nghiên cứu một số chỉ thị dna phục vụ cho xác đinh con lai giữa bò tót (bos gaurus) và bò nhà (bos taurus) tại vườn quốc gia phước bình, ninh thuận

Từ những kết quả PCR các vùng gen quan tâm trên nhiễm sắc thể giới tính, nhiễm sắc thể thường, các đoạn SSR và phân tích các trình tự gen thu được ở các con bê nghi lai và bê nhà chúng t

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

PHẠM THANH TÙNG

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ CHỈ THỊ DNA PHỤC VỤ CHO XÁC ĐINH CON LAI GIỮA BÒ TÓT (BOS GAURUS) VÀ BÒ NHÀ (BOS TAURUS) TẠI VƯỜN QUỐC GIA PHƯỚC BÌNH, NINH THUẬN

Ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 60.42.02.01 Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Lê Văn Sơn

NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2016

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận văn này hoàn toàn được hoàn thiện bằng sự tìm tòi nghiên cứu khoa học của bản thân dưới sự hướng dẫn của PGS TS Lê Văn Sơn – Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và TS Nguyễn Hữu Đức – khoa Công nghệ Sinh học, Học Viện Nông nghiệp Việt Nam Các số liệu, hình ảnh, kết quả được trình bày trong luận văn này là trung thực, không sao chép bất

cứ tài liệu, công trình nghiên cứu của người khác mà không chỉ rõ nguồn tham khảo Tôi xin chịu trách nhiệm về lời cam đoan của mình trước hội đồng và nhà trường

Hà Nội, ngày tháng năm 2016

Tác giả luận văn

Phạm Thanh Tùng

Tôi xin gửi lời biết ơn chân thành đến ThS Lê Hoàng Đức phòng Công nghệ ADN Ứng Dụng, viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã cộng tác giúp tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin cám ơn phòng Công nghệ DNA ứng dụng, phòng Công nghệ trọng điểm gen, phòng Công nghệ Tế bào Thực vật – Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện thuận cho tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy giáo, cô giáo Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình dạy bảo tôi trong suốt khoá học

Lời cuối, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới những người thân trong gia đình đã luôn

ở bên tôi, chăm sóc, động viên tôi và toàn thể bạn bè đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp này

Mặc dù tôi đã có nhiều cố gắng hoàn thiện luận văn bằng tất cả sự nhiệt tình và năng lực của mình, tuy nhiên không thể tránh khỏi những thiếu sót, rất mong nhận được những đóng góp quý báu của quý thầy cô và các bạn

Tôi xin trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2016

Tác giả luận văn

Phạm Thanh Tùng

MỤC LỤC

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt v

Danh mục bảng vi

Danh mục hình vii

Trích yếu luận văn viii

Thesis abstract x

Phần 1 Mở đầu 1

1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1

1.2 Giả thuyết Khoa học 2

1.3 Mục tiêu nghiên cứu 2

1.4 Phạm vi nghiên cứu 2

1.5 Ý nghiã khoa học và thực tiễn của đề tài 2

Phần 2 Tổng quan tài liệu 4

2.1 Tổng quan về bò tót 4

2.1.1 Vị trí phân loại 4

2.1.2 Đặc điểm hình thái 4

2.1.3 Đặc điểm sinh học và phân bố 4

2.2 Các phương pháp giám định di truyền con lai 5

2.2.1 Phương pháp phân tích rDNA – ITS 6

2.2.2 Phương pháp phân tích gen ty thể 7

2.2.3 Phương pháp phân tích gen chức năng trên nhiễm sắc thể giới tính 7

2.2.4 Phương pháp phân tích gen chức năng trên nhiễm sắc thể sinh dưỡng 10

2.2.5 Phương pháp phân tích gen sử dụng chỉ thị phân tử 10

2.2.6 Microsatellite 11

Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 15

3.1 Vật liệu nghiên cứu 15

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 15

3.1.2 Các chủng vi khuẩn, vector sử dụng 15

3.1.3 Hóa chất 15

3.1.4 Thiết bị 16

3.2 Phương pháp nghiên cứu 16

3.2.1 Phương pháp thiết kế mồi cho phản ứng PCR 16

3.2.2 Phương pháp tách chiết DNA tổng số từ các mẫu mô tai 17

3.2.3 Phương pháp PCR với các mồi đặc hiệu 17

3.2.4 Phương pháp điện di DNA trên gel agarose: 18

3.2.5 Phương pháp điện di trên gel polyacrylamide 18

3.2.6 Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR 19

3.2.7 Phương pháp tách dòng gen 19

3.2.8 Phương pháp tách chiết plasmid tái tổ hợp 21

3.2.9 Phương pháp xác định trình tự gen 22

Phần 4 Kết quả nghiên cứu 23

4.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số 23

4.2 Kết quả giám định con lai bằng gen trên Nhiễm Sắc Thể sinh dưỡng số 1 24

4.2.1 Kết quả PCR với 2 cặp mồi PGF1/PGR1 và PT1F/PT1R 24

4.2.2 Kết quả so sánh trình tự 25

4.3 Kết quả giám định bê đực nghi lai bằng gen ZFY trên NST giới tính Y 26

4.4 Kết quả giám định bê đực nghi lai bằng các chỉ thị SSR 28

Phần 5 Thảo luận 32

5.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số 32

5.2 Kết quả giám định con lai bằng gen trên Nhiễm Sắc Thể sinh dưỡng số 1 32

5.2.1 Kết quả PCR với 2 cặp mồi PGF1/PGR1 và PT1F/PT1R 32

5.2.2 Kết quả so sánh trình tự 33

5.3 Kết quả giám định bê đực nghi lai bằng gen ZFY trên NST giới tính Y 34

5.4 Kết quả giám định bê đực nghi lai bằng các chỉ thị SSR 34

Phần 6 Kết luận và kiến nghị 36

6.1 Kết luận 36

6.2 Kiến nghị 36

Tài liệu tham khảo 37

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt

PCR Polymerase Chain Reaction

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Trình tự các mồi sử dụng trong nghiên cứu 16

Bảng 3.2 Thành phần gel polyacrylamide 15% 18

Bảng 3.3 Thành phần phản ứng nối gen vào vector tách dòng 20

Bảng 3.4 Thành phẩn phản ứng colony PCR sử dụng mồi PUC18F/R 21

Bảng 4.1 Kết quả định lượng DNA tổng số bằng máy đo Nanodrop 23

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Bò tót, bò nhà và bê lai 2

Hình 2.1 Ảnh bò tót trong tự nhiên 5

Hình 2.2 Cấu trúc rDNA ở động vật 6

Hình 2.3 Sơ đồ gene ZFY trên NST Y 9

Hình 2.4 So sánh đánh giá đặc điểm của một số chỉ thị phân tử 10

Hình 2.5 Một số SSR lặp lại hoàn chỉnh 12

Hình 3.1 Vector tách dòng pBT 20

Hình 4.1 Kết quả tách DNA tổng số từ mô tai của 6 mẫu bê 23

Hình 4.2 Kết quả điện di sản phẩm PCR gen POU1F1 bằng cặp mồi PG1F-PG1R 24

Hình 4.3 Kết quả điện di sản phẩm PCR gen POU1F1 bằng cặp mồi PT1F/PT1R 24

Hình 4.4 Kết quả so sánh trình tự gen POUF1 với mồi PGF1/PGR1 của bê đực nghi lai bằng chương trình BLAST trên ngân hàng gen quốc tế 25

Hình 4.5 Kết quả so sánh trình tự gen POUF1 với mồi PGF1/PGR1 của bê cái nghi lai số 3 bằng chương trình BLAST trên ngân hàng gen quốc tế 25

Hình 4.6 Kết quả so sánh trình tự gen POUF1 của bê đực nghi lai với cặp mồi PT1F/PT1R bằng chương trình BLAST trên ngân hàng gen quốc tế 26

Hình 4.7 Kết quả so sánh trình tự gen POUF1 của bê cái nghi lai (BL3) với cặp mồi PT1F/PT1R bằng chương trình BLAST trên ngân hàng gen quốc tế 26

Hình 4.8 Kết quả PCR gen ZFY 27

Hình 4.9 Kết quả so sánh trình tự gen ZFY của bò tót bằng chương trình BLAST trên ngân hàng gen quốc tế 27

Hình 4.10 Kết quả so trình tự gen ZFY của bê đực nhà bằng chương trình BLAST trên ngân hàng gen quốc tế 27

Hình 4.11 Kết quả PCR-SSR của các mẫu nghiên cứu với mồi ETH10 trên gel polyacrilamide 15% 28

Hình 4.12 Kết quả PCR-SSR của các mẫu nghiên cứu với mồi BM1824 trên gel polyacrilamide 15% 28

Hình 4.13 Kết quả PCR-SSR của các mẫu nghiên cứu với mồi TGLA126 trên

gel polyacrilamide 15% 29 Hình 4.14 Kết quả PCR-SSR của các mẫu nghiên cứu với mồi INRA023 trên

gel polyacrilamide 15% 29 Hình 4.15 Kết quả PCR-SSR của các mẫu nghiên cứu với mồi BM1818 trên gel

polyacrilamide 15% 30 Hình 4.16 Kết quả PCR-SSR của các mẫu nghiên cứu với mồi BM861 trên gel

polyacrilamide 15% 30 Hình 4.17 Kết quả so sánh trình tự đoạn SSR của bê đực nghi lai và bê đực nhà

bằng phần mềm Bioedit 31

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN

Tên tác giả: Phạm Thanh Tùng

Tên Luận văn: “Nghiên cứu một số chỉ thị DNA phục vụ cho xác đinh con lai giữa bò tót (Bos gaurus) và bò nhà (Bos taurus) tại vườn quốc gia Phước Bình, Ninh Thuận” Ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60.42.02.01

Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Bò tót (tên khoa học Bos gaurus) là động vật thuộc bộ guốc chẵn, họ trâu bò (Bovidae) có lông màu sẫm và kích thước lớn, sinh sống chủ yếu ở vùng đồi của Ấn

Độ và Đông Nam Á Hiện nay, tại Việt Nam chỉ còn khoảng 300 con bò tót, phân bố chủ yếu tại vườn quốc gia Mường Nhé (Điện Biên), vùng rừng núi Tây Nguyên, vườn quốc gia Chư Mom Rây (Kon Tum) và vườn quốc gia Cát Tiên (Lâm Đồng), sân bay Phú Bài (Huế) Trong tự nhiên, bò tót thường sống thành đàn từ 8– 10 con Khi về già,

do không cạnh tranh được với những con bò tót đực trẻ, khỏe hơn trong đàn nên bò tót đực già thường tách đàn để sống riêng lẻ hoặc chúng hội nhau lại thành những nhóm bò đực già riêng lẻ Có thể do hiện tượng sa thải sinh học trên mà cuối năm 2009 tại khu vực Vườn Quốc Gia Phước Bình, có xuất hiện một con bò tót đực tách bầy, có chiều cao khoảng 1,7 mét, thân dài hơn 2 mét, nặng khoảng 1000 kg nhập bầy với đàn bò cái của nông dân địa phương [14] Tới năm 2012, sau một thời gian con bò tót đực về sống chung với bò cái nhà, theo ghi nhận của Vườn Quốc gia Phước Bình đã có một số con

bê được cho là con lai của bò tót với bò nhà do có một số đặc điểm về ngoại hình và màu lông bê lai gần giống với bò tót Mục tiêu của nghiên cứu này sàng lọc một số chỉ thị DNA phục vụ cho xác định con lai giữa bò tót (Bos gaurus) và bò nhà (Bos taurus) tại vườn quốc gia Phước Bình, Ninh Thuận Từ những kết quả PCR các vùng gen quan tâm trên nhiễm sắc thể giới tính, nhiễm sắc thể thường, các đoạn SSR và phân tích các trình tự gen thu được ở các con bê nghi lai và bê nhà chúng tôi đã thu được các kết quả: (i) các cặp mồi PCR sử dụng trong giám định con bê nghi lai có độ đặc hiệu cao với loài

bò tót và bò nhà, qua đó có thể sử dụng các cặp mồi này để phân biệt các con bê nghi lai với bê nhà.(ii) các trình tự gen thu được ở các con bê nghi lai có độ tương đồng cao so với loài bò tót, qua đó có thể khẳng định những con bê này chính là con lai F1 giữa bò tót đực (Bos gaurus) và bò cái nhà (Bos taurus)

THESIS ABSTRACT

Master candidate: Pham Thanh Tung

Thesis title: “Study on DNA marker for identification of hybrid calf between Bos gaurus and Bos taurus Phuoc Binh national park, Ninh Thuan”

Major: Biotechnology Code: 60.42.02.01

Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA) The gaur (Bos gaurus), also called Indian bison, is the largest extant bovine, native to South Asia and Southeast Asia The species has been listed as Vulnerable on the IUCN Red List since 1986 Currently, Vietnam have only about 300 individuals They are distributed mainly in Muong Nhe nature reserve (Dien Bien), Central highlands, Chu Mom Ray national park (Kontum), Cat Tien national parks (Lam Dong) and Phu Bai airport (Hue) In the wildlife, most gaurs often live as herd together (8-10 individuals) When get older, the bull cannot compete effectively against younger males for breeding opportunities and therefore they are usually made up of several separate groups or live alone Perhaps due to this biological phenomena, the area of Phuoc Binh national park (Ninh Thuan) appears a separated bull in 2009 The bull has a height of about 1.7 meters, 2 meters in length and 1000 kg weight, which merged with the cowherd of local farmer [14] After 3 years of living on farm, they born calves that supposedly is an offspring of a bull with the cows due to a number of characteristics including appearance and color similar to gaur The purpose of our project is to find genetic markers based on blood samples for identification between Bos gaurus and Bos taurus by SSR method and DNA sequencing As a result, firstly, the PCR primers used

in the assessment of suspected calf have high specificity for the bovine species and gaur, which could use this primer pair to differentiate the next generation Secondly, the gene sequences obtained of hybrid suspected calves has a high similarity index to gaur species, thereby confirm this calf as an F1 between male gaur (Bos gaurus) and the cows (Bos taurus)

PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Bò tót (Bos gaurus) là một trong những loài bò rừng lớn nhất trong tự nhiên, sinh sống chủ yếu ở vùng rừng núi của Ấn Độ và Đông Nam Á, cá thể trưởng thành có thể cao đến 1,9 - 2 m, nặng 800 - 1.000 kg Tại Việt Nam, bò tót còn có tên gọi là con min (người Raglai ở Ninh Thuận còn gọi là kvây, nghĩa là trâu rừng, do chúng có hình dáng tương tự loài trâu) Theo Nghị định số 32/2006/NĐ-CP, bò tót được xếp vào nhóm IB trong danh mục động vật rừng nguy cấp, quý hiếm, nghiêm cấm khai thác và sử dụng vào mục đích thương mại [1] Số lượng bò tót hoang dã ở nước ta theo điều tra ước tính chỉ còn khoảng 500

Bình Phước), Phước Bình (Ninh Thuận) và một số ít ở nơi khác Có thể nhận thấy, vùng Tây Nguyên trong đó có Ninh Thuận và Lâm Đồng là vùng đất sinh sống chủ yếu bò tót tại Việt Nam

Trong tự nhiên, bò tót thường sống thành đàn từ 5 – 10 con (có đàn tới 20 –

30 con) Khi về già, do không cạnh tranh được với những con bò tót đực trẻ, khỏe hơn trong đàn nên bò tót đực già thường tách đàn để sống riêng lẻ hoặc chúng hội nhau lại thành những nhóm bò đực già riêng lẻ Có thể do hiện tượng

sa thải sinh học trên mà cuối năm 2009 tại khu vực Vườn Quốc Gia Phước Bình,

có xuất hiện một con bò tót đực tách bầy, có chiều cao khoảng 1,7 mét, thân dài hơn 2 mét, nặng khoảng 1000 kg nhập bầy với đàn bò cái của nông dân địa phương [14] Tới năm 2012, sau một thời gian con bò tót đực về sống chung với

bò cái nhà, theo ghi nhận của Vườn Quốc gia Phước Bình đã có một số con bê được cho là con lai của bò tót với bò nhà do có một số đặc điểm về ngoại hình và màu lông bê lai gần giống với bò tót như: đầu hơi nhỏ, trán rộng và lõm, mặt hình chữ V, sừng nhọn và phát triển sớm Ngoài ra, những con bê này không có nọng và u cổ, thay vào đó là một bờm lông chạy dài từ cổ đến nửa lưng Đây là đặc điểm sinh học đặc trưng nhất để phân biệt với bò nhà, do được trải qua quá trình thuần dưỡng lâu dài nên bò nhà có u và nọng cổ, nhờ đó mà bò nhà mới có thể mang ách kéo cày, kéo xe Bên cạnh những khác biệt về mặt kiểu hình, những con bê nghi lai với bò tót rất nhát nên khó tiếp cận hơn so với bê nhà thuần chủng [15]

Nguồn: Internet

Hình 1.1 Bò tót, bò nhà và bê lai

(A): Bò tót đực sống chung với bò nhà (B): Bê nhà thuần chủng (phải) và bê nghi lai bò tót (trái)

1.2 GIẢ THUYẾT KHOA HỌC

Từ một số sự khác biệt về kiểu hình và tập tính quan sát được giữa các cá thể bê nghi lai và cá thể bò nhà, chúng tôi đặt ra giả thiết các cá thể nghi lai là các cá thể được sinh ra giữa bò tót (Bos gaurus) và bò nhà (Bos taurus)

1.3 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Sử dụng chỉ thị DNA nhắm giám định được bò tót, bê con nghi lai và bò nhà Xác định được mối quan hệ di truyền giữa các cá thể Qua đó liên hệ đến các tính trạng tốt của các cá thể con lai góp phần phục vụ công tác chọn giống chất lượng cao

Nôi dung nghiên cứu: Sử dụng phương pháp PCR, tách dòng gen, đọc trình

tự gen để tìm ra các chỉ thị DNA để khẳng định bê nghi lai chính xác là con lai giữa bò tót (Bos gaurus) và bò nhà (Bos taurus), xác định các chỉ thị DNA dùng

để phân biệt các cá thể bò tót, bê nghi lai với bò nhà

1.4 PHẠM VI NGHIÊN CỨU

01 mẫu cá thể bò tót đực (Bos gaurus), 04 mẫu cá thể bê con nghi lai giữa

bò tót và bò nhà thu tại vườn quốc gia Phước Bình, Ninh Thuận gồm 1 bê đực và

3 bê cái, 02 mẫu cá thể bê nhà thu tại vườn quốc gia Phước Bình, Ninh Thuận gồm 1 bê đực và 1 bê cái

1.5 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

Nếu kết quả giám định gene xác nhận đàn bê lai F1 giữa bò tót đực và bò cái nhà là đúng, thì đây là trường hợp lai tạo quần thể tự nhiên hiếm gặp ở Việt

Nam từ trước đến nay Đó sẽ là sự kiện khoa học có giá trị thực tiễn quan trọng đối với ngành chăn nuôi gia súc, là cơ sở khoa học cho việc xây dựng các kế hoạch nghiên cứu và cải tạo giống bò ở Việt Nam, cải thiện năng suất, chất lượng, khả năng chống chịu với bệnh tật, đồng thời mở ra triển vọng mới về giống bò thịt có khả năng cho năng suất chất lượng cao hướng tới giá trị thương hiệu bò lai Việt Nam

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 TỔNG QUAN VỀ BÒ TÓT

2.1.1 Vị trí phân loại

2.1.2 Đặc điểm hình thái

Bò tót (Bos gaurus) là loài thú cỡ lớn trong họ trâu bò (Bovidae), thân dài 2,5 - 3 m Trọng lượng 900 - 1000 kg Đầu to, trán dẹt hơi lõm, có đốm lông trắng trên trán, đỉnh trán giữa hai sừng dô cao Sừng to khoẻ cân đối, uốn cong lên phía trên tạo vòng cung hình bán nguyệt Gốc sừng mầu vàng xám, mút sừng nhọn đen bóng Lớp da ở cổ và trước ngực không tạo thành yếm Bộ lông ngắn mềm mượt mầu nâu thẫm hoặc đen xám hơi phớt xanh bóng ở lưng Lông ở bụng dài mầu nâu nhạt Con cái thường có mầu hung đỏ Mông đen, bốn chân từ khoeo trở xuống mầu trắng bẩn Đuôi dài mầu đen [2]

2.1.3 Đặc điểm sinh học và phân bố

Thức ăn chủ yếu của bò tót là cỏ, mầm lá non của lau sậy, chuối rừng, măng non tre nứa Sinh sản thường vào tháng 6, 7 Mỗi năm đẻ 1 lứa, mỗi lứa 1 con Thời gian có chửa 270 - 280 ngày Nơi sinh sống của bò tót là rừng già thường xanh, rừng khộp, rừng hỗn giao tre nứa, rừng thứ sinh địa hình tương đối bằng ở

độ cao 500 – 1.500m so với mặt biển Sống thành từng đàn 5 - 10 con (có đàn tới

20 - 30 con) đôi khi cũng gặp những cá thể sống đơn lẻ lẫn với đàn bò rừng [2]

Nguồn: Internet

Hình 2.1 Ảnh bò tót trong tự nhiên

Ở trong nước, bò tót phân bố ở các tỉnh: Lai Châu, Sơn La, Thanh Hoá, Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Bình, Quảng Trị, Thừa Thiên - Huế, Kontum, Gia Lai, Đắk Lắk, Lâm Đồng, Đồng Nai và Bình Phước Hiện nay, do tình trạng phá rừng tràn lan nên diện tích rừng bị suy giảm nhiều làm cho vùng sống, vùng phân bố của bò tót bị chia cắt mạnh Hiện tượng săn bắn bò tót vẫn xảy ra ở một

số nơi nên số lượng bò tót đã giảm nhiều, vùng Tây Nguyên còn khoảng dưới

300 con, các vùng khác còn những quần thể nhỏ dưới 10 con Theo sách đỏ Việt Nam, bò tót được phân hạng vào nhóm nguy cấp E (Endangered), có nguy

cơ tuyệt chủng cao

Để có thể cải thiện tính chống chịu với bệnh tật, thời tiết khắc nghiệt và cho năng suất thịt cao thì việc sử dụng nguồn gen quý hiếm trong tự nhiên của bò tót lai tạo với các giống bò khác có ý nghĩa khoa học và giá trị thực tiễn quan trọng đối với ngành chăn nuôi đại gia súc

2.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP GIÁM ĐịNH DI TRUYềN CON LAI

Con lai là sự kết hợp của 2 cá thể bố và mẹ, do đó nhận một nửa bộ nhiễm sắc thể của bố và một nửa bộ nhiễm sắc thể của mẹ, sự tái tổ hợp, trao đổi chéo

và tương tác giữa các gen sẽ dẫn sự khác biệt về kiểu hình của con lai với cá thể

bố mẹ và giữa các con lai với nhau Có rất nhiều phương pháp tiếp cận khác nhau

để xác con lai, thông qua các dữ liệu kiểu hình (chỉ thị hình thái), thành phần protein và hoạt chất (chỉ thị hóa sinh) hay sự khác biệt đa hình trong DNA (chị thị phân tử) Mỗi loại chỉ thị đều có ưu - nhược điểm cũng như mức độ đánh giá

con lai khác nhau Trong đó, chỉ thị hình thái được sử dụng sớm nhất và là cơ sở ban đầu để đánh giá con lai, còn chỉ thị hóa sinh và đặc biệt là chỉ thị DNA được

Những chỉ thị trên nhiễm sắc thể Y là đặc biệt quan trọng vì lai trong loài sống theo bầy đàn xảy ra chủ yếu thông qua sự trao đổi gen của của con đực[30] Những mồi đặc hiệu trên nhiễm sắc thể Y hoặc những microsatellites sẽ tạo nên những trình tự đặc hiệu thích hợp như các chỉ thị phân tử Tuy nhiên chỉ có một

số ít các chỉ thị trên nhiễm sắc thể Y được phát triển [30], các microsatellite trên nhiễm sắc thể Y đã được sử dụng trong một nghiên cứu về 11 loài bò hoang dã ở Viêt Nam [21]

2.2.1 Phương pháp phân tích rDNA – ITS

rDNA là nhóm gen mã hóa rRNA của ribosome, đóng vao trò quan trọng trong các nghiên cứu phát sinh loài Ở động vật, rDNA là những vùng trình tự lặp lại giàu GC và có cấu trúc phức tạp, bao gồm các vùng 18S; 5,8S và 28S mã hóa cho các rRNA tương ứng, nằm xen kẽ là các vùng phiên mã bên trong ITS (Internal Transcribed Spacer) và các vùng phiên mã bên ngoài ETS (External Transcribed Spacer) Các vùng 18S; 5,8S và 28S tương đối bảo tồn nên được xem là cơ sở để tìm ra sự tương đồng và các khác biệt khi so sánh các loài với nhau Trong khi đó, các vùng ITS lại là những vùng ít bảo tồn, do đó những so sánh trên các vùng này thường được sử dụng để xác định mức độ khác nhau trong loài [5]

Hình 2.2 Cấu trúc rDNA ở động vật

Do cấu trúc rDNA ở động vật rất phức tạp và có những đoạn lặp lại trải dài với thành phần nuceotide giàu G hoặc C Vì vậy, có rất ít nhóm gen rDNA ở động vật được tách dòng thành công [4]

Trên đối tượng bò nhà (Bos taurus), Tang và cộng sự (2002) đã dựa trên trình tự rDNA của người để thiết kế 16 cặp mồi nhân các vùng trên rDNA của bò (Bos taurus) Kết quả cho thấy, có 5 cặp mồi nhân bản thành công các vùng 18S; ITS1; 5,8S; ITS2; 28S với các kích thước từ 498 bp – 3326 bp Kết quả nghiên cứu là cơ sở quan trọng giúp xác định sự khác biệt giữa vùng rDNA của bò tót và

bò nhà, qua đó có thể khẳng định chính xác nguồn gốc bố của con bê nghi lai giữa bò tót đực và bò cái nhà

2.2.2 Phương pháp phân tích gen ty thể

Trong quá trình thụ tinh, tinh trùng chỉ góp vào DNA nhân, còn hợp tử thừa

kế tế bào chất và các bào quan từ tế bào trứng của cá thể mẹ, nên DNA ty thể của

cá thể con chỉ có nguồn gốc từ cá thể mẹ Do đó DNA ty thể được sử dụng để xác định trong nghiên cứu di truyền theo dòng mẹ

Hệ gen ty thể là hệ gen ngoài nhân thường được sử dụng trong giám định di truyền, một số gen ty thể đã được sử dụng để phân biệt loài bò tót với các loài bò khác như gen Cytochrome Oxidase subunit I (COI) và Cytochrome b (Cytb) [10, 12] Tuy nhiên, phương pháp này chỉ được sử dụng để khẳng định hoặc bác bỏ mối quan hệ họ hàng trực tiếp theo dòng mẹ, do ty thể di truyền theo dòng mẹ 2.2.3 Phương pháp phân tích gen chức năng trên nhiễm sắc thể giới tính Việc xác định trình tự DNA của một số gen chức năng trên nhiễm sắc thể giới tính đặc trưng cho loài bò tót và bò nhà cũng có thể được sử dụng để giám định con lai F1

Ở nhiễm sắc thể giới tính, ở động vật cũng như trong phần lớn các loài, cá thể cái có bộ nhiễm sắc thể đồng hợp (2n, XX), cá thể đực có bộ nhiễm sắc thể dị hợp (2n, XY).Trong chăn nuôi các đại gia súc trong đó có loài bò thì việc xác định giới tính vật nuôi trước sinh rất quan trọng, giúp hoạch định cho việc chăn nuôi lấy sữa hay chăn nuôi lấy thịt Nhiều nghiên cứu đã tìm ra những gen nằm trên nhiễm sắc thể Y có thể giúp phân biệt giới tính cho phôi động vật [26]

Ở động vật có vú, giới tính được xác định theo cơ chế di truyền, sự có mặt của một nhiễm sắc thể Y cần thiết cho sự phát triển của kiểu hình giống đực Chẳng hạn, những người mắc hội chứng Turner (45, X) đều là nữ Hơn nữa,

những người mắc hội chứng Klinefelter (47, XXY hoặc 48, XXXY) đều là nam mặc dù họ có thể có tới hai hoặc ba nhiễm sắc thể X Điều đó chứng tỏ nhiễm sắc thể Y có chứa gene xác định tính đực (maleness) Ngày nay ta biết rõ rằng

đó chính là nhân tố biệt hóa tinh hoàn (TDF - Testis-determining factor) nằm trên vai ngắn nhiễm sắc thể Y Trong phần lớn các loài, cá thể cái có bộ NST đồng hợp (2n, XX), cá thể đực có bộ NST dị hợp (2n, XY) Theo Chiarelli và cộng sự (1960), Sasaki và Makino (1962), ở loài bò, mỗi cá thể có số NST đơn bội là 60 [12]

Trong bộ NST của động vật có vú, NST X thường có kích thước lớn hơn các NST sinh dưỡng (có kích thước trung bình) Chúng chứa khoảng 5% số gen của bộ gen Trong khi đó, NST Y thường nhỏ hơn các NST sinh dưỡng và có kích thước nhỏ nhất Người ta ước chừng trên NST X có khoảng 1000 gen, còn trên NST Y có khoảng 330 gen Cả hai loại NST này đều rất cần cho sự phát triển và hoạt động bình thường của cơ quan tạo giao tử [5]

Theo Burgoyne (1998), NST X và Y có một vùng trình tự tương đồng với kích thước khoảng 2600 kb tại đầu cuối vai ngắn của NST, được gọi là vùng giả NST thường- Pseudo autosomal region (PAR) bởi vì các gene định khu bên trong chúng (cho đến nay chỉ phát hiện được 9 gene) đều được di truyền giống như bất

kỳ các gene nào thuộc nhiễm sắc thể thường Và sự trao đổi chéo giữa X và Y chỉ

có thể xảy ra ở hai vùng tương đồng rất nhỏ này của Y Trong xác định giới tính, các gen nằm trên vùng PAR của 2 NST X và Y cùng với các gen đặc biệt của NST Y nhưng nằm ở vùng trình tự không bắt cặp với NST X đóng vai trò rất quan trọng

Năm 1987, Page và cộng sự đã khám phá ra gen ZFY trên người Bằng phân tích sự chuyển vị NST ở nam XX và nữ XY, các nhà khoa học này đã tìm thấy một đoạn xác định tinh hoàn trên vùng giả NST của NST Y Trong vùng này

có một gen với tính bảo toàn cao gọi là Zinc finger Y hay ZFY mã hoá cho một protein gắn kết DNA Gen này giúp ngăn ngừa sự thiếu hụt tinh trùng trong quá trình sinh tinh Tương ứng với ZFY, trên NST X cũng có vùng ZFX có thể liên kết chéo với ZFY trên NST Y Lúc này, người ta nghĩ nó là TDF ( Testis determining factor- yếu tố biệt hóa tinh hoàn) [15]

Tuy nhiên, những nghiên cứu tiếp sau đó cho thấy ZFY không phải là TDF Người ta phát hiện protein ZFY có biểu hiện ở tế bào giao tử (đây là những tế

bào không cần biệt hoá tinh hoàn) và những trình tự bắt nguồn từ NST Y thiếu ZFY được tìm thấy ở những người đàn ông XX [15] Koopman et al (1991) đã khẳng định ZFX / ZFY không là yếu tố biệt hoá và xác định giới tính chủ yếu ở động vật có vú mà chúng chỉ là một trong số các nhóm gen tham gia tích cực vào quá trình này Ngày nay, người ta thường sử dụng ZFY như là một chỉ thị cho NST Y trong việc sàng lọc giới tính [2]

Hình 2.3 Sơ đồ gene ZFY trên NST Y [15]

Tóm lại, gen ZFY (Zinc Finger Y) nằm trên nhiễm sắc thể Y, mã hóa cho một protein gắn kết với DNA là một gen được sử dụng như một chỉ thị cho nhiễm sắc thể Y trong sàng lọc giới tính [19,32] Xác định trình tự gen ZFY đặc trưng cho bò tót đực và bò tót nhà không những giúp phân biệt được bò đực và

bò cái còn có thể trả lời chính xác câu hỏi con bê đực nghi lai có mang gen của

bò tót hay không

Phương pháp này dựa dựa trên những vùng có trình tự nucleotide khác nhau trên gen ZFY của bò tót (Bos gaurus) và bò nhà (Bos taurus) từ đó để thiết kế các cặp mồi đặc hiệu cho gen của bò tót và bò nhà Về lý thuyết, chỉ những mồi đặc hiệu cho loài bò tót (Bos gaurus) mới được khuếch đại bằng phản ứng PCR, kết quả chỉ có những con lai Còn kết quả phản ứng PCR với những mồi đặc hiệu cho bò nhà (Bos taurus) sẽ xuất hiện ở cả mẫu bò lai và bò nhà Giải trình tự các vùng gen được nhân lên sẽ giúp xác định chính xác nguồn gốc của các mẫu giám định bằng việc so sánh trình tự gen vừa xác định với các trình tự gen của bò tót

và bò nhà trên ngân hàng gen quốc tế

2.2.4 Phương pháp phân tích gen chức năng trên nhiễm sắc thể sinh dưỡng Bên cạnh việc phân tích các gen trên nhiễm sắc thể giới tính, sự sai khác giữa các trình tự gen chức năng trên nhiễm sắc thể thường của bò tót và bò nhà cũng là một cơ sở cho việc giám định bò lai F1 Phương pháp này dựa vào kết quả so sánh giữa trình tự gen trên ngân hàng gen quốc tế giữa hai loài bò tót (Bos gaurus) và bò nhà (Bos taurus) từ đó để thiết kế các cặp mồi đặc hiệu cho gen của bò tót và bò nhà Trong đó, mẫu bò nhà chỉ khuếch đại được với cặp mồi đặc hiệu cho gen bò nhà, mẫu bò tót cũng chỉ khuếch đại được với cặp mồi đặc hiệu cho gen bò tót Nhưng mẫu bò lai sẽ khuếch đại được với cả 2 cặp mồi trên do bộ nhiễm sắc thể của bò lai chứa cả nhiễm sắc thể của bò tót và bò nhà Kết quả này

sẽ được khẳng lại bằng giải trình tự Việc so sánh với các trình tự gen của bò tót

và bò nhà trên ngân hàng gen quốc tế sẽ giúp xác định chính xác nguồn gốc các mẫu nghiên cứu

2.2.5 Phương pháp phân tích gen sử dụng chỉ thị phân tử

Hình 2.4 So sánh đánh giá đặc điểm của một số chỉ thị phân tử [16]

L: thấp, M: trung bình, H: cao, ex-H: rất cao, D: trội, R: lặn, C: đồng trội

Nghiên cứu tổng hợp của Joshi (1999) và Weising (2005) đã đề ra những đặc điểm và cũng là tiêu chuẩn cho các loại chỉ thị phân tử như sau [16,31]:

 Có mức độ đa hình cao

 Di truyền đồng trội

 Phân định rõ ràng giữa các alen

 Tần suất xuất hiện trong hệ gen cao

 Phân bố đều trong hệ gen

 Có trạng thái trung tính (không chịu tác động đa gen)

 Dễ dàng tiếp cận đánh giá

 Có thể phân tích nhanh và đơn giản

 Khả năng tái lặp cao

 Kết quả có thể trao đổi dễ dàng giữa các cơ sở nghiên cứu

 Có chi phí phát triển và thực hiện thấp

Cho đến nay khẳng định không một chỉ thị nào có thể đáp ứng được tất cả các yêu cầu trên, tuy nhiên hoàn toàn có thể lựa chọn trong các chỉ thị này để nghiên cứu xác định bò lai

2.2.6 Microsatellite

2.2.6.1 Khái niệm

Trong hệ gen sinh vật bậc cao,ngoài các đoạn trình tự (gen) mã hóa protein còn có các yếu tố DNA lặp lại, phân bố trên mọi nhiễm sắc thể có kích thước khác nhau Tùy thuộc vào sự phân bố trên hệ gen, các yếu tố DNA lặp lại được chia thành hai nhóm: trình tự DNA lặp lại rải rác (ví dụ như DNA transposon) và trình tự DNA lặp lại nối tiếp có kích thước khác nhau (VNTR-Variable Number

of TDNAem Repeat) [10,16] VNTR bao gồm hàng loạt các đơn vị trình tự (motif) lặp lại nối tiếp nhau và có mặt trên các nhiễm sắc thế (kể cả nhiễm sắc thể giới tính) [31] Các VNTR được phân chia thành các nhóm khác nhau dựa trên chiều dài motif, số lần lặp lại của các motif cũng như vị trí của chúng trên các nhiễm sắc thể [27]

Microsatellites là một dạng của VNRT, là các đoạn lặp nối tiếp của các motif có kích thước rất ngắn (từ 1 đến 6bp) [16] Microsatellite có nhiều motif khác nhau, thường có mức độ lặp lại thấp và biến đổi ở một locus nhất định,chính

vì vậy số lượng alen ở mỗi locus là rất nhiều Các microsatellite được tìm thấy ở khắp mọi nơi, ở cả vùng exon và intron trên hệ gen trong nhân và cả hệ gen ngoài nhân (ti thể, lục lạp) [28]

Microsatellite ngày nay trở thành một thuật ngữ chung nhất để miêu tả các trình tự lặp lại ngắn và ngẫu nhiên, bao gồm các đoạn lặp lại ngắn từ 1 - 6 bp và kích thước tại mỗi locus là 20 - 100 bp Microsatellite có tính đa hình rất cao, là những codominant-alen hay alen đồng trội, nó có các tính chất cần thiết cho một

microsatellite trên nhiễm sắc thể có thể được xác định bằng PCR từ một lượng DNA rất nhỏ.Có nhiều tên gọi khác nhau được dùng để chỉ microsatellite : trình

tự lặp đơn giản - SRS (Simple Repetitive Sequences), đoạn lặp trình tự đơn giản - SSR (Simple Sequence Repeats) hay đoạn lặp nối tiếp đơn giản - STR (Simple TDNAem Repeats) [25]

Trong ba loại trình tự lặp nêu trên, microsatellite - SSR có số lượng motif rất phong phú, phân tán đều khắp hệ gen và có mức độ đa hình rất cao Với bốn loại base A-T-G-C, số lượng các motif SSR trên cấu trúc sợi đôi DNA có thể lên đến 501 loại khác nhau, bao gồm 2 motif một nucleotide (monomeric), 4 motif hai nucleotide (dimeric), 10 motif ba nucleotide (trimeric), 33 motif bốn nucleotide (tetrameric), 102 motif năm nucleotide (pentameric) và 350 motif sáu nucleotide (hexameric) [17] Ở hệ gen động vật có vú có các motif phổ biến: (A)n và (CA)n

Hình 2.5 Một số SSR lặp lại hoàn chỉnh [25]

Bên cạnh sự đa dạng về số lượng, sự sắp xếp các motif trong đoạn trình tự lặp cũng góp phần làm phong phú SSR trong hệ gen Những đoạn SSR phân bố ở gần tâm động hoặc đầu mút của nhiễm sắc thể, có vai trò bảo vệ và liên quan đến

sự di chuyển của nhiễm sắc thể ở các quá trình phân bào trong hệ gen của tất cả các sinh vật nhân thực [18]

2.2.6.2 SSR ( Simple Sequence Repeats )

Dựa trên mức độ hoàn chỉnh của các motif lặp lại, Weber (1990) đã phân chia các SSR thành ba nhóm khác nhau, bao gồm: (1) SSR lặp lại hoàn chỉnh (Perpect repeats), bao gồm một motif lặp lại liên tục không bị ngắt quãng; (2) SSR lặp lại không hoàn chỉnh (imperfect repeats), chuỗi motif lặp lại bị gián đoạn bởi một hay một vài base không thuộc cấu trúc motif; và (3) SSR lặp lại phức hợp (Compound repeats) là sự kết hợp xen kẽ có/không có quy luật của hơn hai motif khác nhau [25]

Do sự phân bố khắp mọi nơi trên hệ gen,có mức độ đa dạng alen ở mỗi locus cao, di truyền đồng trội đã đưa SSR trở thành loại chỉ thị DNA có hiệu quả nhất trong nghiên cứu di truyền Hiện nay, có nhiều loại chỉ thị DNA khác nhau được phát triển dựa trên các trình tự lặp, phổ biến hơn cả là chỉ thị SSR

Chỉ thị SSR là chỉ thị DNA quan trọng và được sử dụng phổ biến trong nghiên cứu đa dạng di truyền, lập bản đồ gen, nhân dạng di truyền, chọn giống… Chỉ thị SSR có hai ưu điểm lớn so với các chỉ thị DNA khác:

 Tính đặc hiệu cao: các đoạn mồi SSR được thiết kế dựa trên vùng trình tự sườn có tính bảo thủ cao của các đoạn lặp SSR, do đó sản phẩn của phản ứng SSR-PCR đặc hiệu và ổn định hơn các chỉ thị DNA ngẫu nhiên Bên cạnh đó, nhớ tính chất bảo thủ của vùng trình tự sườn mà các mồi SSR có thể được sử dụng chéo giữa các loài có quan hệ di truyền gần gũi [10]

 Di truyền đồng trội và mức độ đa hình cao: Trải qua tiến hóa và các biến đổi di truyền, số lần lặp lại các motif SSR thay đổi rất nhiều và làm cho các đoạn SSR có chiều dài khác nhau Bởi vậy phản ứng SSR-PCR có thể phát hiện các alen khác nhau trong một locus SSR, qua đó phát hiện được các cá thể đồng hợp tử/dị hợp tử ở locus đó (chỉ thị đồng trội)

Ngoài hai ưu điểm trên, với tần suất xuất hiện trên hệ gen cao của các trình

tự lặp thì số lượng chỉ thị SSR là rất phong phú với mức độ đa hình cao Dựa trên

kĩ thuật PCR và kết hợp các phương pháp phát hiện khác nhau, các phân tích sử dụng chỉ thị SSR rất đơn giản, thành công và đáng tin cậy

Kỹ thuật SSR dựa trên nguyên lý của PCR dùng các cặp mồi đặc hiệu để nhân các đoạn trình tự SSR Sự khác nhau trong cấu trúc đơn vị lặp lại dẫn đến

sự thay đổi độ dài đoạn lặp lại được nhân lên và xác định khi kiểm tra bằng chạy điện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamide Các đoạn SSR đa hình về độ

dài cũng có thể được phát hiện khi lai DNA hoặc có thể được tách dòng, xác định trình tự Hiện nay, kỹ thuật này đang được sử dụng rộng rãi trong lĩnh vực di truyền phân tử của loài bò như lập bản đồ di truyền, nghiên cứu đa dạng và quan

hệ di truyền, chọn giống

Bằng việc sử dụng chỉ thị SSR, kết hợp với các chỉ thị RFLP, bản đồ liên kết trên nhiễm sắc thể số 17 và 19 trên dòng lai backcross của con lai giữa Bos gaurus và Bos Taurus đã được xác lập [23,33] Con lai của bò Banteng (Bos javanicus) và bò Zebu (Bos indicus) cũng đã được Nijman et al (2003) giám định bằng các chỉ thị AFLP và SSR [22]

Trên đối tượng bò tót (Bos gaurus), Nguyen Trung Thanh và cộng sự (2007) đã sử dụng 130 chỉ thị SSR của bò để đánh giá mức độ đa dạng di truyền của loài bò tót ở Việt Nam Kết quả chỉ ra có 117 chỉ thị SSR được khuếch đại thành công bằng phản ứng PCR với DNA tổng số của bò tót Nghiên cứu cũng đã xác định được 3 chỉ thị SRR trên nhiễm sắc thể Y có tính đặc trưng cao cho loài

bò tót với một băng duy nhất được khuếch đại ở bò tót được Kết quả trên là cơ

sở quan trọng giúp cho việc phân biệt bò tót và bò nhà bằng các chỉ thị SSR đặc trưng [21]