thiết kế cấu trúc crisprcas9 và sử dụng tạo đột biến gen alcohol dehydrogenase trên cà chua

Như vậy, hệ thống CRISPR/Cas9 đã tạo được những đột biến mới trên vùng gen Alcohol dehydrogenase, cung cấp cơ sở cho những ứng dụng tiềm năng của công cụ chỉnh sửa gen sau này, không chỉ

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tôi xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ rõ nguồn gốc

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2016

Tác giả luận văn

Lê Thị Hoa

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, ngoài sự nỗ lực phấn đấu của bản thân, tôi còn nhận được rất nhiều sự hướng dẫn, sự giúp đỡ tận tình của rất nhiều các cá nhân, tập thể và các đơn vị

Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn tới cô giáo TS Nguyễn Thị Thanh Thủy - Vụ Trưởng vụ Khoa học Công nghệ và thầy TS Đồng Huy Giới – Trưởng bộ môn Sinh học đã dành nhiều thời gian, tâm huyết, chỉ bảo, hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS Roland Schaftleitner – Trưởng bộ môn Chọn giống phân tử-AVRDC đã trao cho tôi cơ hội quý giá được học tập và nghiên cứu tại Trung tâm Rau màu Thế giới - Đài Loan, người đã kiên nhẫn chỉ dạy và tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian tôi học tập tại Đài Loan Tôi xin cảm ơn các đồng nghiệp tại trung tâm rau màu thế giới đã luôn động viên ủng hộ giúp tôi hoàn thiện luận văn này

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Trung tâm Tài nguyên thực vật đã tạo cơ hội để tôi được tiếp cận với hướng nghiên cứu và tích lũy được những kinh nghiệm, kiến thức để

có được kết quả này Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy giáo, cô giáo học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình dạy bảo tôi trong suốt thời gian qua

Lời cuối, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới những người thân trong gia đình đã luôn ở bên tôi, chăm sóc, động viên tôi và toàn thể bạn bè đồng nghiệp đã giúp đỡ tôi

Mặc dù tôi đã có nhiều cố gắng hoàn thiện luận văn bằng tất cả sự nhiệt tình và năng lực của mình, tuy nhiên không thể tránh khỏi những thiếu sót, rất mong nhận được những đóng góp quý báu của quý thầy cô và các bạn

Tôi xin trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2016

Tác giả luận văn

Lê Thị Hoa

MỤC LỤC

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục chữ viết tắt v

Danh mục bảng vi

Danh mục hình vii

Trích yếu luận văn ix

Thesis abstract x

Phần 1 Mở đầu 1

1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1

1.2 Giả thuyết khoa học 2

1.3 Mục tiêu nghiên cứu 2

1.4 Phạm vi nghiên cứu 3

1.5 Ý nghĩa khoa học 3

Phần 2 Tổng quan tài liệu 4

2.1 Chọn giống cây trồng 4

2.1.1 Chọn giống bằng phương pháp lai 4

2.1.2 Chọn giống bằng phương pháp đột biến 5

2.1.3 Cây trồng chuyển gen 6

2.2 Công nghệ chỉnh sửa hệ gen (genome-editing) 7

2.2.1 Công cụ Zinc finger nucleases (ZFNs) 7

2.2.2 Công cụ Transcription activator-like effector nucleases (TALENs) 8

2.2.3 Công cụ CRISPR/Cas9 10

2.3 Công nghệ chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 10

2.3.1 Sự ra đời của CRISPR/Cas 10

2.3.2 Cấu trúc của hệ thống CRISPR/Cas 12

2.3.3 Cơ chế hoạt động của hệ thống Crispr/cas9 14

2.3.4 Thành tựu nghiên cứu về hệ thống CRISPR/Cas9 15

2.4 Gen alcohol dehydrogenase (AHD)trên cây cà chua 16

2.5 Tiềm năng nghiên cứu tạo đột biến cripsr cas9 trên cà chua 17

Phần 3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 19

3.1 Địa điểm, thời gian nghiên cứu 19

3.2 Đối tượng/vật liệu nghiên cứu 19

3.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 19

3.3.1 Thiết kế gRNA 19

3.3.2 Thiết kế vector tái tổ hợp CRISPR cas9 20

3.3.3 Biến nạp vector tái tổ hợp chứa hệ thống CRISPR/Cas9 vào vi khuẩn A tumefaciens bằng sốc nhiệt (Van Eck, Conlin et al., 2007) 22

3.3.4 Chuyển cấu trúc CRISPR/cas9 vào cà chua thông qua A tumefaciens 24

3.3.5 Xác định đột biến tạo bởi cấu trúc CRISPR/cas9 27

Phần 4 Kết quả và thảo luận 30

4.1 Kết quả 30

4.1.1 Thiết kế gRNA đặc hiệu cho 2 gen mục tiêu ADH2-4 và ADH2-6 30

4.1.2 Thiết kế vector tái tổ hợp CRISPR/Cas9 33

4.1.3 Biến nạp vector tái tổ hợp chứa hệ thống CRISPR/Cas9 vào vi khuẩn A tumefaciens (GV3101::pMP90) 36

4.1.4 Kết quả chuyển cấu trúc CRISPR/Cas9 vào cà chua 38

4.1.5 Khảo sát đột biến trên cây chuyển gen 41

4.2 Thảo luận 49

Phần 5 Kết luận và kiến nghị 52

5.1 Kết luận 52

5.2 Kiến nghị 52

Tài liệu tham khảo 53

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt

CRISPR/Cas9 Clustered regularly interspaced short

palindormic repeat/Cas9

Trình tự sắp xếp kiểu lặp lại ngắn xen lẫn khoảng trống ZFN Zinc finger nucleases

GMO Genetically Modified Organisms Cây chuyển gen

ODM Oligonucleotide directed mutagenesis Oligonucleotide gây đột biến gRNA guideRNA RNA dẫn đường

ADH Alcohol dehydrogenase Gen alcohol dehydrogenase TALENs Transcription activator-like effector

tiếp DSB Double-strand break Phá vỡ sợi kép

EEN Enzyme endonucleases (EENs

RNAi RNA interference Can thiệp RNA

PAM Protospacer-Adjacent Motif Dạng trình tự liền kề

tracrRNA Trans-activating crRNA Tiền RNA hoạt động

sgRNA Single-guideRNA RNA dẫn đường đơn

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Các trình tự PAM ứng với mỗi biến thể enzyme Cas9 13

Bảng 4.1 Danh sách guideRNA thiết kế cho gen ADH2-6 31

Bảng 4.2 gRNA và enzyme cắt giới hạn cho gen ADH2-4 và ADH2-6 32

Bảng 4.3 Mồi thiết kế khuếch đại vùng gen đích 33

Bảng 4.4 Số khuẩn lạc/1 đĩa môi trường ở các nồng độ Kanamycine 35

Bảng 4.5 Kết quả chuyển cấu trúc CRISPR/Cas9 vào cà chua 39

Bảng 4.6 Danh sách các mẫu mang đột biến của ADH2-4 43

Bảng 4.7 Danh sách các mẫu mang đột biến cấu trúc ADH2-6 48

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Cấu trúc Zinc finger nucleases và cơ chế sửa chữa qua trung gian 8

Hình 2.2 Cấu trúc của Zinc finger nucleases (ZFNs) và Transcription activator-like effector nucleases (TALENs) 9

Hình 2.3 a)một locus CRISPR trong nhiễm sắc thể vi khuẩn với đặc trưng đoạn lặp-khoảng trống b) Vi khuẩn có thể nhận biết trình tự PAM ở bên trong virus/plasmid và hợp nhất nucleic acid ngoại lai 11

Hình 2.4 Cấu trúc của hệ thống CRISPR/Cas9 13

Hình 2.5 Mô tả 2 cơ chế sửa chữa mạch kép khi bị cắt bởi enzyme Cas9 14

Hình 2.6 Biểu đồ các công bố khoa học của CRISPR/Cas9 theo từng năm 15

Hình 2.7 Cơ chế xúc tác của enzyme ADH 17

Hình 3.1 Giao diện chương trình CCTop để thiết kế gRNA 20

Hình 3.2 Sơ đồ vector pKSE401 20

Hình 3.3 Minh họa gRNA trên gen mục tiêu 27

Hình 4.1 Giao diện chương trình Cas9 Designer khi thiết kế gRNA 31

Hình 4.2 Xác định gRNA đặc hiệu gen ADH2-4 32

Hình 4.3 Vị trí của guideRNA và mồi PCR của gen ADH2-6 32

Hình 4.4 Cấu trúc của vector pCAMBIA và pKSE401 34

Hình 4.5 Vector pKSE401 trước và sau khi biến nạp gRNA 35

Hình 4.6 Kiểm tra vector tái tổ hợp trên môi trường chọn lọc kanamycine ở nồng độ 25, 50 và 100 mg/l trên gel agarose 1% a) cấu trúc ADH2-4 b) cấu trúc ADH2-6 36

Hình 4.7 Cấy chang vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 37

Hình 4.8 Kết quả kiểm tra plasmid tách từ vi khuẩn A tumefaciens sau khi biến nạp 37

Hình 4.9 Các chồi tái sinh có sức sống kém 38

Hình 4.10 Quy trình biến nạp và tái sinh 2 cấu trúc ADH2-4 và ADH2-6 ở cà chua CLN1621 thông qua vi khuẩn A tumefaciens 40

Hình 4.11 Kiểm tra chất lượng DNA trên gel agarose1% 41

Hình 4.12a Minh họa hoạt động enzyme cắt giới hạn trên gen đích 42

Hình 4.13 Kiểm tra đột biến gen ADH2-4 bằng enzyme cắt giới hạn 42

Hình 4.14 Trình tự các đột biến mất nu trên gen ADH2-4 44

Hình 4.15 Trình tự các đột biến chèn nu trên gen ADH2-4 44

Hình 4.16 Dự đoán thay đổi trình tự amino acid của gen ADH2-4 45

Hình 4.17 Các mẫu cà chua mang đột biến gen ADH2-4 45

Hình 4.18 Minh họa các phương pháp khảo sát đột biến 46

Hình 4.19 Kết quả PCR sử dụng mồi đặc hiệu trên gen ADH2-6 46

Hình 4.20 Kết quả cắt bằng enzyme cắt giới hạn AflII 47

Hình 4.21 Kết quả giải trình tự mẫu đột biến gen ADH2-6 47

Hình 4.22 Kết quả PCR và cây của số 43 cấu trúc ADH2-6 48

Hình 4.23 Dự đoán thay đổi trình tự amino acid ở cấu trúc ADH2-6 49

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN

Hệ thống CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindormic Repeat) cas9 là một công nghệ mới trong lĩnh vực sửa chữa hệ gen Nghiên cứu này đã thử nghiệm thành công hệ thống CRIPSR/Cas9 cảm ứng gây đột biến 2 gen mục tiêu thuộc

họ Alcohol dehydrogenase của cà chua Hai guideRNA (gRNA) được thiết kế bổ sung với trình tự gen đích để đưa enzyme Cas9 tới chính xác vị trí mong muốn để chỉnh sửa

Cơ chế tự sửa chữa của tế bào sẽ đưa ra các phương án khôi phục lại những sai hỏng do enzyme cas9 gây ra tạo ra những đột biến tại gen mục tiêu Hệ thống CRISPR/Cas9 được thiết kế cho 2 gen ADH trên nhiễm sắc thể thứ 4 và nhiễm sắc thể thứ 6 của hệ gen

cà chua Hai cấu trúc tương ứng với 2 gen sẽ được chuyển nạp vào cà chua dòng CLN1621 (AVRDC) Sau khi sàng lọc bởi kháng sinh kanamycine, 132 chồi được tái sinh từ 1844 mẫu lá Trong số đó, các đột biến xác định được là đột biến mất nu: phổ biến từ 1 đến 4 nu, đặc biệt có một đột biến mất 55 nu, chèn và đột biến thay thế một nucleotid Kết quả là 08 cây tái sinh mang đột biến được tiếp tục trồng trong nhà lưới để thu hạt, đánh giá khả năng di truyền của đột biến tạo bởi hệ thống CRIPSR/Cas9 Như vậy, hệ thống CRISPR/Cas9 đã tạo được những đột biến mới trên vùng gen Alcohol dehydrogenase, cung cấp cơ sở cho những ứng dụng tiềm năng của công cụ chỉnh sửa gen sau này, không chỉ ở cà chua mà còn nhiều giống cây trồng khác

THESIS ABTRACT

CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat) cas9 system

is a novel techique for genome editing In this thesis, a start-up attempt using CRISPR Cas9 to induce site-specific mutation in tomato has been made on one model gene alcohol dehydrogenase (ADH) By this means, two guideRNA sequence targets in two specific sites of interest have been created, and constructed into a vector containing a Cas9-expression cassette Constructs targeting Cas9 to two different loci in two target genes (alcohol dehydrogenase) were transformed into AVRDC tomato line CLN1621 After kanamycine screening selection, 132 transformed shoots were regenerated from 1,844 co-cultured explants Among them, the induced mutations were recorded as deletions comonly ranging from1 to 4 base pairs and distint one of 55 base pairs, inserts

of 1 nucleotide base and single base subtitution For the further heritability confirmation research, 8 mutant plants are currently grown in the transgenic greenhouse for seed production In conclusion, The CRISPR/Cas9 platform for creating new mutations in multiple targeted genome regions of alcohol dehydrogenase model gene (ADH) was established in the research Further researches on stability and heritability of CRISPR Cas9 induced mutants and mutation expressions on tomato should be esteblsihed to confirm the application of this technology in tomato and plant breeding

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Cà chua là cây rau có giá trị dinh dưỡng và giá trị y học cao Vì vậy, khi cây

cà chua du nhập vào nước ta, nó đã được ưa chuộng và sử dụng rộng rãi, trở thành cây có giá trị kinh tế cao Do đó, công tác chọn tạo giống cà chua cũng được tiến hành từ lâu và đã đạt được những thành tựu đáng khích lệ (Foolad 2007) Nhiều phương pháp giúp tăng năng suất cũng như chất lượng của sản phẩm, ngoài ra còn có thể giảm tác động đến môi trường bởi hạn chế nhiều thuốc trừ sâu và thuốc bảo vệ thực vật trong quá trình chăm bón Tuy nhiên, các phương pháp chọn giống lai hay tạo đột biến bằng tia X, hóa chất (Lehrman, Chatzopoulou et al., 2014) thường gặp khó khăn do các đột biến là ngẫu nhiên không định hướng được tính trạng đích, đôi khi còn tạo ra những đột biến có hại cho cây trồng

Công nghệ chỉnh sửa gen ngày nay được coi là tương lai của cây trồng thế

hệ mới đánh dấu bằng sự ra đời của những phương pháp zinc finger nuclease (ZFN) và phương pháp gây đột biến trực tiếp trên oligonucleotide - oligonucleotide directed mutagenesis (ODM) (Parisi et al., 2011) Hai phương pháp này có thể gây ra đột biến tại những vị trí xác định trước trên hệ gen của cây trồng Từ đó, các đột biến được tạo ra có ý nghĩa to lớn trong chọn giống Tuy nhiên, bộ máy hoạt động của hai phương pháp này còn cồng kềnh dẫn đến

dù đạt hiệu quả cao nhưng tính ứng dụng thực tiễn còn hạn chế Đến năm 2011, Lusser và cộng sự đã công bố nghiên cứu về một kĩ thuật mới gây đột biến tại

vị trí xác định – CRISPR/Cas9 (Clustered regularly interspaced short palindromic repeat-cas9) với bộ máy hoạt động tối giản hơn rất nhiều Sự kiện này đã tạo ra bước đột phá trong công nghệ chuyển gen, giúp giảm 99% chi phí dành cho công nghệ di truyền và thời gian rút ngắn từ 1 năm xuống một vài tuần Đặc biệt là có thể thực hiện ở hầu hết các phòng thí nghiệm cơ bản Kĩ thuật mới CRISPR/Cas9 được nâng cao hơn so với phương pháp ZFN là nhờ vào thiết kế guideRNA (gRNA) đơn giản với 20bp bắt cặp bổ sung với gen đích, đưa enzyme cas9 tới chính xác vị trí mong muốn và tiến hành chỉnh sửa gen (Cong et al., 2013; Yang et al., 2013)

Với công cụ mới này, cho đến nay, nhiều loại cây trồng đã được thử nghiệm

để tạo đột biến có chủ đích như lúa gạo (Liu et al., 2012), lúa mì (Cheng et al., 2014), khoai tây (Sawai et al., 2014), cà chua (Starker et al., 2014) Trong đó, cà chua (Solanum lycopersicum) là một lựa chọn thích hợp cho nghiên cứu thử nghiệm tạo đột biến mong đợi vì những lý do sau: là một trong những cây trồng quan trọng trong sản xuất nông nghiệp, là đại diện cho cây 2 lá mầm mang bộ gen lưỡng bội (Kirk et al., 2006) và hệ gen đã được công bố trình tự rõ ràng (Tomato Genome 2012) Ứng dụng kỹ thuật CRISPR/Cas9 cải tiến hệ gen cà chua hứa hẹn sẽ là một hướng đi đầy tiềm năng, tiết kiệm đáng kể thời gian và công sức để chọn tạo giống đột biến mới dựa trên cơ sở chỉnh sửa những đặc điểm tính trạng chưa hoàn hảo của thế hệ giống trước

Để kiểm tra hiệu quả hoạt động của CRISPR/Cas9 trên cà chua, chúng tôi lựa chọn gen Alcohol dehydrogenase (ADH), là một họ gen lớn và có vai trò quan trọng trong nhiều loài sinh vật Ở thực vật, gen mã hóa cho enzyme ADH, đảm bảo cung cấp lượng NAD+ cho cơ thể sinh vật Biểu hiện của các gen này tác động đến sự đáp ứng mất nước, nhiệt độ và nồng độ axit absocisis nội bào, đóng vai trò quan trọng trong quá phát triển cây con, phấn hoa và đặc biệt trong quá trình chín của quả ADH còn được coi là gen lý tưởng để nghiên cứu do kích thước nhỏ thuận lợi để nghiên cứu chức năng: chỉ 2-3kb với xấp xỉ 1000 trình tự

là nucleotid coding và có số bản sao chép gen nhỏ (Thompson, Fernandes et al., 2010) Đặc biệt, trong cà chua, tăng giảm biểu hiện của gen ADH2 cho thấy có tác động đến mùi vị của cà chua chín cụ thể là đến các thành phần volatile tạo mùi vị (Speirs et al., 1998) Hai gen thuộc họ gen ADH nằm tại nhiễm sắc thể số

4 và nhiễm sắc thể số 6, có chức năng bổ sung cho nhau Vì vậy, khi CRISPR/Cas9 gây ra những thay đổi trên gen làm biến mất chức năng thì cũng không ảnh hưởng đến sự sinh tồn của cây (Brooks et al., 2014)

Xuất phát từ những cơ sở trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài nghiên cứu: “Thiết kế cấu trúc CRISPR/Cas9 và sử dụng tạo đột biến gen Alcohol dehydrogenase trên cà chua”

1.2 GIẢ THUYẾT KHOA HỌC

Hệ thống CRISPR/Cas9 có khả năng chỉnh sửa thông tin di truyền trên gen mục tiêu Alcohol dehydrogenase

1.3 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Thiết kế được các cấu trúc CRISPR/Cas9 gây đột biến hiệu quả trên 2 gen ADH2-4 và ADH2-6 ở cà chua

1.4 PHẠM VI NGHIÊN CỨU

Nghiên cứu được tiến hành trên quy mô nghiên cứu phòng thí nghiệm nuôi cấy mô và sinh học phân tử tại AVRDC, trên đối tượng vật liệu là dòng cà chua AVRDC …, các dòng vi khuẩn E Coli và A tumefaciens liên quan đến biến nạp thực vật

1.5 Ý NGHĨA KHOA HỌC

Hệ thống CRISPR/Cas9 đã được thiết kế và thử nghiệm thành công trên cà chua đã chứng minh tính hiệu quả trong chỉnh sửa genome của hệ thống Kết quả của nghiên cứu là cơ sở khoa học thực tiễn để áp dụng công cụ mới này trong công cuộc cải cách hệ gen cây trồng thế hệ mới

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 CHỌN GIỐNG CÂY TRỒNG

Chọn giống thực vật là hoạt động nông nghiệp lâu đời nhất, song song với sự phát triển của xã hội loài người Bắt đầu từ xã hội nguyên thủy, nông nghiệp chủ yếu là săn bắt, hái lượm từ khoảng 11.000 năm trước đây, cho đến khi biết trồng trọt và chăn nuôi, con người dần dần can thiệp vào sự tiến hóa làm thay đổi cấu trúc di truyền của thực vật để thỏa mãn nhu cầu của mình Bắt đầu bằng chọn lọc những cá thể phù hợp cho sự tiến hóa, chọn lọc nhân tạo đối với những tính trạng mong muốn, như hạt và quả to, thời gian sinh trưởng ngắn, thấp cây Đến cuối thế kỉ 18, nhờ những nỗ lực không ngừng nghỉ của mình, con người đã thuần hóa được hơn 10.000 loài thực vật, trong đó, có khoảng 100-200 loài là cây trồng chủ lực cung cấp lương thực và thức ăn cho con người như lúa gạo, lá mì, ngô, khoai tây, khoai lang, dừa, chuối…Ngoài ra một số loại cây trồng còn phục vụ cho nhu cầu y tế và thẩm mỹ Để có được năng suất cao hơn, chất lượng tốt hơn, nhiều phương pháp khoa học đã và đang được áp dụng trong nhân giống cây trồng như lai, gây đột biến và biến đổi hệ gen của cây trồng Thông qua những công nghệ mới, nhiều cây trồng mang đặc tính ưu việt được tạo ra đem lại lợi ích to lớn về giá trị sử dụng cũng như giá trị kinh tế

2.1.1 Chọn giống bằng phương pháp lai

Phương pháp lai tạo được sử dụng từ rất lâu đời trong chọn giống Vào những ngày đầu, lai tạo xảy ra tự nhiên giữa hai cá thể có các tính trạng mong muốn như quả, hạt lớn, có hương vị ngon hoặc năng suất cao Sau đó, con người mới quan sát thấy sự khác biệt hoa cái và hoa đực nhận ra rằng đời sau mang những đặc điểm vượt trội so với bố mẹ có thể được tạo ra nhờ giao phối nhân tạo hoặc thụ phấn chéo Thông qua phương pháp lai nhân tạo, các nhà chọn giống kết hợp được nhiều tính trạng tốt trong cá thể lai hoặc trong nhiều thế hệ lai Một trong những ứng dụng thành công nhất của phương pháp lai tạo là ưu thế lai, một hiện tượng mà thế hệ F1 thường vượt trội hơn hẳn về kích thước và đặc điểm sinh trưởng so với bố mẹ (Dirks et al., 2009) Nhiều loại cây ăn quả và rau màu được tạo ra nhờ phương pháp lai và chọn lọc như dâu tây (Fragaria x ananassa), táo (malus x domestica), cam đường (Citrus sinensis), cà chua (solanum

lycopersicum) và bí (Cucurbita maxima)… Các ứng dụng khác của phương pháp lai tạo ra những trái cây không hạt như dưa hấu khi lai cây nhị bội và cây tứ bội Tuy nhiên, chọn giống bằng phương pháp lai tạo cũng có những hạn chế nhất định Thứ nhất, chỉ tiến hành lai tạo giữa những cá thể cùng loài (lai gần) Thứ hai, khi tiến hành lai tạo chọn lọc được những tính trạng tốt lại đi kèm với một số tính trạng không mong muốn có thể dẫn đến mẫn cảm đối với bệnh cây hoặc tác nhân nào đó từ môi trường Do mối liên hệ chặt chẽ từ các gen, cần phải lai tạo rất nhiều thế hệ mới có thể loại bỏ được các gen không mong muốn Thứ ba, khả năng sinh sản của nhiều loài thân gỗ như táo, óc chó có thể mất 20 hoặc 30 năm

để chọn lọc những tính trạng mong muốn trong một cá thể duy nhất, điều này đòi hỏi một lượng lớn nguồn lực vật liệu và lao động

2.1.2 Chọn giống bằng phương pháp đột biến

Trong quá trình tiến hóa của cây trồng, các đột biến tự phát sinh với các đặc điểm mới đôi khi được bảo tồn và duy trì cho các thế hệ sau Sử dụng các nguồn đột biến trong tự nhiên tiêu biểu như đột biến lùn ở cây ngũ cốc mang lại năng suất được nâng cao rõ rệt gọi là “cách mạng xanh” (Peng, Richards et al., 1999) Các giống cây trồng mới được lựa chọn từ các đột biến tự nhiên đặc biệt hiệu quả ở cây lâu năm, ví dụ như táo Fuji đỏ(Ban, Honda et al., 2007) Phương pháp này bắt nguồn từ những món quà mà thiên nhiêu ưu ái dành tặng cho con người cho đến nay vẫn được sử dụng rộng rãi Tuy nhiên, phương pháp này cũng có nhiều điểm thiếu sót, hầu hết các đột biến này không di truyền và có thể đảo lại kiểu hình gốc, tần số đột biến trong tự nhiên không cao Có thể làm tăng tần số đột biến bằng các tác nhân vật lí, hóa học lên hạt, phấn hoa hoặc trong nuôi cấy mô sẹo Được phát hiện vào đầu thế kỉ 20, các nhà thực vật học khi sử dụng một số chất hóa học nhất định hoặc các tia phóng xạ có thể cảm ứng đột biến trên cây trồng Mặc dù cơ chế phân tử và di truyền của phương pháp này chưa được nắm rõ tại thời điểm đó, tuy nhiên, các chất gây đột biến đem lại nhiều thành tựu to lớn trong sản xuất nông nghiệp (Shu 2009) Dù vậy, bất chấp sự tăng lên đáng kể của tần số đột biến, đột biến dạng này vẫn xảy ra một cách ngẫu nhiên, không cụ thể, một phần không nhỏ là các đột biến có hại

Do đó, để có được giống mang những đặc điểm mong muốn, đòi hỏi một số lượng lớn vật liệu, thời gian sàng lọc…

2.1.3 Cây trồng chuyển gen

Ngày nay, công nghệ chuyển gen cho phép nhà tạo giống cùng lúc đưa vào một loài cây trồng những gen mong muốn có nguồn gốc từ những cơ thể sống khác nhau, không chỉ giữa các loài có họ gần nhau mà còn ở những loài rất xa nhau Phương pháp hữu hiệu này cho phép các nhà tạo giống thực vật thu được giống mới nhanh hơn và vượt qua những giới hạn của kỹ thuật tạo giống truyền thống Cây chuyển gen (transgenic plant - GMO) là cây mang một hoặc nhiều gen được đưa vào bằng phương thức nhân tạo thay vì thông qua lai tạo như trước đây Những gen được tạo đưa vào (gen chuyển) có thể được phân lập từ những loài thực vật có quan hệ họ hàng hoặc từ những loài khác biệt hoàn toàn Thực vật tạo ra được gọi là thực vật “chuyển gen” mặc dù trên thực tế tất cả thực vật đều được “chuyển gen” từ tổ tiên hoang dại của chúng bởi quá trình thuần hóa, chọn lọc và lai giống có kiểm soát trong một thời gian dài Nhìn chung, việc ứng dụng cây chuyển gen đã có những lợi ích rõ rệt như sau:

- Tăng sản lượng

- Giảm chi phí sản xuất

- Tăng lợi nhuận nông nghiệp

- Cải thiện môi trường

Những cây chuyển gen “thế hệ thứ nhất” đã giúp giảm chi phí sản xuất Cho đến nay, các nhà khoa học đang hướng đến việc tạo ra những cây chuyển gen

“thế hệ thứ hai” nhằm tăng các giá trị dinh dưỡng hoặc có những đặc điểm thích hợp cho công nghiệp chế biến Lợi ích của những cây trồng này hướng trực tiếp hơn vào người tiêu dùng, điển hình như:

- Lúa gạo giàu vitamin A và sắt

- Khoai tây tăng hàm lượng tinh bột

- Vaccine thực phẩm (edible vaccine) ở ngô và khoai tây

- Những giống ngô có thể trồng được trong điều kiện nghèo dinh dưỡng

- Dầu ăn có lợi cho sức khoẻ hơn từ đậu nành và cải dầu

Tuy nhiên, bên cạnh những ưu điểm cũng có những nguy cơ tiềm ẩn trong việc phát triển những kỹ thuật mới bao gồm:

- Mối nguy hiểm trong việc vô tình đưa những chất gây dị ứng hoặc làm giảm dinh dưỡng vào thực phẩm

- Khả năng phát tán những gen biến nạp trong cây trồng sang họ hàng hoang dại

- Sâu bệnh có nguy cơ tăng cường tính kháng với các chất độc tiết ra từ cây chuyển gen

- Nguy cơ những chất độc này tác động tới các sinh vật không phải là loại sinh vật cần diệt, vì thế có thể làm mất cân bằng sinh thái

Nhìn chung, mặc dù còn những điểm chưa rõ ràng về cây chuyển gen nhưng với khả năng tạo ra những giống cây trồng mới có giá trị kinh tế, công nghệ này

có vai trò không thể phủ nhận được Tuy vậy, để giải quyết những vấn đề đáng lo ngại kể trên thì những kết luận thu được phải dựa trên những thông tin tin cậy và

có cơ sở khoa học

2.2 CÔNG NGHỆ CHỈNH SỬA HỆ GEN (genome-editing)

Bắt đầu từ thập kỉ trước, cùng với sự tiến bộ của khoa học kĩ thuật, công nghệ chỉnh sửa gen ra đời, đánh bại tất cả các kĩ thuật trước đó bởi tính đặc hiệu Thay vì tích hợp ngẫu nhiên plasmid, transposon, virus hoặc thông qua tái tổ hợp tương đồng không đem lại hiệu quả cao thì công nghệ chỉnh sửa gen đưa ra một phương thức chỉnh sửa ổn định, tại vị trí đặc hiệu một các hiệu quả Các phương pháp này dựa trên hoạt động của enzyme endonucleases (EENs) tạo nên các gãy kép DNA tại một vị trí cụ thể nhờ sự hỗ trợ của trình tự RNA dẫn đường có thể nhận diện chính xác vị trí mục tiêu Phá vỡ sợi DNA kép (double strand break -DSB) kích hoạt cơ chế tự sửa chữa của tế bào bằng sự tái tổ hợp đồng dạng Hai con đường sửa chữa chủ yếu là non-homology end joining (NHEJ) và homology-directed repair (HDR) (Wyman and Kanaar 2006) Một số phương pháp chỉnh sửa hệ gen được biết đến như Zinc finger nucleases (ZFNs), Transcription activator-like effector nucleases (TALENs) và gần đây nhất từ năm 2013 ra đời công cụ Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/cas (CRISPR/Cas)

2.2.1 Công cụ Zinc finger nucleases (ZFNs)

ZFNs là thế hệ đầu tiên được phát triển của EENs sau khi khám phá ra chức năng của các vùng ngón tay kẽm Cys2-His2 (zinc finger domains) (Pabo, Peisach

et al., 2001) Mỗi vùng ngón tay kẽm Cys2-His2 bao gồm 30 amino acid được làm bền bằng một ion kẽm tạo thành cấu trúc β β α (Cathomen and Joung 2008) Protein này được gắn với DNA bằng cách chèn chuỗi xoắn α vào rãnh chính của chuỗi xoắn kép (Pavletich and Pabo 1991) Mỗi protein zinc finger có thể nhận

diện 3 nucleotide liên tiếp ở trong trình tự DNA mục tiêu Vùng cắt DNA của ZFNs bắt nguồn từ enzyme ForkI không có tính đặc hiệu Để có thể cắt được DNA vùng này phải được dime hóa Do đó, 2 ZFN phải gắn gần hoặc tại vị trí mục tiêu như hình 2.1

Hình 2.1 Cấu trúc Zinc finger nucleases và cơ chế sửa chữa qua trung gian

Kể từ báo cáo đầu tiên vào năm 1996, ZFNs đã được áp dụng thành công chỉnh sửa gen của một số loài sinh vật như tế bào người (Perez, Wang et al., 2008), cá ngựa (Doyon, McCammon et al., 2008; Meng, Noyes et al., 2008) và cây trồng như arabidopsis (Osakabe, Osakabe et al., 2008), ngô (Shukla, Doyon

et al., 2009) Tuy nhiên, ZFNs tồn tại rất nhiều hạn chế khi bộ máy hoạt động cồng kềnh dễ làm mất chức năng gen đích, thậm chí gây hại cho tế bào chủ 2.2.2 Công cụ Transcription activator-like effector nucleases (TALENs) TALENs là thế hệ thứ hai của EENs, hoạt động linh hoạt hơn, chi phí thấp hơn ZFN nên đã nhanh chóng thay thế cho ZFNs (Joung and Sander 2013) Các ứng dụng rộng rãi của TALENs dựa trên cơ chế hoạt động của yếu tố phiên mã loại III bắt nguồn từ vi khuẩn gây bệnh trên cây trồng Xanthomonas (Boch and Bonas 2010) DNA liên kết với protein đặc hiệu và vùng chức năng để gắn với enzyme FokI (Bogdanove and Voytas 2011) Trong đó loại protein có tên gọi Transcription activator-like Effector (TAL Effector) có nhiệm vụ tìm kiếm vị trí cần cắt bỏ Protein còn lại chính là nuclease có nhiệm vụ cắt bỏ chuỗi DNA

Chính vì vậy protein tạp giao này được gọi là TAL Effector Nuclease Cắt đứt bộ

phận DNA không cần thiết và thay thế bằng các đoạn DNA chức năng được gọi

là quá trình tái tổ hợp tương đồng Nguyên lý hoạt động của protein tạp giao là

trước tiên làm cho TAL Effector đọc trình tự DNA và tìm kiếm vị trí cần cắt bỏ,

đồng thời liên kết đoạn cần cắt bỏ này với DNA Trong khi đó bộ phận nuclease

sẽ cắt bỏ chuỗi đôi DNA tại vị trí liêt kết, qua đó cắt đứt đoạn DNA không cần

thiết và hàn gắn đoạn DNA mới Các nhà khoa học cho biết, protein tạp giao có

thể thực hiện việc tổ hợp tùy ý căn cứ vào các nhu cầu khác nhau, qua đó thực

hiện việc tìm kiếm vị trí cần thiết trong bất kỳ DNA có tổ chức hữu cơ nào TAL

Effector Nuclease đã giúp cải tiến công cụ chuyển đổi gen hiện tại, hơn nữa giá

thành lại thấp, thời gian nhận biết trình tự DNA cũng dễ dàng hơn so với ZFNs

rất nhiều Hơn thế nữa, các gen biến đổi bởi TALENs đã được sử dụng thành

công ở loài động vật và thực vật bao gồm cá ngựa (Sander, Cade et al., 2011),

chuột (Tesson, Usal et al., 2011), lúa gạo (Li, Liu et al., 2012), lúa mì (Wang,

Cheng et al., 2014), khoa tây (Sawai, Ohyama et al., 2014), cà chua (Lor, Starker

et al., 2014) Thành quả to lớn mới đây của TALEN đạt được khi áp dụng thành

công trên bệnh nhân ung thư máu đầu tiên Bằng cách chỉnh sửa tế bào T của

người cho trước khi truyền vào bệnh nhân nhằm ngăn chặn khả năng tế bào T

này tấn công bệnh nhân (Groschel, Sanders et al., 2014)

Hình 2.2 Cấu trúc của Zinc finger nucleases (ZFNs) và Transcription

activator-like effector nucleases (TALENs)

Hai hệ thống chỉnh sửa gen ZFN và TALEN có tiềm năng to lớn nhưng bên cạnh đó cũng có những hạn chế nhất định như: việc nhận diện trình tự đặc hiệu chịu trách nhiệm bởi vùng protein gắn ADN thông qua tương tác protein – ADN Tương tác này không đặc hiệu hoàn toàn, hơn nữa khó dự đoán trước độ đặc hiệu

mà cần phải kiểm tra và tối ưu hóa qua thực nghiệm; việc thiết kế ZFN và TALEN khó khăn do tính phức tạp trong thiết kế protein và dự đoán độ đặc hiệu Ngoài ra, 2 phương pháp này còn có khả năng gây đột biến lệch mục tiêu và phát sinh độc tố

2.2.3 Công cụ CRISPR/Cas9

CRISPR được phát hiện vào năm 1987 trong vi khuẩn E coli Sự ra đời của

hệ thống chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 đã khắc phục được những hạn chế của ZFN và TALEN, tạo nên cuộc cách mạng đột phá trong công nghệ sinh học

Về bản chất, CRISPR là một phần hệ thống miễn dịch của vi khuẩn chống lại virus xâm nhiễm Hệ thống này đã được ứng dụng trên các tế bào nhân thực Tính đặc hiệu được điều khiển bởi “gRNA” (thường gắn với một đoạn trình tự 18-20 cặp base trên DNA mục tiêu) và có thêm một số motifs giúp hình thành một phức hợp với Cas9 nuclease (CRISPR – associated nuclease) Để có thể gắn thành công Cas9, trong trình tự bộ gen đích phải có một đoạn trình tự protospacer adjacent motif (PAM) ngay sau trình tự đích PAM là một motif NGG liền kề vị trí liên kết Đối lập với ZFN và TALEN, hệ thống CRISPR giúp nuclease (enzyme cắt – Cas9) nhận biết trình tự cắt thông qua “gRNA” Đặc tính này giúp

ta dễ dàng thiết kế một “gRNA” mới khi cần cắt một trình tự mục tiêu mới và cũng cho phép cắt nhiều mục tiêu cùng lúc (khi kết hợp nhiều “gRNA”) Một cách ngắn gọn, ZFN và TALEN cần phải tổng hợp protein, do đó tốn thời gian, công sức hơn để tạo ra một nuclease mới cho một vị trí mục tiêu khác Đối với hệ thống CRISPR, chỉ cần tạo ra một “gRNA” mới để gắn vào trình tự mục tiêu khác Hơn nữa, với CRISPR việc gắn đa mục tiêu có thể được thực hiện bằng cách kết hợp Cas9 nuclease với nhiều “gRNA” cùng một lúc

2.3 CÔNG NGHỆ CHỈNH SỬA GEN CRISPR/CAS9

2.3.1 Sự ra đời của CRISPR/Cas

CRISPR là viết tắt của Clustered regularly interspaced short palindromic repeats được hiểu là trình tự sắp xếp kiểu lặp lại ngắn xen lẫn khoảng trống thấy trên vi khuẩn, công bố lần đầu tiên bởi các nghiên cứu của Yoshizumi Ishino và

cộng sự tại trường Đại học Osaka, Nhật Bản năm 1987 (Doudna and Charpentier 2014), tuy nhiên tại thời điểm đó, chưa ai thật sự hiểu rõ vai trò và chức năng của những trình tự này Điều này thúc đẩy các nhà khoa học tập trung nghiên cứu chức năng đặc biệt của chúng trong hệ miễn dịch của vi khuẩn chống lại sự xâm nhập của các thực khuẩn thể Vi khuẩn và vi khuẩn cổ có thể ngăn chặn sự tấn công của thực khuẩn thể (bacteriphage) bằng cách tích hợp các đoạn ngắn của hệ gen virus, có độ dài tương đương với các khoảng trắng lặp lại trong bộ gen của vi khuẩn Vi khuẩn sẽ tự cắt chuỗi DNA của chính chúng và chèn đoạn mã di truyền vào các khoảng trắng lặp lại (spacer) thường 20-50bp (Sorek, Lawrence et al., 2013), đó chính là trình tự CRISPR Vùng trình tự này được phiên mã và được xử lý thành các đoạn RNA ngắn (được gọi là crRNA_CRISPR-derived RNA) các crRNA này sẽ liên kết với endonuclease Cas để nhận diện DNA mục tiêu (thông qua liên kết bổ sung của trình tự crRNA và DNA mục tiêu) và cắt phân tử DNA mục tiêu (thông qua hoạt động endonuclease của Cas)

Hình 2 3 a)một locus CRISPR trong nhiễm sắc thể vi khuẩn với đặc trưng đoạn lặp-khoảng trống b) Vi khuẩn có thể nhận biết trình tự PAM ở bên

trong virus/plasmid và hợp nhất nucleic acid ngoại lai

Chú thích: PS: a proto-spacer Sự hợp nhất của proto-spacer tạo một khoảng trống (spacer) mới (S0) và một trình tự lặp lại R (repeat squence) (Van der Oost, Jore et al., 2009)

Nhiễm sắc thể vi khuẩn có thể chứa một hay nhiều locut CRISPR (Godde and Bickerton 2006) Trong các loài chứa hai hay nhiều locut CRISPR, có một chuỗi các vùng giàu TA được tìm thấy trên mỗi locut (Jansen, Embden et al., 2002), bao gồm 300-500bp Mặt khác, CRISPR- trình tự gen liên kết (cas) được tìm thấy trên cả 2 bên của locut CRISPR Gen Cas có nhiều loại khác nhau mã

hóa cho nhiều protein khác nhau, tuy nhiên gen Cas1 và Cas2 được bảo tồn trong tất cả các bộ gen chứa locus CRISPR Vào năm 2012, hai nhóm nghiên cứu độc lập của tiến sĩ Jinek và cộng sự tại trường đại học Umea và tiến sĩ Jennifer Doudna tại trường đại học California, Berkeley đã cùng khám phá ra cơ chế hoạt động của enzyme Cas và CRISPR (Jinek, Chylinski et al., 2012)

Tiến sĩ Craig Mello, người được trao giải thưởng Nobel về Sinh lý học và

Y học năm 2006 về công trình nghiên cứu RNAi (RNA interference), đã có những lời bình luận về tương lai hứa hẹn của phương pháp này: “CRISPR/Cas

có ý nghĩa vô cùng to lớn, khả năng của nó vô cùng mạnh mẽ, bởi vì chúng ta

về cơ bản có thể thay đổi bộ gen theo bất cứ điều gì chúng ta muốn” Mello nhấn mạnh rằng phương pháp này có thể được sử dụng rộng rãi từ các ứng dụng cho nông nghiệp đến các ứng dụng liệu pháp gen trong điều trị các bệnh

lý trên người Phương pháp này thật sự là một thành công của nghiên cứu khoa học cơ bản, đây cũng là một đột phá to lớn có tác động mạnh mẽ đối với

di truyền học phân tử

2.3.2 Cấu trúc của hệ thống CRISPR/Cas

Cấu trúc của hệ thống CRISPR/Cas được hình thành từ 3 gen bao gồm 1 gen mã hóa cho enzyme cắt DNA Cas9 nuclease và 2 gen không mã hóa RNA: crRNA hoạt hóa phiên mã (trans-activating crRNA (tracrRNA)) và tiền crRNA Tiền crRNA sau khi liên kết với crRNA hoạt hóa phiên mã trở thành crRNA trưởng thành, mang trình tự bổ sung trực tiếp với 1 đoạn ngắn (thường

là 20nu) trên gen đích vì vậy có thể đưa enzyme cắt Cas9 tới gen đích một cách chính xác 2 gen RNA có thể được thay thế bởi một gen RNA (single-guide RNA) thiết kế như một cấu trúc kẹp tóc là phức hợp của crRNA-trancrRNA Single-guideRNA (sgRNA) liên kết chắc chắn với protein Cas9 (Ran, Hsu et al., 2013) nhờ cấu trúc kẹp tóc Enzyme Cas 9 có vai trò phân cắt DNA mục tiêu, trong khi phân tử sgRNA có vai trò nhận diện DNA mục tiêu chứa trình tự bổ sung với phân tử gRNA và đưa enzyme Cas9 tới Ngoài ra, ngay sau gen đích được lựa chọn còn có sự hiện diện của trình tự PAM (Protospacer-Adjacent Motif) Trình tự PAM có vai trò quan trọng như gRNA đối với quá trình nhận diện và gắn chuyên biệt của enzyme Cas 9 vào trình tự đích Cas9 có nguồn gốc từ các loài vi khuẩn khác nhau có trình tự PAM đặc hiệu khác nhau được trình bày ở bảng 2.1

Bảng 2.1 Các trình tự PAM ứng với mỗi biến thể enzyme Cas9

Loài/biến thể của Cas9 Trình tự PAM

Streptococcus pyogenes (SP); SpCas9 NGG

SpCas9 D1135E NGG

SpCas9 VRER NGCG

SpCas9 VQR NGAN hoặc NGNG

Staphylococcus aureus (SA); SaCas9 NNGRRT hoặc NNGRR(N)

Neisseria meningitidis (NM) NNNNGATT

Streptococcus thermophilus (ST) NNAGAAW

Treponema denticola (TD) NAAAAC

Cpf1 (từ nhiều loài) TTN

Nguồn: addgene.com

Đối với nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn enzyme Cas 9 có nguồn gốc từ

vi khuẩn Streptococcus với trình tự PAM gồm 3 nucleotit – NGG, trong đó N là một nucleotit bất kỳ Bằng việc thiết kế các trình tự gRNA khác nhau (khoảng 20 nucleotit), các nhà khoa học hầu như có thể tác động đến bất kì gen nào Với việc thiết kế đơn giản (chỉ thay đổi trình tự gRNA) và hiệu quả cao, có thể sử dụng đối với nhiều loại tế bào khác nhau và nhiều gen cùng lúc, CRISPR/Cas thực sự

là một hệ thống tiềm năng để biến đổi DNA bộ gen (Hình 2.4)

Hình 2.4 Cấu trúc của hệ thống CRISPR/Cas9

2.3.3 Cơ chế hoạt động của hệ thống Crispr/cas9

Cas9 nuclease có 2 vùng chức năng: RuvC và HNH, mỗi vùng sẽ cắt một sợi

ở mạch kép DNA Khi cả 2 vùng cùng hoạt động, enzyme Cas9 phá vỡ mạch kép DNA trong hệ gen Nếu không cung cấp nguyên liệu phù hợp, vị trí gãy ở mạch kép sẽ nối lại nhờ cơ chế sửa chữa Non-Homologous End Joining (NHEJ) - kết nối đầu cuối không tương đồng Khi phục hồi đoạn DNA đứt gãy bởi cơ chế này, hiện tượng chèn hay mất đi một vài nucleotide xảy ra một cách tự do Điều này dẫn đến làm thay đổi khung đọc mở trên gen đích hay biến đổi amino acid kể từ

vị trí bị cắt trở đi Bất kì thay đổi nào ở gen đích theo con đường này đều phá vỡ gen đích và tạo ra những thay đổi cần thiết phù hợp với hệ gen

Bên cạnh đó, hệ thống CRISPR còn có thể đưa một đoạn trình tự đặc hiệu vào vùng gen đích nhờ cơ chế Homology Directed Repair (HDR) Khi cơ chế NHEJ không đem lại kết quả mong muốn, tế bào có thể được sửa chữa theo cơ chế Homology Directed Repair (HDR) bằng cách cung cấp mẫu DNA ngoại lai Với cơ chế này, chúng ta có thể tự cung cấp một đoạn gen theo mong muốn vào một vị trí xác định (hình 2.5)

Hình 2.5 Mô tả 2 cơ chế sửa chữa mạch kép khi bị cắt bởi enzyme Cas9

2.3.4 Thành tựu nghiên cứu về hệ thống CRISPR/Cas9

Ngay khi được công bố lần đầu tiên vào năm 2011 tính đến nay, ngày càng

có nhiều công trình khoa học được công bố về những thành tựu tuyệt vời mà CRISPR/Cas9 mang lại Trong năm 2013, ba nhóm nghiên cứu khác nhau đồng thời báo cáo việc ứng dụng hệ thống CRISPR-Cas9 để sửa đổi hệ gen cây trồng (Li, Norville et al., 2013; Nekrasov, Staskawicz et al., 2013; Shan, Wang et al., 2013) Sau đó, một loạt các bài báo được công bố chứng minh tính hiệu quả và tiềm năng của công nghệ CRISPR-Cas9 như một hệ thống chỉnh sửa gen điển hình trên thực vật (Belhaj, Chaparro-Garcia et al., 2013; Feng, Zhang et al., 2013; Jiang, Zhou et al., 2013; Jia and Wang 2014; Sugano, Shirakawa et al., 2014; Wang, Cheng et al., 2014)

Các dạng khác nhau của Cas9 như Cas9 tự nhiên, Cas9 nickase và dCas9 có thể được dùng cho nhiều mục đích khác nhau Các protein Cas9 bẻ gãy sợi DNA kép tại những vị trí xác định, kích hoạt cơ chế tự sửa chữa của tế bào NHEJ, dẫn đến chèn/xóa một hoặc nhiều nu tại vị trí cắt Năm 2013, Shan và cộng sự đã thiết kế gRNA và tối ưu hóa S.pyogenes Cas9 (Sp Cas9) để chỉnh sửa gen trên lúa mì (Shan, Wang et al., 2013) Ứng dụng kỹ thuật CRISPR-Cas9 trên cây mô hình Arabidopsis

và Nicotiana benthamiana gây đột biến ở gen Phytoene desaturase cho kết quả đột biến chính xác trong các trình tự đích với tần số 2,7% (Li, Norville et al., 2013) (Feng, Zhang et al., 2013) công bố nghiên cứu sử dụng Cas9 và gRNA cho 2 gen riêng biệt trên Arabidopsis và lúa chứng minh gây đột biến hiệu quả, không phụ thuộc vào cấu trúc gen và trạng thái nhiễm sắc thể Nghiên cứu còn chứng minh các đột biến gây ra bởi hệ thống CRISPR/Cas9 này có khả năng di truyền qua các thế

hệ Hơn nữa, hệ thống CRISPR-Cas9 tiêu tốn ít thời gian nhất để tạo ra cây trồng biến đổi gen với chỉnh sửa đặc hiệu gen đích (Zhang, Zhang et al., 2014)

Hình 2.6 Biểu đồ các công bố khoa học của CRISPR/Cas9 theo từng năm

2.4 GEN ALCOHOL DEHYDROGENASE (AHD)TRÊN CÂY CÀ CHUA Alcohol dehydrogenases (ADH, EC 1.1.1.1) liên họ enzyme dehydrogen (khử hydro), có mặt trong rất nhiều loài sinh vật (Chase Jr, 1999; Strommer, 2011; Jornvall, Hedlund et al., 2013) Đã có nhiều nghiên cứu ở mức độ phân tử đối với liên họ gen này đối với cả sinh vật nhân sơ và sinh vật nhân chuẩn, enzyme ADH đóng vai xúc tác cho phản ứng chuyển hóa alcohol và aldehyde (Hoog, Stromberg et al., 2003; Thompson, Fernandes et al., 2010) Ở người, động vật, nấm men và vi khuẩn, ADHs đã được nghiên cứu rộng rãi (Khan, Husain et al., 2010; Kumar, Sandell et al., 2012; Alka, Windle et al., 2013; Plapp, Lee et al., 2013)…Do đó các gen ADH được phân chia thành nhiều liên

họ tương ứng dựa vào độ dài amino acid mà chúng mã hóa, chuỗi ngắn (~250 amino acid) chuỗi trung bình (~350 amino acid) chuỗi dài (600~750 amino acid) (Chase Jr 1999), các ADHs chuỗi trung bình nhóm thành tám lớp ở vật có xương sống, dựa trên tương tự, tính năng xúc tác và các mẫu biểu hiện gen (Thompson

et al., 2007) nhưng vai trò chức năng của các ADHs chưa được hiểu đầy đủ Tập hợp gen ADH đã được xác định trong bộ gen của cây họ hòa thảo (Poaceae), họ hoa hồng (Rosaceae), họ cải (brassicaceae), họ đậu (Fabaceae) và cây họ thông (Thompson, Fernandes et al., 2010; Zheng, Hu et al., 2011) Cho đến nay, hầu hết các thành viên của ADHs trong thực vật đặc trưng ở mức độ gen thuộc về liên họ ADH protein chuỗi trung bình thường chứa các phối tử kẽm ở vị trí hoạt động (Tesniere and Verries 2000; Garabagi and Strommer 2004; Pathuri, Reitberger et al., 2011; Strommer 2011; Iaria, Bruno et al., 2012) ADH thuộc liên họ protein chuỗi ngắn không chứa phối tử kẽm ít tham gia hoạt động xúc tác phản ứng, chỉ một số được biết đến (ManrÃ-quez, El-Sharkawy et al., 2006; González-Agüero, Troncoso et al., 2009; Kim, Shim et al., 2009) Trên cơ sở phân tích phát sinh loài, các gen ADH chuỗi trung bình được sắp xếp vào các phân nhóm khác nhau (Perry and Furnier 1996; Small and Wendel 2000; Komatsu, Thibaut et al., 2011) Nhiều nghiên cứu trước đây khẳng định, gen ADH tham gia phản ứng chống chịu sinh học và phi sinh học, được biểu hiệu trong các mô khác nhau của đậu tương, lúa mì, lúa mạch Hơn thế nữa, gen ADH còn đóng vai trò quan trọng trong quá trình chín của trái cây, tổng hợp hương thơm ở cà chua (Singh, Sane et al., 2010; Moummou, Tonfack et al., 2012), dưa hấu (ManrÃ-quez, El-Sharkawy et al., 2006), xoài (Singh, Sane et al., 2010)

Hình 2.7 Cơ chế xúc tác của enzyme ADH Đối với cà chua, 2 gen ADH được phát hiện nằm trên 2 nhiễm sắc thể khác nhau ADH2-4 được xác định gần vị trí tâm động (centromere) của nhiễm sắc thể

số 4 qua phân tích liên hợp (linkage analysis) (Tanksley, 1979), đóng vai trò là isozyme, tồn tại chủ yếu ở hạt phấn, hạt và cây non ADH2-6 là được biết đến như một gen riêng biệt khi điện di sản phẩm izoyme, liên kết với nhiễm sắc thể

số 6 (Tanksley and Jones 1981) Hoạt động chủ yếu ở những mô dưới điều kiện hiếm khí (Longhurst, Tung et al., 1990), ngoài ra còn được tìm thấy ở vỏ quả chín (Bicsak, Kann et al., 1982) Trong điều kiện thí nghiệm tác động đến một trong hai gen ADH bởi hệ thống CRISPR/Cas9, gen ADH còn lại sẽ hỗ trợ chức năng cho nhau để đảm bảo quá sinh trưởng của cây vẫn tiếp tục diễn ra Chính vì vậy, cây nghiên cứu sẽ không bị chết nếu bị làm mất chức năng một trong hai gen, vì vậy hai gen này có thể được sử dụng để nghiên cứu chỉnh sửa gen giúp xác định được hiệu quả chỉnh sửa của các cấu trúc được thiết kế

2.5 TIỀM NĂNG NGHIÊN CỨU TẠO ĐỘT BIẾN CRIPSR CAS9 TRÊN

CÀ CHUA

Cà chua (Lycopersicon esculentum Mill) là loại rau ăn trái rất được ưa chuộng vì phẩm chất ngon và dễ chế biến được nhiều cách Cà chua cho năng suất cao và là một mặt hàng tươi có giá trị xuất khẩu vào loại lớn trên thị trường thế giới Châu Á là thị trường đứng đầu về diện tích trồng và sản lượng cà chua Theo FAO (2015) trên thế giới có hơn 150 nước trồng cà chua Trong đó, Trung Quốc là nước có sản lượng cà chua lớn nhất thế giới và cũng là nước duy trì được tình trạng ổn định về sản xuất cà chua Ở Việt Nam, cà chua là loại rau ăn quả chủ lực được nhà nước ưu tiên phát triển Phần lớn diện tích trồng cà chua tập trung tại đồng bằng Sông Hồng như Hà Nội, Hải Phòng, Hải Dương, Thái Bình, Hưng Yên, Bắc Giang, Nam Định… Và một số tỉnh tại miền Trung, Tây Nguyên

và Nam Bộ

Hiện nay, các nhà khoa học đang tập trung nghiên cứu những giống cà chua mang nhiều phẩm chất tốt Xu hướng chọn tạo giống mới nhất là:

+Tạo giống chín sớm, phục vụ cho sản xuất vụ sớm

+ Tạo giống có sản lượng, giá trị sinh học dùng làm rau tươi và nguyên liệu cho chế biến đồ hộp

+ Tạo giống chống chịu sâu bệnh, chịu ngập úng,…

Để chọn giống cà chua chống chịu ngập úng, các nhà chọn giống trên thế giới đã sử dùng nhiều nguồn gen của các loài hoang dại bằng nhiều phương pháp khác nhau Tuy nhiên, nếu sử dụng phương pháp truyền thống thông thường sẽ tiêu tốn từ 6-8 năm để tạo ra một giống mới Từ thập kỉ trước, với sự phát triển của công nghệ tế bào và công nghệ gen đã sản xuất được nhiều giống cà chua mang lại năng suất và chất lượng cao, đồng thời cũng tiết kiệm được rất nhiều thời gian Phương pháp chỉnh sửa hệ gen mới nhất CRISPR/Cas9 trên cây cà chua hứa hẹn những tác động nhanh chóng và hiệu quả lên công nghệ chọn giống

cà chua nói riêng và cây trồng nói chung (Đồng, 2011)

PHẦN 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

- Nghiên cứu được thực hiện tại Bộ môn Chọn giống phân tử, Trung tâm rau màu Thế giới- The world vegetable center AVRDC- Đài Loan

- Thời gian thực hiện: Tháng 1-2016 đến tháng 8-2016

3.2 ĐỐI TƯỢNG/VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

- Cà chua dòng CLN1621 được cung cấp bởi trung tâm Rau màu thế giới- Đài Loan

- Thông tin trình tự gen ADH được truy xuất từ cơ sở dữ liệu của AVRDC và trang web chính thức của hệ gen cà chua:

ADH2-6: https://solgenomics.net/feature/17847465/details

ADH2-4: https://solgenomics.net/feature/17800027/details

- Vector pKSE401 (Qi-Jun Chen, 2014) được cung cấp bởi Addgene.Co

- Dòng vi khuẩn Agrobacterium (GV3101::pMP90) được cung cấp bởi Addgene.Co

- Các vật tư hóa chất cơ bản sử dụng trong nuôi cấy mô, nuôi cấy vi khuẩn, sinh học phân tử

3.3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

- Thiết kế gRNA đặc hiệu cho 2 gen mục tiêu ADH2-4 và ADH2-6

- Thiết kế vector tái tổ hợp CRISPR/Cas9

- Biến nạp vector tái tổ hợp chứa hệ thống CRISPR/Cas9 vào vi khuẩn A tumefaciens

- Chuyển cấu trúc CRISPR/Cas9 vào cà chua

- Khảo sát đột biến trên cây chuyển gen

3.3.1 Thiết kế gRNA

Hiện nay, có rất nhiều công cụ tin sinh học cho phép thiết kế gRNA dễ dàng

và thân thiện với người dùng Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng chương trình Cas9 Designer (http://cas9.cbi.pku.edu.cn) được phát triển bởi Ma

và cộng sự (2013) Trình tự 2 vùng gen ADH được công bố trên cơ sở dữ liệu của

cà chua (https://solgenomics.net) Qua đó, xác định gen ADH2-6 có 10 vùng exon, ADH2-4 có 10 vùng exon Để thiết kế một gRNA hiệu quả, tác động trực tiếp tới protein chức năng, chúng tôi đưa vào chương trình Cas9 Designer vùng trình tự mã hóa protein lớn nhất Cùng với chương trình Cas9 Designer, chương trình CCTop (http://crispr.cos.uni-heidelberg.de) giúp kiểm tra lại chính xác vùng trình tự đặc hiệu và đưa ra gRNA phù hợp

Nguồn: http://crispr.cos.uni-heidelberg.de

Hình 3.1 Giao diện chương trình CCTop để thiết kế gRNA

3.3.2 Thiết kế vector tái tổ hợp CRISPR cas9

Bước 1: Chuẩn bị

Hình 3.2 Sơ đồ vector pKSE401

Bất hoạt hoạt động enzyme BsaI ở 65°C trong 20 phút

Giữ ống phản ứng trên đá hoặc giữ ở -20°C để tiến hành thí nghiệm nối plasmid

Trộn sợi trên và sợi dưới của gRNA cho nồng độ 10 µM Sử dụng máy PCR

để làm nóng hỗn hợp tại 95°C trong 10 phút và gắn 2 sợi trên và dưới khi giảm từ

từ nhiệt độ xuống 4°C trong vòng 10 phút

Bước 2: Tạo vector tái tổ hợp

Giữqua đêm ở điều kiện 4°C

Bước 3: Kiểm tra vector tái tổ hợp mang gRNA

Sử dụng cặp mồi đặc hiệu 401F/401R cho phản ứng PCR theo chu trình dưới đây

401F: CAAAAGTCCCACATCGCTTA 401R: TTCTTCGGCGTTCAATTTCT

Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1 % được chuẩn bị bằng đệm TBE

và chứa 0.5 mg/mL ethidium bromide

- Gel được chạy trên thiết bị điện di là Mini-Sub Cell (Biorad) với đệm TBE ở điện thế 100V trong 30 - 40 phút

- Bản gel được kiểm tra dưới ánh sáng tử ngoại và được chụp lại bằng máy chụp chuyên dụng hoặc máy ảnh kỹ thuật số

3.3.3 Biến nạp vector tái tổ hợp chứa hệ thống CRISPR/Cas9 vào vi khuẩn

A tumefaciens bằng sốc nhiệt (Van Eck, Conlin et al., 2007)

Bước 1: Nhân vector tái tổ hợp bằng vi khuẩn E.coli

- Cho 10 µl sản phẩm của phản ứng nối vào tuýp chứa dịch 100µl dịch khuẩn (cung cấp bởi Addgene.Co);

- Trộn nhẹ nhàng và giữ trên đá khoảng 5 phút;

- Sốc nhiệt ở 42°C trong 1 phút;

- Nhanh chóng đặt lại trong đá khoảng 2 phút;

- Chuyển toàn bộ hỗn hợp vào môi trường LB nuôi lắc khoảng 20 phút trong 370C;

- Hút 50µl dịch khuẩn cấy chang trên đĩa môi trường LB thử 3 nồng độ kháng sinh chọn lọc kanamycine 25, 50 và 100µg/mL;

- Nuôi cấy qua đêm ở 37°C

Bước 2: Nuôi cấy thu sinh khối:

- Chọn 4 khuẩn lạc đơn hoặc nhiều hơn trong đĩa nuôi cấy và chuyển vào 3~5ml LB lỏng chứa 50µg/mL kanamycin

- Nuôi lắc qua đêm ở 37°C

Bước 3: Tách Plasmid DNA:

Sử dụng kit mini plus Plasmid DNA extraction system Macrogen

Bước 4: Chuyển plasmid DNA vào Agrobacterium tumefaciens

- Lấy Agrobacterium (GV3101::pMP90) từ tủ lạnh -800C Để vi khuẩn tan đông trên đá

- Lấy 10µg plasmid DNA của mỗi cấu trúc cho vào ống tế bào vi khuẩn và trộn đều (các thao tác được tiến hành trên đá)

- Làm đông hỗn hợp tế bào vi khuẩn và plasmid DNA trong nitơ lỏng khoảng

5 phút

- Để hỗn hợp dịch vi khuẩn và DNA vào block nhiệt 37°C trong 5 phút

- Bổ sung 1ml môi trường YEP lỏng (không chứa kháng sinh) và phục hồi

vi khuẩn ở 28°C trong 2h lắc nhẹ nhàng

- Ly tâm trong 3 phút, thu kết tủa, sau đó làm tan tủa bằng 200 μl môi trường YEP lỏng

- Huyền phù của tế bào được làm tan trong 0.2 ml YEP lỏng

- Dịch vi khuẩn được cấy trên đĩa môi trường thạch YEP chứa 50µg/ml kanamycin và 50µg/ml gentamycin

- Các đĩa petri được ủ ở 280C trong vòng 2 ngày Kiểm tra sự hình thành khuẩn lạc