Phát hiện ADN phôi thai tự do trong huyết tương máu ngoại vi mẹ ứng dụng cho chẩn đoán trước sinh bằng biện pháp không can thiệp

PHÁT HIỆN ADN PHÔI THAI TỰ DO TRONG HUYẾT TƯƠNG MÁU NGOẠI VI MẸ: ỨNG DỤNG CHO CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH BẰNG BIỆN PHÁP KHÔNG CAN THIỆP Trần Văn Khoa, Nguyễn Duy Bắc Hồ Hữu Thọ, Nguyễn Vi

PHÁT HIỆN ADN PHÔI THAI TỰ DO TRONG HUYẾT TƯƠNG MÁU NGOẠI VI MẸ: ỨNG DỤNG CHO CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH BẰNG

BIỆN PHÁP KHÔNG CAN THIỆP

Trần Văn Khoa, Nguyễn Duy Bắc

Hồ Hữu Thọ, Nguyễn Viết Trung

Học viện quân y

Tóm tắt

ĐẶT VẤN ĐỀ: Gần đây, sự phát hiện ra ADN phôi thai trong huyết thanh mẹ đã

mở ra một phương pháp mới chẩn đoán trước sinh bằng biện pháp không can thiệp Mục đích của nghiên cứu này là tách chiết ADN phôi thai tự do trong trong máu ngoại vi mẹ để sử dụng cho chẩn đoán trước sinh bằng biện pháp không can thiệp ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU: AND phôi thai được tách chiết từ huyết tương máu ngoại vi của 29 phụ nữ mang thai với tuổi thai từ 7 đến 38 tuần Gen đặc hiệu giới tính nam – SRY được phân tích bằng kỹ thuật PCR KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN: 15 trong số 29 thai đã được xác định là nam qua phân tích PCR với gen đặc hiệu giới tính nam Kết quả này hoàn toàn phù hợp với kết quả kiểm tra giới tính qua siêu âm cũng như giới tính sau sinh KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ: ADN tự do phôi thai tách chiết được từ huyết thanh máu ngoại vi mẹ rất có giá trị để chẩn đoán trước sinh bệnh di truyền bằng biện pháp không can thiệp

*Từ khoá: AND phôi thai tự do, chẩn đoán trước sinh

1 Đặt vấn đề

Lo và cộng sự, 1996 đã phát hiện ra ADN phôi thai trong huyết thanh trong máu ngoại vi mẹ [3] Điều này mở ra một triển vọng mới trong công tác chẩn đoán trước sinh bằng biện pháp không can thiệp

Trên thế giới cũng như Việt Nam chẩn đoán trước sinh bằng các biện pháp can thiệp là phương pháp được tiến hành chủ yếu từ trước tới nay Tuy nó mang lại nhiều lợi ích như xác định sớm các trường hợp thai mang bệnh di truyền để giúp

ối, sinh thiết nhau thai… cũng gặp phải tỷ lệ tai biến từ 0,5-1% Chính vì vậy nhiều nhà khoa học trên thế giới trong những năm gần đây tập trung vào việc nghiên cứu tách chiết ADN phôi thai trong máu mẹ để có thể áp dụng chẩn đoán trước sinh bằng biện pháp không can thiệp qua phân tích ADN của bào thai lưu hành trong máu mẹ [1, 2, 6] Trong thực tế đã có nhiều tác giả thành công trong lĩnh vực này như áp dụng chẩn đoán giới tính [4] hay chẩn đoán nhóm máu Rh [7], chẩn đoán bệnh di truyền [6, 9, 10] Có tác giả đã sử dụng ADN phôi thai tự do phân tích đột

biến và nhận dạng cá thể của thai trong hình sự pháp y [5]

Đề tài được thực hiện nhằm một số mục tiêu sau:

- Nghiên cứu tách chiết ADN thai trong huyết tương máu mẹ

- Xác định ADN phôi thai tự do trong huyết tương máu mẹ bằng kỹ thuật PCR

2 Đối tượng, vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Đối tượng: 29 phụ nữ mang thai vào khám thai tại phòng khám bệnh Viện quân y 103 và Trung tâm nghiên cứu ứng dụng Sinh - Y - Dược học, Học viện quân

y với tuổi thai từ 7-38 tuần Mẫu chứng dương được lấy từ nam giới; mẫu chứng

âm được chọn từ phụ nữ chưa mang thai lần nào

Thu và chuẩn bị mẫu: Máu ngoại vi toàn phần được lấy vào tuýp lấy máu vô khuẩn được chống đông bằng EDTA Mỗi mấu lấy 5ml máu Máu sau khi lấy được

li tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút Bảo quản huyết tương thu được trong tủ lạnh

âm – 80oC cho tới khi tách ADN

Phương pháp tách chiết ADN phôi thai từ huyết tương máu mẹ: ADN phôi thai được tách chiết từ huyết thanh máu mẹ bằng QIAgen Blood KIT (Qiagen) theo qui trình của nhà sản suất có cải biên [4]

Phương pháp nhân gen In vitro (PCR): gen đặc hiệu giới tính nam - SRY

nằm nhiễm sắc thể giới tính Y được khuyếch đại với mồi đặc hiệu trên máy nhân gen ABI 9800 FAST Trình tự mồi: SRY-F 5’-GGT GTT GAG GGC GGA GAA ATG-3’; SRY-R 5’-ATA AGA AAG TGA GGG CTG TAA GTT-3’ Chu trình

nhiệt:biến tính 5 phút/ 940C, gắn mồi 2phút/ 550C, nối dài 720C/3 phút; tổng số

25-30 chu kỳ

Điện di kiểm tra sản phẩm PCR phát hiện băng đặc hiệu

Nghiên cứu được thiết kế theo kiểu mù đơn, mù kép kết hợp với tiến cứu Giới tính thai nhi được kiểm chứng qua siêu âm thai sau tuần thứ 25 và sau sinh

3 Kết quả và bàn luận

Tách chiết được ADN phôi thai trong huyết tương mẹ qua gen đặc hiệu giới

tính nam - SRY trên nhiễm sắc thể Y

Hình ảnh kết quả điện di xác định gen đặc hiệu giới tính nam-SRY của ADN phôi thai tự do tách chiết từ máu ngoại vi của mẹ:

1: thang ADN chuẩn; 2: mẫu chứng +;

3,4,7,8: thai nam;

5,6,8: thai nữ

Kết quả tách chiết ADN phôi thai tự do trong huyết thanh mẹ và xác định qua phân tích PCR gen SRY được trình bày ở bảng sau:

Trường

hợp

Tuổi thai

(Tuần)

SRY (+/-)

Giới tính (SÂ/SS)

Trường hợp

Tuổi thai (Tuần)

SRY (+/-)

Giới tính (SÂ/SS)

Sau sinh (Nam)

Chưa có kết quả

Siêu âm (nữ)

Siêu âm (nữ)

5 22 + Siêu âm

Sau sinh (Nam)

Sau sinh (nữ)

Siêu âm (nam)

Siêu âm (nữ)

Siêu âm (nam)

Siêu âm (nữ)

Sau sinh (nam)

Sau sinh (nữ)

Siêu âm (nữ)

Sau sinh (nam)

(nữ)

Từ bảng kết quả trên cho thấy: trong số 29 trường hợp, 15 thai được xác định là nam, 14 thai được xác định là nữ Trong đó 28/29 trường hợp đã được xác định qua siêu âm sau tuần thứ 25 hoặc sau sinh Kết quả phân tích cho thấy có độ chính xác cao

Nghiên cứu của nhiều tác giả khác trên thế giới cũng cho thấy khả năng tách chiết và xác định giới tính qua phân tích ADN phôi thai tự do trong máu mẹ cũng

có độ chính xác cao:

Chungwen Wei và cộng sự (2001), nghiên cứu tách chiết ADN phôi thai tự do trong 30 phụ nữ mang thai đã chẩn đoán chính xác 100% giới tính (19 thai nam), đặc biệt đã phát hiện sự tăng cao bất thường nồng độ ADN phôi thai tự do trong máu mẹ ở thai trisomy-21 Kết quả này cũng đã được xác chẩn qua phân tích kiểu nhân (Karyotyping) [4] Zhao Y và cộng sự (2004) cũng dùng kỹ thuật PCR xác

định giới tính qua phân tích ADN phôi thai tự do trong máu mẹ trên 44 phụ nữ mang thai từ 7 đến 41 tuần với độ chính xác 100% [10]

Về cơ chế xuất hiện và mất đi của ADN phôi thai tự do trong máu mẹ vẫn còn nhiều điều chưa rõ [3] Khác với tế bào phôi thai trong máu mẹ có ba loại chính là bạch cầu lymhpo, tế bào màng nuôi (trophoblast) và tế bào hồng cầu có nhân của phôi thai (fetal nucleated red blood cell) tồn tại lâu sau khi sinh hoặc sẩy thai, ADN phôi thai tự do tồn tại một thời gian rất ngắn: ngày thứ tư sau sinh hoặc sẩy thai đã không còn được phát hiện thấy [8]

4 Kết luận và kiến nghị

Từ những kết quả nghiên cứu thu được, chúng tôi đi đến một số kết luận sau: -Tách chiết được ADN phôi thai tự do lưu hành trong máu ngoại vi của mẹ -Dùng kỹ thuật PCR khuếch đại gen đặc hiệu giới tính nam cho phép phát hiện và khẳng định sự có mặt của ADN phôi thai trong huyết tương máu ngoại vi

mẹ với độ nhạy cao

ADN phôi thai tự do trong máu mẹ rất có giá trị dùng để chẩn đoán trước sinh bệnh di truyền liên kết giới tính và nhiều bệnh lý di truyền khác bằng biện pháp không can thiệp qua phân tích gen đặc hiệu góp phần cho công tác tư vấn di truyền y học

Tài liệu tham khảo

1 Ana Bustamante et al (2006) Detection of a Paternally Inherited Fetal mutation

in maternal Plasma by the use of Automated Sequencing Ann NY Acad Sci.1075: 108-117

2 Avent ND; Chitty LS (2006) Non-invasive diagnosis of fetal sex; utilisation of free fetal DNA in maternal plasma and ultrasound Prenat Diagn 26(7): 598-603 (ISSN: 0197-3851)

3 Chiu RW; Lo YM (2006) Noninvasive prenatal diagnosis by analysis of fetal DNA in maternal plasma Methods Mol Biol.; 336:101-9 (ISSN: 1064-3745)

4 Chungwen Wei et al (2001) Screening cell-free fetal DNA in maternal plasma Clin Chem.47, 336 Reference QIAGEN News, 14-16

5 Deng Z; Wu G; Li Q; Zhang X; Liang Y; Li D; Gao S; Lan Y (2006) Noninvasive genotyping of 9 Y-chromosome specific STR loci using circulatory fetal DNA in maternal plasma by multiplex PCR Prenat Diagn; 26(4): 362-8 (ISSN: 0197-3851)

6 Denis L Y.M et al (1998) Quantitatve Analysis of Fetal DNA in Maternal Plasma and Serum: Implication for noninvasive Prenatal Diagnosis Am.J.Hum.Genet., 62: 768-775

7 Finning K; Martin P; Daniels G A (2004) Clinical service in the UK to predict fetal Rh (Rhesus) D blood group using free fetal DNA in maternal plasma Ann

NY Acd Sci 1022: 119-23 (ISSN: 0077-8923)

8 Smid M; Galbiati S, Vassallo A, Gambini D, Ferrari A, Viora E, Pagliano M, Restangno G, Ferrari M, Cremonesi L (2003) Noevidence of fetal DNA persistence in materanl plasma after pregnancy Hum genet 112 (5-6: 617-8 (ISSN: 03406717)

9 Warunee Tungwiwat et al (2006) Development and Application of a Real-Time Quantitative PCR for Prenatal Detection of Fetal Thalassemia from maternal Plasma Ann NY Acad Sci.1075: 103-107

10 Zhao Y; Zou L (2004) Application of fetal DNA in maternal plasma in noninvasive prenatal diagnosis J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci 24(1): 59-61(ISSN: 1672-0733)

Summary

DETECTION OF CELL-FREE FETAL DNA IN MATERNAL

PERIPHERAL BLOOD: IMPLICATIONS FOR NON-INVASIVE

PRENATAL DIAGNOSIS Khoa Tran Van, Bac Nguyen Duy,

Tho Ho Huu, Trung Nguyen Viet

Military Academy of Medicine

INTRODUCTION: Recent discovery of the presence of fetal DNA in maternal plasma has opened up a new method for non-invasive prenatal diagnosis The aim

of this study was to extract cell-free fetal DNA in maternal peripheral blood with a view of using for non-invasive prenatal diagnosis MATERIALS AND METHODS: Fetal DNA was extracted from maternal plasma of 29 pregnant women during the 7th to 38th weeks of gestation PCR analysis of the SRY gene was performed Routine ultrasound was also performed on the pregnant women after 25 weeks of gestation to confirm fetal gender RESULTS: 15 of 29 pregnancies were found male fetuses by PCR analysis with male specific gene-SRY Which were totally correlated to the results by ultrasound examination or confirmed by the gender determining after birth CONCLUSIONS: Cell-free fetal DNA extracted in maternal plasma seems to be useful for non-invasive prenatal diagnosis of inherited diseases

*Key words: Cell-free fetal DNA, prenatal diagnosis