹ lúa lai PRR78, KMR3 với các gen kháng Xa4, xa5, xa13, Xa21 Kết quả đánh giá quy tụ với 16 chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá phổ biến ở Ấn Độ, các dòng mang gen đều cho khả năng kháng tốt với các chủng kháng bệnh Tác gả Yadla et al (2013) sử dụng chỉ thị phân tử trong lai backcross và chọn lọc để chuyển gen kháng bệnh bạc lá Xa21 và gen kháng đạo ôn Pi54 từ giống Mashuri vào dòng duy trì IR58025B mang cả hai gen kháng Xa21 và Pita54 Các dòng này được sử dụng vào cac tổ hợp lúa lai 3 dòng ở Ấn Độ

Tại Pakistan, Ulah et al (2012) đã sử dụng chỉ thị phân tử liên kết để kiểm tra nguồn gen kháng bệnh Xa4, xa5, Xa7 và xa13 trên 52 mẫu giống lúa Basmati bản địa và 5 mẫu giống lúa Basmati cải tiến Kết quả cho thấy hầu hết các mẫu giống bản địa và cải tiến đều chứa gen Xa7, 10 mẫu giống Basmati bản địa chứa

2 gen kháng xa5 và Xa7; Xa7 & Xa12; xa5 & xa13 Sử dụng các mẫu giống lúa bản địa chứa 2 gen lặn xa5, xa13 trong phép lai Basmati 385 và Basmati 2000 chứa 2 gen trội Xa4 và Xa7, bằng sử dụng phân tử liên kết với 4 gen kháng này cùng với việc đánh giá quy tụ khả năng kháng với các chủng vi khuẩn gây bệnh, nhóm tác giả đã chọn ra một số dòng lúa Basmati mới mang cả 4 gen kháng trên

và kháng tốt với các chủng vi khuẩn gây bệnh tại Pakistan

Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá cũng được tiến hành tại Philipine Nhóm tác giả Suh et al (2013) đã tiến hành lai chuyển gen kháng bệnh bạc lá Xa4, xa5, Xa21 từ dòng IRBB57 sang giống lúa Japonica Mangeumbye Bằng sử dụng cỉ thị phân tử chọn lọc từ các cá thể phân

ly tại thế hệ BC3F5, nhóm tác giả đã chọn được 3 dòng lúa mang cả 3 gen Xa4, xa5, Xa21 với khả năng kháng cao với 18 chủng vi khuẩn Năng suất và chất lượng, đặc điểm nông học khác của các dòng kháng mới này tương tự như dang

mẹ Mangeumbye

Tại Thái Lan, công tác chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá cũng được quan tâm nhiều đặc biệt là sử dụng chỉ thị phân tử hỗ trợ trong lai quy tụ và chọn lọc Nhóm nghiên cứu của Pinta sử dụng chỉ thị phân tử hỗ trợ trong lai quy tụ và chọn lọc thành công các dòng lúa mang đồng thời hai gen kháng đạo ôn (Pita) và gen kháng bạc lá (xa5) (Pita et al., 2013) Các phép lai kép được tiến hành từ dòng đẳng gen RD6 mag gen kháng đạo ôn với các dòng lúa của Thái Lan như P0489 và Jao Hom Nin, sau đó được lai với dòng mang gen kháng bệnh bạc lá IR62266 mang gen kháng xa5 Hỗ trợ chỉ thị phân tử trong lai quy tụ và trong chọn lọc, các nhà chọn giống đã chọn ra được dòng ở thế hệ BC2F2 2-26 mang cả gen kháng đạo ôn và kháng bạc lá xa5 Những dòng này được sử dụng làm vật liệu cho chương trình tạo giống lúa kháng bệnh ở Thái Lan

2.3.2 Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá ở Việt Nam

Nhìn chung các ống lúa hiện nay đang trồng đều có thể bị nhiễm bệnh bạc

lá nhưng ở mức độ khác nhau và tác hại cũng khác nhau Thông thường các giống lúa địa phương cũ như: Di Hương, Tám thơm nhiễm nhẹ, còn các giống nhập nội đều bị nhiễm nặng như: HT1, Q5, Bắc Thơm 7, NN8, CR203, CR101 Một số giống lúa lai như: Nhị ưu 838, Tạp giao, Thục Hưng, bị nhiễm bệnh bạc lá rất nặng

Phương pháp chọn giống kháng bệnh bạc lá phổ biến và quan trọng nhất cho đến nay là phương pháp lai hữu tính Phương pháp này tiến hành lai giữa các giống có chứa gen kháng, sau đó chọn lọc các thế hệ phân ly Bằng phương pháp này nhiều giống kháng bệnh đã được tạo ra Khả năng kháng bạc lá thường do đơn gen quy định, vì vậy việc sử dụng phương pháp lai lại để chuyển gen kháng

là rất hiệu quả Nguyên lý của phương pháp này là sử dụng một giống lúa tốt nhưng không mang gen kháng cần thiết để lai lại với một giống mang gen kháng

hữu hiệu Sau một số lần chọn lọc và lai lại liên tục, giống mới được tạo thành gần như mang toàn bộ nguồn gen tốt của cây lai lại và mang thêm được gen kháng mong muốn Trong quá trình lai lại, có thể kết hợp với tự phối, chọn lọc các dạng phân ly để đẩy nhanh quá trình tạo dòng thuần

Tại Việt Nam, nghiên cứu và ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa cũng đã được tiến hành trong những năm gần đây Viện Nghiên cứu và phát triển cây trồng thuộc Học viện Nông nghiệp Việt Nam (VNUA) đã sử dụng chỉ thị phân tử để cải tiến giống lúa thơm BT7 kháng bệnh bạc lá với gen Xa21, nhưng kết quả chưa được đánh giá cao Tại trung Tâm Bảo tồn và Phát triển Nguồn gen Cây trồng, Học viện Nông Nghiệp Việt Nam đã chọn tạo thành công giống lúa NV1 và N91 chứa gen kháng bệnh bạc lá Xa7 bằng việc sử dụng phương pháp lai truyền thống kết hợp với chỉ thị phân tử chọn lọc trong quần thể F2 Hai giống này đã được Cục Trồng trọt, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn công nhận giống Quốc gia Giống lúa T65 và T23 chứa gen Xa4, giống NV3 chứa gen Xa7 cũng chọn tạo bằng việc kết hợp giữa phương pháp truyền thống và chỉ thị phân tử, ba giống này đã được công nhận cho sản xuất thử Tại các tỉnh phía nam, Nguyen et al (2005) đã sử dụng chỉ thị RM144 liên kết với Xa4, chỉ thị RM122 liên kết với xa5 và chỉ thị RG136 liên kết với gen xa13 để chọn các dong lúa mang gen kháng bệnh bạc lá như OM2517, OM5636, OMCS2000, DS2002

Bệnh lá lúa được phát hiện lần đầu tiên ở Việt Nam sau năm 1954 trên các giống lúa địa phương cao cây, nhưng vẫn ở mức độ gây hại không nghiêm trọng Khi phong trào thâm canh phát triển, đặc biệt là việc gieo trồng các giống lúa mới chọn tạo có năng suất cao, chịu phân tốt, kết hợp với sử dụng nhiều phân bón hóa học là nguyên nhân chính gây nên bệnh bạc lá phát triển và lan tràn trong cả vụ xuân và vụ mùa miền Bắc Việt Nam

Trong ba năm 2001- 2003 nhóm nghiên cứu bệnh bạc lá ở Học viện Nông ngiệp Việt Nam đã phân lập và bảo quản được 154 isolate vi khuẩn Xoo thu thập ở 11 tỉnh miền Bắc Việt Nam trên 27 giống lúa, đã xác định một số gen hữu hiệu liên kết với chủng bạc lá ở các tỉnh miền Bắc là gen Xa4, Xa5, Xa7, Xa21 Naruto Funiya et al (2002) đã xác định được miền Bắc Việt Nam tồn tại ít nhất 10 chủng vi khuẩn Xoo

Năm 2005, Phan Hữu Tôn và cs đã ứng dụng kỹ thuật PCR phát hiện 4 gen kháng bệnh bạc lá từ 500 mẫu giống địa phương Việt Nam và thu được: 56 mẫu giống chứa gen Xa4, 36 mẫu giống chứa gen xa5, 16 mẫu giống chứa gen Xa7 và không có mẫu giống chứa gen Xa21

Phan Hữu Tôn và cs (2001) đã dùng PCR để chọn lọc gen kháng và kết hợp với nuôi cấy bao phấn, kết quả đã chọn ra được một số giống kháng bệnh tốt như: SS-2; 10091; 10119 đồng thời nhóm tác giả từ năm 2001- 2002 đã thu thập được 385 mẫu lá bệnh từ 28 giống lúa trồng ở 11 tỉnh thành thuộc hệ thống sông Hồng, sông Lô, sông Gấm Bằng phương pháp nuôi cấy đơn tế bào kết hợp với kỹ thuật PCR đã phân lập 10 chủng vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae

từ 154 isolate và xác định được chúng thuộc 10 chủng vi khuẩn gây bệnh khác nhau đánh số từ 1-10 Trong đó chủng 2 gồm 3 chủng phụ là 2A, 2A’và 2B , chủng 3 bao gồm 3 chủng phụ 3A, 3A’và 3B, chủng 5 gồm 5A, 5B , chủng 7 gồm chủng 7A, 7A’ (Phan Hữu Tôn và cs., 2005)

PHẦN 3 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

- 136 mẫu giống lúa địa phương thu thập được lưu trữ tại Trung tâm Bảo tồn và Phát triển Nguồn gen Cây trồng - Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Bảng 3.1 Danh sách các giống lúa địa phương sử dụng trong nghiên cứu

TT Tên Giống TT Tên giống

7 Lúa sẻ 75 Kháu cẩm pưng

8 Nam vàng 76 Bông tranh

9 Nếp cá rô 77 Nếp nương (Sơn La)

15 Nếp non tre 83 Nếp nhung

16 Nếp quan 84 Nếp lang liêu

34 Nếp ruồi 85 Nếp cau

35 Nha trang 86 Nếp quả vải

36 Chiêm 3 87 Chanh Sơn Tây

TT Tên Giống TT Tên giống

48 Đèo đàng 99 Chiêm mộc

49 Nếp râu 100 Nàng soi

50 Nếp lốc nương 101 Lúa ba lá

51 Nếp hạt mây 102 Lúa râu

52 Khẩu tan pỏm 103 Lúa cát

53 Khẩu tan hang 104 Ngô Gia

54 Bao thai 105 Blau Dang

17 Nếp rằn 106 Chiêm bầu

18 Dàng chiêm 107 Lúa nung

19 Lúa ma 108 Lúa cáy

20 Nếp chín sớm 109 Lúa lau

21 Lúa nếp Tăng Sản 110 Khẩu tan nương

22 Lúa nếp, Pelệnh 111 Vũ di

23 Nếp pelạnh (2) 112 Khẩu dao

24 Lúa nếp bông tròn 113 Pude

25 Nếp, Khẩu bông tròn 114 Lúa rồng

- 10 chủng bạc lá đã phân lập, được bảo quản tại phòng thí nghiệm Bộ môn Sinh học phân tử và Công nghệ sinh học ứng dụng, Khoa Công nghệ Sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Bảng 3.2 Danh sách 10 chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá

STT Chủng Ký hiệu Phân lập từ giống Địa điểm thu thập

1 Race 1 HUA 01043 TN 13-4 Sóc Sơn, Hà Nội

2 Race 2 HUA 0020131-1 Khang Dân Đông Triều, Quảng Ninh

3 Race 3 HUA 0020131-2 Khang Dân Đông Triều, Quảng Ninh

4 Race 4 HUA 020361 Nếp Tân Thuận Châu, Sơn La

5 Race 5 HUA 02012 Tẻ thơm Đông Anh, Hà Nội

6 Race 6 HUA 010081 Bắc Thơm7 An Lộc, Hải Dương

7 Race 7 HUA 020020-2 Nếp 87 Xuân Trường, Nam Định

8 Race 8 HUA 020083 Bắc Thơm 7 Quỳnh Lưu, Nghệ An

9 Race 9 HUA 020020-1 Nếp 87 Xuân Trường, Nam Định

10 Race 10 HUA 020131-3 Khang Dân Diễn Châu, Nghệ An

- Các giống lúa BT7, KD18, IR24, IRBB4, IRBB5, IRBB7 sử dụng làm giống đối chứng

- Các chỉ thị phát hiện gen kháng bệnh bạc lá Xa4, xa5 và Xa7 thông tin được tổng hợp ở bảng 3.3

Bảng 3.3 Chỉ thị phát hiện gen kháng bệnh bạc lá Xa4, xa5, Xa7

Xa4 Npb181 11

F: ATCGATCGATCTTCACGAGG R: GTGCTATAA AAGGCATTCGGG

Yoshimura

et al , 1992

xa5 RM122 5 F: GAG CGATGTAATGTCATCAGTGC

R:GGAAGGAGG TATCCG CTTTGTTGGAC

Blair and

Mc Couch,

1997 Xa7 P3 6 F: CAG CAA TTC ACT GGA GTA GTG GTT

3.2 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

- Địa điểm: Tại bộ môn Sinh học phân tử và Công nghệ sinh học ứng dụng và Khu thí nghiệm Trung tâm Bảo tồn và Phát triển Nguồn gen Cây trồng, Học viện Nông nghiệp Việt Nam

- Thời gian nghiên cứu : Từ tháng 1/2016 đến tháng 7/2016

3.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Nội dung 1: Sử dụng chỉ thị phân tử DNA phát hiện gen kháng bạc lá hữu hiệu Xa4, xa5, Xa7

Nội dung 2: Đánh giá khả năng kháng bệnh bạc lá bằng lây nhiễm nhân tạo với 10 chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá

Nội dung 3: Phân loại giống (Phân loại loài phụ, phân loại nếp, tẻ), đánh giá đặc điểm nông sinh học, các yếu tố cấu thành năng suất và chất lượng gạo 3.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.4.1 Sử dụng chỉ thị phân tử DNA phát hiện các gen kháng bệnh bạc lá 3.4.1.1 Quy trình tách chiết DNA

- Thành phần đệm chiết DNA được tổng hợp ở bảng 3.4

Bảng 3.4 Thành phần của dung dịch chiết tách DNA

Thành phần Nồng độ dung

dịch bố mẹ

Nồng độ dung dịch làm việc

Hỗn hợp 50ml dung dịch tách chiết Tris-HCl, PH=8,0 1M 50mM 2,5

EDTA 0,5M 0,25mM 2,5

- Thành phần đệm TE pha loãng và bảo quản DNA được tổng hợp tại bảng 3.5

Bảng 3.5 Thành phần dung dịch TE để bảo quản DNA

Thành phần Nồng độ dung dịch mẹ Nồng độ dung

dịch làm việc V = 50ml Tris- HCl 1M 10 mM 0,5ml

- Quy trình tách chiết DNA: theo phương pháp của Zheng và cs (2003) có cải tiến

+ Thu lá non, thường lấy lá vào sáng sớm, cho vào ống nghiệm và ghi tên + Cắt 0,5g lá thành các mẩu nhỏ bằng kéo vô trùng vào trong cối sứ đã được khử trùng đặt trên đá lạnh

+ Cho vào cối 400µl dung đệm chiết tách DNA và nghiền nát cho đến khi dung dịch chuyển thành màu xanh, đây là quá trình phá vỡ tế bào lúa

+ Thêm 400µl đệm chiết vào cối rồi chuyển vào ống eppendoff đã được đánh dấu ghi tên sẵn từng giống

+ Thêm 700µl dung dịch Chloroform: phenol: isoalcolhol (25:24:1) ly tâm

+ Chu kỳ nhiệt nhân phản ứng PCR:

- PCR của gen Xa4 và Xa 7 được thực hiện theo chu kì nhiệt như sau: 94ºC trong 4 phút, 34 chu kỳ: 94ºC trong 1 phút, 56ºC trong 1 phút, 72º trong 2 phút,

và 72 º C trong 7 phút

- PCR của gen xa5 được thực hiện theo chu kì nhiệt: 94ºC trong 4 phút, 34 chu kỳ: 94ºC trong 1 phút, 55ºC trong 1 phút, 72º trong 1 phút 50 giây, và 72 º C trong 7 phút

+ Sản phẩm PCR điện di trên gel agarose 2% Bản gel được nhuộm bằng ethidium bromide và chụp ảnh dưới tia UV

3.4.2 Đánh giá khả năng kháng bệnh bạc lá bằng lây nhiễm nhân tạo

- Sử dụng 10 chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá đang tồn tại ở miền Bắc, Việt Nam, được bảo quản tại phòng thí nghiệm Bộ môn Sinh học Phân tử và Công nghệ Sinh học Ứng dụng, Khoa Công nghệ Sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam

- Nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường Wakimoto

+ Thành phần môi trường bao gồm trong 1000ml: Khoai tây 300g, Ca(NO3)2.H2O: 0,5g; Na2HPO4.H2O: 2,0g; Pepton: 5,0g; Saccarose :15g; Agar:17g, PH: 6,8-7,0

+ Cách nấu: Khoai tây gọt vỏ, rửa sạch bằng nước cất, thái mỏng đổ 50ml nước cất vào, đun sôi trong 30 phút Sau đó lọc lấy dịch chiết khoai tây, thêm nước cất cho đủ 1000ml Cân hóa chất còn lại lần lượt đổ vào dung dịch, vừa đổ vừa khuấy đều cho tan hết Sau khi đun xong đổ môi trường vào ống nghiệm đặt nghiêng, đem hấp khử trùng Sau 4-8h môi trường đông lại, tiến hành cấy vi khuẩn

+ Dung dịch lây nhiễm đạt nồng độ từ 108- 109 vi khuẩn/ml

+ Tiến hành lây nhiễm nhân tạo: theo phương pháp Taura (2004) Lây nhiễm bằng cách cắt đầu lá lúa khi lúa bắt đầu có đòng Cắt sâu 3-5cm, cắt 10 lá Lây nhiễm mỗi giống 10 cây đeo thẻ

+ Đánh giá bệnh: đo chiều dài vết bệnh sau 18 ngày lây nhiễm, chia ra

<8cm: Kháng bệnh (R); 8-12cm : Nhiễm vừa (M); >12cm : Nhiễm nặng (S) 3.4.3 Phân loại loài phụ, nếp tẻ, đặc điểm nông sinh học năng suất

3.4.3.1 Phân loại loài phụ, phân loại nhóm giống

- Phân loại nếp, tẻ: Thông qua phản ứng của tinh bột với dung dịch KI, cắt ngang 05 hạt gạo lật cho vào dung dịch KI, sau đó quan sát sự thay đổi màu của tinh bột Nếu tinh bột đổi màu xanh đen thì đó là giống tẻ, tinh bột đổi màu nâu

đỏ thì là giống nếp

- Phân loại các mẫu giống lúa thuộc loài phụ, phương pháp nhuộm phenol (theo IRRI) Cách tiến hành: lần lượt cho 10 hạt thóc của mỗi giống lúa vào ống nghiệm, đổ phenol vào mỗi ống nghiệm, sau 12 giờ thì quan sát:

+ Hạt thóc không bắt màu: có nguồn gốc Japonica

+ Hạt thóc có màu nâu đậm: có nguồn gốc Indica

3.4.3.2 Đánh giá đặc điểm nông sinh học

- Thiết kế thí nghiệm:

+ Thí nghiệm được bố trí theo từng ô, mỗi ô 1 giống được bố trí tuần tự không nhắc lại, mỗi ô cấy 5m2;

+ Khoảng cách hàng cách hàng 20cm, cây cách cây 12cm, cấy 1 dảnh

- Chăm sóc bón phân: Lượng phân bón sử dụng ch 1 ha 120kgN +90kg

+ Số nhánh tối đa: Theo dõi vào giai đoạn đẻ nhánh

+ Số nhánh hữu hiệu: Là số nhánh thành bông, theo dõi giai đoạn trỗ + Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất: Theo dõi các chỉ tiêu

 Số bông hữu hiệu/khóm: bông có 10 hạt chắc trên bông

 Số hạt /bông

 Tỷ lệ chắc = số hạt chắc/ tổng số hạt/bông

 Khối lượng 1000 hạt