nghiên cứu hoạt tính kháng nấm, tính chất chức năng, hiệu lực bảo quản của chitosan, nano chitosan và compozit với axit oleic ứng dụng cho bảo quản quả mận tam hoa

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM PHẠM THỊ PHƯƠNG NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG NẤM, TÍNH CHẤT CHỨC NĂNG, HIỆU LỰC BẢO QUẢN CỦA CHITOSAN, NANO CHITOSAN VÀ COMPOZIT VỚI AXIT OLEIC ỨNG DỤNG CHO

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

PHẠM THỊ PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG NẤM, TÍNH CHẤT CHỨC NĂNG, HIỆU LỰC BẢO QUẢN CỦA CHITOSAN, NANO CHITOSAN VÀ COMPOZIT VỚI AXIT OLEIC ỨNG DỤNG CHO BẢO QUẢN QUẢ MẬN TAM HOA

NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2016

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo

vệ lấy bất kỳ học vị nào

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám

ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày tháng năm 2016

Tác giả luận văn

Phạm Thị Phương

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được

sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình

Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết

ơn sâu sắc PGS TS Nguyễn Duy Lâm, PGS TS Nguyễn Thị Bích Thủy đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Công nghệ Sau thu hoạch, Khoa Công nghệ Thực phẩm - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ viên chức Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực Phẩm Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên; Phòng phân tích Trung tâm Nghiên cứu và Kiểm tra chất lượng nông sản thực phẩm Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch, đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận văn./

Hà Nội, ngày tháng năm 2016

Tác giả luận văn

Phạm Thị Phương

MỤC LỤC

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục chữ viết tắt v

Danh mục bảng vi

Danh mục hình vii

Trích yếu luận văn viii

Thesis abstract x

Phần 1 Mở đầu 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2.1 Mục đích 2

1.2.2 Yêu cầu 2

Phần 2 Tổng quan tài liệu 3

2.1 Giới thiệu chung về chitosan 3

2.1.1 Nguồn gốc và cấu trúc hóa học của chitosan 3

2.1.2 Tính chất cơ bản của chitosan 4

2.1.3 Đặc tính kháng vi sinh vật của chitosan 6

2.2 Ứng dụng của chitosan trong bảo quản rau quả tươi 10

2.3 Giới thiệu chung về nano chitosan 11

2.3.1 Giới thiệu về nano chitosan 11

2.3.3 Hoạt tính kháng khuẩn của nano chitosan 13

2.4 Giới thiệu về compozit của chitosan với axit oleic 15

2.4.1 Một số tính chất của compozit của chitosan với axit oleic 15

2.4.2 Một số ứng dụng của compozit của chitosan trong bảo quản rau quả tươi 16

2.5 Giới thiệu về nguyên liệu mận 17

2.5.1 Thành phần hóa học của mận 18

2.5.2 Các quá trình xảy ra khi bảo quản mận 19

2.5.3 Một số bệnh thường gặp ở mận 21

2.5.4 Một số nghiên cứu bảo quản mận 23

Phần 3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 25

3.1 Vật liệu thời gian và địa điểm nghiên cứu 25

3.1.1 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu 25

3.1.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 26

3.2 Nội dung nghiên cứu 26

3.3 Phương pháp nghiên cứu 27

3.3.1 Nghiên cứu khả năng kháng vi sinh vật của chitosan, nano chitosan và compozit của chúng với axit oleic trên mận Tam Hoa 27

3.3.2 Nghiên cứu một số tính chất chức năng của màng film tạo thành từ chitosan, nano chitosan và compozit với axit oleic 29

3.3.3 Nghiên cứu so sánh hiệu quả bảo quản của chitosan, nano chitosan và compozit của chúng với axit oleic đối với mận Tam Hoa 31

3.4 Phương pháp xử lý số liệu 33

Phần 4 Kết quả và thảo luận 34

4.1 Nghiên cứu khả năng kháng nấm của chitosan, nano chitosan và compozit của chúng với axit oleic 34

4.1.1 Nghiên cứu khả năng ức chế sự phát triển nấm mốc Penicillium expansum và Botryotinia fluckeliana của chitosan, nano chitosan và compozit của chúng trên mận 34

4.1.2 Đánh giá chất lượng vi sinh vật trên mận xử lý bằng chitosan, nano chitosan và compozit của chúng ở những thời gian xử lý khác nhau 35

4.2 Nghiên cứu một số tính chất của màng film tạo ra từ chitosan, nano chitosan và compozit của chúng với axit oleic 38

4.2.1 Tính tan của màng trong nước 38

4.2.2 Tính hút ẩm của màng 40

4.3 Nghiên cứu so sánh hiệu quả bảo quản của chitosan, nano chitosan và compozit của chúng với axit oleic trong bảo quản mận Tam Hoa 40

4.3.1 Ảnh hưởng của chitosan nano chitosan và compozit của chúng đến hao hụt khối lượng tự nhiên của quả mận 40

4.3.2 Ảnh hưởng của chitoán nano chitosan và compozit của chúng đến độ cứng của mận trong quá trình bảo quản 41

4.3.3 Ảnh hưởng của chitosan, nano chitosan và compozit của chúng đến biến đổi chất rắn hòa tan tổng số (0Bx) 42

4.3.4 Ảnh hưởng của chitosan, nano chitosan và compozit của chúng đến biến đổi Vitamin C 43

4.3.5 Ảnh hưởng của chitosan, nano chitosan và compozit của chúng đến tỷ lệ thối hỏng của mận trong quá trình bảo quản 44

4.3.6 Ảnh hưởng của chitosan, nano chitosan và compozit của chúng đến chất lượng cảm quan 45

Phần 5 Kết luận và đề nghị 47

5.1 Kết luận 47

5.2 Kiến nghị 47

Tài liệu tham khảo 48

DD Degree of Deacetylation (mức độ deacetyl hóa) HHKLTN

Oleic acid Polygalacturonase Titratable Acidity (axit tổng số Tiêu chuẩn Việt Nam

Glass transition temperature (nhiệt độ chuyển thủy tinh)

Total Soluble Solid (chất khô hòa tan tổng số) Water vapour permeability (tính thấm nước) Vitamin C

DANH MỤC BẢNG

Bảng 4.1 Khả năng ức chế Penicillium expansum của chitosan và biến thể của

chitosan lây nhiễm nhân tạo trên mận 35 Bảng 4.2 Khả năng cức chế Botryotinia fluckeliana của chitosan và biến thể của

chitosan lây nhiễm nhân tạo trên mận 35 Bảng 4.3 Đánh giá mức độ nhiễm vi sinh vật tổng số ở mận sau các khoảng thời

gian xử lý khác nhau 37 Bảng 4.4 Theo dõi sự thay đổi của Nấm men – Nấm mốc trong thời gian bảo

quản mận 38 Bảng 4.5 Tính tan và tính hút ẩm của màng tạo ra từ chitosan nano chitosan và

compozit của chúng với axit oleic 39 Bảng 4.6 Hao hụt khối lượng tự nhiên của mận Tam Hoa trong quá trình bảo quản 41 Bảng 4.7 Sự biến đổi độ cứng của mận Tam Hoa trong quá trình bảo quản 42 Bảng 4.8 Sự biến đổi nồng độ chất rắn hòa tan tổng số (oBx) trong quá trình bảo

quản mận 43 Bảng 4.9 Sự biến đổi hàm lượng Vitamin C trong quá trình bảo quản mận 44 Bảng 4.10 Tỷ lệ thối hỏng (%) của mận trong quá trình bảo quản 45 Bảng 4.11 Ảnh hưởng của chitosan và các biến thể của chitosan đến chất lượng

cảm quan của mận sau 10 ngày bảo quản 46

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Công thức cấu tạo của chitin 3 Hình 2.2 Cấu trúc của chitosan 4

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN

Tên tác giả: Phạm Thị Phương

Tên luận văn: “ Nghiên cứu tính chất kháng nấm, tính chất chức năng, hiệu lực bảo quản của chitosan, nano chitosan và compozit với axit oleic ứng dụng trong bảo quản mận Tam Hoa”

Chuyên nghành: Công nghệ sau thu hoạch Mã số: 60.54.01.04

Cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Thí nghiệm 1: Nghiên cứu khả năng ức chế nấm mốc của chitosan nano chitosan

và compozit với axit oleic lây nhiễm nhân tạo trên quả mận Tam Hoa

Thí nghiệm 2: Đánh giá chất lượng vi sinh vật của mận xử lý bằng chitosan, nano chitosan và compozit của chúng với thời gian xử lý khác nhau

Thí nghiệm 3: Nghiên cứu một số tính chất của màng film tạo thành từ chitosan, nano chitosan và compozit với axit oleic

Thí nghiệm 4: Nghiên cứu so sánh hiệu quả bảo quản của chitosan, nano chitosan và compozit của chúng với axit oleic trên mận Tam Hoa

Phương pháp nghiên cứu

- Phương pháp xác định khả năng ức chế hai chủng nấm mốc Penicillinum expansum và Botryotinia fluckeliana của chitosan, nano chitosan và compozit của chúng với axit oleic

- Phương pháp đánh giá chất lượng vi sinh vật

- Phương pháp nghiên cứu một số tính chất của màng film tạo ra từ chitosan nano chitosan và compozit của chúng với axit oleic

- Phương pháp phân tích chỉ tiêu sinh lý: Xác định sự biến đổi độ cứng, xác định

hao hụt khối lượng tự nhiên, đánh giá cảm quan

- phương pháp phân tích hóa sinh: Xác định hàm lượng chất rắn hòa tan tổng số, xác định hàm lượng vitamin C,

Nano chitosan nồng độ 3000 ppm thời gian xử lý chế phẩm 1 phút có khả năng

ức chế tốt nhất đối với chỉ tiêu vi sinh vật tổng số và nấm men, nấm mốc trê bề mặt quả mận trong quá trình bảo quản

Màng tạo ra từ compoxit của chitosan với axit oleic có tính tan và tính thấm hơi nước thấp nhất

Compozit của chitosan với axit oleic có hiệu lực bảo quản tốt nhất đối với mận Tam Hoa bảo quản ở nhiệt độ thường

độ 107 CFU biểu hiện ở tỷ lệ vết xước nhiễm nấm mốc và tỷ lệ quả thối hỏng do nấm thấp nhất

Nano chitosan nồng độ 3000 ppm xử lý bảo quản mận trong thời gian 1 phút cho khả năng kháng cao nhất đối với chỉ tiêu vi sinh vật tổng số và nấm men-nấm mốc, sau

7 ngày bảo quản mật độ tế bào vi sinh vật được quan sát thấy vẫn ở mức an toàn 104 –

THESIS ABSTRACT

Master candidate: Pham Thi Phuong

Thesis title: “Study on the antifungal properties, functional properties, and storage effects of chitosan, nano chitosan and their composites with oleic acid application on

Tam Hoa plum ”

Major: Post- harvest technology Code: 60.54.01.04

Educational organization: Vietnam National University and Agriculture (VNUA)

1 Research Objectives

Determining the ability of chitosan, nano chitosan and their composites with oleic acid on growth inhibition two type mold Penicillinum expansum and Botryotinia fluckeliana

Determining a number of characteristics of film made by chitosan, nano chitosan and their composites with oleic acid

Determing the preservative effects of chitosan, nano chitosan and their composites with oleic acid on Tam Hoa plum fruit

2 Materials and Methods

Experiment design:

- Experiment 1: Study the inhibition ability of chitosan, nano chitosan and their composites with oleic acid with two types of mold antificial infection on Tam Hoa plum

- Experiment 2: Assessing the microorganisms quality on plum treated with chitosan, nano chitosan and their composites with different processing time

- Experiment 3: Study a number of characteristics of the films formed from chitosan, nano chitosan and their composites with oleic acid

- Experiment 4: Comperative study the effects of chitosan, nano chitosan and their composites with oleic acid on Tam Hoa plum fruit

Study methods:

- The study method inhibition ability of chitosan, nano chitosan and their composites with oleic acid with two types of mold Penicillinum expansum and Botryotinia fluckeliana antificial infection on Tam Hoa plum

- The assessment microorganisms quality methods

- Study a number of characteristics of the films formed from chitosan, nano chitosan and their composites with oleic acid

- Comperative study the effects of chitosan, nano chitosan and their composites with oleic acid on Tam Hoa plum fruit

+ Physiological indicator analysis method: To determine: hardness, natural weight loss and sensory quality

- Biochemical analysis method: Determination of total soluble solid, vitamin C

- Determination of the decay rate

- Statistical analysis: Data were recorded periodically and analysed statistically following SPSS Software version 11.5

3 Main results

- The results shown that nano chitosan at concentration 1,5% having the best results of growth inhibition to Penicillinum expansum and Botryotinia fluckeliana those are typical mold infested and damaged on plum

- Nano chitosan at concentration of 3000 ppm, processing time at one minute have the best ability to inhibit the target for total microorganism and yeast, mold on the plum surface during storage at room temperature

- Films are formed from composites of chitosan with oleic acid has the lowest solubility and water vapor permeability

- Composites of chitosan with oleic acid could maintain the best quality and shelf life of Tam Hoa plum

of screpes infected fungal, and the decay rate by mold

Nano chitosan at concentration of 3000 ppm, processing time at one minute have the best ability to inhibit the target for total microorganism and yeast, mold on the plum surface during storage at room temperature Affter 7 days of storage microorganism cell density was observed still at a safe level 104 – 106 cells/gam

Films are formed from composites of chitosan with oleic acid has the lowest solubility and water vapor permeability

Result storage plum by chitosan, nano chitosan and their composites with oleic acid at room temperature (30 ± 20 C) showed that composite of chitosan with oleic acid could maintain the lowest natural weight loss, the lowest total soluble solids, sensory quality were rated as the highest Overal comparision about the practical application value between nano chitosan and composite of chitosan with oleic acid formulation coatings, the select composite has over advantage

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Chitosan được biết đến như là một chất có khả năng kháng vi sinh vật, khả năng phân hủy sinh học và không độc được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực công nghiệp, y tế, chế biến và bảo quản nông sản (Elsabee et al., 2012) Nhiều công trình nghiên cứu ứng dụng chitosan để tạo màng bề mặt dùng trong bảo quản rau quả tươi đều có chung kết luận rằng chitosan có tác dụng làm chậm quá trình chín và già hóa, làm giảm cường độ hô hấp của rau quả, làm giảm sự hao hụt khối lượng tự nhiên, giữ được màu sắc (Aider, 2010) Tuy nhiên, do chitosan là một polysacharide có bản chất ưa nước nên khả năng giữ ẩm kém (Elsabee & Abdou, 2013) Để cải thiện đặc tính giữ ẩm của chế phẩm tạo màng từ chitosan người ta thường kết hợp chitosan với một số hợp chất kỵ nước như chất béo (axit béo, dầu thực vật, tinh dầu, sáp) để tạo chất tạo màng dạng nhũ tương (Aguirre-Loredoa et al., 2014; Galus and Kadzinska, 2015) Bằng cách tạo nhũ tương chitosan với acid oleic, Vargas và cộng sự đã chỉ ra rằng việc bổ sung axit oleic không những tăng cường hoạt tính kháng vi sinh vật của chitosan mà còn cải thiện được tính ngăn cản mất nước ở quả dâu tây (Vargas et al., 2006)

Việc chitosan không tan trong nước mà chỉ tan trong dung dịch axit là một trong những hạn chế ứng dụng chitosan trong thực tế, nhất là khi muốn kết hợp chitosan với nhiều loại hợp chất khác có tính kiềm gây ra hiện tượng kết tủa chitosan Dung dịch pH axit cũng có thể gây hiệu ứng sinh lý bất lợi cho hoa quả khi phủ lên bề mặt Trong những năm gần đây, để cải thiện khả năng kháng khuẩn và tính tan của chitosan, các nhà khoa học đã tổng hợp và sử dụng nano chitosan, một vật liệu có khả năng tan tốt trong nước, khả năng kháng khuẩn cao hơn so với chitosan nguyên thủy do hạt nano chitosan có diện tích tiếp xúc và điện tích dương lớn hơn (Pilon et al., 2014; Nguyễn Thị Minh Nguyệt et al., 2016) Mặc dù có nhiều nghiên cứu riêng rẽ về tác động của chitosan, của nhũ tương chitosan với axit béo và của nano chitosan tới chất lượng và khả năng bảo quản hoa quả tươi, nhưng cho đến nay hầu như chưa có một nghiên cứu so sánh nào về tác dụng của của chúng được thực hiện trong cùng một điều kiện, trên cùng một đối tượng

Mận Tam Hoa (Plunus salisica) là loại cây ôn đới được trồng phổ biến ở

vùng miền núi phía bắc Việt Nam, tập trung tại Lào Cai, Lai Châu và Sơn La Đối với Lào Cai, quả mận Tam hoa được coi là đặc sản của tỉnh, được thị trường

cả nước ưa chuộng để ăn tươi Tuy nhiên tại Việt Nam, trên thực tế chưa có nhiều nghiên cứu bảo quản sau thu hoạch quả mận nói chung và mận Tam hoa nói riêng

Nấm mốc là một trong những đối tượng gây hại chủ yếu trên quả bảo quản sau thu hoạch, là nguyên nhân chính dẫn đến tổn thất về số lượng, chất lượng dinh dưỡng cũng như chất lượng cảm quan của quả Bệnh thường xuất hiện trên mận sau thu hoạch và trong quá trinh bảo quản là: Bệnh mốc xám (do chủng nấm mốc Botryotinia fluckeliana), bệnh mốc xanh (do chủng nấm mốc Penicillium expansum) gây ra (Trần Thị Mai và cs., 2002)

Từ những lý do trên chúng tôi tiến hành đề tài “ Nghiên cứu hoạt tính kháng nấm, tính chất chức năng, hiệu lực bảo quản của chitosan, nano chitosan

và compozit với axit oleic ứng dụng cho bảo quản quả mận Tam Hoa”

1.2 MỤC ĐÍCH - YÊU CẦU

1.2.1 Mục đích

- Xác định được tính chất kháng nấm gây nhiễm nhân tạo và tự nhiên, xác định được một số tính chất chức năng của màng film tạo thành từ chitosan, nano chitosan và compozit của chúng với axit oleic

- Xác định và so sánh được hiệu quả bảo quản của chitosan, nano chitosan

và compozit của chúng với axit oleic trên mận Tam Hoa

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CHITOSAN

2.1.1 Nguồn gốc và cấu trúc hóa học của chitosan

2.1.1.1 Nguồn gốc chitin/chitosan

Về mặt lịch sử, chitin được Braconnot phát hiện đầu tiên vào năm 1811, trong cặn dịch chiết từ một loại nấm Ông đặt tên cho chất này là “Fungine” để ghi nhớ nguồn gốc của nó Năm 1923, Odier phân lập được một chất từ bọ cánh cứng

mà ông gọi là “chitin” hay “chitine”, tiếng Hy Lạp gọi là vỏ giáp, nhưng ông không phát hiện ra sự có mặt của nitơ Cuối cùng cả Odier và Braconnot đều đi đến kết luận chitin có dạng công thức giống với cellulose Sự có mặt của nitơ trong chitin đã được Lassaige chứng minh vào năm 1843, từ đó nhân loại bắt đầu nghiên cứu và ứng dụng lâu dài hợp chất này và các dẫn xuất của nó (Shahidi et al., 1999)

Ở động vật chitin là một thành phần cấu trúc quan trọng trong vỏ một số động vật không xương sống như côn trùng, nhuyễn thể, giáp xác, giun tròn Hàm lượng chitin (theo % chất khô) ở động vật giáp xác như tôm, cua (58,85%), côn trùng (20-60%), động vật thân mềm (3-26%), giun đốt (20-28%), ruột khoang (3 – 30%), rong biển chứa một lượng nhỏ chitin, nấm có chứa khoảng 45% chitin (Mati-Baouche et al., 2014) Ở động vật bậc cao, monome của chitin

là một thành phần chủ yếu trong mô da giúp cho sự tái tạo và gắn liền các vết thương ở da Ở vi sinh vật chitin có trong thành tế bào nấm, trong sinh khối nấm mốc và một số loại tảo (Sun et al., 2014)

2.1.1.2 Cấu trúc hóa học của chitosan

a Công thức cấu tạo của chitin

Chitin có cấu trúc là một polyme được tạo thành từ các đơn vị N – acetyl –

β – D – glucosamin liên kết với nhau bởi liên kết β – 1 – 4 glucoside

Hình 2.1 Công thức cấu tạo của chitin

Chitosan thu được từ quá trình diacetyl hóa chitin, thay thế nhóm N-acetyl thành nhóm amin ở vị trí C2 Do qúa trình acetyl hóa xảy ra không hoàn toàn nên người ta quy ước nếu độ diacetyl hóa (degree of deacetylation)(DD), DD > 50% thì gọi là chitosan, nếu DD < 50% thì gọi là chitin

Chitosan có cấu trúc tuyến tính từ đơn vị 2-deoxy-β-D-glucosamine liên kết với nhau bằng liên kết β-(1-4) glucozit

b Cấu trúc hóa học của Chitosan

Hình 2.2 Cấu trúc của chitosan

Tên gọi khoa học: Poly(1-4)-amino-2deoxy- β-D-glucose; poly(1-4)-

amino-2deoxy- β-D-glucopyranose

Công thức phân tử: [C6H11O4N]n

Phân tử lượng: Mchitosan = (161,07)n

Trong thực tế các mạch chitin – chitosan đan xen nhau, vì vậy tạo ra nhiều sản phẩm đồng thời, việc tách và phân tích chúng rất phức tạp (Huỳnh Nguyễn Duy Bảo và cs., 2000)

2.1.2 Tính chất cơ bản của chitosan

2.1.2.1 Tính chất vật lý

Chitosan là chất rắn hình vẩy, xốp, nhẹ, màu trắng ngà, không mùi, không

vị, có thể xay nhỏ ở các kích thước khác nhau Nhiệt độ nóng chảy ở 309 –

3110C tùy vào trọng lượng phân tử và mức độ diacetyl hóa Trọng lượng phân tử 10000- 1200000 Da tùy theo điều kiện sản xuất Tỷ trọng của chitosan trong động vật giáp xác rất cao khoảng 0,39g/lit phụ thuộc vào loài giáp xác, phương pháp chế biến, mức độ diacetyl hóa (Dutta et al., 2004)

Quá trình diacetyl hóa bao gồm quá trình loại nhóm acetyl khỏi chuỗi phân

tử chitin và hình thành phân tử chitosan với nhóm amin hoạt động hóa học cao Mức độ diacetyl hóa là một đặc tính quan trọng của quá trình sản xuất chitosan bởi nó ảnh hưởng đến tính chất lý, hóa học và khả năng ứng dụng của chitosan

Mức độ diacetyl hóa vào khoảng 70 – 100% phụ thuộc vào loài giáp xác, phương pháp sử dụng Có nhiều phương pháp để xác định mức độ diacetyl hóa của chitosan như: Khử ninhydrin, chuẩn độ theo điện thế, quang phổ hồng ngoại, chuẩn độ pH, Trong đó phương pháp sử dụng hồng ngoại thường được sử dụng

để thiết lập các giá trị mức độ deacetyl hóa của chitosan Khi ở mức độ diacetyl hóa thấp, chitosan có khả năng hút ẩm lớn do vậy trước khi phân tích chitosan cần phải sấy (Pal et al., 2007)

Tính tan của chitosan phụ thuộc vào mức độ diacetyl hóa, sự phân bố của các nhóm acetyl dọc theo chuỗi chính, trọng lượng phân tử và bản chất của các axit được sử dụng để cho proton, nhưng không giống như chitin, chitosan hòa tan trong dung dịch axit loãng có pH < 6.0 do sự có mặt của các nhóm anin (Leceta

et al., 2013a) Các acid hữu cơ như acetic, formic, lactic thường được sử dụng để hòa tan chitosan Dung dịch axit axetic nồng độ cao tại nhiệt độ cao có thể dẫn đến dipolyme hóa chitosan Ở pH cao có thể xảy ra hiện tượng kết tủa hoặc đông

tụ nguyên nhân là do hình thành hỗn hợp với chất keo anion Tính tan của chitosan còn bị ảnh hưởng bởi mức độ diacetyl hóa, mức độ diacetyl hóa trên 85% để đạt được tính tan mong muốn (Shahidi et al., 1999)

Chitosan có khả năng tạo màng sử dụng trong bảo quản thực phẩm Khi sử dụng màng chitosan dễ dàng điều chỉnh nhiệt độ, độ thoáng cho thực phẩm Màng chitosan khá dai, khó xé rách, có độ bền tương đương với một số chất dẻo vẫn được dùng để bao gói (Shahidi et al., 1999)

Trong phân tử các chitosan có chứa các nhóm chức mà trong đó các nguyên tử oxy và nito của nhóm chức có cặp electron chưa sử dụng nên chúng

có khả năng tạo phức với kim loại như: Hg+, Zn2+, Cu2+, Ni2+, Co2+… Tùy

nhóm chức trên mạch polyme mà thành phần và cấu trúc của phức khác nhau (Hiroshi, 1997)

2.1.2.3 Tính chất sinh học và độc tính của chitosan

Chitosan là hợp chất tự nhiên không độc, dùng an toàn cho người, có tính hòa hợp sinh học cao với cơ thể, có khả năng tự phân hủy sinh học (Elsabee et

al, 2012) Chitosan có nhiều tác dụng sinh học đa dạng như: có khả năng hút nước, giữ ẩm, tính kháng nấm, tính kháng khuẩn, với nhiều chủng loại vi sinh vật khác nhau, kích thích sự phát triển tăng sinh của tế bào, có khả năng nuôi dưỡng tế bào trong điều kiện ngèo dinh dưỡng, tác dụng cầm máu, chống xưng

u (Zemljic et al., 2013)

Chitosan là chất thân lipid có khả năng hấp thụ dầu mỡ cao, chúng có thể hấp thụ 6 – 8 lần trọng lượng phân tử Chitosan phân tử lượng nhỏ có điện tích dương nên có khả năng gắn kết với điện tích âm của lipid và acid tạo thành những chất có phân tử lượng lớn không bị tác dụng bởi men tiêu hóa Do đó không bị hấp phụ vào cơ thể mà được thải ra ngoài làm giảm cholesterol, acid uric trong máu nên tránh được nguy cơ bệnh tim mạch, bệnh gut, kiểm soát được tăng huyết áp và giảm cân Với khả năng thúc đẩy hoạt động của các peptide – insulin, kích thích việc tiết ra insulin ở tuyến tụy nên chitosan đã được dùng để điều trị bệnh tiểu đường Nhiều công trình nghiên cứu đã công bố khả năng kháng đột biến, kích thích làm tăng cường hệ thống miễn dịch cơ thể, tăng cường bạch cầu, hạn chế sự phát triển các tế bào u, ung thư, HIV/AIDS, chống tia tử ngoại, chống ngứa của chitosan (Hsieh et al., 2007)

Vào năm 1968, Arai và cộng sự đã xác định chitosan hầu như không độc, chỉ số LSD50 = 16g/kg cân nặng cơ thể, không gây độc lên súc vật thực nghiệm

và người, không gây độc tính trường diễn Dùng chitosan loại trọng lượng phân

tử trung bình thấp để tiêm tĩnh mạch không thấy có tích lũy ở gan Loại chitosan

có DD = 50% có khả năng phân hủy sinh học cao, sau khi tiêm vào ổ bụng chuột,

nó được thải trừ dễ dàng, nhanh chóng qua thận và nước tiểu, chitosan không phân bố tới gan và lá lách (Dutta et al., 2004)

2.1.3 Đặc tính kháng vi sinh vật của chitosan

2.1.3.1 Đặc tích kháng vi sinh vật của chitosan

Chitosan có khả năng kháng nhiều loài vi sinh vật như vi khuẩn Gram âm,

vi khuẩn Gram dương, nấm mốc và nấm men Khả năng kháng khuẩn của chitosan được cho là do tương tác tĩnh điện giữa các polycation của chitosan với

các ion âm trên màng tế bào vi sinh vật Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của chitosan đối với vi khuẩn Gram âm và Gram dương từ 100 – 2000 ppm (Goy et al., 2009) Nghiên cứu khả năng kháng một số vi sinh vật gây hư hỏng thực phẩm của chitosan cho thấy, nấm men bị loại bỏ hoàn toàn khi tăng thêm 0,3g chitosan trên mỗi lít nước ép táo đóng chai tiệt trùng được lưu trữ tại 7°C Số lượng vi khuẩn lactic tăng với tốc độ chậm hơn Tuy nhiên sự gia tăng số lượng vi khuẩn thấp hơn so với đối chứng (Rhoades and Roller, 2000) Chitosan sử dụng để xử

lý nước ép trái cây kết quả cho thấy chitosan ức chế nấm men nhưng không ức chế E coli O157: H7 (Kiskó et al., 2005) Tuy nhiên, Abd and Niamah (2012) cho rằng chitosan ở nồng độ 0,2-1 g L trong nước ép táo có thể ức chế sự tăng trưởng của một số vi khuẩn, nấm mốc và nấm men gây hư hỏng nước ép táo Gần đây phức chitosan arginine cho thấy hoạt động kháng khuẩn E.coli O157 trong nước cốt gà (Lahmer et al., 2012)

Nghiên cứu hiệu quả kháng nấm mốc gây hư hỏng quả của chitosan nồng

độ 0,5; 1; 1,5 và 2% cho thấy chitosan có tác dụng kháng nấm ở các giai đoạn phát triển khác nhau (sự tăng trưởng của sợi nấm, sự nảy mầm của bào tử) của cả Colettochitrum musae phân lập từ chuối, Colettochitrum gloeosporioides phân lập từ đu đủ và thanh long (Zahid et al., 2012) Kết quả này cũng tương tự như kết quả của Bautista-Baños et al (2004) cho rằng sự tăng trưởng của sợi nấm và

sự này mầm của bảo tử nấm Fusarium, Penicillium và Rhizopus bị ức chế bởi chitosan Tuy nhiên so với Penicillium và Rhizopus thì Fusarium là nấm nhạy cảm nhất Việc giảm tối đa trọng lượng khô của sợi nấm và ức chế hình thành bào tử được quan sát thấy ở chitosan nồng độ 2% đối với Colettochitrum musae phân lập từ chuối, Colettochitrum gloeosporioides phân lập từ đu đủ và thanh long (Zahid et al., 2012) Hiệu ứng tương tự cũng được chứng minh trong các nghiên cứu trước đây về F oxysporum phân lập từ đu đủ (Bautista-Baños et al., 2004) Các nghiên cứu khác cũng đã chỉ ra rằng chitosan kích thích hình thành bào tử của Penicillium digitatum (Bautista-Baños et al., 2004) và C gloeosporioides (Bautista-Baños et al., 2005)

2.1.3.2 Những yếu tố ảnh hưởng đến khả năng kháng vi sinh vật của chitosan

Tính kháng vi sinh vật của chitosan không chỉ phụ thuộc vào các điều kiện bên ngoài (vi sinh vật đích, tính chất của môi trường, pH, nhiệt độ, vv), mà còn phụ thuộc vào các yếu tố bên trong (như trọng lượng phân tử và mức độ polymer hóa và mức độ diacetyl hóa) (Vargas et al., 2012)

- Trọng lượng phân tử: Nhiều nhà nghiên cứu đã thông báo rằng hoạt tính kháng khuẩn của chitosan phụ thuộc vào trọng lượng phân tử Nghiên cứu của Hwang (1998) khảo sát khả năng kháng E coli của chitosan có trọng lượng phân tử từ 10000 – 170000 Dalton cho rằng chitosan có trọng lượng phân tử lớn hơn 30000 Dalton có hiệu quả diệt E coli cao nhất Chitosan có khối lượng phân

tử thấp được cho là có khả năng kháng khuẩn cao hơn so với chitosan thông thường có khối lượng phân tử cao (Dutta et al., 2009) vì chitosan có khối lượng phân tử thấp có khả năng tan trong nước cao hơn dẫn đến phản ứng tốt hơn với các vị trí hoạt động của vi sinh vật Tuy nhiên kết quả nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của chitosan phụ thuộc vào trọng lượng phân tử là không hoàn toàn tương thích Trọng lượng phân tử tăng làm giảm hoạt tính kháng E.coli của chitosan (Gerasimenko et al., 2004) Ngược lại với kết quả đề cập ở trên không

có sự khác biệt trong hoạt động kháng khuẩn của chitosan có trọng lượng phân tử khác nhau đối với E coli và Bacillus subtilis (Gerasimenko et al., 2004)

- Mức độ diacetyl hóa (DD)

Hiệu quả kháng khuẩn của chitosan cũng phụ thuộc vào mức độ diacetyl hóa Mức độ diacetyl hóa cao làm tăng khả năng hòa tan chitosan và tăng mật độ điện tích do đó cải thiện độ bám dính của chitosan lên các tế bào vi sinh vật (Aider and de Halleux, 2010) Mặt khác sự gia tăng DD có nghĩa là số lượng các nhóm amin trong chitosan tăng lên, kết qủa là trong môi trường có tính acid làm gia tăng sự tương tác giữa chitosan và các điện tích âm trên màng tế bào vi sinh vật (Elsabee and Abdou, 2013)

- Độ pH

Hoạt động kháng khẩn của chitosan bị ảnh hưởng mạnh mẽ bởi pH Ở môi trường có giá trị pH thấp, có khả năng hòa tan chitosan cao và proton trong dung dịch chitosan cao làm tăng hiệu quả kháng khuẩn (Aider and de Halleux, 2010) Nghiên cứu của Tsa and Su (1999) kiểm soát hoạt động kháng khuẩn của chitosan (DA 98%) đối với E coli ở các giá trị pH khác nhau là 5,0; 6,0; 7,0; 8,0; 9,0 cho rằng chitosan có khả năng kháng khuẩn tốt nhất ở pH 5,0 và chitosan có hoạt tính kháng khuẩn kém ở pH 9,0 Các nhà nghiên cứu khác cũng kết luận rằng chitosan không có hoạt tính kháng khuẩn ở pH 7,0 do nhóm amin và độ hòa tan của chitosan ở pH này rất kém Điều này cho thấy hoạt tính kháng khuẩn còn phụ thuộc vào bản chất cation của chitosan

- Nhiệt độ

Nhiệt độ cũng có ảnh hưởng đến hoạt tính kháng khuẩn của chitosan Nhiệt độ cao hơn 370 C làm tăng cường hoạt tính kháng khuẩn của chitosan so với nhiệt độ lạnh Tuy nhiên, ảnh hưởng lớn nhất về hoạt động kháng khuẩn là môi trường xung quanh Tsai and Su (1999) kiểm tra tác động của nhiệt độ đến hoạt động kháng E.coli của chitosan cho biết huyền phù tế bào E.coli trong đệm phosphate (pH 6) có chứa chitosan nồng độ 150 ppm được nuôi ở các nhiệt độ là

4, 15, 25, 370C trong các khoảng thời gian khác nhau và định lượng tế bào còn sống sót Kết quả là hoạt động kháng khuẩn của chitosan tỷ lệ thuận với nhiệt độ

Ở nhiệt độ 25 và 370C các tế bào E.coli đã hoàn toàn bị giết chết trong vòng 1 giờ Tuy nhiên, ở nhiệt độ thấp hơn (4 và 150C) số lượng E.coli giảm trong vòng 5giờ đầu tiên và sau đó ổn định Các tác giả kết luận rằng hoạt động kháng vi khuẩn giảm do tỷ lệ tương tác giữa chitosan và các tế bào vi khuẩn ở nhiệt độ thấp thì thấp hơn ở nhiệt độ cao

- Vi sinh vật đích

Các vi sinh vật đích cũng có một vai trò quan trọng trong hiệu quả kháng khuẩn của chitosan Mật độ điện tích trên bề mặt tế bào vi sinh vật là một yếu tố quyết định đến lượng chitosan hấp phụ Lượng chitosan hấp phụ nhiều rõ ràng sẽ dẫn đến những thay đổi lớn trong cấu trúc và tính thấm của màng tế bào Nấm men và nấm mốc thường nhạy cảm nhất, tiếp theo là vi khuẩn Gram dương và vi khuẩn Gram âm (Aider and de Halleux, 2010)

2.1.3.3 Cơ chế kháng vi sinh vật của chitosan

Mặc dù cơ chế kháng khuẩn chính xác của chitosan chưa được hiểu một cách đầy đủ, tuy nhiên có 3 cơ chế giải thích khả năng kháng khuẩn của chitosan là: Khả năng kháng khuẩn của chitosan là do sự tương tác giữa điện tích dương của nhóm amin (NH3+) ở giá trị pH thấp hơn 6,3 (các pKa của chitosan) và bề mặt tích điện âm của vi khuẩn Kết quả là làm thay đổi các đặc tính của màng bán thấm, do đó gây mất cân bằng thẩm thấu bên trong và bên ngoài dẫn đến ức chế sự tăng trưởng của vi sinh vật (Shahidi et al, 1999) Chitosan thủy phân peptidoglycan trong thành tế bào vi sinh vật dẫn đến làm rò rỉ các chất điện giải trong tế bào như các ion kali và các thành phần protein có trọng lượng phân tử thấp khác (như protein, axit nucleic, glucoza và lactat dehydrogenaza) (Dutta et al., 2009)

Trong nghiên cứu về tính kháng E.coli của chitosan từ vỏ tôm người ta cho rằng khả năng ức chế vi khuẩn của chitosan là do liên kết giữa chuỗi polyme của chitosan với các ion kim loại trên bề mặt của vi khuẩn làm thay đổi tính thấm của màng tế bào Khi bổ sung chitosan vào môi trường, tế bào vi khuẩn sẽ chuyển từ điện tích âm sang điện tích dương Quan sát trên kính hiển vi huỳnh quang cho thấy chitosan không trực tiếp hoạt động ức chế vi khuẩn E.coli mà do

sự kết lại của các tế bào và sự tích điện dương ở màng tế bào của vi khuẩn

Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của chitosan có khối lượng phân tử khác nhau trên 6 loài vi khuẩn Cơ chế kháng khuẩn của chitosan được xác định dựa trên việc đo tính thấm của màng tế bào vi khuẩn và quan sát sự nguyên vẹn của tế bào Kết quả chỉ ra rằng khả năng này giảm khi khối lượng nguyên tử tăng Chitosan cũng là nguyên nhân làm rò rỉ các chất trong tế bào và phá hủy thành tế bào

2.2 ỨNG DỤNG CỦA CHITOSAN TRONG BẢO QUẢN RAU QUẢ TƯƠI

Chitosan được biết đến như một chất bảo quản tự nhiên được áp dụng trên nhiều loại rau quả Bằng cách tạo ra một màng bán thấm trên bề mặt rau quả, chitosan có tác dụng làm thay đổi khí quyển bên trong (thay đổi tính thấm nước, oxy, carbon dioxide) do đó làm giảm sự thoát hơi nước, giảm tỷ lệ hô hấp, trì hoãn quá trình chín, kéo dài thời gian bảo quản và kiểm soát thối hỏng ở nhiều loại quả (Shi et al., 2013) Trong hầu hết các nghiên cứu bảo quản rau quả đều cho rằng tác dụng duy trì chất lượng trái cây của chitosan phụ thuộc phần lớn vào tính chất của màng, loại trái cây, độ chín cũng như điều kiện bảo quản Nghiên cứu của Krishna & Rao (2014) bảo quản ổi bằng chitosan 1% chỉ ra rằng chitosan có tác dụng giảm tỷ lệ hô hấp, giảm hao hụt khối lượng tự nhiên, màu sắc, độ cứng và chất lượng được duy trì cho đến khi kết thức quá trình bảo quản

ở nhiệt độ thường (28 – 320C, độ ẩm 32 – 41%) trong 7 ngày

Nghiên cứu của Hossain & Iqbal (2016) bảo quản chuối bằng chitosan tạo

ra từ vỏ tôm kết luận xử lý chuối bằng chitosan nồng độ 1% có tác dụng làm giảm hao hụt khối lượng tự nhiên thấp nhất, duy trì được màu sắc, chất lượng dinh dưỡng, chất lượng cảm quan tốt nhất, mức độ nhiễm bệnh và tỷ lệ bệnh thấp nhất và kéo dài thời gian bảo quản chuối 16,6 ngày bảo quản ở nhiệt độ thường Theo nhóm tác giả Trần Thị Thu Huyền, Nguyễn Thị Bích Thủy (2011), Nghiên cứu ảnh hưởng của Chitosan đến những biến đổi hóa lý của quả nhãn sau thu hoạch cho biết: Bảo quản nhãn bằng phương pháp bao màng chitosan và để

trong bao bì có đục lỗ, kết hợp với khống chế môi trường ở mức 100 C có tác dụng kéo dài thời gian bảo quản và duy trì chất lượng quả Nhãn được bảo quản bằng màng chitosan với nồng độ 2% có thể duy trì chất lượng của quả trong thời gian 20 ngày, đảm bảo tiêu chuẩn về dinh dưỡng và cảm quan được người tiêu dùng chấp nhận

Theo nhóm tác giả Nguyễn Bích Thủy và cs (2008) nghiên cứu ảnh hưởng của chitosan đến chất lượng và thời gian bảo quản quả chanh đã kết luận: Màng chitosan bao bọc quanh quả chanh tươi có tác dụng làm giảm hao hụt khối lượng

tự nhiên, giữ hàm lượng chất khô tổng số, hàm lượng axit hữu cơ tổng số và vitamin C vẫn còn cao trong suốt thời gian bảo quản Do đó duy trì được chất lượng dinh dưỡng, chất lượng cảm quan của quả trong quá trình bảo quản Chitosan có tác dụng bảo quản chanh lên tới 30 ngày

Một số nghiên cứu bảo quản chuối bằng màng chitosan cho biết chitosan có tác dụng làm giảm sự biến màu vỏ quả Rau quả sau khi thu hoạch sẽ dần dần bị thâm, làm giảm chất lượng và giá trị Rau quả bị thâm là do quá trình lên men tạo

ra các sản phẩm polyme hóa của oquinon Nhờ bao gói bằng màng chitosan đã ức chế được hoạt tính oxy hóa của các polyphenol, làm thành phần của anthocyamin, flavonoid và tổng lượng các hợp chất phenol ít biến đổi, giữ cho màu sắc của rau quả tươi lâu hơn Chitosan nồng độ 1% được hòa tan trong dung dịch axit acetic 1% sau đó được phun lên bề mặt chuối Ưu điểm của phương pháp này là kéo dài thời gian bảo quản, độ tươi của chuối gấp 3 lần so với các mẫu đối chứng (không sử dụng chitosan) (Đặng Văn Phú và cs., 2008)

2.3 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ NANO CHITOSAN

2.3.1 Giới thiệu về nano chitosan

Gần đây, hướng nghên cứu sử dụng nano chitosan thay thế chitosan được quan tâm nhằm tăng cường và mở rộng hơn nữa tiềm năng ứng dụng của hợp chất này cho các mục đích công nghệ sinh học và hóa học Nhũ tương của nano chitosan có kích thước siêu nhỏ với độ ổn định động học cao đã được áp dụng thương mại trong ngành công nghiệp dược phẩm và hóa chất nông nghiêp (Sonneville-Aubrun et al., 2004) Nano chitosan là hạt chitosan có kích thước nano met (10 đến 100nm) do có kích thước siêu nhỏ nên nano chitosan dễ đàng

đi qua màng tế bào, có diện tích và điện tích bề mặt cực lớn nên được ứng dụng nhiều trong y học như mang thuốc, vaccine, vecto chuyển gen, chống ung thư

(Patel et al., 2009) Nhũ tương của nano chitosan có thể gói gọn các thành phần chức năng trong giọt của chúng, do đó tạo điều kiện làm giảm sự thoái hóa của các thành phần này (Clements and Decker, 2000) Mặt khác do có kích thước nhỏ nên nano chitosan có khả năng xâm nhập vào tế bào nấm tốt hơn so với chitosan thông thường, hơn nữa khi sử dụng nano chitosan có thể lượng chitosan thực tế cần thiết để xử lý trái cây ít hơn so với chitosan thông thường do nano chitosan

có khả năng thâm nhập và hấp thu cao hơn so với chitosan (Zahid et al., 2012)

Ở nước ta nghiên cứu về nano chitosan còn tương đối ít, chỉ có một số công trình nghiên cứu như: Nghiên cứu hoạt tính kháng nấm của phức hệ nano chitosan – tinh dầu nghệ (kích thước hạt nano trên 100nm) đã được thử nghiệm thành công trên C albicans, T mentagrophyte, F oxysporum và P italicum (Nguyễn Thị Kim Cúc và cs., 2014) Theo tác giả Nguyễn Thị Minh Nguyệt Nano chitosan, một vật liệu có khả năng tan tốt trong nước, khả năng kháng khuẩn cao hơn so với chitosan nguyên thủy do hạt nano chitosan có diện tích tiếp xúc và điện tích dương lớn hơn (Nguyễn Thị Minh Nguyệt và cs., 2016)

2.3.2 Phương pháp tổng hợp nano chitosan

Theo Shi et al (2011a), có 5 phương pháp chủ yếu tạo hạt nano chitosan là: phương pháp khâu mạch nhũ tương (emulsion cross-linking), phương pháp giọt tụ/ kết tủa (coacervation/ precipitation), phương pháp hợp nhất giọt nhũ tương (emulsion –droplet coalescence), phương pháp tạo gel ion (ionic gelation)

và phương pháp mixen đảo (reverse micellar)

Phương pháp khâu mạch nhũ tương: Hỗn hợp nhũ tương nước trong dầu (w/v) được tạo ra bằng cách phân tán dung dịch chitosan trong dầu Những giọt lỏng được làm bền bởi chất hoạt động bề mặt Dung dịch nhũ tương sau đó được khâu mạch bằng tác nhân tạo nối thích hợp như glutaraldehyde Hai nhóm – CHO glutaraldehyde sẽ phản ứng với nhóm – NH2 của chitosan để khâu mạch tạo hạt nano chitosan Các hạt nano sau đó được rửa sạch và sấy khô (Agnihotri

et al., 2004)

Phương pháp giọt tụ/ kết tủa: Phương pháp này sử dụng tính chất của chitosan là không tan trong dung dịch kiềm Bởi vậy, chitosan sẽ bị kết tủa, tạo giọt ngay khi dung dịch chitosan tiếp xúc với dung dịch kiềm Dung dịch kiềm có thể là NaOH, NaOH-metanol hoặc ethandiamine Dung dịch chitosan sẽ được một thiết bị nén phun vào dung dịch kiềm để tạo hạt nano (Agnihotri et al., 2004)

Phương pháp hợp nhất giọt nhũ tương: Phương pháp này lần đầu tiên được sử dụng vào năm 1999 Phương pháp này sử dụng nguyên tắc của cả hai phương pháp: tạo nối ngang nhũ tương và kết tủa Thay vì tác nhân tạo nối ngang, kết tủa tạo ra bằng cách cho các giọt chitosan kết hợp với các giọt NaOH, một hệ nhũ tương bền chứa dung dịch chitosan cùng với thuốc tạo ra trong parafin lỏng Đồng thời một hệ nhũ tương bền khác chứa dung dịch chitosan và NaOH cũng được tạo ra theo cách như trên Khi cả hai hệ nhũ tương này được trộn lại với tốc độ khuấy cao, các hạt từ mỗi hệ sẽ va chạm một cách ngẫu nhiên, hợp lại và kết tủa thành những hạt nhỏ (Agnihotri et al., 2004)

Phương pháp tạo gel ion: Cơ chế của phương pháp này dựa trên tương tác tĩnh điện giữa chitosan tích điện dương và một polyanion như tripolyphosphate Kỹ thuật này có ưu điểm là giai đoạn chuẩn bị đơn giản và thực hiện trong môi trường nước Đầu tiên chitosan được hòa tan vào dung dịch axit axetic Sau đó chitosan được trộn lẫn với polyanion để tạo hạt nano chitosan dưới điều kiện khuấy từ liên tục tại nhiệt độ phòng Kích thước và dện tích bề mặt có thể kiểm soát bằng cách sử dụng những tỷ lệ chitosan và polyanion khác nhau (Racovita et al., 2008)

Phương pháp mixen đảo: Trong phương pháp này, người ta hòa tan chất hoạt động bề mặt vào dung môi hữu cơ để tạo ra những hạt mixen đảo Dung dịch lỏng chứa chitosan và thuốc được thêm từ từ với tốc độ khuấy không đổi để tránh làm đục dung dịch Pha lỏng được giữ sao cho hỗn hợp trở thành pha vi nhũ trong suốt Sau đó tác nhân tạo nối ngang được thêm vào và khuấy qua đêm

Cô quay loại dung môi, phần còn lại phân tán lại trong nước Dung dịch muối thích hợp được thêm vào để kết tủa chất hoạt động bề mặt Hỗn hợp được ly tâm Phần dung dịch ở trên chứa hạt nano mang thuốc được chiết ra, cho qua màng thẩm tách 1 giờ Đông cô chất lỏng thu được cho ta bột thuốc (Agnihotri et al., 2004)

2.3.3 Hoạt tính kháng khuẩn của nano chitosan

Hạt nano chitosan có diện tích tiếp xúc và điện tích lớn hơn chitosan thông thường nên có hiệu quả kháng khuẩn cao hơn nhiều lần so với chitosan (Qi, 2004) Nghiên cứu chế tạo hạt nano chitosan để tăng hoạt tính kháng khuẩn Hạt nano chitosan được chuẩn bị bằng phương pháp tạo gel trong tripolyphosphate (TPP), kích thước hạt 40nm Các thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của hạt nano chitosan trên 4 loại vi khuẩn E Coli, S typhimurium, S choleraesuis và S

aureus cho thấy hoạt tính kháng khuẩn tăng lên nhiều lần so với chitosan thông thường Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của hạt nano chitosan là 1/8 – 1/32μg/ml

so với chitosan là 8 – 16μg/ml và kháng sinh doxycyline là 1/4 - 4μg/ml

Một số nghiên cứu cho rằng nano chitosan có hoạt tính kháng nấm với giá trị MIC trong khoảng 10 – 500 ppm đối với nhiều loài khác nhau Các loại nấm như Botrytis cinerea và Drechstera sorokiana kháng ở MIC rất thấp 10ppm trong khi một số loại nấm khác như Candida albicans, Microsporum canis, Aspergillus fumigatus, Aspergillus parasiticus đã chỉ ra MIC cao hơn từ 1000 - 2000 ppm, trong khi đối với Trichophyton mentagrophytes và Byssochlamys spp các giá trị MIC được phát hiện khoảng 2000-5000 ppm (Goy et al., 2009) Ngoài ra nồng

độ, kích thước, Zeta tiềm năng của cả chitosan có khối lượng phân tử thấp và cao

có xu hướng ảnh hưởng tới tác dụng ức chế đối với C albicans và F solani Tuy nhiên chỉ có dung dịch chitosan khối lượng phân tử cao và các hạt nano chitosan

có thể ức chế sự tăng trưởng của A niger (Ly et al., 2012)

Đánh giá khả năng kháng khuẩn của nano chitosan bằng cách xác định nồng

độ ức chế tối thiểu (MIC) và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) với E coli, Salmonela choleraesuis và S aureus in vitro kết luận rằng nano chitosan có khả năng kháng khuẩn cao hơn chitosan hòa tan trong môi trường Muller Hinton (MH) (Han et al, 2010)

Nghiên cứu của (Zahid et al., 2012) thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của nhũ tương nano chitosan cho thấy, quan sát trên kính hiển vi điện tử qét ba loại nấm mốc Collecttotrichum musae phân lập từ chuối, collecttotrichum gloeosporioides phân lập từ đu đủ và thanh long cho thấy sợi nấm tích tụ và bào

tử có hình dạng bất thường có thể là do sự thay đổi của tế bào được đánh dấu Kết quả tương tự cũng được quan sát thấy trong một nghiên cứu gần đây của (Hetar et al., 2010), tìm thấy thay đổi tế bào được đánh dấu trong hình thái học của F oxysporum sau khi sử dụng nhũ tương của nano chitosan Các kết quả của nghiên cứu này cho thấy, nhũ tương của nano chitosan có hiệu quả hơn trong việc kiểm soát bệnh, trì hoãn việc khởi phát triệu chứng bệnh và giảm bớt những tiến trình bệnh Cũng trong nghiên cứu của Zahid et al (2012) cho rằng nhũ tương của nano chitosan nồng độ 1; 1,5 và 2% với kích thước giọt 200nm có khả năng kháng C musae tốt nhât, trong khi đó nhũ tương của nano chitosan cùng nồng độ có kích thước giọt 600nm cho thấy kết quả tốt nhất cho hai chủng khác

C gloeosporioides phân lập từ đu đủ và thanh long

2.3.4 Hiệu quả của nano chitosan trong bảo quản nông sản thực phẩm

Nano chitosan là vật liệu tự nhiên có đặc tính lý hóa, sinh học và kháng khuẩn thân thiện với môi trường và không độc được ứng dụng trong nhều lĩnh vực như dược phẩm, bao gói thực phẩm, công nghệ enzyme và xử lý nước thải Các hạt nano chitosan được sử dụng như là rào cản sinh học, để bảo vệ các đại phân tử như peptide protein, oligonucleotide suy thoái gen trong môi trường sinh học và dẫn truyền thuốc hoặc các đại phân tử tới đích (Shi et al., 2011a) Một số nghiên cứu đã chứng minh rằng hạt nano chitosan có thể cải thiện khả năng sinh học của thuốc, giảm dược động học của thuốc và bao gói thuốc (Shi et al., 2011b)

Trong những thập kỷ vừa qua các loại màng sinh học gia tăng một cách đáng kể do đặc tính kháng khuẩn và kháng nấm của chúng góp phần cải thiện chất lượng thực phẩm bảo quản Màng chitosan đã thu hút được sự quan tâm đặc biệt trong bảo quản thực phẩm và trong công nghệ bao gói Do màng chitosan có tác dụng ngăn cản khí có khả năng kháng khuẩn và kháng nấm cao chống lại các

vi sinh vật gây bệnh và hư hỏng thực phẩm bao gồm các loại nấm và vi khuẩn (Malmiri et al., 2011) Bổ sung hạt nano chitosan vào công thức tạo màng cải thiện độ dẻo và tính thấm hơi nước và không khí (Moura et al., 2009)

2.4 GIỚI THIỆU VỀ COMPOZIT CỦA CHITOSAN VỚI AXIT OLEIC 2.4.1 Một số tính chất của compozit của chitosan với axit oleic

Tương tự như hầu hết các các màng polysaccharide, màng chitosan có tính

ưa nước mạnh nên có khả năng ngăn cản tốt đối với không khí và chất béo nhưng khả năng giữ ẩm kém (Elsabee and Abdou, 2013), việc kiểm soát độ ẩm là mong muốn của hầu hết các ứng dụng bao bì thực phẩm Để cải thiện đặc tính giữ ẩm của chế phẩm tạo màng từ chitosan người ta thường kết hợp chitosan với một số hợp chất kỵ nước như chất béo (axit béo, dầu thực vật, tinh dầu, sáp) để tạo chất tạo màng dạng nhũ tương (Aguirre-Loredoa et al., 2014; Galus & Kadzinska, 2015) Tuy nhiên việc kết hợp với các hợp chất lipid thường làm suy yếu các tính chất cơ học của màng chitosan (Vargas et al., 2009)

Độ giòn là đặc tính vốn có của màng chitosan do cấu trúc phức tạp và lực liên kết giữa các polymer tự nhiên yếu Theo nhóm tác giả (Suyatma et al., 2004) màng chitosan giòn là do nhiệt độ chuyển thủy tinh (Tg) của polyer cao (2030C) Nhiệt độ chuyển thủy tinh của có liên quan đến độ cứng và cấu hình phân tử của

chitosan Bằng cách giảm lực liên kết giữa các phân tử và do đó tăng tính linh động của các chuỗi polymer, chất dẻo hóa như glycerol, sorbitol và polyethylene glycerol được đưa vào để giảm nhiệt độ chuyển thủy tinh của màng và cải thiện tính linh hoạt, khả năng kéo dài và độ dẻo dai của màng (Domjan et al., 2009)

Cơ chế hoạt động của chất dẻo hóa được giải thích như sau: Chất dẻo hóa được đưa vào để giảm lực ma sát giữa các chuỗi polymer Lý thuyết gel mặc nhiên cho rằng độ cứng của polyme xuất phát từ cấu trúc 3 chiều và chất dẻo hoạt động bằng cách phá vỡ các tương tác polymer-polymer ở các chuỗi liền kề, do đó làm tăng tính linh hoạt của các chuỗi này Các chất hoá dẻo có hiệu quả nhất là những chất có cấu trúc tương tự như các polymer, vì vậy chất dẻo như polyol là phù hợp nhất với màng polysaccharide (Sothornvit and Krochta, 2005) Một số nghiên cứu cho rằng việc bổ sung glycerol vào màng chitosan làm tăng tính thấm của màng (cả oxy và hơi nước) do sự gắn kết trong màng giảm (Azeredo et al., 2010)

Việc tạo màng như một lớp phủ không chỉ phụ thuộc vào sự gắn kết (lực hút giữa các phân tử polymer của màng) mà còn liên quan đến độ bám dính (lực hấp dẫn giữa màng và chất nền) (Sothirnvit and Krochta, 2005) Trong quá trình phủ màng cần có một chất bám dính tốt giữa bề mặt ẩm của thực phẩm và dung dịch tạo màng Khi các nhóm amino chính của chitosan và các proton trong dung dịch axit chiếm ưu thế sẽ chi phối các ion tích điện trái dấu trên bề mặt do đó đóng một vai trò quan trọng trong việc hấp thụ và bám dính Trong mọi trường hợp thì độ dày và tính đồng nhất là yếu tố quan trọng đối với tính giữ ẩm của màng (Hong et al., 2004) Đôi khi một chất hoạt động bề mặt là cần thiết để giảm sức căng bề mặt của dung dịch chitosan và tăng khả năng giữ ẩm (Choi et al., 2002; Casariego et al., 2008) (Choi et al., 2002) sử dụng tween 80 như một chất hoạt động bề mặt để làm giảm sức căng bề mặt của dung dịch tạo màng chitosan

và tăng cường khả năng giữ ẩm trên vỏ táo (Casariego et al., 2008) báo cáo rằng

độ ẩm và hệ số bám dính của màng chitosan trên bề mặt của cà chua và cà rôt giảm khi tăng nồng độ chitosan và tính thấm của chất dẻo hóa

2.4.2 Một số ứng dụng của compozit của chitosan trong bảo quản rau quả tươi

Một trong những hạn chế khi sử dụng màng chitosan là màng chitosan có khả năng giữ ẩm kém (Elsabee & Abdou, 2013) Để cải thiện đặc tính giữ ẩm của chế phẩm tạo màng từ chitosan người ta thường kết hợp chitosan với một số hợp chất

kỵ nước như chất béo (axit béo, dầu thực vật, tinh dầu, sáp) để tạo chất tạo màng

dạng nhũ tương (Aguirre-Loredoa et al., 2014; Galus and Kadzinska, 2015)

Nghiên cứu của Puttongsiri and Haruenkit (2010) bảo quản quýt Kiew Wan

ở nhiệt độ thường bằng màng chitosan kết hợp với axit oleic ở nồng độ chitosan

1% và axit oleic là 2,5% cho rằng màng tạo ra từ chitosan và axit oleic có tác

dụng tốt nhất trong việc giảm hao hụt khối lượng, hàm lượng ethanol trong dịch

quả và hàm lượng CO2 giảm

Nghiên cứu kéo dài thời gian bảo quản quả dâu tây đông lạnh bằng màng

phủ chitosan 1% kết hợp với axit oleic với nồng độ (0, 1, 2 và 4%) Dâu tây được

nhúng trong dung dịch thí nghiệm 15 giây, được để khô tự nhiên trong 1 giờ ở

200C và được đóng hộp 750ml Hộp được bảo quản tại 4 ± 10C Kết quả là màng

chitosan kết hợp với axit oleic có tác dụng làm tăng khả năng giữ ẩm và kháng

nấm Chất hòa tan, độ acid và độ pH không thay đổi đáng kể trong thời gian lưu

trữ và không bị ảnh hưởng bởi màng bảo quản (Vargas et al., 2006)

Màng tạo thành từ chitosan có chứa Tocophenyl acetate làm chậm đáng kể

sự đổi màu của quả dâu tây tươi và đông lạnh Sự phát triển của màng chitosan,

kẽm và vitamin E cũng cung cấp một cách thay thế cho việc giữ rau quả tươi,

mặc dù chưa hiệu quả để đạt đến đại trà (Meyers et al., 2007)

Nghiên cứu bảo quản dâu tây bằng màng chitosan 1%, 1,5%, hoặc kết

hợp với canxi gluconate lưu giữ ở 100C, độ ẩm là 70 ± 5%. Kết quả với nồng

độ chitosan 1,5% làm giảm đáng kể hoạt động hô hấp, chì hoãn sự chín, tỷ lệ

thối hỏng, hạn chế giảm khối lượng, độ cứng, màu sắc bên ngoài tốt nhất Bổ

sung canxi vào chitosan làm tăng độ cứng, giá trị dinh dưỡng của quả (Vargas

et al., 2006)

Nghiên cứu của Medieros et al (2012) Ứng dụng các lớp phủ nano nhiều

lớp của k-carrageenan và lysozyme trên quả lê ‘Rocha’ nguyên vẹn và lê tươi cắt

công bố rằng có ảnh hưởng tích cực trong tính chất ngăn cản khí và tính kháng

khuẩn, cũng như duy trì màu sắc, giảm tổn thất khối lượng Trong nghiên cứu của

(Jang et al., 2013) chỉ ra rằng lớp phủ Alginate/ nano-Ag có những lợi ích đáng kể

về tính chất hóa lý và sinh lý của nấm hương bảo quản 16 ngày ở 4 ± 10C

2.5 GIỚI THIỆU VỀ NGUYÊN LIỆU MẬN

Mận (Plunus salicica) thuộc họ hoa hồng (Rosaceae) tiếng anh gọi là Plum,

tiếng pháp gọi là plunier Là cây nguồn gốc ôn đới, nhưng có nhiều giống thích

nghi và phát triển được ở những vùng có khí hậu nhiệt đới gió mùa và có một mùa lạnh (Trần Thi Mai, 2002) Ở Việt Nam mận được trồng nhiều ở vùng miền núi và vùng cao Mộc Châu (Sơn La) Bắc Hà (Lào Cai) Chợ Đồn, Bạch Thông (Bắc Cạn), Quản Bạ (Hà Giang) Cây mận dễ trồng, sớm cho thu hoạch, cho năng suất cao, góp phần phủ xanh đất trống đồi núi trọc, cải thiện đời sống cho đồng bào vùng dân tộc thiểu số Quả mận được sử dụng chủ yếu ở dạng ăn tươi và tiêu thụ phần lớn ở các tỉnh phía Bắc Hiện nay chúng ta chưa có một dây truyền đồng

bộ, hiện đại để chế biến một lượng lớn mận cho nông dân Thực tế mận không được chú trọng nhiều trong vấn đề bảo quản tươi bởi vì giai đoạn thu hoạch mận

ở nước ta thường ngắn Hơn nữa sau khi mùa mận ở nước ta thu hoạch, Trung Quốc cũng bắt đầu thu hái mận, với ưu thế về sản lượng lớn, giá bán không cao, xuất khẩu sang thị trường nước ta theo con đường tiểu ngạch Do đó, mận nước

ta đưa vào bảo quản tươi sẽ gặp khó khăn trong quá trình tiêu thụ, cạnh tranh với mận Trung Quốc, hiệu quả kinh tế sẽ không cao

2.5.1 Thành phần hóa học của mận

Theo Guierơ, Mận chứa 82% nước, 8 – 10% đường, 1,5% acid Như vậy mận là loại quả chua, hơi ít đường Chất khoáng ở trong mận khá nhiều chiếm 0,6%: Fe, Ca, Mg, K, Mn,…

Cũng như các loại quả tươi khác mận là loại quả có hàm lượng nước lớn, nhiều chất dinh dưỡng và rất kém bền vững nên dễ bị hư hỏng nếu không chú ý khi thu hoạch, bảo quản lưu thông, phân phối thì chúng sẽ nhanh chóng bị hư hỏng và tỷ lệ tổn thất lớn

Trong quả mận có rất ít tinh bột và đường sucrose ở giai đoạn trước khi trưởng thành nhưng sau đó tăng dần trong quá trình chín Trong quả mận có rất nhiều loại đường như: D-glucitol, sorbitol, galactose, mannose, arabinose, rhamnose, raffinose và xylose, Trong mận có nhiều loại chất pectic khác nhau góp phần vào cấu trúc của quả mận Thành phần phenolic có mặt trong quả mận bào gồm neo-chlorogenic catechin, caeffeic acid, chlorogenic acid và rutine, với phenolic acid như là phenol chiếm ưu thế

Acid chính trong quả mận là acid malic và acid quinic, tạo nên vị acid cho mận Flavanone cũng có mặt, nhưng do không có màu nên không dễ để nhận thấy Trong mận có nhiều loại vitamin, nhưng vitamin C có mặt với một lượng khá lớn Hàm lượng protein trong quả rất thấp và các amino acid chính có mặt

bao gồm asparagine, axit aspartic, axit glutamic, glutamine, serine, threonine, valine, proline…màu của quả mận được hình thành bởi anthocyanin, nằm dưới lớp biểu bì Tác động về màu của anthocyanin được giải thích dựa trên phức của chúng với kim loại Độ sẫm màu phụ thuộc vào pH của môi trường Cyanidin-3-rutinoside và peonidin-3-rutinoside là các anthocyanin chính trong mận Lượng anthocyanin gia tăng trong quả khi đạt đến độ truởng thành Carotenoide cũng góp phần vào màu sắc của một số giống mận và bị tác động bởi quá trình sấy Một lượng các hợp chất liên quan đến quá trình chín của mận, bao gồm các loại terpene, alcohol, aldehyde và ester,… Mùi hương của hoa mận liên quan đến

sự có mặt của benzaldehyde Bề mặt của quả bao gồm lớp sáp chứa D-glucose, L-arabinose, D-xylose, L-rhamnose, axit gluconic và axit hexanoic (Trần Thị Mai, 2002)

2.5.2 Các quá trình xảy ra khi bảo quản mận

Những biến đổi về vật lý, sinh lý và sinh hóa xảy ra trong quá trình bảo quản quả mận liên quan chặt chẽ với tính chất tự nhiên của quả: như giống, điều kiện gieo trồng và chăm sóc, độ chín thu hái, kỹ thuật thu hái, vận chuyển và những yếu tố kỹ thuật trong quá trình bảo quản

2.5.2.1 Các quá trình vật lý

Sự giảm khối lượng tự nhiên của mận trong quá trình bảo quản phụ thuộc vào trạng thái sinh lý, thời điểm thu hái, kỹ thuật thu hái và điều kiện bảo quản Mận còn lớp phấn trắng bên ngoài sẽ bảo quản tốt hơn và dễ hơn so với mận mất lớp phấn trắng Lớp phấn trắng không những làm giảm sự bay hơi nước ở quả mận tránh hao hụt khối lượng, giảm độ căng bóng, mà còn làm giảm sự vận chuyển oxy, giảm sự hô hấp của quả kéo dài thời gian bảo quản quả

Mận thu hái còn non khi bảo quản sẽ chóng héo, mất độ tươi, độ căng bóng bởi vì các phần tử keo trong chất nguyên sinh và trong không bào có khả năng giữ nước yếu, nên tốc độ bay hơi nước rất lớn Tốc độ bay hơi nước của quả mận hái non gấp 2, 3 lần so với quả mận hái đúng độ chín kỹ thuật Những quả bị tổn thương cũng làm tăng cường sự mất nước Diện tích thương tật tăng gấp đôi thì

sự mất nước tăng lên gấp 2 lần Tốc độ bay hơi nước trong quá trình bảo quản là khác nhau Ở giai đoạn đầu (ngay sau khi thu hái) mất nước rất nhanh, ở giai đoạn giữa giảm đi và cuối cùng lại tăng lên mãnh liệt

Trong thực tế để giảm sự hao hụt khối lượng tự nhiên của mận thường áp dụng các biện pháp hạ thấp nhiệt độ, tăng độ ẩm và dùng bao bì thích hợp Trong quá trình bảo quản mận ở nhiệt độ thường cũng như ở nhiệt độ lạnh có thể xảy ra

sự sinh nhiệt Sự sinh nhiệt trong quá trình bảo quản mận là một bất lợi bởi vì tất

cả nhiệt sinh ra trong bảo quản là do quá trình hô hấp Và trong điều kiện nhiệt

độ cao, độ ẩm thích hợp còn làm tăng sự phát triển của vi khuẩn, nấm mốc dẫn đến lượng nhiệt sinh ra càng nhiều, kết quả là làm cho mận dễ bị hỏng, nên khi bảo quản mận cần chú ý đến độ thông thoáng để tránh hiện tượng tăng nhiệt của khối quả

2.5.2.2 Quá trình sinh lý, sinh hóa

a Quá trình hô hấp

Hô hấp là quá trình mà các chất hữu cơ dự trữ trong mận được phân giải đến sản phẩm cuối cùng là CO2 và H2O, đồng thời giải phóng năng lượng Năng lượng hô hấp được giải phóng dưới dạng nhiệt làm nóng khối mận Cường độ hô hấp càng tăng lên trong quá trình bảo quản càng làm cho khối mận chóng hỏng

Vì vậy một trong những mục đích của quá trình bảo quản là phải hạn chế hô hấp Các biện pháp làm giảm cường độ hô hấp sẽ hạn chế được sự giảm khối lượng tự nhiên, giảm sự tạo nhiệt, giảm sự phát triển của vi sinh vật, giảm tổn thất, kéo dài thời gian bảo quản Cường độ hô hấp tỷ lệ nghịch với tuổi thọ, chất lượng Các yếu tố ảnh hưởng đến cường độ hô hấp như nhiệt độ, độ chín thu hái, sự tạo thành ethylene, tổn thương cơ giới, ẩm độ, …

b Sự tạo ethylene

Ethylene là một hooc môn của sự chín Sự tạo thành ethylene trong quá trình bảo quản là yếu tố bất lợi, làm giảm tuổi thọ bảo quản của qủa ngay cả khi

ở nhiệt độ an toàn Sự tăng hàm lượng ethylene trong khối quả sẽ làm tăng cường

độ hô hấp Người ta thấy rằng sự tăng cường độ CO2 trùng với sự tăng ethylene Ethylene bắt đầu xuất hiện khi có mặt của CO2

Ở mận vai trò của ethylene dường như là chất xúc tác tạo sắc tố màu tổng hợp làm mất chlorophil và gắn liền với sự tạo thành chất thơm Trong quá trình bảo quản phải khống chế sự tổng hợp ethylene để làm chậm quá trình chín, kéo dài thời gian bảo quản Nhưng trong giai đoạn phân phối và buôn bán tới tay người tiêu dùng thì vai trò của ethylene lại ngược lại, cần phải có sự tạo ethylene

để tạo sắc tố màu và tạo hương vị đặc trưng cho quả mận

c Độ chín thu hái

Cũng như một số loại quả khác trong công tác bảo quản, tiêu thụ, phân phối, lưu thông, thời điểm thu hoạch là nhân tố quan trọng để xác định sự chấp nhận của người tiêu dùng bởi vì chất lượng quả sẽ giảm xuống nếu thu hoạch quá sớm hay quá muộn Mận hái ở độ chín xanh tạo sản phẩm tốt về khả năng bảo quản và dễ vận chuyển, nhưng sản lượng có thể bị ảnh hưởng và mùi vị kém Quả thu hoạch quá muộn chín nhanh và có thể bị thối hỏng trước khi đem bán Như vậy cần phải xác định thời điểm thu hái hợp lý

Một số thông số được sử dụng để đánh giá độ chín của mận như: thay đổi màu ở bề mặt quả, cấu trúc thịt quả, khả năng thấm màng vỏ quả, nồng độ chất hòa tan, chất thơm bay hơi, tổng hợp ethylene, sự tạo CO2 và sự thay đổi cấu trúc protein của quả mận Tất cả các nghiên cứu đều chứng minh rằng không có chỉ số nhất định nào để đánh giá độ chín thu hái của các loại mận

d Ảnh hưởng của độ ẩm

Độ ẩm tương đối của không khí trong phòng bảo quản có ảnh hưởng lớn đến sự bốc hơi nước của quả Độ ẩm thấp làm tăng sự bay hơi nước, giảm khối lượng tự nhiên, héo bề mặt quả và bên trong quả gây ra hiện tượng co nguyên sinh dẫn đến sự rối loạn trao đổi chất và làm mất khả năng bảo quản Độ ẩm không khí cần phải duy trì tối ưu để vừa chống mất hơi nước vừa hạn chế sự phát triển của vi sinh vật gây thối hỏng

2.5.3 Một số bệnh thường gặp ở mận

2.5.3.1 Bệnh thối nâu

Do chủng vi sinh vật là: Monilinia fructicola và Monilinia fructogena gây

ra, đây một loại bệnh phổ biến và rất nguy hại cho mận Monilinia fructicola lại

là nguyên nhân chính gây hiện tượng thối hỏng đối với quả Cả hai chủng vi sinh vật này đều có đặc điểm hình thái học giống nhau nên rất khó phân biệt chúng khi soi lên kính hiển vi

Bào tử của các chủng vi sinh vật trên lơ lửng trong không khí, được các dòng không khí khuếch tán đi khắp nơi, tiếp cận với quả Tuy nhiên, ở trạng thái quả còn xanh, sự phát triển của chúng chỉ dừng lại ở đó Khi quả chuyển sang trạng thái chín, những hoạt động của chúng mới bắt đầu xảy ra Lượng bào tử được tạo ra càng nhiều và xuất hiện sự lây nhiễm từ những ổ bệnh ra các quả khỏe mạnh khác Khi nhiệt độ xuống thấp, chúng chuyển sang trạng thái nấm và khi điều kiện nhiệt độ, độ ẩm thích hợp chúng hoạt động trở lại Nhiệt độ tới hạn

dưới của các chủng này là 2 – 50C Vì thế sự thối hỏng thường xuất hiện khi quả chín, trong khi vận chuyển hoặc sau khi bảo quản lạnh

2.5.3.2 Bệnh mốc xám

Bệnh mốc xám do chủng Botryotinia fluckeliana (trạng thái bào tử; Botrytits cineria) gây ra là nguyên nhân gây ra những tổn thất kinh tế lớn, không những cho mận mà còn rất nhiều cây ăn quả khác Chúng thường phát triển trên các loại quả được bảo quản ở nhiệt độ thấp, dưới 00C Triệu chứng của bệnh này cũng giống như bệnh thối nâu và đối với những người ít kinh nghiệm, thì thường nhầm lẫn bệnh này với bệnh thối nâu Bào tử nảy mầm có thể thâm nhập vào hoa hoặc các quả còn rất non qua các chỗ biểu bì hoặc các mô bị vỡ Tuy nhiên, sự lây nhiễm này lại thường xảy ra trong khi thu hoạch hoặc tồn trữ thông qua những vết thương Khi các sợi nấm đã phát triển trên những chỗ thối Chúng sẽ lây lan sang những quả còn khỏe ở bên cạnh và như vậy chẳng bao lâu khối quả

sẽ nhanh chóng bị thối hỏng

2.5.3.3 Bệnh mốc xanh

Bệnh mốc xanh có thể thấy rất nhiều trong các quả mận được bảo quản ở nhiệt độ 00C sau một hoặc vài tuần bảo quản So với bệnh thối nâu, bệnh mốc xanh ít hơn nhiều Chủng vi sinh vật nào gây nên bệnh mốc xanh hiện giờ vẫn chưa được làm rõ Trạng thái bào tử là Penicillium expansum Trong khối quả bảo quản, Penicillium expansum có khả năng kết nối với những quả còn khỏe mạnh từ những quả bị nhiễm để hình thành ổ bệnh Tuy nhiên do sự phát triển chậm (so với Monilinia fucticola) và bảo quản trong thời gian ngắn Mức độ nguy hại của ổ bệnh này bị giới hạn

Bào tử Penicillium expansum được hình thành trên quả, trên các chất hữu

cơ cũng như trong đất Quả bị nhiễm bệnh thường có dấu hiệu nhũn và mọng nước Hệ sợi trước tiên phát triển trên khu vực tổn thương, làm chúng có màu trắng, sau đó khu vực này chuyển sang màu xanh khi bào tử được hình thành Penicillium expansum phát triển mạnh trên quả được bảo quản ở 00C Giới hạn dưới nhiệt độ phát triển của chúng là – 3,3 đến – 2,20C

2.5.3.4 Bệnh thối Alternaria

Bệnh này thường xuất hiện trên những quả mận sẫm màu, do bị rám nắng

Nó xuất hiện trước thu hoạch và phát triển nhanh chóng sau khi quả được thu hoạch Những vết thương do thu hoạch thường bị vi sinh vật gây bệnh Alternaria tấn công đầu tiên nếu không có sự có mặt của một loài vi sinh vật nào khác có

tính cạnh tranh mãnh liệt hơn nó Chủng vi sinh vật nào gây bệnh Alternaria vẫn chưa được tìm ra nhưng dạng bào tử của nó là Alternaria alterna Những mô quả

bị tổn thương do Alternaria alterna thường rất cứng, khô Nhiệt độ phát triển của bào tử này thấp, khoảng 00C

2.5.4 Một số nghiên cứu bảo quản mận

Bảo quản ở nhiệt độ thấp có tác dụng hiệu quả trong việc trì hoãn quá trình chín và kéo dài thời gian bảo quản mận nhưng hiệu quả này có thể bị hạn chế bởi sự phát triển của tổn thương lạnh – có liên quan tới sự nâu hóa thịt quả (Crisosto et al., 2004; Manganaris et al., 2007) Hậu qủa của những thay đổi này

là giảm chất lượng và giảm sự chấp nhận của người tiêu dùng Do đó cần phải làm chậm hoặc ức chế sự thay đổi lý hóa xảy ra và cải tiến trong bảo quản quả Nghiên cứu của (Eum et al., 2009) chỉ ra rằng bọc mận bằng màng carbohydrate kết hợp với Sorbitol bảo quản ở 200C có tác dụng làm giảm hao hụt khối lượng,

độ cứng và axit tổng số Nghiên cứu bảo quản mận bằng vật liệu polyethylene có màu sắc khác nhau (màu vàng, màu trắng và trong suốt) kết hợp với bảo quản lạnh (1 – 40C) cho thấy bao bì trong suốt ở nhiệt độ lạnh có tác dụng làm giảm hao hụt khối lượng tự nhiên, chỉ số bệnh, TSS, TA, vitamin C, duy trì độ cứng và chất lượng cảm quan được người tiêu dùng chấp nhận ở mức khá sau 32 ngày bảo quản (Khan et al., 2013) Nghiên cứu của Zhao et al (2009) theo dõi ảnh hưởng của lớp phủ chitosan tới chất lượng mận Dashi Early bảo quản ở 250C Kết quả của nghiên cứu đã chỉ ra rằng các mẫu mận phủ màng có chất lượng tốt hơn mẫu đối chứng Nghiên cứu của Bal, (2013) bảo quản hai giống mận Stanley

và Giant bằng màng chitosan 1% ở nhiệt độ 0-10C ẩm độ 90 ± 50C trong 40 ngày Kết quả cho thấy chitosan có tác dụng tốt trong việc giảm hao hụt khối lượng, giảm tỷ lệ hô hấp cũng như tỷ lệ thối hỏng, giữ được chất lượng và kéo dài thời gian bảo quản mận Nghiên cứu của Sima et al (2015) bảo quản mận (Plunus domestica L.) bằng màng carboxymethylcellulose – pectin (CMC-Pec) ở 190C,

độ ẩm 65% trong 8 ngày nghiên cứu một số chỉ tiêu về chất lượng: như hao hụt khối lượng tự nhiên, độ cứng, hàm lượng vitamin C, chất khô hòa tan tổng số, axit tổng số, pH và polygalacturonase (PG) kết quả cho thấy ngoại trừ hàm lượng vitamin C và độ cứng không bị ảnh hưởng bởi màng CMC-Pec còn các chỉ tiêu chất lượng khác đều bị ảnh hưởng Nhìn chung 0,5% Pec + 0,5% CMC cho kết quả tốt nhất đối với tất cả các chỉ tiêu được theo dõi và được sử dụng để cải thiện chất lượng mận bảo quản sau thu hoạch

Trong nghiên cứu của Liu et al (2014) kết hợp axit ascobic với chitosan nồng độ (40,0 mM axit ascobic và 1% chitosan) bảo quản mận ở 5 ± 10 C và ẩm

độ 90 ± 5% sau 20 ngày bảo quản có tác dụng duy trì độ cứng của mô, ức chế và giảm tỷ lệ hô hấp, giảm thay đổi màu sắc, so sánh với đối chứng, sử lý axit ascobic và chitosan riêng rẽ Việc duy trì độ cứng có liên quan đến giảm hàm lượng pectin methylesterase và polygalacturonase, hơn nữa mận xử lý bằng axit ascobic kết hợp với chitosan có tác dụng làm giảm hoạt động của enzyme polyphenol oxydase và hoạt động của enzyme superoxide dismutase, peroxidase

và catalase cao hơn trong thời gian bảo quản Trong thời gian bảo quản các phân tích về anthocyanin bị ức chế bởi axit ascobic kết hợp với chitosan có liên quan đến việc giảm hoạt động của enzyme phenylalamine amonia lyase Hơn nữa việc giảm một cách đáng kể các gốc oxy tự do (O2-) và malondiadehyde (MAD) ở những quả được xử lý bằng axit ascobic kết hợp với chitosan Như vậy rõ ràng là việc kết hợp axit ascobic với chitosan có tác dụng duy trì chất lượng và kéo dài tuổi thọ mận bảo quản

Tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào sử dụng nano chitosan, compozit của nano chitosan với axit oleic và compozit của chitosan với axit oleic trên mận

PHẦN 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 VẬT LIỆU THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

3.1.1 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu

3.1.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Mận Tam Hoa (Plunus salicina) có độ chín 85% (độ chín 85% là độ chín được xác định theo thời gian sinh trưởng của quả từ khi ra hoa đến lúc thu hái vào khoảng 108 – 111 ngày, có diện tích phần mầu đỏ khoảng 15 – 20%) được thu hái tại Bắc Hà - Lào Cai Thời gian từ lúc thu hái đến khi tiến hành thí nghiệm không quá 24 h Quả được lựa có kích thước và độ chín tương đối đồng đều, không sâu bệnh, không bị dập nát Rửa quả bằng nước máy, ngâm với dung dịch clorin 200 ppm trong 5 phút, tráng lại bằng nước máy để khô tự nhiên Sau

đó được nhúng vào dung dịch tạo màng trong 1 phút

3.1.1.2 Vật liệu nghiên cứu

Vật liệu:

- Hai chủng nấm mốc Penicillinum expansum và Botryotinia fluckeliana

do Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học, Đại Học Quốc Gia Hà Nội cung cấp Hóa chất:

- Axit axetic (CH3COOH) (Việt Nam);

- Axit oleic (Sản xuất tại Việt Nam);

- Glycerol (sản xuất tại Việt Nam);

- Tween 80 (sản xuất tại Việt Nam);

- Chitosan dạng bột do Việt Nam sản xuất có độ diacetyl hóa DA > 85%, trọng lượng phân tử khoảng 300.000;

- Nano chitosan do Viện Cơ điện nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch tổng hợp sử dụng axit methacrylic (De Moura et al., 2008);

- Compozit của chitosan với axit oleic và compozit của nano chitosan với axit oleic được tổng hợp tai phòng thí nghiệm hóa sinh và vi sinh Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên;

- Các loại hóa chất khác của phòng thí nghiệm (axit, kiềm, )

- Máy đo pH Hanna (Trung Quốc);

- Máy khuấy từ gia nhiệt ARE (Italy);

- Nồi hấp thanh trùng YX 280 (Pháp);

- Vortex (Đức);

- Cân phân tích có độ chính xác 0,0001g (Trung Quốc);

- Thiết bị đồng hóa (Ultra – Turax Model T25 IKA, Đức);

- Máy đo độ cứng cấm tay (Bertuzzi, Italia);

- Chiết quang kế cầm tay (Atago, Nhật Bản)

3.1.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

3.1.2.1 Địa điểm nghiên cứu

Địa điểm: 1- Phòng thí nghiệm hóa sinh và vi sinh Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên; 2- Phòng phân tích Trung tâm Nghiên cứu và Kiểm tra chất lượng nông sản thực phẩm Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch

3.1.2.2 Thời gian nghiên cứu

Thời gian nghiên cứu 8/2015 – 8/2016

3.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Nội dung 1: Nghiên cứu khả năng kháng vi sinh vật của chitosan, nano chitosan và compozit của chúng với axit oleic

- Xác định khả năng ức chế sự phát triển của 2 chủng nấm mốc Penicillinum expansum và Botryotinia fluckeliana được lây nhiễm nhân tạo lên

bề mặt quả mận của chitosan, nano chitosan, compozit của chitosan với axit oleic

và compozit của nano chitosan với axit oleic

- Xác định khả năng ức chế sự phát triển của vi sinh vật tổng số, nấm men – nấm mốc của chitosan, nano chitosan, compozit của chitosan với axit oleic,

compozit của nano chitosan với axit oleic trong các khoảng thời gian xử lý khác nhau (thời gian xử lý 1 phút, 3 phút, 5 phút)

Nội dung 2: Nghiên cứu một số tính chất chức năng của màng film tạo thành từ chitosan, nano chitosan và compozit với axit oleic

- Xác định tính tan của màng chitosan, nano chitosan, compozit của chitosan với axit oleic và compozit của nano chitosan với axit oleic;

- Xác định khả năng giữ ẩm của màng chitosan, nano chitosan, compozit của chitosan với axit oleic và compozit của nano chitosan với axit oleic

Nội dung 3: Nghiên cứu so sánh hiệu quả bảo quản của chitosan, nano chitosan và compozit của chúng với axit oleic đối với mận Tam Hoa

- Xác định ảnh hưởng của chitosan, nano chitosan và compozit của chúng với axit oleic đến sự biến đổi các tính chất lý, hóa của quả trong quá trình bảo quản;

- Xác định ảnh hưởng của chitosan, nano chitosan và compozit của chúng với axit oleic đến tỷ lệ thối hỏng của mận trong quá trình bảo quản;

- Xác định ảnh hưởng của chitosan, nano chitosan và compozit của chúng với axit oleic đến tính chất cảm quan của mận trong quá trình bảo quản

3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.3.1 Nghiên cứu khả năng kháng vi sinh vật của chitosan, nano chitosan và compozit của chúng với axit oleic trên mận Tam Hoa

3.3.1.1 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính đối kháng nấm mốc của chitosan nano chitosan và compozit với axit oleic trên quả mận Tam Hoa

Thí nghiệm đánh giá hoạt tính đối kháng nấm mốc của chitosan, nano chitosan và compozit với axit oleic trên quả mận được thực hiện bằng phương pháp gây nhiễm nhân tạo trên bề mặt quả Dịch bào từ nấm mốc được hoạt hóa bằng nước muối sinh lý sau 24h Mỗi quả được gây xước 4 điểm, sau đó nhỏ 20

μl bào tử nấm mốc với mật độ 107 CFU vào vết xước Để khô tự nhiên 12 h, sau

đó nhỏ và xoa 200 μl một trong 4 dịch lỏng chitosan, nano chitosan, compozit chitosan với axit oleic và compozit nano chitosan với axit oleic vào vết xước rồi

để khô tự nhiên Sau đó đặt quả vào thùng giấy và bảo quản ở nhiệt độ thường, mỗi công thức được tiến hành trên 25 quả, nhắc lại 3 lần Theo dõi tỷ lệ thối hỏng và vết xước nhiễm nấm sau 1, 3, 7 và 10 ngày bảo quản

Bố trí thí nghiệm

CT1: Đối chứng (không xử lý)

CT2: Chitosan (1,5%)

CT3: nano chitosan (1,5%)

CT4: compozit của chitosan với axit oleic 1,5%

CT5: Compozit của nano chitosan với axit oleic 1,5%

3.3.1.2 Phương pháp đánh giá chất lượng vi sinh vật của mận xử lý bằng chitosan và biến thể của chitosan với thời gian xử lý khác nhau

b Phương pháp xác định vi sinh vật hiếu khí tổng số

Lấy mẫu: mận được lấy mẫu 5 quả/1 công thức gọt phần vỏ quả, nghiền nhỏ bằng cối chày sứ, trộn đều, cân 1 gam mẫu, pha loãng tới nồng độ 10-2, 10-3 (thao tác không quá 30 phút)

Lấy 100μl mẫu đã pha loãng cấy trên đĩa petri có môi trường TGA (Tripton – Glucose – Agar) mỗi nồng độ pha loãng cấy 3 đĩa, sau đó nuôi trong tủ ấm ở

370C sau 48 đến 72 giờ, đếm tất cả khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa thạch (số lượng khuẩn lạc trong mỗi đĩa từ 30 - 300 khuẩn lạc) Số lượng vi sinh vật trung bình trong 1g mẫu được tính theo công thức

N khuẩn lạc/g hay ml =

V f n n

C

1 2

( 



Trong đó ∑C: tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa

n1:số đĩa đếm ở nồng độ pha loãng thứ nhất

n2: số đĩa đếm ở nồng độ pha loãng thứ 2