Chiết hoạt chất azadirachtin cùng với các limonoid trong bã neem để ứng dụng làm thuốc trừ sâu sinh học

rước thực trạng này, các nhà nông học đã nghiên cứu và đưa ra những phương pháp mới trong phòng trừ và tiêu diệt các loài sâu bọ hại cây trồng. Một trong những hướng nghiên cứu triển vọng là kiểm soát sinh học như: nghiên cứu sử dụng nấm, vi khuẩn, ký sinh thiên địch, các hợp chất thứ cấp từ thảo mộc,….Những chế phẩm sinh học này đang rất được quan tâm, bởi chúng ít làm ảnh hưởng đến các sinh vật sống khác, dễ phân hủy, không làm độc cho nông phẩm và dễ sử dụng. Cây neem (Azadirachta indica A.Juss) là một trong những loài thảo mộc có đặc tính kháng sâu bọ đang được sử dụng và nghiên cứu ở nước ta và nhiều nước khác. Nhằm tìm phương pháp tối ưu hóa trong việc sử dụng cây neem trong quá trình phòng trừ và tiêu diệt sâu bọ nên em thực hiện đề tài “Chiết hoạt chất azadirachtin cùng với các limonoid trong bã neem để ứng dụng làm thuốc trừ sâu sinh học”. rước thực trạng này, các nhà nông học đã nghiên cứu và đưa ra những phương pháp mới trong phòng trừ và tiêu diệt các loài sâu bọ hại cây trồng. Một trong những hướng nghiên cứu triển vọng là kiểm soát sinh học như: nghiên cứu sử dụng nấm, vi khuẩn, ký sinh thiên địch, các hợp chất thứ cấp từ thảo mộc,….Những chế phẩm sinh học này đang rất được quan tâm, bởi chúng ít làm ảnh hưởng đến các sinh vật sống khác, dễ phân hủy, không làm độc cho nông phẩm và dễ sử dụng. Cây neem (Azadirachta indica A.Juss) là một trong những loài thảo mộc có đặc tính kháng sâu bọ đang được sử dụng và nghiên cứu ở nước ta và nhiều nước khác. Nhằm tìm phương pháp tối ưu hóa trong việc sử dụng cây neem trong quá trình phòng trừ và tiêu diệt sâu bọ nên em thực hiện đề tài “Chiết hoạt chất azadirachtin cùng với các limonoid trong bã neem để ứng dụng làm thuốc trừ sâu sinh học”. rước thực trạng này, các nhà nông học đã nghiên cứu và đưa ra những phương pháp mới trong phòng trừ và tiêu diệt các loài sâu bọ hại cây trồng. Một trong những hướng nghiên cứu triển vọng là kiểm soát sinh học như: nghiên cứu sử dụng nấm, vi khuẩn, ký sinh thiên địch, các hợp chất thứ cấp từ thảo mộc,….Những chế phẩm sinh học này đang rất được quan tâm, bởi chúng ít làm ảnh hưởng đến các sinh vật sống khác, dễ phân hủy, không làm độc cho nông phẩm và dễ sử dụng. Cây neem (Azadirachta indica A.Juss) là một trong những loài thảo mộc có đặc tính kháng sâu bọ đang được sử dụng và nghiên cứu ở nước ta và nhiều nước khác. Nhằm tìm phương pháp tối ưu hóa trong việc sử dụng cây neem trong quá trình phòng trừ và tiêu diệt sâu bọ nên em thực hiện đề tài “Chiết hoạt chất azadirachtin cùng với các limonoid trong bã neem để ứng dụng làm thuốc trừ sâu sinh học”.

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về cây neem 3

1.1.1 Định danh 3

1.1.2 Đặc điểm hình thái 4

1.1.3 Nguồn gốc và sự phân bố 5

1.1.4 Giá trị và công dụng 6

1.1.4.1 Thuốc bảo vệ thực vật và phân bón 6

1.1.4.2 Dùng làm dược liệu 6

1.1.4.3 Dùng trong mỹ phẩm 8

1.1.4.4 Công dụng khác 9

1.2 Thành phần hóa học có trong hạt neem 9

1.2.1 Diterpenoids 10

1.2.2 Triterpenoid và dẫn xuất của chúng 10

1.2.2.1 Triterpenoid 11

1.2.2.2 Meliacin 13

1.2.3 Các hoạt chất chính 16

1.2.3.1 Azadirachtin 16

1.2.3.2 Meliantriol 17

1.2.3.3 Salannin 18

1.2.3.4 Nimbin và Nimbidin 18

1.2.3.5 Các chất khác 19

1.3 Tổng quan về thuốc bảo vệ thực vật 19

1.4 Phương thức tác động và phổ tác động của các hoạt chất trong neem 25

1.4.1 Đối với côn trùng 25

1.4.1.1 Phương thức tác động 25

1.4.1.2 Cơ chế tác động 26

1.4.1.3 Phổ tác động 29

1.4.2 Đối với vi nấm 30

1.4.3 Đối với tuyến trùng 30

1.5 Công trình nghiên cứu, phương pháp chiết tách và phối phẩm 30

1.5.1 Trên thế giới 30

1.5.1.1 Các bằng sáng chế 30

1.5.1.2 Bài báo khoa học 34

1.5.2 Trong nước 36

CHƯƠNG 2 ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN 39

2.1 Mục tiêu 39

2.2 Phương pháp thực hiện 39

2.2.1 Nguyên liệu 39

2.2.2 Các phương pháp định lượng hàm lượng azadirachtin cùng với các limonoid 39 2.2.2.1 Phương pháp so màu bằng UV-Vis 39

2.2.2.2 Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC 41

2.2.3 Khảo sát và tối ưu hóa phương pháp chiết 44

2.2.3.1 Qui trình chiết 44

2.2.3.2 Tối ưu qui trình chiết 44

2.2.4 Phối dịch chiết lên chế phẩm thuốc trừ và khảo sát khả năng của nó 45

2.2.4.1 Phối dịch chiết vào chế phẩm thuốc trừ sâu sinh học 45

2.2.4.2 Khảo sát khả năng kháng sâu của chế phẩm 46

2.2.5 Phối trộn hoạt chất của neem với các chế phẩm sinh học khác Khảo sát hiệu lực trừ sâu của chúng 47

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ SƠ BỘ 48

3.1 Thực nghiệm ban đầu 48

3.1.1 Định lượng bằng phương pháp so màu UV-Vis 48

3.1.1.1 Thử nghiệm phản ứng vanillin trên dầu neem, dầu dừa và dịch chiết bã neem 48 3.1.1.2 Thử nghiệm phản ứng vanillin trên các loại dịch chiết neem 49

3.3 Kết quả so màu phản ứng vanillin trên dịch chiết qua UV-Vis 50

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN 53

4.1 Kết quả thô và bàn luận 53

4.2 Kết luận 53

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 A- nhánh thân neem; B- Lá Neem; C- Hạt neem chín; D- Hạt neem khô; 4

Hình 1.2 Neem tricyclic diterpene 10

Hình 1.3 Neem tricyclic diterpene 11

Hình 1.4 Neem tricyclic diterpene 12

Hình 1.5 Limonoid với hệ thống vòng đóng 13

Hình 1.6 Các limomoid mở vòng 14

Hình 1.7 Neem limonoid biến đổi trong hệ thống vòng C và D 15

Hình 1.8 Công thức cấu tạo azadirachtin A và B 16

Hinh 1.9 Công thức cấu tạo của meliantriol 17

Hình 1.10 Công thức cấu tạo của salannin 18

Hình 1.11 Công thức cấu tạo của nimbin và nimbidin 19

Hình1.12 Quá trình phát triển của sâu và bọ 27

Hình 1.13 Các con đường tác động dự kiến của Azadirachtin thông qua trung gian ecdysone 28

Hình 2.1 Phương pháp chiết có loại béo đơn giản 41

Hình 2.2 Qui trình chiết loại béo phức tạp 42

Hình 2 3 Qui trình chiết không loại béo đơn giản 44

Hình 3.1 Phản ứng vanillin của dầu neem và dầu dừa 50

Hình 3 2 UV- Vis của bã neem bằng phản ứng mà vanillin sử dụng dm dichloromethane và ethanol 50

Hình 3 3 UV- Vis của bã neem bằng phản ứng mà vanillin sử dụng dm ethanol 51

JH: Hormone Juvenile

UV: Tia tử ngoại

VSV: Vi sinh vật

WHO: Tổ chức y tế thế giới

MỞ ĐẦU

Nông nghiệp là ngành chiếm tỷ trọng lớn đối với nền kinh tế nước ta Nền sản xuất nông nghiệp ở nước ta đang đối đầu với những thách thức và áp lực từ bên trong lẫn bên ngoài Nông nghiệp Việt Nam muốn phát triển bền vững, cần phải có những thay đổi trong cả tư duy lẫn hành động Hiện nay, nền nông nghiệp phát triển theo chiều rộng là chính, năng suất thấp, hiệu quả kém Nguyên nhân là do sự lạc hậu, thiếu sự chuyên môn hóa trong quá trình canh tác và sản xuất dẫn đến những sản phẩm kém chất lượng, làm giảm sự cạnh tranh trên thị trường quốc tế Trên thực tế, nền nông nghiệp nước ta phải đối mặt với nhiều loài sâu, bọ hại cây trồng nên việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật là không thể tránh khỏi Theo thống kê của tổ chức lương thực thế giới (FAO) cho thấy: các loại cây trồng trên đồng ruộng đang phải chống đỡ với hơn 100.000 loài sâu hại khác nhau, 10.000 loài nấm, 200 loài vi khuẩn, 600 loài tuyến trùng và 600 loài virus gây bệnh Lượng lương thực bị mất do vấn nạn này ngày càng tăng lên Để khắc phục tình trạng trên, con người

đã tích cực tìm kiếm các biện pháp phòng chống các tác nhân gây hại, nhiều biện pháp khác nhau đã được sử dụng, trong đó thuốc trừ sâu hóa học được sử dụng nhiều nhất Chúng đóng vai trò quan trọng trong hệ thống canh tác nông nghiệp trong một thời gian dài và mang lại hiệu quả cao với phạm vi sử dụng rộng lớn Có thể nói, không một biện pháp nào bảo vệ mùa màng tốt hơn thuốc trừ sâu hóa học cả về mặt qui mô lẫn hiệu quả

Tuy nhiên, các biện pháp hóa học ngày càng bộc lộ những khuyết điểm của nó Do dư lượng thải ra môi trường ngày càng lớn nên nó đang gây vấn nạn đến môi trường, đầu độc con người, gây mất cân bằng hệ sinh thái Điều nghiêm trọng hơn là do tình trạng sử dụng quá liều lượng, không đúng thời gian sử dụng thuốc và thời gian thu hoạch đã tạo nên dư lượng thuốc không cho phép trong hoa màu và nông sản Những thông tin như bị ép giá,

bị trả lại hàng, không loạt qua được khâu kiểm định nghiêm ngặt khi nhập khẩu vào các nước tiên tiến đã quá quen thuộc trên các mặt báo Đây cũng là nguyên nhân gây nhiễm độc cho khoảng 1,5 triệu người mỗi năm trên toàn thế giới, trong đó có 25 nghìn người bị

tử vong (WHO-1998)

Trước thực trạng này, các nhà nông học đã nghiên cứu và đưa ra những phương pháp mới trong phòng trừ và tiêu diệt các loài sâu bọ hại cây trồng Một trong những hướng nghiên cứu triển vọng là kiểm soát sinh học như: nghiên cứu sử dụng nấm, vi khuẩn, ký sinh thiên địch, các hợp chất thứ cấp từ thảo mộc,….Những chế phẩm sinh học này đang rất được quan tâm, bởi chúng ít làm ảnh hưởng đến các sinh vật sống khác, dễ phân hủy, không làm độc cho nông phẩm và dễ sử dụng

Cây neem (Azadirachta indica A.Juss) là một trong những loài thảo mộc có đặc tính

kháng sâu bọ đang được sử dụng và nghiên cứu ở nước ta và nhiều nước khác Nhằm tìm phương pháp tối ưu hóa trong việc sử dụng cây neem trong quá trình phòng trừ và tiêu

diệt sâu bọ nên em thực hiện đề tài “Chiết hoạt chất azadirachtin cùng với các limonoid

trong bã neem để ứng dụng làm thuốc trừ sâu sinh học”

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về cây neem

1.1.1 Định danh

Tên khoa học: Azadirachta indica A.Juss Được nhà khoa học Andriew Henri Laurent de

Jussieu tìm thấy năm 1830

Tên thường gọi: xoan Ấn Độ, sầu đâu, neem (tiếng anh), nim (tiếng La-tinh), xoan trắng, xoan chịu hạn

Đặc điểm lá: lá có dạng xẻ, lá kép lông chim lẻ dài 20 đến 38 cm, mọc so le, dạng

mác, xẻ răng cưa sâu và sắc cạnh, nhẵn cả trên hai bề mặt, cân đối hai bên, nhọn, cuống rất ngắn

Kiểu phát hoa: hoa mọc thành từng chùm ở nách lá, hoa nhỏ có 5 cánh, lưỡng tính,

màu trắng Đài hoa có phủ lớp lông mịn bên ngoài, có 5 thùy, các thùy xếp dưới dạng

trứng hoặc tròn, có lông mịn nhỏ Nhị dạng ống mang bao phấn ở bên, trong chứa 2 lá noãn, hoa có mùi thơm giống mùi mật ong

Quả: cây bắt đầu ra quả khi trồng từ 3 đến 5 năm, cho năng suất cao và ổn định sau 5

đến 10 năm, trung bình một cây trưởng thành cho từ 30-35 kg quả/ năm Quả trơn láng hình bầu dục dài khoảng 2 cm, khi chín có màu vàng hoặc màu vàng xanh, thịt quả ngọt Quả phát triển và chín trong vòng 1-2 tháng Hạt gồm vỏ và nhân, có 1-3 nhân trong một hạt

Vỏ cây: cây có vỏ dày trung bình, vỏ có màu xám đậm bên ngoài và màu đỏ lợt bên

trong Vỏ của các nhánh có màu xanh lợt, mềm và trơn, đôi khi có các vân dọc màu xanh

Độ dày vỏ từ 1,25 đến 2,5 cm Khi cắt ngang thân cây quan sát thấy có ba vùng: vùng ngoaị biên hẹp có màu tía, vùng giữa có màu trắng, vùng trong cùng khá dày, chứa các sợi libe thứ cấp, có màu trắng vàng Vỏ cây có mùi giống tỏi và hơi đắng

1.1.3 Nguồn gốc và sự phân bố

Cây neem được xem là có nguồn gốc từ vùng Assam và Burma Tuy nhiên, nguồn gốc chính xác của nó vẫn chưa được biết, một số người cho rằng neem sống tự nhiên ở vùng tiểu lục địa Ấn Độ, những người khác lại cho rằng nó thuộc vùng khô hạn trên toàn khu vực Nam Á, Đông Nam Á bao gồm Sri Lanka, Thái Lan, Malaysia và Indonesia [1] Ngày nay, nó được trồng rộng rãi ở ít nhất 30 quốc gia, đặc biệt ở vùng dọc theo vành đai phía nam hoang mạc Sahara

Ấn Độ là nước trồng xoan chịu hạn lớn nhất thế giới, tại đây cây neem được trồng khắp nơi và được xem như là loài cây tiêu biểu của quốc gia Với gần 25 triệu cây neem cho 442.300 tấn hạt/ năm đã tạo ra khoảng 88.400 tấn dầu neem và 353.800 tấn bánh dầu [2] Năm 1981, Cây neem được GS Lâm Công Định, một nhà lâm học Việt Nam mang giống

về trồng tại Phan Thiết Sau khi di thực vào, nó được nhân rộng và trồng nhiều tại Ninh Thuận, Bình Thuận (diện tích tới 1000 ha) Ông cũng đã đặt tên cây này là cây xoan chịu

hạn (Azadirachta indica A.Juss) để phân biệt với cây xoan địa phương (Melia azedarach)

được trồng phổ biến ở nước ta [3]

1.1.4 Giá trị và công dụng

Neem có rất nhiều công dụng trong nông nghiệp và công nghiệp Tại nhiều nước trên thế giới, cây neem không những mang lại những hiệu quả đáng kể về kinh tế với nhiều sản phẩm da dạng mà nó còn giải quyết được một số vấn đề về môi sinh Tại Ấn Độ, cây neem từ lâu đã được xem là một tài sản quí giá do tính đa dụng và khả năng thích nghi rộng của nó [4]

1.1.4.1 Thuốc bảo vệ thực vật và phân bón

Các hoạt chất sinh học phân bố khắp các bộ phận của cây neem [5] Dịch chiết của lá, nhân hạt neem, bánh dầu neem, dầu neem [6] hay dẫn xuất của chúng đều có công dụng trong việc tạo chế phẩm phòng trừ sâu Đặc biệt, các limonoids trong cây có tác dụng gây ngán ăn và xua đuổi côn trùng rất có hiểu quả Từ xa xưa, các nông dân Ấn Độ và nhiều khu vực khác trên thế giới đã lấy dịch chiết neem để làm thuốc bảo vệ thực vật [1] Bằng những cách rất đơn sơ như xay nhỏ lá, hạt hay bã neem, rồi ngâm lấy dịch chiết đem phun lên thực vật Công dụng và cơ chế bảo vệ thực vật sẽ được làm rõ ở phần sau

Bánh dầu neem là sản phẩm phụ có giá trị của công nghiệp ép dầu Bánh dầu chứa khoảng 1,07- 1,36% lưu huỳnh, 2-3% nitơ, 2-3% đạm, 1% photpho, 1,4% kali trong thành phần, bánh dầu neem là nguồn nguyên liệu tốt sản xuất phân hữu cơ nhằm cung cấp dinh dưỡng cho cây, duy trì và cải thiện độ phì của đất, giải quyết được vấn đề chất thải của ngành công nghiệp ép dầu

STT Tên chất Nguồn Hoạt tính sinh học

Chống viêm khớp

Hạ sốt Giảm đường huyết Chống viêm dạ dày Chất diệt tinh trùng Chống nấm

Chống khuẩn Lợi tiểu

8 Gallic acid, (-) epicatrchin và

12 Polysacchrides G1A, G1B Vỏ cây Chống ung thư

13 Polysacchrides G2A, G3A Vỏ cây Chống viêm

14 NB-2-Peptidoglucan Vỏ cây Điều hòa hệ miễn dịch

Bảng 1.1 Hoạt tính dược liệu các chất trong neem

Ngoài những công dụng trên, vỏ cây neem còn có công dụng cầm máu, bổ gan, trị đàm,… Neem còn được báo cáo chữa được stress và điều khiển tỷ lệ sinh đẻ,…Tại một số vùng Andhra Pradesh, nông dân thường cho gia súc ăn lá neem sau khi sinh con để tăng sự tiết sữa Ngoài ra lá neem còn có tác dụng phòng trị bệnh giun sán cho gia súc và kiểm soát nhiều loại tác nhân gây bệnh khác Nhiều nơi còn dùng lá non làm rau ăn vừa bổ sung khoáng chất, vừa có thể phòng ngừa giun sán hoặc viêm nhiễm đường ruột Ở Ấn Độ, dân gian thường lấy lá neem để gần trẻ em giúp ngăn ngừa bệnh ho gà

1.1.4.3 Dùng trong mỹ phẩm

Bởi hoạt tính kháng khuẩn tốt, có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn trong tế bào gây mụn nên dầu neem đang được ưa chuộng trong việc điều trị mụn như một liệu pháp tự nhiên

Bằng cách phối dầu neem vào nền mỹ phẩm hay sử dụng trực tiếp có khả năng điều trị mụn trứng cá, mụn nhọt [7]

Nhờ hoạt tính này, dịch chiết lá neem còn giảm lượng vi khuẩn, mảng bám men răng từ

đó chống bị viêm răng (bệnh nha chu) nên có thể phối dịch chiết neem vào kem đánh răng

để sử dụng hằng ngày [2] Ngoài ra, neem còn được phối vào nhiều sản phẩm mỹ phẩm khác như dầu gội đầu, sữa tắm, xà phòng,… để tăng khả năng diệt khuẩn

1.1.4.4 Công dụng khác

Cùng với những hoạt tính sinh học trên, cây neem còn có nhiều hữu ích khác như tạo bóng mát, tạo môi trường xanh trong lành, giúp bảo vệ đất, chống xói mòn, cát bay,…Gỗ neem được dùng chế tạo hàng gia công mỹ nghệ có độ bền cao không bị mối mọt làm hư hại Ngoài ra, vỏ neem chứa nhiều tannin phục vụ cho công nghệ thuộc da, công nghệ nhuộm, nhựa mủ làm kẹo gum,…

1.2 Thành phần hóa học có trong hạt neem

Cây neem (Azadirca indica A Juss), đã được thu hút nghiên cứu bởi rất nhiều nhà khoa

học trên các lĩnh vực khác nhau Hơn 300 chất đã được phân lập và xác định tính chất từ hạt của cây neem [8] Có thể chia chúng thành 2 nhóm:

Isoprenoid (terpen): gồm diterpenoid và triterpenoid như là các protomeliacin, limonoid,

azadirone và dẫn xuất của chúng, gedunin và dẫn xuất của chúng, các hợp chất dạng vilasinin và C-secomeliacin (nimbin, salanin và azadirachtin)

Non-isoprenoid: gồm protein, amino acid, carbohydrate, hợp chất của lưu huỳnh, hợp

chất polyphenolic như flavonoid, glycoside của chúng, dihydrochalcone, coumarin, tannins, chất béo,…

Các hạt neem chứa khoảng 45% chất béo bao gồm: loeic acid (50–60%), palmitic acid (13–15%), stearic acid (14–19%), linoleic acid (8–16%) và arachidic acid (1–3%) Dầu neem có màu vàng, có vị cay và mùi hơi khó chịu [9]

Một phần ba trong số các hoạt chất có trong hạt neem là các tetranortriterpenoid (limonoid) [8] như: azadiractin, salanin, meliantriol, nimbin, nimbidin, Các thành phần gây vị đắng như nimbin (0,12%), nimbinin (0,01%), nimbidin (1,4%) and nimbidiol (0,5%) cũng được xác định [9] Tetranortriterpenoid là thành phần chính và là nhóm đặc trưng của các thành phần trong cây neem

Hai nhóm hoạt tính lớn được nghiên cứu trong hạt neem là diterpenoid và triterpenoid với

sự quan tâm đặc biệt đến các limonoid [10]

1.2.1 Diterpenoids

Trong các loại terpene thì tricyclic diterpene được tìm thấy nhiều nhất, đặc biệt là những

chất có vòng C với nhóm chức của oxygen tại C-3 và C-7 (Hình 1.2)

Hình 1.2 Neem tricyclic diterpene

Đa số các tricyclic diterpene trong neem được báo cáo có hoạt tính sinh học cao: chống tế bào ung thư, kháng sinh và trừ sâu cao [11]

1.2.2 Triterpenoid và dẫn xuất của chúng

Triterpenoid và xuất của chúng thể hiện toàn bộ các tính chất của các thành phần có trong

cây neem (Hình 1.3)

Có 7 loại tetracyclic triterpene (protomeliacin) được báo cáo là những thành phần khác

nhau trong cây neem (Hình 1.4) Gồm: meliantriol 16 [12], nimbocinone 17 [13] và

nimolinone 18 [14], đó là những dẫn xuất của euphol/tirucallol và azadirachtol 19 [15], azadirachnol 20 [16], dẫn cuất của apoeuphol/apotirucallol Một tetracyclic terpenoid mới, azadirol 21, đã được chiết từ neem cùng với triterpenoid kulactone 22 chất mà được

phân lập trước đây từ Melia azedarach L [17]

Limonoid

Dẫn xuất triterpenoid

Triterpenoid

1.2.2.2 Meliacin

Meliacin (limonoid) là dẫn xuất của triterpene, có cấu trúc giống triterpen nhưng bị mất 4 nhóm methylene và các C còn lại đóng vòng thành vòng furan Một hay nhiều hệ thống vòng này có thể mở vòng oxidative Tất cả các meliacin đã biết có oxygen tại C-7, một

nối đôi ở vòng D và một nhóm methyl tại C-8 (Hình 1.5) [18, 19]

Hình 1.5 Limonoid với hệ thống vòng đóng

Limonoid với hệ thống vòng

Limonoids với hệ thống vòng là những chất tương đối giống với tetracyclic triterpenoids,

đại diện là azadirone 10, azadiradione 23, epoxyazadiradione 26 [20],

azadiradione-7-benzoate 24, meldenin 25 [21], vilasinin 27 và vilasinintriacetate 28 [22] Những

limonoids này có vòng D nguyên vẹn nhưng đã bị oxidized thành vòng tại C-14 và C-15

Limonoid mở vòng

Những chất thuộc nhóm này có một hay nhiều vòng đã được mở hay thay đổi bởi quá trình oxi hóa Tuy nhiên sự mở vòng ở vòng B vẫn chưa được xác định trong cây neem

mà đặc trưng là sự mở vòng ở vòng C limonoid của nhóm nimbin (Hình 1.6) Đại diện

nhóm này có: salannin 31 [23] , desacetylsalannin 32 [24], nimbandiol 29 [24],

nimbenene 30 [25], desacetyl-nimbinolide 33 và desacetyl-isonimbinolide 34 [24]

Hình 1.6 Các limomoid mở vòng

Hình 1.7 Neem limonoid biến đổi trong hệ thống vòng C và D

Nhận xét: Những chất limonoids oxi hóa cao nhất trong neem được biến đổi trong cả

vòng C và D Đây là những chất được tìm thấy nhiều trong nhân của hạt neem Ngoài khả năng thay đổi cấu trúc độc nhất vô nhị này, những chất trong nhóm này có những nhóm

thế side-chain tương tự như các phân tử Azadirachtin 15 được nghiên cứu nhiều nhất

trong nhóm cấu trúc này

1.2.3 Các hoạt chất chính

1.2.3.1 Azadirachtin

Trong các limonoids, azadirachtin được xem là chất có đặc tính hoạt động nhất, bởi tính chất tác dụng lên đa số các côn trùng khác nhau [27] Chiết xuất azadirachtin sử dụng trong thuốc trừ sâu thương mại được đo nồng độ bởi HPLC [28] hoặc bằng phương pháp sắc ký lỏng siêu tới hạn [29] Azadirachtin có nhiều đồng phân, trong đó đồng phân azadirachtin A chiếm 73% và có ít nhất 8 đồng phân azadirachtin khác chiếm 27% còn lại [30] Các đồng phân từ azadirachtin B-L đã được xác định [31-36]

Hình 1.8 Công thức cấu tạo azadirachtin A và B

Phân tử azadirachtin A có 16 nguyên tử oxygen và 16 trung tâm bất đối xứng, CTPT

C35H44O16, khối lượng phân tử 720,7; nhiệt độ nóng chảy 154-158oC Độ hòa tan trong nước là 0,26 g/l, tan rất nhanh trong ethanol, diethyl ether, acetone, chloroform, không tan trong hexan Azadirachtin có bước sóng hấp thu UV cực đại tại 212 nm trong dung môi methanol [29]

Azadirachtin có thể đạt 0,6% đến 0,7% trên nhân hạt neem phơi khô, nhưng thường ở mức 0,2% đến 0,3% là phổ biến, nó cũng tồn tại trong thân và lá nhưng hàm lượng ít hơn Azadirachtin A là một chất không bền, dễ bị phân hủy bởi tia UV trong ánh sáng mặt trời, nhiệt độ, độ ẩm không khí, môi trường acid hay enzymes có trong lá Dureja (1999) đã nghiên cứu khả năng phân hủy của azadirachtin trong các dung môi khác nhau trong 25 ngày bảo quản ở 29±1oC Kết quả cho thấy rằng 50% Azadirachtin bị phân hủy trong methanol và acetone; 75-80% bị phân hủy trong methylene chloride, carbon tetrachloride

Azadirachtin không giết côn trùng một cách trực tiếp mà thay vào đó nó ngăn chặn và phá

vỡ quá trình sinh trưởng và sinh sản của côn trùng gây hại Azadirachtin có cấu trúc tương

tự như hormone “ecdysone”, hormone này có tác dụng kiểm soát tiến trình biến đổi nội hóa học của côn trùng chuyển từ dạng ấu trùng sang dạng nhộng để sang dạng trưởng thành Azadirachtin được xem là chất ngăn cản sự tổng hợp các hormone này, do đó phá

vỡ chu kỳ sống của côn trùng [10]

Tuy nhiên không phải chỉ có azadirachtin là phân tử có hoạt tính duy nhất Dịch chiết của cây neem chứa tương đương azadirachtin so với azadirachtin tinh khiết có khả năng hoạt động cao hơn 3-4 lần [37] Điều này gây nên bởi sự hiện diện của những limonoid khác trong dịch chiết Do đó, lượng tổng của azadirachtin và các limonoid có liên quan trong dịch chiết có thể giúp tiên đoán khả năng hoạt động giữa các loài neem khác nhau [38]

1.2.3.2 Meliantriol

Meliantriol là hợp chất thuộc triterpenoid alcohol, là tác nhân gây ngán ăn mạnh đối với côn trùng ngay cả khi xử lý với nồng độ thấp Nhiều loài côn trùng không dám ăn trong 2-

6 tuần sau khi tiếp xúc với chế phẩm có chứa meliantriol từ neem [39]

Hinh 1.9 Công thức cấu tạo của meliantriol

1.2.3.3 Salannin

Salannin cũng là hoạt chất gây ngán ăn mạnh và là chất chống lại sự lột xác của côn trùng Một số nghiên cứu salannin có tác động mạnh lên sự lột xác của con bọ cánh cứng

trên dưa chuột- Acalymma vitta và bọ cánh cứng Nhật Bản Popillia japonica Trong hạt

hàm lượng salannin thường từ 15– 1247 g /g nhân hạt neem

Hình 1.10 Công thức cấu tạo của salannin

1.2.3.4 Nimbin và Nimbidin

Nimbin và nimbidin được xem là những chất có hoạt tính kháng virus mạnh Chúng tỏ ra

có hiệu quả đối với virus gây bệnh trên cây cà chua, bệnh đậu mùa và các bệnh trên gia cầm Eeswara và các cộng sự (1996) báo cáo rằng nimbindin có trong hạt neem có hàm lượng từ 9- 619 g /g nhân hạt neem [39]

Hai chất tương tự như salannin là 3- diacetylsalannin và salannol cũng gây hiệu lực ngán

ăn cho côn trùng

1.3 Tổng quan về thuốc bảo vệ thực vật

Theo giáo trình sử dụng thuốc bảo vệ thực vật của PGS-TS Nguyễn Trần Oánh, các thành thành phần trong thuốc BVTV có liên quan chặt chẽ với nhau Lựa chọn tỷ lệ phù hợp giữa các thành phần sẽ nâng cao hiệu lực của sản phẩm, tiện lợi khi sử dụng và an toàn với cây trồng, môi sinh và môi trường

Hoạt chất (Active ingredient)

Là thành phần cơ bản của thuốc BVTV, mang hoạt tính sinh học: có tác dụng diệt trừ hoặc hạn chế sự sinh trưởng, phát triển các sinh vật gây hại tài nguyên thực vật, là chất có tác dụng điều hòa sinh trưởng thực vật, gây ngán ăn, chất thu hút hay xua đuổi sinh vật gây hại

Chất làm loãng (diluent)

Là chất trơ, ở thể lỏng hay rắn có tác dụng làm loãng hoạt chất, nhưng không làm giảm hoạt tính sinh học của hoạt chất, giúp rải đều hoạt chất trên cây Chất làm loãng ở thể rắn gọi là chất mang, ở thể lỏng gọi là dung môi

Dung môi (solvent): là các chất ở dạng lỏng có khả năng hòa tan dạng rắn, khí, thường để tạo sản phẩm dạng sữa, đậm đặc, dạng phun thể tích cực nhỏ (hàm lượng DM >50%) và dạng hạt (khoảng 10%)

Tiêu chuẩn dung môi: hòa tan mạnh hoạt chất, có độ độc thấp với thực vật, động vật máu nóng và không gây kích ứng da, không phản ứng với hoạt chất và chất nhũ hóa, bền và làm giảm giá thành sản phẩm

Chất hoạt động bề mặt (surfactant)

Chất hoạt động bề mặt có tác dụng giữ độ bền và tăng tuổi thọ cho sản phẩm Có chức năng chính là hoạt hóa, phù trợ, khử keo tụ, phân tán, tạo nhũ, tạo bọt, khử bọt, tăng khả năng loang, dính lên bề mặt, làm ướt và tăng hoạt tính sinh học,…

Chất bề mặt anion: đầu ghét nước mang điện tích âm, tạo thành chủ yếu do hydroxyl và sulfo hóa rượu Được dùng nhiều trong gia công thuốc BVTV (chiếm 50% tổng khối lượng)

Chất hoạt động bề mặt lưỡng cực: chỉ dùng trong các pha chuyên dụng, gia công trong trường hợp có nhiều độ pH để ngăn sự đông tụ khi bổ sung các chất anionic khác

Chất bề mặt không ion: dùng nhiều trong gia công thuốc BVTV, chiếm 75% tổng lượng

bổ sung khi phun

Chất hoạt động bề mặt tạo điều kiện quyết định cho sự hình thành các thuốc dạng mới, tăng khả năng hòa tan của hoạt chất và kích thước giọt, tăng thời gian bền vững hoạt tính

sinh học khi gia công Các chất hoạt động bề mặt bị sinh vật phân hủy hoàn toàn, có độ độc thấp nên an toàn với môi trường

Hàm lượng chất hoạt động bề mặt trong gia công khoảng 1-10% để thêm vào bình phun với nồng độ 0,01- 0,1%, làm tăng hoạt tính sinh học 1-2% ( tăng xâm nhập và vận chuyển thuốc trong cây)

Chất thấm ướt (wetting agrent)

Chất thấm ướt đưa vào chất lỏng để làm giảm sức căng bề mặt giữa chất lỏng và bề mặt vật phun, tăng cường sức thâm nhập của chất lỏng, khiến cho giọt thuốc dễ loang Hàm lượng chất thấm ướt trong sản phẩm thường chứa từ 2-10%

Chất hoạt động bề mặt có trọng lượng phân tử nhỏ, thường có tính làm ướt tốt hơn các chất hoạt động bề mặt có trọng lượng phân tử cao

Hàm lượng của chúng trong các dạng bột thấm nước, huyền phù đậm đặc và hạt phân tán trong nước chiếm 1- 6%

Chất loang (spreader)

Chất loang là chất làm tăng diện tích che phủ bề mặt chất rắn hay bề mặt chất lỏng của một lượng nhất định của chất lỏng đã có Chất gây loang và chất bám dính là những phụ

gia dùng trong gia công để nâng cao khả năng bám dính của các thành phẩm thuốc dạng lỏng, nhằm tạo điều kiện cho sản phẩm trải ra đều hơn và bám dính tốt hơn trên lá cây, thân cây khi phun

Chất hòa tan (solutes)

Là những chất tạo micelle trong nước ở nồng độ vượt nồng độ micelle tới hạn Các micelle có thể bị tan hay hòa tan chất không tan trong nước ở phần ưa nước của micelle

Những chất nâng cao hoạt tính sinh học

Là những chất giảm sức căng bề mặt, được dùng riêng hay cùng với các chất khác như dầu khoáng hay dầu thảo mộc được thêm vào để nâng cao hoạt tính sinh học của hoạt chất với đối tượng phòng trừ Lựa chọn chất nâng cao hoạt tính sinh học phụ thuộc vào bản chất, phương thức tác động của hoạt chất để đáp ứng độ độc, hiệu quả, an toàn và môi trường

Các chất được sử dụng là non-ionic như: các alkylphenol ethoxylat, các rượu aliphatic mạch thẳng ethoxylat, các liphatic amin ethoxylat

Chất chống lắng (anti- deposit)

Là chất làm đặc (tăng độ nhớt, giảm lượng hạt thuốc quá nhỏ, giảm khả năng bay hơi và kìm hãm sự rửa trôi của dung dịch phun) và các chất tạo gel có tác dụng tăng độ bền của huyền phù đậm đặc, sữa và hỗn hợp huyền phù nhũ tương hay độ chảy của chất lỏng, ngăn cản tách lớp và lắng đọng của các phần tử và giọt Dễ bị biến đổi bởi độ pH, nhiệt

độ và chất điện li

Các chất chống lắng thường dùng dưới dạng hồ tinh bột biến thể, polyacryl hóa, rượu polyvinyl và polyethylene oxide Gôm xanthan là chất chống lắng quan trọng cho các dạng huyền phù và nhũ tương đậm đặc Gôm tan tạo dung dịch trong nước ở điều kiện

pH, nhiệt độ và nồng độ chất điện li rộng Hàm lượng khoảng 0,5% dạng gia công hay tạo liên kết ngang ở 0,2% khi hỗn hợp với đất sét hay silica hoặc các vật liệu hòa tan khác

Chất chống đông (anti-cogulant)

Là chất bổ sung vào dung dịch nước/ huyền phù đậm đặc để giảm điểm đông < 0oC (-5 hay -10oC) Chất chống đông thường dùng là propylene glycol Hàm lượng: 5-10% urea cũng dùng để chống đông cho các hoạt chất tan trong glycol

Chất tạo bọt (foaming adjuvant) và chất chống tạo bọt (anti-foaming adjuvant)

Chất tạo bọt có tác dụng giảm sức căng bề mặt của dịch phun, giúp giọt thuốc nhanh loang dính, bám tốt hơn, khó bị rửa trôi hơn Nhưng nếu thuốc tạo quá nhiều bọt sẽ khó

đóng gói và giảm tốc độ phun Trong trường hợp này phải cho thêm chất chống tạo bọt khi gia công Hàm lượng tối đa chống tạo bọt là 0,2%

Chất bảo quản (preservative)

Là chất ngăn chặn VSV phát triển phá hủy một số thành phần trong gia công thuốc Một

số trường hợp gia công dùng nhiều nguồn carbon thích hợp cho VSV phát triển như polysaccharide (trong dung dịch đậm đặc, huyền phù đậm đặc và sữa O/W), dễ bị VSV phân hủy, khiến cho thuốc sinh khí, đổi màu, độ nhớt và độ pH thay đổi, thuốc bị phân lớp, lắng đọng Trong tương lai, các dạng gia công có cơ sở là nước và các chất bổ sung

dễ bị VSV phân hủy được dùng nhiều, nên lượng chất bảo quản sẽ tăng thêm

Tiêu chuẩn của một chất bảo quản là có thể chống được nhiều VSV ở nồng độ rất thấp và

an toàn

Chất bảo quản có thể làm mất tính ổn định của các chất hoạt động bề mặt cationic, anionic hoặc chất làm đặc anionic- polysacchorid Những năm gần đây, nhiều chất bảo quản mới với phổ rộng, có hiệu lực với biên độ pH rộng và không phản ứng với chất hoạt động bề mặt khác xuất hiện như: 1,2-benzissothiazalin-3-one (BIT) sử dụng tốt trong nhiều môi trường Nồng độ sử dụng chất bảo quản từ 0,03- 0,06%

Các hợp chất màu (colour adjuvant)

Là các chất cho thêm vào sản phẩm để cảnh báo, ngăn ngừa khả năng ngộ độc và kiểm tra nồng độ đồng đều của thuốc khi phun hay sử dụng Cần chọn chất nhuộm màu thích hợp với các thành phần khác để tránh ảnh hưởng đến độ bền của thuốc

1.4 Phương thức tác động và phổ tác động của các hoạt chất trong neem

1.4.1 Đối với côn trùng

1.4.1.1 Phương thức tác động

Các hoạt chất này thường tác động lên côn trùng theo các phương thức chủ yếu sau đây [10]:

 Gây ngán ăn: Là một trong những phương thức tác động đặc biệt nhất của các

hoạt chất trong cây neem đối với côn trùng, trong đó azadirachtin là hoạt chất gây ngán ăn mạnh nhất đối với nhiều loại côn trùng Salannin và meliantriol cũng có khả năng này Nguyên nhân của sự ngán ăn này, là do côn trùng sau khi tiếp xúc một vài lần với dịch chiết neem sẽ phát hiện và cảnh giác nên không dám ăn những lần sau [40-42]

Dịch chiết từ xoan chịu hạn chiết xuất trong nước có nồng độ 0,5- 1,0% gây ngán

ăn hiệu quả đối với Spodoptera litura F trên đồng ruộng thuốc lá sau 7 ngày phun

mà không ảnh hưởng xấu đến chất lượng thuốc lá [43]

 Xua đuổi: Các chất có trong dịch chiết neem có mùi nặng giống tỏi, hơi khó ngửi

nên khi phối vào thuốc trừ sâu có nền dễ bay hơi nên có khả năng tác động đến côn trùng từ xa thông qua cơ quan thụ cảm hóa học khứu giác Điều này gây bất lợi trong đời sống sinh học của côn trùng, khiến chúng di chuyển ra xa vùng gây nhiễm [27]

Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy, nhiều loại côn trùng dễ dàng bị xua đuổi bởi các hoạt chất trích từ cây neem, nhất là châu chấu và các loại bọ rầy Năm 1980, ngoài việc chứng minh hoạt chất gây ngán ăn, Saxena và ctv cũng đã theo dõi tác động xua đuổi của dầu neem đối với rầy nâu [44]

 Khả năng diệt côn trùng: Các hoạt chất từ neem ở nồng độ thích hợp có khả năng

diệt côn trùng (đặc biệt là ấu trùng muỗi [45], ruồi đục quả [46], nhện [47], bọ rầy…) ở các tỷ lệ khác nhau, tuy hiệu lực không nhanh và mạnh như các thuốc trừ sâu tổng hợp

 Ảnh hưởng đến sự phát triển và lột xác: theo Koul (1984), tác động của neem

đối với sự phát triển và lột xác của côn trùng biểu hiện qua các biến đổi như: giảm kích thước, giảm trọng lượng, kéo dài thời gian phát triển, tạo ra những trưởng thành dị dạng như cụt râu, cụt cánh hoặc râu, cánh, chân bị biến dạng [48]

 Làm giảm khả năng sinh sản và gây vô sinh: Các hoạt chất sinh học từ cây neem

có khả năng ức chế sinh sản của nhiều loại côn trùng như ngăn chặn sự đẻ trứng và làm trứng không nở [49, 50]

Ngoài ra, các hoạt chất từ cây xoan chịu hạn còn tác động lên côn trùng theo phương thức khác như làm giảm khả năng nuốt thức ăn hoặc ức chế sự hình thành kitin (polyacetyl glycoamine) [10]– thành phần cơ bản nhất của vỏ côn trùng, làm chúng không lột xác được

1.4.1.2 Cơ chế tác động

Azadirachtin và những hoạt chất sinh học trong neem gây hai tác động chính trên côn trùng là gây ngán ăn và ngăn cản sự lột xác, điều này được ghi nhận ở hầu hết các loài côn trùng trong đó hiệu quả ngán ăn là rõ rệt nhất [40]

Azadirachtin và các hoạt chất sinh học khác có trong neem có hình dạng và cấu trúc tương tự nhiều loại hormone quan trọng có trong cơ thể côn trùng, nên chúng dễ dàng xâm nhập và dần dần ức chế hệ nội tiết, gây ra những rối loạn về hormone ở côn trùng Trong quá trình nội sinh xảy ra ở côn trùng, bộ não của côn trùng sinh ra một protein-

hormone prothoracotropic (PTTH) chất này thông qua corpus cardiacum kích thích các

tuyến prothoracic để bắt đầu tổng hợp một nhóm các hormone nội tiết côn trùng-

ecdysteroid Hormone Juvenile (JH) được sản xuất chủ yếu trong corpora allata Tỷ lệ hai