Nghiên cứu thành phần hóa học và khảo sát hoạt tính sinh học của polysaccharide từ hạt me (tamarindus indica l ) việt nam

Mặc dù các hợp chất thiên nhiên đã thu hút được sự quan tâm nghiên cứu của các nhà khoa học, nhưng nhiều cây được sử dụng làm thuốc vẫn chưa được nghiên cứu đầy đủ về mặt hóa học cũng nh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

BÙI NGỌC TÂN

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA POLYSACCHARIDE TỪ HẠT ME (TAMARINDUS INDICA L.) VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỮU CƠ

Hà Nội – 2017

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

BÙI NGỌC TÂN

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA POLYSACCHARIDE TỪ HẠT ME (TAMARINDUS INDICA L.) VIỆT NAM

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ

Mã số: 62440114

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỮU CƠ

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1 GS.TS THÀNH THỊ THU THỦY

2 TS NGUYỄN TUẤN ANH

Hà Nội – 2017

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu do tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Thành Thị Thu Thủy và TS Nguyễn Tuấn Anh Các số liệu và kết quả trong luận án này là hoàn toàn trung thực và chưa từng được tác giả khác công bố

Hà Nội, ngày tháng năm 2017

TM Tập thể hướng dẫn Nghiên cứu sinh

Bùi Ngọc Tân

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận án này, tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ quý báu của các thầy cô, các nhà khoa học thuộc nhiều lĩnh vực cùng bạn bè và đồng nghiệp

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Thành Thị Thu Thủy, TS Nguyễn Tuấn Anh - người thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện các nội dung nghiên cứu của luận án này, đã cho tôi những lời khuyên bổ ích, những lời động viên trong những lúc tôi gặp khó khăn

và truyền cho tôi lòng say mê khoa học

Tiếp theo, tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ và tạo điều kiện về mọi mặt của các cô chú, các anh chị em tại:

- Trung tâm các phương pháp phổ ứng dụng -Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

- Bộ môn Hữu cơ - Trường Đại học Bách khoa Hà Nội

- Bộ môn Hóa học - trường Đại học Y Dược Hải Phòng

- Phòng Hóa phân tích và Triển khai công nghệ, Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang

- Phòng Thử nghiệm Sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

- Dự án Hộ trợ Nguồn nhân lực Y tế (ADB) - Bộ Y tế

- GS Yoshiaki Yuguchi tại Đại học Osaka – Nhật Bản

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Kỹ thuật Hóa học, Viện Đào tạo sau Đai học - Trường Đại học Bách khoa Hà Nội đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành các học phần của luận án và mọi thủ tục cần thiết

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân và bạn

bè đã luôn quan tâm, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận án

Tác giả luận án

Bùi Ngọc Tân

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

DANH MỤC KÍ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC CÁC BẢNG viii

DANH MỤC CÁC HÌNH x

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Polysaccharide và lớp chất Xyloglucan 3

1.2 Polysaccharide từ quả me 8

1.2.1 Vài nét về cây me 8

1.2.2 Cấu trúc hóa học và ứng dụng của polysaccharide từ quả me 11

1.3 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan đến nội dung nghiên cứu của luận án 13

1.3.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 13

1.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 20

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 Phương pháp chiết tách 21

2.2 Phương pháp xác định cấu trúc 21

2.2.1 Phương pháp sắc ký thẩm thấu gel (GPC) 21

2.2.2 Phương pháp phổ IR 22

2.2.3 Phương pháp phổ NMR 23

26

2.2.5 Phương pháp tán xạ ánh sáng (LS) và tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS) 29

2.3 Phương pháp thử hoạt tính sinh học 32

2.3.1 Hoạt tính gây độc tế bào 32

2.3.2 Hoạt tính chống oxy hóa 33

2.3.3 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 35

2.3.4 Hoạt tính chống đông tụ máu 36

2.3.5 Hoạt tính ly giải cục máu đông 36

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM 38

3.1 Đối tượng nghiên cứu 38

3.2 Thu hái, định danh và xử lý mẫu quả me 39

3.2.1 Thu hái và định danh 39

3.2.2 Xử lý mẫu 39

3.3 Chiết tách và tinh chế Tamarind Seed Polysaccharide (TSP) từ thịt và hạt me 39

3.3.1 Xác định thành phần hóa học của thịt và hạt me 39

3.3.2 Chiết tách và tinh chế TSP từ thịt và hạt me 41

3.4 Điều chế dẫn xuất 43

3.4.1 Sulfate hóa 43

3.4.2 Acetyl hóa 46

3.5 Xác định thành phần và cấu trúc hóa học của TSP 49

3.5.1 Xác định thành phần đường 49

3.5.2 GPC 49

3.5.3 Phổ IR 49

3.5.4 Phổ NMR 49

3.5.5 Phổ MS 50

3.5.6 Phương pháp SEM 50

3.5.7 Phương pháp LS 50

3.5.8 Phương pháp SAXS 50

3.6 Đánh giá hoạt tính sinh học 51

3.6.1 Hoạt tính gây độc tế bào 51

3.6.2 Hoạt tính chống oxy hóa 52

3.6.3 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 53

3.6.4 Hoạt tính chống đông tụ máu 54

3.6.5 Hoạt tính ly giải cục máu đông 54

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 55

4.1 Xác định thành phần chính của thịt và hạt quả me 55

4.2 Lựa chọn quy trình chiết tách và mẫu nghiên cứu 56

4.3 Xác định cấu trúc của TSP 59

4.4 Điều chế dẫn xuất 81

4.4.1 Dẫn xuất TSPS 81

4.4.2 Dẫn xuất TSPA 88

4.5 Đánh giá hoạt tính sinh học và ảnh hưởng của mức độ sulfate hóa và acetyl hóa đến hoạt tính của TSP và các dẫn xuất 94

KẾT LUẬN 102

KIẾN NGHỊ 104

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU 105

TÀI LIỆU THAM KHẢO 106

PHỤ LỤC 120

DANH MỤC KÍ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AOAC Association of Official Analytical

ESI-MS Electron spray ionization mass spectra Phổ khối lƣợng ESI-MS

HR-ESI-MS High resolution electrospray

ionization mass spectrum

Phổ khối lƣợng phân giải cao ESI-MS

IC50 Inhibitory concentration at 50% Nồng độ ức chế 50% đối tƣợng

thử nghiệm

nghiệm

MIC Minimum inhibitory concentration Nồng độ ức chế tối thiểu

NOESY Nuclear Overhauser Effect

TSPA Acetyl Tamarind Seed Polysaccharide TSP acetyl hóa

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Một số monosaccharide của polysaccharide có nguồn gốc từ thực vậtBảng 2.1 Một số nhóm đặc trưng và băng sóng hấp thụ trong phổ FT-IR của polysaccharide

Bảng 2.2 Độ chuyển dịch hoá học δ(ppm) từ cơ sở dữ liệu sugabase của dạng glucose, galactose và xylose dung môi D2O

Bảng 2.3 Thông số đối với một số dạng cấu trúc polymer

Bảng 3.1 Ký hiệu mẫu và tỉ lệ số mol các chất tạo tác nhân sulfate hóa

Bảng 3.2 Ký hiệu mẫu và nồng độ tác nhân acetyl hóa

Bảng 4.1 Thành phần chính của thịt và hạt của quả me

Bảng 4.2 Hiệu suất chiết tách TSP (% khối lượng)

Bảng 4.3 Thành phần đường của TSPchiết từ hạt và thịt me

Bảng 4.4 Thành phần đường của TSP

Bảng 4.5 Trọng lượng phân tử và thành phần đường của TSP

Bảng 4.6 Kết quả phân tích thành phần phổ IR của TSP

Bảng 4.7 Độ dịch chuyển hóa học phổ 1H và 13C NMR của TSP

Bảng 4.8 Phổ ESI-MS của TSP-oligosaccharide

Bảng 4.14 Kết quả từ phép đo LS của TSP

Bảng 4.15 Mối tương quan giữa tỉ lệ số mol tác nhân sulfate với DS

Bảng 4.16 Kết quả phân tích phổ IR của TSPS4

Bảng 4.17 Kết quả từ phép đo LS của TSP và TSPS4

Bảng 4.18 Mối tương quan giữa tỉ lệ số mol acetyl với DA

Bảng 4.19 Kết quả phân tích phổ IR của TSPA4

Bảng 4.20 Giá trị IC50 hoạt tính gây độc tế bào ( g/ml)

Bảng 4.21 Kết quả hoạt tính khử sắt và chống oxy hóa tổng số

4.23 ạt tính chống đông tụ máu

4 Kết quả hoạt tính ly giải cục máu đông

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc, danh pháp các xyloglucan

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học xyloglucan của tamarind seed polysaccharide (TSP) Hình 2.1 Sơ đồ khối của thiết bị GPC

Hình 2.2 a) Phổ 1H-NMR của (1 3) và (1 4) -D-glucan; b) Phổ 13C-NMR của (1 3) và (1 4) -D-glucan

Hình 2.3 Độ dịch chuyển hóa học của các nhóm trong polysaccharide

Hình 2.4 Phổ khối của poysaccharide và dẫn xuất (anion, cation và benzyl amin) đo bằng a) MALDI-ToF-MS và b) ESI–MS

Hình 2.5 Cơ chế phân mảnh của carbohydrate

Hình 2.6 Sơ đồ tổng quát về phổ khối nhiều lần

Hình 2.7 Qui trình đánh giá khả năng ức chế quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào

Hình 3.1 Quả của cây me (Tamarindus indica L.) thu hái tại huyện Thủy Nguyên, Hải Phòng

Hình 3.2 Sơ đồ chiết tách TSP từ hạt me

Hình 3.3 Sơ đồ quy trình tạo TSPS

Hình 3.4 Sơ đồ phản ứng tạo TSPA

Hình 4.1 Phổ 1H-NMR của TSP chiết từ a) hạt me, b) thịt me

Hình 4.2 Sắc đồ GPC của mẫu TSP chiết từ a) hạt me, b) thịt quả me

Hình 4.3 Phổ 1H-NMR của TSP chiết tách theo a) quy trình 1,b) quy trình 2, c) quy trình 3

Hình 4.9 Kết quả phân tích phổ a) 1H-NMR b )13C-NMR của TSP

Hình 4.10 Phổ ESI-MS của TSP-oligosaccharide

Hình 4.11 Phổ ESI-MS/MS của mảnh m/z 1224

Hình 4.19 Mô phỏng hình dạng của phân tử TSP

Hình 4.20 Kết quả đo SAXS từ dung dịch TSP 0,5% trong nước: a) Đường tán xạ, b) Biểu đồ Kratky và c) Biểu đồ Guinier

Hình 4.21 a) Mô hình cấu trúc phân tử của TSP xây dựng dựa trên cấu trúc hóa học (với n=4), b) Biểu đồ Kratky với các đường tán xạ từ thực nghiệm (đường đỏ)

và từ mô hình cấu trúc phân tử (đường đen)

Hình 4.22 Cấu trúc hóa học của TSPchiết tách từ hạt me thu hái tại Hải Phòng Hình 4.23 Phổ IR của a) TSP và b) TSPS4

Hình 4.24 Phổ 13C-NMR của a) TSP b) TSPS4

Hình 4.25 Ảnh SEM của a)TSP và b) TSPS4

Hình 4.26 Kết quả đo SAXS của TSPS4 0,5% trong nước: a) Đường tán xạ, b) Biểu

đồ Kratky và c) Biểu đồ Guinier

Hình 4.27 Phổ IR của: a) TSP và b) TSPA4

Hình 4.28 Phổ 1H-NMR của: a) TSP và b) TSPA4

Hình 4.29 Ảnh SEM của a)TSP, b) TSPA4

Hình 4.30 Kết quả đo SAXS của TSPA4 0,5% trong nước: a) Đường tán xạ, b) Biểu

đồ Kratky và c) Biểu đồ Guinier

Hình 4.31 Mối tương quan giữa a) hoạt tính khử sắt, b) hoạt tính chống oxy hóa tổng số với DS của TSPS

Hình 4.32 Mối tương quan giữa a) hoạt tính khử sắt, b) hoạt tính chống oxy hóa tổng số với DA của TSPA

Hình 4.33 Ảnh thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định

Hình 4.34 Mối tương quan giữa khả năng ly giải cục máu đông với DS của TSPS

ĐẶT VẤN ĐỀ

Nước ta có thảm thực vật phong phú và đa dạng, có truyền thống về sử dụng các loài thực vật làm thuốc chữa bệnh Theo các số liệu thống kê mới nhất, Việt Nam có trên 12000 loài thực vật, trong đó hơn 3200 loài được sử dụng làm thuốc trong y học dân gian

Những hợp chất tự nhiên phân lập từ thực vật được ứng dụng trong rất nhiều ngành công nghiệp như dược phẩm, thực phẩm và mỹ phẩm Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, việc khai thác và sử dụng những cây thuốc quý không còn đơn thuần dựa vào kinh nghiệm mà còn dựa trên những cơ sở khoa học hiện đại Một trong những con đường hữu hiệu để phát hiện ra các chất tiềm năng có hoạt tính sinh học quý có thể phát triển thành thuốc chữa bệnh cho con người, gia súc và cây trồng là đi từ các hợp chất thiên nhiên Các số liệu gần đây cho thấy có khoảng 60% dược phẩm được dùng chữa bệnh hoặc đang thử cận lâm sàng đều có nguồn gốc từ thiên nhiên

Mặc dù các hợp chất thiên nhiên đã thu hút được sự quan tâm nghiên cứu của các nhà khoa học, nhưng nhiều cây được sử dụng làm thuốc vẫn chưa được nghiên cứu đầy đủ về mặt hóa học cũng như hoạt tính sinh học mà chủ yếu dựa trên kinh nghiệm dân gian, vì vậy chưa phát huy hết được hiệu quả của nguồn tài nguyên quý giá này

Trong vô số loài thực vật ở Việt Nam, cây me thuộc chi Tamarindus của họ

Đậu (Fabaceae) có giá trị sử dụng cao, các bộ phận của cây me đều được dùng trong cuộc sống hàng ngày Cho đến nay tại Việt Nam chưa có công trình nghiên cứu về mặt hóa học của các thành phần có trong quả me, do vậy quả me là một đối tượng nghiên cứu có nhiều triển vọng Trong các bộ phận của cây me, quả me mà thành phần hóa học chủ yếu là polysaccharide đã được sử dụng nhiều trong ngành công nghiệp thực phẩm và dược phẩm

Mặt khác, đã có nhiều nghiên cứu cho thấy có mối liên hệ chặt chẽ giữa cấu trúc hóa học, cấu trúc không gian và cấu trúc bề mặt với tính chất của polysaccharide nói riêng và chất có hoạt tính sinh học nói chung Hiện nay một

hướng nghiên cứu khác đang được quan tâm là tạo ra các dẫn xuất hóa học của hợp chất thiên nhiên với mục đích tìm kiếm các chất có hoạt tính sinh học cao

Với các lý do nêu trên, chúng tôi chọn đề tài luận án "

phần hóa học và khảo sát hoạt tính sinh học của polysaccharide từ hạt me

của nguồn thực vật Việt Nam

Mục tiêu nghiên cứu của luận án là:

 Xác định thành phần hóa học, cấu trúc và đánh giá hoạt tính sinh học của Tamarind Seed Polysaccharide (TSP) có trong hạt me

 Điều chế được các dẫn xuất sulfate hóa và acetyl hóa có hoạt tính sinh học cao hơn TSP tự nhiên từ đó góp phần làm sáng tỏ ảnh hưởng của mức độ sulfate hóa và acetyl hóa đến hoạt tính sinh học

Với mục tiêu nghiên cứu đặt ra, các nội dung nghiên cứu của luận án bao gồm:

1 Thu thập mẫu quả me tại các vị trí địa lý khác nhau ở Việt Nam

2 Tách chiết và tinh chế TSP từ các bộ phận khác nhau của quả me

3 Xác định thành phần hóa học và cấu trúc của các TSP thu được

4 Tạo các dẫn xuất sulfate hóa và acetyl hóa của TSP với các mức độ sulfate hóa và acetyl hóa khác nhau

5 Khảo sát hoạt tính sinh học của TSP và các dẫn xuất

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Polysaccharide và lớp chất Xyloglucan

Saccharide, còn gọi là carbohydrate hay glucid, là các hợp chất hỗn chức của polyhydroxyaldehyde, polyhydroxyketone và một số dẫn chất ngưng tụ của chúng Thành phần nguyên tố của saccharide gồm có C, H, O Chúng có công thức tổng quát là Cm(H2O)n Carbohydrate là một trong những thành phần quan trọng của cơ thể sinh vật, chiếm tới gần 80% trọng lượng khô của thực vật và khoảng 2% của cơ thể động vật [1,9]

Polysaccharide là polymer sinh học mà monomer của nó là các gốc đường nối với nhau bằng liên kết glycoside Thành phần đường tạo nên các polysaccharide

có nguồn gốc từ một số loài thực vật được đưa ra trên Bảng 1.1 [50,81] Polysaccharide có thể có cấu trúc mạch thẳng hoặc mạch nhánh, mức độ phân nhánh ảnh hưởng đến tính chất vật lý như khả năng tan trong nước, độ nhớt, khả năng tạo gel [84]… Trong polysaccharide các nhóm hydroxyl chiếm đa phần và đôi khi có thể thay bằng các nhóm thế khác bởi quá trình ester hóa, acetyl hóa, sulfate hóa, phosphate hóa hoặc ether hóa Polysaccharide thông thường được phân lập từ thực vật hoặc quá trình chế biến thực phẩm bằng phương pháp chiết nóng với dung môi nước và được kết tủa bằng ethanol hoặc aceton Dung dịch polysaccharide thường có độ nhớt cao và chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố như nhiệt độ, kích thước, hình dạng phân tử, nhiều polysaccharide có khả năng tạo gel [99]

Bảng 1.1 Một số monosaccharide của polysaccharide có nguồn gốc từ thực vật

-D-kí hiệu cho glucose được thể hiện là mạch chính, X, L và F mô tả liên kết glycoside với các mạch nhánh tương ứng là -D-Xylp, -D-Galp-(1,2)- -D-Xylp và -L-Fucp-(1,2)- -D-Galp-(1,2)- -D-Xylp (Hình 1.2) XyG được tổng hợp hầu hết từ thực vật hai lá mầm và cây hạt trần có chứa nhiều mạch nhánh khác nhau với mạch chính là glucose [34]

Một số mạch nhánh của XyG có liên kết glycoside khác nhau nhưng có cấu trúc không gian giống nhau Chẳng hạn như -L-Galp-(1,2)- -D-Galp-(1,2)- -D-

Xylp (J) có trong hạt cây bụi và trong loài Arabidopsis thuộc họ cải chúng có cấu

trúc giống nhau F là 6deoxyGalp XyG từ cây thạch tùng và cỏ đuôi ngựa chứa L-Arap-(1,2)- -D-Xylp (D) và -L-Fucp-(1,2)- -L-Arap-(1,2)- -D-Xylp (E) là

-mạch nhánh Trong cấu trúc khác trong loài Arabidopsis thuộc họ cải có hai -mạch

Xylp (Z) Một mô tả khác của mạch nhánh gồm LAraf(1,2) DXylp (S) và L-Araf-(1,3)- -L-Araf-(1,2)- -D-Xylp (T) có trong nhiều loài khác nhau Với mạch nhánh A, B, C đƣợc tìm thấy trong tế bào của nhiều loài cây với mạch chính là

-glucose bao gồm cả hai liên kết tại vị trí O-6 và O-2 Mạch nhánh (M, N, P, Q) đƣợc tìm thấy trong những thực vật vô mạch nhƣ loài Physcomitrella patens trong

khi U đƣợc tìm thấy trong hạt cây argan và cây Việt quất

Hình 1.1 Cấu trúc, danh pháp các xyloglucan

Xyloglucan đầu tiên được phát hiện trong hạt của cây Tòng chi (Hymenaea

courbaril) Cấu trúc hóa học của xyloglucan đã được phân tích bằng phương pháp

phân tích methyl hóa Cấu trúc này cũng có trong hạt sen cạn, hạt lanh… và có cấu

trúc oligosaccharide là XXXXG Nghiên cứu khác cho thấy XyG từ hạt của loài Tòng chi có cấu trúc và tính chất như xyloglucan được tổng hợp từ hạt me

Từ rất nhiều các nghiên cứu người ta đã tìm ra các đặc trưng của xyloglucan như: có bốn gốc đường trong cấu trúc của TSP có trong hạt me đã được xác định theo William và cộng sự khi sử dụng tia X tại bước sóng 2,06 nm [111]

Burchard và cộng sự [21] bằng phương pháp tán xạ ánh sáng đa góc (Multiangle laser light scattering -MALLS) đã cho thấy polysaccharide thuộc lớp chất xyloglucan có trọng lượng phân tử của khoảng 8.8x105g mol-1 Các tác giả đã

sử dụng phương pháp tán xạ ánh sáng động và tĩnh để nghiên cứu cấu trúc chuỗi và các tương tác trong phân tử, nghiên cứu chỉ ra rằng các chuỗi đơn có dạng bó xoắn

là nguyên nhân tạo nên độ cứng của hạt

Hiện nay, người ta đã đưa ra cấu trúc chính xác của dẫn xuất oligosaccharide

từ xyloglucan chiết tách từ các hoại hạt H courbariland và T indica thu thập tại

Brazil, kết quả cho thấy các xyloglucan thu được có sự tương quan về hình dạng phân tử [86]

1.2 Polysaccharide từ quả me

1.2.1 Vài nét về cây me

Cây me là cây bản địa của vùng nhiệt đới châu Phi nhưng được phân bố rộng rãi trên toàn thế giới với trên 50 quốc gia Diện tích trồng phần lớn tập trung tại các nước châu Á như Ấn Độ, Thái Lan, Băng La Đét, Srilanka và Indonecia Tại châu

Mỹ, Mexico và Costa Rica là nơi có sản lượng lớn nhất, tại châu Phi cây me được trồng rải rác và không có sản phẩm thương mại Một số ít sản phẩm từ các quốc gia của châu Phi như Senegal, Gambia, Kenya, Tanzania và Zambia, sau đó được trồng phổ biến ở khắp các tỉnh nước ta cũng như ở rất nhiều nước nhiệt đới khác [6,74]

Cây me tên khoa học là Tamarind indica L hay Tamarindus indica L thuộc

họ Đậu Fabaceae Các bộ phận của cây me được sử dụng với nhiều mục đích khác

nhau trong lĩnh vực thực phẩm hay dược phẩm Cây me cao 15 đến 30m, tán cây rộng, nhiều lá Lá cây me có dạng kép lông chim chẵn, dài từ 8 đến 10cm, gồm 10 đến 20 đôi lá chét thuôn không cân xứng, chóp lõm, dài 20mm, rộng 2mm Hoa

trắng nhạt có những vệt đỏ hay trắng, mọc thành chùm đơn ở kẽ lá hay thành chùy tận cùng Quả dài mọc thõng xuống, hơi dẹt, dài 7-12cm, rộng 25mm, dày 10mm

Vỏ quả ngoài mỏng, cứng, giòn, màu hung đỏ, vỏ quả giữa có xơ, vị chua, sau khi loại hết xơ, thịt thì phần hạt ở giữa có màu nâu nhạt hay vàng nhạt Quả chứa 3-5 hạt dẹt, nhẵn màu nâu đỏ, bóng Mùa quả vào tháng 10-11 [6, 7]

Các bộ phận của cây me như quả, hạt, lá, hoa và vỏ cây me đều được sử dụng với mục đích hóa học thực vật và dược phẩm Lá và hoa me có thể được sử dụng như một loại rau trong bữa ăn truyền thống của nhiều dân tộc [3, 30] Chúng được

sử dụng trong món cà ri, salat, món hầm và súp tại nhiều quốc gia, và hiện nay ngày càng khan hiếm [31]

Đặt biệt là quả me và hạt me đã được nhiều tác giả nghiên cứu về thành phần

và tác dụng trong hóa học thực vật và dược phẩm Trong quả me có chứa chủ yếu hơn 10% acid hữu cơ (9,4% acid citric, 1,55% acid tactric, 0,45% acid malic), kali bitactrat 3,25%, đường 12,5%, gôm 4,70%, pectin 6,25% Ngoài ra còn có 34,35%

xơ, nước 27,55% Trong hạt có glucozan, xylan, protein, chất béo, muối vô cơ Trong đời sống quả me được sử dụng theo mùa vụ, như làm thực phẩm, tạo hương

vị, gia vị trong món cà ri, súp và cũng là thành phần chính trong một số loại nước

ép và đồ uống [98] Người ta có thể dùng quả me để ăn trực tiếp hoặc thêm vào trong đồ uống, dịch chuyền và cũng có thể chế biến thành mứt, kẹo Nước quả me là loại đồ uống bổ dưỡng được nhiều nước trên thế giới sử dụng và có nhiều cách thức chế biến khác nhau Tại một số quốc gia châu Phi nước quả me được trộn với tro gỗ

để trung hòa vị chua của acid tartaric Tuy nhiên phương pháp phổ biến nhất là thêm đường để tạo vị ngọt cho đồ uống Phần lớn sản phẩm đồ uống có nước me được sản xuất thương mại Đôi khi nước quả me được cho vào trong đồ uống có cồn [3,31]

Trong y học, theo đông y [3, 6, 7, 10], quả me có vị chua, tính mát, có tác dụng thanh nhiệt, giúp tiêu hoá, lợi trung tiện và nhuận tràng Vỏ cây me có vị chát,

có tác dụng làm săn da, dùng làm thuốc cầm máu, điều trị một số bệnh về tiêu hóa (kiết lỵ, ỉa chảy ) và nấu nước để ngậm chữa viêm lợi

Lá me có tác dụng giải độc, trị bệnh ngoài da, lá me thường được dùng để nấu nước tắm cho trẻ em đề phòng bệnh ngoài da vào mùa hè Thịt me, lá và hoa được kết hợp với nhau trong nhiều bài thuốc đông y để đắp vào các khớp bị đau

Theo kinh nghiệm dân gian các bộ phận của cây me còn có tác dụng như: Quả

me có tác dụng chữa triệu chứng nôn nghén, chán ăn ở phụ nữ mang thai, điều trị

nôn mửa, đầy hơi và khó tiêu; chữa cảm lạnh Hạt me có tác dụng tẩy giun, lá me có

tác dụng chữa rôm sảy, mẩn ngứa, vỏ cây me có tá dụng chữa táo, phòng và chữa viêm lợi, viêm nha chu Hạt me rang được coi là một loại gia vị trong thực phẩm Theo y học phương Tây quả me được sử dụng như một phương thuốc lợi tiểu điều trị chứng rối loạn mật, vàng da và tiêm chảy, giúp hệ thần kinh hoạt độ

(hàm lượng thiamin 29%), thiamin là một loại vitamin B có vai trò quan trọng trong các hoạt động của dây thần kinh và cơ bắp Me là một nguồn cung cấp vi chất cho

cơ thể như Mg2+, Ca2+.Quả me là một trong những nguồn cung cấp chất xơ cao nhất trong các loại trái cây, giúp ngăn ngừa táo bón (hàm lượng chất xơ 20%) Chất xơ

nhiên và không gây tác dụng phụ Quả me có thành phần kali cao gấp hai lần lượng

trong cơ thể, tránh để tình trạng lượng natri tăng cao làm cho huyết áp tăng [3, 29] Quả me cũng được biết như một loại thuốc chữa bệnh thiếu máu (hàm lượng sắt 2,8%) Vì vậy, đây cũng là loại trái cây rất tốt cho phụ nữ mang thai Giúp kiểm soát mức cholesterol (hàm lượng niacin 1,2%) Me chứa khá nhiều chất niacin, một loại vitamin B rất quan trọng với sức khỏe Chất này có thể giúp giảm cholesterol xấu và tăng lượng cholesterol tốt trong cơ thể Thành phần của me bao gồm chất

có tác dụng hỗ trợ máu (hàm lượng calcium 7%) Quả me là một trong những loại trái cây giàu canxi Canxi (với sự giúp đỡ của vitamin K) đóng một vai trò rất quan trọng trong quá trình đông máu Vì vậy, quả me được coi là loại quả có tác dụng ổn định cơ chế đông máu Quả me cũng có tác dụng giảm sốt và bảo vệ

chống lại cảm lạnh (dùng thịt quả me đun với nước dùng để uống) Quả me giúp cơ thể tiêu hóa thức ăn, vỏ của hạt me là một phương thuốc hiệu quả chống tiêu chảy

và bệnh lỵ

Mặc dù đã có nhiều tác giả đã công bố về các ứng dụng đa dạng của cây me và được đưa vào sử dụng trong cuộc sống Tuy nhiên cây me vẫn còn có rất nhiều tiềm năng giá trị sử dụng khác nữa bởi vậy cần phải có những nghiên cứu sâu hơn về giá trị của cây me đặc biệt là trong lĩnh vực dinh dưỡng và dược phẩm

1.2.2 Cấu trúc hóa học và ứng dụng của polysaccharide từ quả me

Theo Patel và cộng sự [77], polysaccharide phân lập được từ quả me thuộc lớp chất xyloglucan, có liên kết -(1-4)-D-glucoside là mạch chính, tại vị trí C6 là liên kết với -D-xylopyranose và liên kết với -D-galactopyranose-(1-2)- -D-xylopyranose Chuỗi này được lập lại nhiều đơn vị theo dạng XXXG, bao gồm ba nhóm đơn vị bị xylosyl hóa glucopyranose (X) và được phân cách bằng một glucopyranose (G), và có thể một vài nhóm xylose được liên kết với galactopyranose (L) theo Hình 1.2

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học xyloglucan của tamarind seed polysaccharide (TSP)

Gần đây cấu trúc của TSP được mô tả có dạng heptasaccharide (Glc4Xyl3, theo kiểu XXXG), octasaccharide (Glc4Xyl3Gal, theo kiểu XXLG), và monosaccharide (Glc4Xyl3Gal2, theo kiểu XLLG) đã được đề cập

Nhiều tính chất của xyloglucan (khả năng tạo gel, độ tan…) phụ thuộc vào trọng lượng phân tử, một số polysaccharide có trọng lượng phân tử nhỏ đều có các hoạt tính sinh học quý giá và được sử dụng trong y học [12,13]

Trong hạt me có các chất tanin và chất nhuộm màu ở vỏ ngoài của hạt, do vậy hạt me không thể dùng trực tiếp được TSP là thành phần có trong bột hạt me (TKP) đóng vai trò quan trọng khi được sử dụng trong ngành may mặc, giấy, sơ sợi hoặc làm nguyên liệu thô để sản xuất polysaccharide dùng cho thực phẩm [40]

TSP chiết trong nước có dạng gel và kết tủa trong dung môi hữu cơ, TSP có trọng lượng phân tử từ 700–2500 kDa TSP chiếm khoảng 65% thành phần hạt me phụ thuộc vào nguồn gốc [31] TSP được sử dụng để kiểm soát liều lượng thuốc và không có bất kỳ phản ứng phụ nào và có thể tạo khuôn với natri alginate để làm bao cho viên thuốc [16,28,41,90,100] Người ta đã tạo dẫn chất sulfate hóa và cetyl hóa của polysaccharide để làm tăng khả năng chống oxy hóa, kháng vi sinh vật kiểm định [39,40,42]

Gần đây, TSP đã được xác định là chất không gây ung thư, là chất kết dính có nguồn gốc tự nhiên, và là chất mang có khả năng giữ thuốc cao TSP được sử dụng như chất kết dính ở dạng viên, dạng gel, tác nhân làm dày, như chất nhũ hóa và làm chất ổn định trong thực phẩm, và được sử dụng trong các ngành công nghiệp dược phẩm, thực phẩm [53,67,74, 83, 93, 96]

TSP từ hạt me dự kiến sẽ có các ứng dụng mới trong thực phẩm, như là một chất làm đặc và chất ổn định, tác nhân gel hóa, chất làm ổn định nước đá tinh thể và thay thế tinh bột vì tính chất của nó tương tự như tinh bột nhưng ổn định hơn TSP được thử nghiệm trong nhãn khoa và có hiệu quả trong việc thử nghiệm áp lực nội nhãn của sản phẩm nhỏ mắt có timolol và đã được nghi nhận trên thỏ TSP đã được thử nghiệm có hiệu quả trong điều trị bệnh về tiêu hóa và được sử dụng là chất mang của thuốc chữa bệnh đại tràng [27,48]

Năm 1989 Iain C M Dea [43] đã nghiên cứu tạo dung dịch polysaccharide với tỷ lệ dung môi khác nhau, nghiên cứu cho thấy có mối tương quan giữa cấu trúc

và hoạt tính sinh học, một số polysaccharide có tác dụng tốt trong nhãn khoa

Gần đây các nghiên cứu đã khẳng định TSP chiết từ hạt me có khả năng ổn định huyết áp và lipid máu được nghiên cứu và đã được thử nghiệm trên bệnh nhân cao huyết áp [62,68,70] Ngoài ra TSP tăng cường khả năng chống viêm và làm

thuốc giảm đau Dịch gel của TSP đã được thử nghiệm in vitro trong việc chống lại

hiện tượng đục thủy tinh thể Hỗn hợp của TSP và acid hyaluronic là nước mắt nhân tạo được sử dụng cho hội chứng khô mắt TSP có thể được sử dụng là thành phần chính trong thuốc kháng sinh ưa nước và kị nước Tamarind seed polysaccharide kết hợp với pectin có lượng methoxyl cao (6,8-8,4%) có khả năng thúc đẩy sự phát triển gel và ổn định nhiệt [44,78,92]

Một số kết quả nghiên cứu TSP và sản phẩm biến tính của TSP đã thể hiện tốt khả năng làm chất mang cho thuốc và kiểm soát liều lượng nhả thuốc với thuốc sử dụng qua đường uống [82]

1.3 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan đến nội dung nghiên cứu của luận án

1.3.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Việc nghiên cứu cấu trúc của các TSP và ứng dụng của nó đã được các nhà khoa học trên thể giới nghiên cứu từ rất lâu Các nghiên cứu này tập trung theo hướng chiết tách TSP từ quả me và xác định cấu trúc của nó bằng nhiều phương pháp khác nhau Các nghiên cứu về mặt ứng dụng của TSP cho thấy nó có khả năng ứng dụng đa dạng trong rất nhiều lĩnh vực

Michael và cộng sự [64] đã nghiên cứu cấu trúc và tính chất của TSP từ hạt

me Kết quả cho thấy thành phần chính của polysaccharide trong quả me là một galactoxyloglucan tỷ lệ galactose: xylose: glucose là 1:2,25:2,8 Một lượng nhỏ polysaccharide (2-3%) có chứa phân nhánh (1→ 5)-α-L-arabinofuranan và không nhánh (1→ 4)-β-D-galactopyranan, và xác định được cấu trúc dạng sợi bằng tia X Cấu trúc dạng chuỗi được rút ra từ nghiên cứu tán xạ ánh sáng tĩnh

Để xác định nhóm phân tử đặc trưng polysaccharide, Kacura Kova và cộng

sự [51] đã sử dụng phổ hồng ngoại của hỗn hợp nhiều loại polysaccharide dựa trên thành phần đường chủ yếu là các monosaccharide đã được nhận diện Phổ FT-IR tại vùng 1200–800 cm-1 cho biết thông tin về polysaccharide có trong mẫu đo Phổ IR

polysaccharide có thể xác định được thành phần mạch chính nhưng cũng chịu ảnh hưởng mạnh của mạch nhánh Thông thường mỗi mạch nhánh đều là đặc trưng của một polysaccharide Vị trí axial và equatorial của nhóm OH cũng ảnh hưởng đến mạch chính, chẳng hạn như tại vùng 1100–1000 cm-1 là hấp thụ lớn nhất của vòng

và nhóm mạch nhánh cũng ảnh hưởng đến phổ polysaccharide Do vậy việc xác định vị trí nhóm đặc trưng cho phép xác định cấu trúc và thành phần của polysaccharide Ferreira và cộng sự [33] đã nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện chiết tách đến thành phần của polysaccharide bằng phổ FT-IR Họ đã phân tích phổ (số sóng) của dịch chiết chứa hàm lượng pectic polysaccharide cao giàu acid galacturonic (GalA) và hemicellulosic polysaccharide (xylan) Tác giả cho thấy việc lựa chọn vùng số sóng (1120 và 990 cm-1) rất quan trọng để xác định GalA trong pectic polysaccharide Ngoài ra Coimbra và cộng sự [23] đã dùng phổ FT-IR để xác định thành phần polysaccharide trong quả oliu khi đo tại bước sóng 1200 và 850

cm-1 với sự kết hợp các thuật toán, như phương pháp phân tích thành phần chính, dự đoán, tương quan chuẩn, hồi quy tuyến tính Bằng sự kết hợp thuật toán và phương pháp hóa học, họ đã xác định loại polymer có trong mẫu, như pectic polysaccharide giàu acid uronic, pectic polysaccharide giàu arabinose, glycoprotein, xyloglucan, và glucuronoxylan Đó cũng là điểm nổi bật quan trọng với mỗi số sóng đặc trưng của một loại polysaccharide Phương pháp này được sử dụng để hiệu chỉnh thiết bị, xác định lượng monosaccharide có trong polysaccharide Như tại vùng phổ FT-IR vùng 1200–850 cm-1 được sử dụng để dự đoán lượng arabinose và tỷ lệ phần trăm số mol trong mẫu pectic polysaccharide Phổ FT-IR được thường xuyên sử dụng để phân tích cấu trúc polysaccharide tế bào thực vật như celluose, pectin Phổ FT-IR hấp thụ tại vùng 1200–850 cm-1 thường đáng tin cậy và là phương pháp nhanh để xác định pectin và hemicellulose và dẫn xuất có trong quả cam và quả oliu và cũng được sử dụng để kiểm tra ảnh hưởng của phương pháp chiết tách polysaccharide có trong quả lê tươi và khô Pectin là polysaccharide có cấu trúc hỗn hợp có mạch chính gồm liên kết (1 4)- -D-galactose với các mạch nhánh là (1 4)- -D-galacturonic acid

và (1 2)- -L-rhamnopyranose Nhóm thế rhamnosyl có liên kết đồng thời với nhóm arabinose và galactose được tạo bởi hỗn hợp heteropolysaccharide của rhamnogalacturonan với arabinan, galactan và arabinogalactan Mặc dù thành phần

hóa học rất đa dạng nhưng pectin polysaccharide và hemicellulose đã được xác định bằng phổ FT-IR

Một nghiên cứu khác của Vandana và cộng sự [109] đã tạo TSP dạng sợi có cấu trúc nano để loại bỏ Hg(II), kết quả cho thấy khi kết hợp TSP với silica tạo dạng sợi có cấu trúc nano có khả năng loại bỏ Hg(II) từ dung dịch Sợi nano tổng hợp được xác định cấu trúc bằng quang phổ hồng ngoại (FTIR), X-ray, nhiễu xạ tia X (XRD), kính hiển vi điện tử quét (SEM), phân tích nhiệt trọng lượng, phân tích nhiệt vi sai và phân tích quang

Rupali Singh và cộng sự [85] đã chiết tách TSP bằng cách ngâm hạt me (đã tách bỏ phần vỏ ngoài) trong nước (trong 24h) và dịch chiết được lọc qua vải Phần không tan được loại bỏ và thêm một lượng tương đương ethanol để kết tủa dịch keo chiết và được lọc Phần không tan được ngâm chiết với nước nhiều lần, cho đến khi thu được hết dịch keo Phần tủa của dịch keo được sấy bằng khí khô ở 40ºC đến khối lượng không đổi thu được TSP chiếm 18,39% (theo khối lượng) Tác giả đã tiến hành xác định lượng carbohydrate, protein, và các thành phần khác như alkaloid, chất béo, amino acid, tannin và xác định màu sắc, mùi, vị, cấu trúc bề mặt Tác giả đã xác định khả năng tan trong một số dung môi khác nhau, xác định pH của dung dịch 1%, đồng thời xác định khả năng trương nở của TSP, xác định tỉ trọng của bột TSP, khả năng tạo gel và độ nhớt của dung dịch TSP Tác giả tiến hành phân tích các tính chất của TSP thu đươc theo hướng ứng dụng trong y học Kết quả chỉ ra rằng TSP chiết tách từ hạt me được sử dụng như một tác nhân làm đông trong y học và thực phẩm

Năm 2010 Mishra và cộng sự [66] cũng đã khẳng định TSP hiện nay đang được nghiên cứu như là một chất mang trong quá trình sử dụng thuốc Dung dịch TSP sử dụng làm chất mang của thuốc chữa bệnh đại tràng đã được dùng trong y học Cùng với tác giả Rashmirekha và cộng sự [83] đã nghiên cứu khả năng kiểm soát liều lượng trong thuốc chống ung thư bằng sự kết hợp giữa Paclitaxel và Tamarind Seed Polysaccharide Với dung dịch TSP có các nồng độ (0,5 %, 1 %, 1,5 %, 2% và 2,5 % (theo khối lượng)) được pha trong dung dịch acid acetic 1 % Glycerol 25 % (theo khối lượng) được thêm vào hỗn hợp được trải phẳng và sấy tại

5 %, 10 %, 15 %, 20 % và 25 % (theo khối lượng) để thử nghiệm kiểm soát liều lượng tại nhiệt độ phòng bằng phương pháp so màu Người ta nghiên cứu ảnh hưởng pH đến khả năng kiểm soát liều lượng nhả thuốc, thấy sau 2 giờ tại pH = 1,2 thì lượng nhả thuốc được là 18,42 %, còn với pH = 7,4 được 32,55 % Thêm vào đó TSP là polymer tự nhiên có khả năng tự phân hủy, kiểm soát chính xác liều lượng nhả thuốc, thời gian phân tán của thuốc, có khả năng tương thích sinh học cao, an toàn không có tác dụng phụ, không gây độc [115] Khả năng hấp thụ nước của TSP được xác định theo tiêu chuẩn ASTM D 570- 98 [17]

Bên cạnh đó Landi và cộng sự [57] đã chiết tách polysaccharide từ quả me và kết quả nghiên cứu cho thấy polysaccharide có khả năng chống oxy hóa, hạ cholesterol, giảm khả năng xơ vữa thành mạch máu Một số nghiên cứu tạo một số dẫn xuất sulfate hóa và acetyl hóa của TSP có khả năng làm giảm đường huyết và chống bệnh tăng đường huyết [59,63] Theo Maruf và cộng sự [62] thì dịch chiết của TSP đã ảnh hưởng tốt đến huyết áp và lipid máu (qua nghiên cứu và ứng dụng trên người)

Sougata và cộng sự [95] đã chiết tách và tiến hành phân tích các tính chất của TSP và hướng đến sử dụng trong y học Kết quả nghiên cứu chỉ ra TSP chiết tách được có thể sử dụng làm chỉ phẫu thuật trong y học, được chế tạo bằng phương pháp đúc dung môi Trong nghiên cứu này cho thấy chỉ phẫu thuật có độ bền không khác chỉ phẫu thuật thông thường nhưng có cường độ cao hơn và có khả năng tự tiêu trong 2-6 giờ Quang phổ FT-IR cho thấy không có sự tương tác giữa thuốc và polymer TSP Do đó, TSP có thể được sử dụng cho việc chế tạo chỉ phẫu thuật Lang và cộng sự [59] đã điều chế các dẫn xuất của TSP (từ TSP tự nhiên) và xác định cấu trúc của cả mẫu tự nhiên và dẫn xuất bằng phổ IR và NMR Sau đó họ

so sánh tính chất của các mẫu biến tính với mẫu tự nhiên Xiao-xiao Liu và cộng sự [114] cũng tiến hành sulfate hóa và acetyl hóa polysaccharide nhằm tạo dẫn xuất làm tăng khả năng kháng vi sinh vật kiểm định Zhongshan, Lihong và cộng sự [60,120] đã tạo dẫn chất sulfate hóa và acetyl hóa của polysaccharide làm tăng khả năng chống oxy hóa Polysaccharide sulfate hóa từ tảo biển đã được nghiên cứu

rộng rãi về cấu trúc cũng như hoạt tính sinh học để phục vụ trong thực phẩm và y học

Thời gian gần đây hoạt tính chống đông tụ máu được nghiên cứu và quan tâm nhiều Các kết quả nghiên cứu đều tìm ra hoặc tổng hợp các dẫn xuất sulfate của polysaccharide từ tảo nâu, tảo xanh, tảo đỏ và hạt của một số loài thực vật, kết quả các sản phẩm tạo ra được đều có hoạt tính ly giải cục máu đông Heparin là một sulfate polysaccharide được sử dụng như thuốc ly giải cục máu đông được sử dụng rộng rãi trong huyết học và truyền máu trong 50 năm gần đây Tuy nhiên có một số hạn chế là phương pháp điều chế khó khăn, tính không đồng nhất, tác dụng phụ trong sinh lý và gây hiện tượng chảy máu Một số tác giả đã nghiên cứu các dẫn xuất của polysaccharide với mục đích tìm ra chất an toàn hơn từ tự nhiên và dễ sử dụng để thay thế heparin Sulfate polysaccharide từ thực vật có cấu trúc ion tương

tự heparin và có hoạt tính ly giải cục máu đông Do dó, dẫn xuất sulfate của polysaccharide có thể thay thế heparin trong điều trị các bệnh về huyết học và truyền máu [39,60,75,113]

Ajiboye và cộng sự [11] sử dụng dịch chiết từ hạt và lá me được biết đến là có khả năng tạo gel trên một phạm vi pH rộng Vì vậy, TSP được sử dụng thay thế pectin quả trong sản xuất mứt, thạch và làm chất ổn định cho kem và mayonnaise Ngoài ra theo Escalona-Arranz và cộng sự [32] đã xác định được lượng phenol tổng, flavonoid tổng, carbohydrate và lượng tro có trong dịch chiết từ lá me và có tỷ lệ khác nhau tùy theo điều kiện chiết

Năm 2014, Jharna và cộng sự [45] nghiên cứu dịch chiết TSP bằng dung môi nước và theo phương pháp Soxhlet Thu được dịch chiết dạng gel trong nước ấm và được kết tủa trong dung môi hữu cơ, dịch chiết có pH = 6,1 và không có bất kỳ phản ứng phụ nào

Yerram và cộng sự [116] đã dùng TSP để kiểm soát liều lượng thuốc theo khả năng tan của TSP trong dung môi nước và sử dụng để kiểm soát liều lượng thuốc thông qua đường uống

Trước đó Taylor I.E.P [103] đã dùng tia X để nghiên cứu cấu trúc của

bốn liên kết β-1,4 glucose đường khử, dạng phẳng và dạng ruy băng xoắn có mạch chính là liên kết β-1,4 polyglucose và có hai nhánh là xylose và galacstose Kết quả cho thấy độ lặp lại của cấu trúc là 2,06nm và tương ứng với tỷ lệ mol glucose, xylose và galactose tương ứng là 4:3:1

Khanittha và cộng sự [55] đã tiến hành chiết TSP từ ba nguồn me khác nhau

và mẫu TSP khô được phân tích bằng phổ 1H-NMR, FT-IR và XRD Kết quả thu được hàm lượng TSP khác nhau theo các nguồn cung cấp, và theo hai phương pháp chiết tách và thấy hiệu suất chiết tách tương tự nhau Phổ FT-IR đều chỉ ra các nhóm đặc trưng của polysaccharide Theo phổ 1

H-NMR có nhóm đặc trưng tại δ 3.50–4.20 ppm và theo XRD đều cho thấy chúng là những chất vô định hình

Lang P và cộng sự [58] đã xác định cấu trúc không gian của TSP trong dung môi nước bằng cách sử dụng phương pháp LS, kết quả cho thấy dung dich TSP có trọng lượng mol phân tử và kích thước khác nhau phụ thuộc và khả năng tự kết hợp giữa các polysaccharide Hình dạng của dung dịch polysaccharide có dạng bó với các chuỗi đơn và chuyển dần về dạng hình cầu khi tăng nồng độ Kết quả cũng cho thấy có mối tương quan giữa khả năng hòa tan của TSP với nhiệt độ và độ dài của mạch polysacchadide

Sone.Y và cộng sự [94] đã dùng xyloglucan nanooligosaccharide để nhận biết các kháng thể bằng phương pháp ELISA, bằng phương pháp này cũng xác định nhanh được xyloglucan oligosaccharide tổng có trong các loài thực vật

Bên canh đó York W.S và cộng sự [118] bằng phương pháp enzyme và phổ NMR để xác định cấu trúc của nonasaccharide, octasaccharide và heptasaccharide Kết quả cho thấy có bảy loại cấu trúc với ba loại đường là glucose, xylose và galactose là do thay đổi vị trí liên kết tại glucose, và galactose liên kết với xylose Theo Anupama và cộng sự [14] TSP làm tăng cường khả năng chống viêm và làm thuốc giảm đau qua các nghiên cứu trên chuột với liều lượng 100 mg/kg, 200 mg/kg và 400 mg/kg trọng lượng cơ thể Khả năng chống viêm được thực hiện khi

sử dụng carrageenan làm chất gây phù chân ở chuột

Theo Kumar và cộng sự [56] TSP đã được thử nghiệm in vitro trong việc

chống lại hiện tượng đục thủy tinh thể ở dê Thủy tinh thể được ủ trong thủy dịch nhân tạo chứa 55 nM glucose (cataractogenesis) và dịch chiết của quả me với nhiều nồng độ khác nhau trong 72 h và được đổi dung dịch sau mỗi 24 h Các thông số về hóa sinh được nghiên cứu với dung dịch đệm Tris, được thử nghiệm hoạt tính oxy hóa malondialdehyde (MDA), lipid peroxidase và protein, chống oxy hóa enzyme Theo Souza và cộng sự [97] nghiên cứu ảnh hưởng dịch chiết cây me lên chuột lang với nồng độ từ 10-8 mg/ml đến 10-2 mg/ml, tăng khả năng tự hoạt động

co thắt với nồng độ (EC50= 4x10-6 mg/ml) Hoạt động này không bị ảnh hưởng của atropine Những kết quả trên cho thấy dịch chiết tạo hiện tượng co thắt, nhưng không bao gồm cơ chế thần kinh

Năm 2015 Mohamed và cộng sự [67] đã nghiên cứu hai loại bột hạt me có trên thị trường: loại màu nâu nhạt và nâu đậm, dịch chiết từ hai loại này được nghiên cứu tính chất hóa lý, so sánh với pectin TSP từ hai loại đều tương tự nhau: như khả năng hòa tan trong nước nóng, pH, cùng chỉ số khúc xạ và có sự khác biệt so với pectin thương mại Trọng lượng phân tử, độ nhớt của hai TSP là như nhau và cao hơn so với pectin TSP dạng gel có khoảng pH rộng trong khi pectin lại có khoảng

pH hẹp (là chất acid) TSP có khả năng tạo gel tốt, không có galacturonic, không có nhóm acetyl, có nhóm methyloxyl và có mức độ ester hóa cao, trong khi pectin có nhiều acid uronic và mức độ ester hóa thấp Theo HPLC cho thấy trong TSP thu được từ hai loại trên gồm đường pentose (xylose and arabinose) và đường hexose (glucose and galactose) Tỉ lệ các đường tương ứng là 2:1:3:1, trong khi đó pectin

có thành phần tương tự nhưng thay fructose bằng xylose

Theo Gidley và cộng sự [35] thành phần các đường chủ yếu có trong polysaccharide từ hạt me gồm galactose:xylose:glucose tương ứng 1:2,25:2,8 và có lượng nhỏ (2-3%) polysaccharide dạng mạch nhánh là (1 5) α-L arabinofuran với phần không phân nhánh là (1 4) β-D-galactopyranan Tác giả đã sử dụng ta X góc nhỏ và phương phương pháp LS xác định được mạch chính gồm liên kết (1 4)-β-D-glucan

Các nghiên cứu của các tác giả chủ yếu tập trung nghiên cứu về cấu trúc của TSP và ứng dụng của TSP trong y học, một số nghiên cứu đã đề cập đến việc tạo các dẫn xuất của TSP như sulfate, acetyl, methyl, phosphate nhưng chủ yếu về cấu trúc Việc nghiên cứu về tác dụng sinh học của các dẫn xuất còn chưa nhiều Do đó tiếp tục nghiên cứu về cấu trúc và hoạt tính sinh học của TSP và dẫn xuất cần được nghiên cứu sâu hơn

1.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Ở nước ta, cây me được trồng rộng rãi ở nhiều tỉnh từ Hà Bắc, Vĩnh Phú tới các tỉnh Tây Nguyên, miền Trung, miền Nam và các Hải đảo Quả me được sử dụng chủ yếu làm thực phẩm, nước sốt, gia vị

Tuy nhiên, ở nước ta cho đến nay ngoài các ứng dụng theo kinh nghiệm dân gian thì chưa có nghiên cứu hóa học nào về quả me, chưa có một nghiên cứu nào về polysaccharide có nguồn gốc từ quả me ở Việt Nam được công bố

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Phương pháp chiết tách

Chiết tách polysaccharide từ quả me bằng các phương pháp chiết tách thông thường, kết hợp các phương pháp tinh chế, làm sạch đồng thời tham khảo các công

bố trên thế giới để đưa ra một phương pháp chiết tách tối ưu, phù hợp với đối tượng

và mục đích nghiên cứu của luận án

2.2 Phương pháp xác định cấu trúc

2.2.1 Phương pháp sắc ký thẩm thấu gel (GPC)

GPC (Gel Permeation Chromatography) là một kỹ thuật sắc ký để phân tách các phân tử kích thước lớn dựa trên sự rửa giải của chúng trên cột GPC có thể xác định một vài thông số cấu trúc quan trọng bao gồm trọng lượng trung bình Mw, trọng lượng phân tử trung bình số Mn, và đặc trưng cơ bản nhất của một polymer là

sự phân bố trọng lượng phân tử của nó GPC được sử dụng để nghiên cứu các chất phân tử lớn như polyme tổng hợp hay các polyme tự nhiên như polysaccharide Ngoài việc cung cấp thông tin về sự phân bố trọng lượng phân tử, GPC cũng tách một hợp chất phân tử lớn phức tạp thành các thành phần của nó như polymer, oligomer, monomer, và các chất phụ gia [80] Sơ đồ khối tổng quát của thiết bị GPC được đưa ra trên sơ đồ:

Hình 2.1 Sơ đồ khối của thiết bị GPC

2.2.2 Phương pháp phổ IR

Ngày nay, phương pháp phổ hồng ngoại (IR) là phương pháp vật lý được sử dụng rộng rãi trong phân tích cấu trúc nói chung và phân tích cấu trúc các ionic polysaccharide nói riêng [1,2] Phương pháp này mang đến những thông tin cấu trúc quan trọng để xác định kiểu nhóm chức trong phân tử polysaccharide Phổ FT-IR đã được áp dụng thành công để phân tích các polysaccharide như pectin, hemicellulose, cellulose, tinh bột và các dẫn xuất polysaccharide từ rong biển Bảng 2.1 đưa ra các nhóm đặc trưng và băng sóng hấp thụ trong phổ FT-IR của polysaccharide [23,51]

Bảng 2.1 Một số nhóm đặc trưng và băng sóng hấp thụ trong phổ FT-IR của

2.2.3 Phương pháp phổ NMR

Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân là phương pháp hữu hiệu để nghiên cứu cấu trúc của polysaccharide Trong phương pháp nghiên cứu cấu trúc của polysaccharide thì phổ 1H và 13C-NMR thường được sử dụng Trong một số trường hợp phổ 1H-NMR còn dùng để định lượng polysaccharide có trong mẫu phân tích [2,25]

Phổ NMR [18,24,87] được thể hiện bằng độ chuyển dịch hóa học (δ, ppm) với chất nội chuẩn (TMS, DSS…) Đặc trưng phổ 1H- NMR và 13C-NMR của glucan được thể hiện theo Hình 2.3 Trong phổ 1

H- NMR tất cả độ dịch chuyển hóa học của carbohydrate bao gồm mono-, oligo-, và polysaccharide có độ chuyển dịch hóa học từ 1-6 ppm trong chất nội chuẩn TMS Độ chuyển dịch hóa học proton anomer của mỗi monosaccharide đều được nhận biết riêng phụ thuộc vào cấu hình hay Như với proton -anomer sẽ xuất hiện tại δ 5–6 ppm trong khi đó với proton -anomer là tại vùng δ 4–5 ppm Phổ 13C-NMR thường có tín hiệu yếu hơn nhưng có những lợi thế hơn so với phổ 1H-NMR trong phân tích cấu trúc polysaccharide vì độ dịch chuyển hóa học trong phổ 13C-NMR được trải rộng trên thang đo (Hình 2.3) Các tín hiệu trên thang đo trên phổ 13C-NMR đã khắc phục được hiện tượng chồng chéo trên phổ 1H-NMR Trên phổ 13C-NMR các tín hiệu carbon anomer xuất hiện tại vùng δ 90–110 ppm trong khi đó các tín hiệu của carbon không ở vị trí anomer xuất hiện tại δ 60 và 85 ppm Với polysaccharide có nhóm deoxy như nhóm –CH3tín hiệu xuất hiện tại vùng trường cao hơn (15–20 ppm) Với hai loại proton anomer, tín hiệu của carbon -anomer xuất hiện tại δ 95–100 ppm trong khi đó tín hiệu của hầu hết carbon -anomer xuất hiện tại δ 100-105 ppm Với polysaccharide có chứa nhóm acid uronic, các tín hiệu của carbon trong nhóm carboxyl sẽ xuất hiện tại δ 170–180 ppm Các tín hiệu của carbon bậc một có chứa nhóm hydroxyl như C6 trong pyranose và C5 trong furanose sẽ chuyển dịch về vùng cao (δ 60–64 ppm), trong khi đó độ chuyển dịch hóa học của nguyên tử carbon bậc 2 có chứa nhóm hydroxyl (C2, 3, 4 trong pyranose và C2, 3 trong furanose) sẽ xuất hiện tại vùng 65–85 ppm Với nguyên tử carbon alkoylate (C5 trong pyranose và C4 trong furanose) độ chuyển dich hóa học sẽ chuyển về phía trường yếu 5–10 ppm

Các tín hiệu thu được từ phổ NMR của polysaccharide chưa xác định ngay được cấu trúc mà cần được so sánh với các giá trị của phổ đặc trưng sau đó để hoàn thiện cấu trúc dùng phổ 2D-NMR và một số kỹ thuật khác Phổ 1H-NMR có thể được sử dụng để định lượng polysaccharide Tuy nhiên xuất hiện hiện tượng chồng chéo của các tín hiệu proton trong quá trình định lượng polysaccharide Do vậy phổ 13

C-NMR với kỹ thuật đo đặc biệt cũng có thể dùng để định lượng polysaccharide

vì các tín hiệu của carbon anomer được tách riêng trong phổ [24] Phổ cộng hưởng

từ hạt nhân proton (1H-NMR) của polysaccharide có thể khẳng định độ tinh khiết của mẫu (không có mặt của các tín hiệu các oligonucleotide, protein hay lipid)

Phổ cũng có thể cho biết số monosaccharide từ số các cộng hưởng proton anomer thông qua các tín hiệu trong khoảng δ 4,4 đến 5,8 ppm Như vậy dựa vào tỷ

lệ tích phân tương đối của tín hiệu các cộng hưởng proton anomer ta cũng có thể đánh giá tỷ lệ của các monosaccharide Về mặt này kết quả phân tích hoá học có thể phù hợp với kết quả phân tích 1H-NMR Nhìn chung, kết quả phân tích NMR là chính xác hơn so với kết quả phân tích hoá học

Hình 2.2 a) Phổ 1 H-NMR của (1 3) và (1 4) -D-glucan; b) Phổ 13 C-NMR của (1 3)

và (1 4) -D-glucan

Nhiều nhóm thế có thể được xác định hoặc sự có mặt của chúng được dự đoán

dựa vào phổ hai chiều đồng hạt nhân 1H-1H COSY Tiếp theo, số lượng chính xác

của các monosaccharide có thể được khẳng định chính xác nhờ vào việc khảo sát

vùng anomer của phổ hai chiều dị hạt nhân 1H-13C-HSQC [24] Từ các thông số độ

chuyển dịch hóa học của C1, H1 thông qua phổ tương tác dị hạt nhân 1H – 13C

HSQC có thể đưa ra được cấu trúc hóa học cơ bản của monosaccharide [88]

Bảng 2.2 Độ chuyển dịch hoá học δ(ppm) từ cơ sở dữ liệu sugabase của dạng glucose,

galactose và xylose dung môi D 2 O

Monosaccharide H-1

C-1

H-2 C-2

H-3 C-3

H-4 C-4

H-5 C-5

H-6a C-6

H-6b

-D-Glcp 5,11

97,5

3,52 72,5

3,76 73,8

3,41 70,7

3,74 72,9

3,64 61,4

3,78

102,9

3,31 74,1

3,55 76,3

3,51 70,4

3,55 76,0

3,77 61,5

3,94

99,1

3,89 68,9

3,93 70,2

4,12 68,6

4,11 71,0

3,73 61,7

3,73

103,5

3,53 71,7

3,80 73,5

4,08 67,9

3,74 75,5

3,74 61,8

3,74

93,12

3,52 72,41

3,67 73,75

3,61 70,16

3,68(H5a);

3,60(H5b) 61,99

97,53

3,22 75,00

3,43 76,77

3,62 70,27

3,31(H5a);

3,93(H5b) 66,05

Các vị trí được thế của monosaccharide được gọi là vị trí aglycon tương ứng

với các nguyên tử C ở các vị trí không phải anomer của liên kết glycoside Từ dữ

liệu NMR, vị trí liên kết được suy ra dựa trên sự tăng mạnh (> 3ppm) về độ dịch

chuyển hoá học của 13C so với độ dịch chuyển hoá học của các monomer không thế

Việc phân tích này cũng mang lại thông tin giống với những phân tích khi

methyl hoá Trật tự các monomer trong mạch polysaccaride được xác định chính là

chuỗi các liên kết glycoside, thể hiện thông tin cấu trúc chính cần xác định thu được

từ hai loại phổ HMBC và NOESY

Một cách tổng quát, độ chuyển dịch hóa học của polysaccharide được trình

bày theo Hình 2.3

Hình 2.3 Độ dịch chuyển hóa học của các nhóm trong polysaccharide

Cho đến tận những năm đầu của thập kỷ 80, việc làm thế nào để phân tích các hợp chất cao phân tử bằng phương pháp phổ khối và làm cho khối phổ trở thành detector mạnh trong kỹ thuật phân tích lỏng vẫn còn là một thách thức Nguyên nhân chủ yếu là do các nhà khoa học bị giới hạn bởi ý tưởng cho rằng một chất phải luôn được hoá hơi trước rồi sau đó mới ion hoá chúng Hơn nữa, năng lượng cần thiết để ion hóa các phân tử chủ yếu được cung cấp từ nhiệt và các phân tử chứa các

“nhóm phân cực” cần được biến đổi hoá học để có thể hoá hơi được Một thời gian dài, đối với nghiên cứu các polysaccharide, phương pháp khối phổ chỉ có thể được

áp dụng sau khi đã có sự chuyển hoá hoá học Trước hết, mẫu được thuỷ phân để tạo thành các monosaccharide hoặc disaccharide, sau đó các tiểu phân này cần được methyl hoá để có thể phân tích bằng GC/MS Quá trình phân tích đòi hỏi nhiều thực nghiệm, tiêu tốn thời gian và hoá chất, trong khi kết quả thu được chỉ cho biết gián tiếp về các monomer hình thành nên mạch mà không cung cấp nhiều thông tin về trật tự liên kết, do các monomer đã được methyl hoá nên có thể thông tin về nhóm

thế của monomer sẽ bị mất đi Chính vì thế phương pháp phổ khối (MS) sử dụng kĩ thuật ion hoá thông thường không phát huy sức mạnh đối với các mẫu polysaccharide [2]

Cuối những năm 80, vướng mắc về kĩ thuật ion hoá đối với các đại phân tử đã được giải quyết nhờ sự ra đời gần như đồng thời của 2 kĩ thuật: ion hóa phu mù điện ESI (Electrospray Ionisation) và sự ion hóa giải hấp laser nhờ mạng lưới MALDI (Matrix-Assited Laser Desorption Ionisation) Đây là bước nhảy vọt về mặt kĩ thuật

đã đưa khối phổ thành một công cụ mạnh trong nghiên cứu các phân tử sinh học lớn,

và nó đã được trao giải Nobel 2002 cùng với những thành tựu về cộng hưởng từ hạt nhân Một ưu điểm của kĩ thuật ESI là đối với những phân tử lớn có nhiều trung tâm điệ ệ khối lượng/điện tích trở nên đủ nhỏ để cho phép chất có thể được phân tích bằng các máy khối phổ thông thường [4,5]

Theo Jun Liu và Juan [49,50] polysaccharide tự nhiên được thủy phân (enzym hóa) để thu được hỗn hợp oligosaccharide và được kiểm tra bằng phổ MALDI-ToF-

MS và phổ khối ESI–MS Tuy nhiên, hỗn hợp oligopolysaccharide thường phức tạp

và các mảnh có khối lượng mol tương đương nhau, do vậy việc xác định cấu trúc hoàn chỉnh là rất khó, nhưng điều này có thể khắc phục bằng cách sử dụng phổ khối nhiều lần để nghiên cứu cấu trúc một cách hoàn chỉnh Các nghiên cứu gần đây đã đưa các dữ liệu trên phổ khối của polysaccharide như: nhóm khử cuối trong mạch oligosaccharide, các nhóm thay thế nhóm hydroxyl và vị trí liên kết glycoside của oligosaccharide hoặc gán cho các mảnh oligosaccharide đã được xác định Tuy nhiên quá trình biến tính, phương pháp tạo dẫn xuất (khử, thủy phân) cần thực hiện cẩn thận để không bị ảnh hưởng đến cấu trúc polysaccharide và dẫn xuất (cấu trúc phụ thuộc vào quá trình khử, môi trường pH)

Kỹ thuật MALDI-ToF-MS và ESI–MS là phương pháp hữu hiệu trong việc xác định trọng lượng phân tử của xyloglucan và các dẫn xuất sau khi được thủy phân và enzym hóa, hai kỹ thuật này đều thu được dữ liệu nhanh chóng và các phân mảnh nhỏ Các mảnh phổ và điện tích được minh họa theo Hình 2.4