ket qua nghien cuu tao thuoc tri mun tu la cay dam but

Đã có một số nghiên cứu về cao chiết từ lá cây dâm bụt đến khả năng kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus như các nghiên cứu của tác giả Seyyednejad, 2010 hay tác giả Lương Thị Mỹ Ngân,

TÊN DỰ ÁN:

NGHIÊN CỨU TẠO THUỐC TRỊ MỤN TỪ LÁ CÂY DÂM BỤT

(Hibiscus rose sinensis L.)

MỤC LỤC

Tiêu đề Trang

I Tổng quan về vấn đề nghiên cứu 1

1 Lý do chọn dự án 1

2 Giới hạn, phạm vi nghiên cứu 1

II GIẢ THUYẾT KHOA HỌC VÀ MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU 1 Tổng quan tài liệu 1

2 Mục đích nghiên cứu 3

III NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3

1 Đối tương nghiên cứu 3

2 Nội dung nghiên cứu 3

3 Phương pháp nghiên cứu 3

IV.SỐ LIỆU VÀ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 5

V KẾT LUẬN 11

VI ĐỀ XUẤT 11

VII TÀI LIỆU THAM KHẢO 11

LỜI CẢM ƠN

Nhóm nghiên cứu xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu TH, THCS, THPT Nguyễn Văn Trỗi, quý thầy cô giáo đã truyền đạt kiến thức cho chúng em cùng tất cả các bạn học sinh đã giúp đỡ, động viên nhóm trong quá trình thực hiện

dự án, đặc biệt cảm ơn thầy Bùi Xuân Lượng đã tận tình chỉ dẫn cho chúng em thực hiện dự án

Cám ơn TS Trần Thị Lệ Minh trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh; Trung tâm Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường ĐH Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh và Trung tâm Sâm Dược liệu Tp Hồ Chí Minh đã hết lòng giúp đỡ, tạo mọi điều kiện tốt nhất cho nhóm hoàn thành dự án

I TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1 Lý do chọn đề tài

Mụn là mối bận tâm thường trực của lứa tuổi dậy thì, đặc biệt là với các bạn học sinh THCS, THPT Trong giai đoạn dậy thì, dưới tác động của hormon sinh dục, các tuyến mồ hôi tiết nhờn trên da sản sinh ra quá nhiều chất nhờn, ứ đọng lại trên da và cùng với tế bào da chết làm bít tắc lỗ chân lông trên bề mặt

da, từ đó tạo điều kiện cho vi khuẩn phát triển và gây ra mụn Mụn không viêm biểu hiện bằng mụn đầu trắng và mụn đầu đen, được gọi chung là nhân trứng cá,

có thể xuất hiện nhiều trên mặt, lưng và ngực Mụn làm cho các bạn học sinh khó chịu, giảm sự tự tin và mất tập trung có thể ảnh hưởng đến kết quả học tập

Staphylococcus aureus là vi khuẩn có thể gây ra rất nhiều bệnh nhiễm trùng

khác nhau Triệu chứng điển hình của nhiễm tụ cầu trên da là bệnh chốc lở và hình thành những ổ áp-xe chứa đầy mủ, sưng đau và tấy đỏ và thường là kèm theo chảy mủ

Lá cây dâm bụt từ lâu trong dân gian đã được sử dụng để trị mụn Đã có một số nghiên cứu về cao chiết từ lá cây dâm bụt đến khả năng kháng vi khuẩn

Staphylococcus aureus như các nghiên cứu của tác giả Seyyednejad, 2010 hay tác giả Lương Thị Mỹ Ngân, 2016 Tuy nhiên các nghiên cứu trên chưa nghiên cứu về độ an toàn của cao lá dâm bụt và chưa nghiên cứu về ứng dụng trong việc tạo thuốc trị mụn đặc biệt là cho các bạn học sinh Vì vậy nhóm nghiên thực hiện

đề tài “Nghiên cứu tạo cao trị mụn từ cây dâm bụt Hibiscus rose sinensis L.”

2 Mục tiêu nghiên cứu

Khảo sát khả năng kháng khuẩn của cao chiết lá dâm bụt đối với chủng vi

khuẩn Staphylococcuc aureus

Nghiên cứu độ an toàn của cao trị mụn từ cao chiết lá dâm bụt trên chuột

3 Giới hạn, phạm vi nghiên cứu

Dự án này được thực hiện trong thời gian ngắn, điều kiện chưa đầy đủ, kinh phí hạn hẹp nên đề tài chỉ giới hạn trong các vấn đề sau:

+ Cao dâm bụt chỉ được thu nhận đến giai đoạn cao tổng ethalnol và methanol

+ Các thí nghiệm chỉ sử dụng 2 loại dung môi ethanol và methanol ở một nồng độ 980

+ Chỉ đánh giá hiệu quả in vitro của thuốc, chưa thực hiện thử nghiệm lâm sàng trên người

II GIẢ THUYẾT KHOA HỌC VÀ MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU

1 Tổng quan tài liệu

1.1 Cây dâm bụt

Râm bụt Tên khác Tên thường gọi: Râm bụt, Bụp, Bông bụp, Dâm bụt, Hồng bụt, Phù tang, Mộc cẩn, Co ngần (dân tộc Thái), Bioóc ngàn (Tày), Phầy quấy phiằng (Dao) Tên khoa học: Hibiscus rosa

sinensis L

Họ khoa học: Thuộc họ Bông - Malvaceae

Cây Râm bụt Cây nhỡ, cao 4-6m Lá hình bầu

dục, nhọn đầu, tròn gốc, mép có răng to; lá kèm

hình chỉ nhọn Hoa ở nách lá, khá lớn, 6-7 mảnh

đài nhỏ (tiểu đài) hình sợi; đài hợp màu lục dài

gấp 2-3 lần đài nhỏ; tràng 5 cánh hoa màu đỏ;

nhị nhiều, tập hợp trên một trụ đài; bầu hình trụ

hay hình nón Quả nang tròn, chứa nhiều hạt Hình 1 Cây dâm bụt

Phân bố: Cây Dâm Bụt là loại cây ưa nắng sống và phát triển ở khí hậu nhiệt đới gió mùa, được trồng làm được trồng làm hàng rào, làm cây cảnh phổ biến ở nhiều nơi

Thành phần hóa học: Hoa chứa thiamin, riboflavin, niacin và acid ascorbic Hoa vò nát chữa sắc tố anthocyanin và cyanin diglucosid Trong hoa có lá đều có chất nhầy (https://vi.wikipedia.org/wiki/D%C3%A2m_b%E1%BB%A5t)

Nhân dân rất hay dùng lá và hoa tươi giã nhỏ với một ít muối đắp lên những mụn nhọt đang mưng mủ, khô thuốc lại thay Mụn nhọt sẽ đỡ nhức và chóng vỡ mủ (Đỗ Tất Lợi, 2004)

1.2 Vi khuẩn Staphylococcuc aureus

Staphylococcus có nguồn từ tiếng Hy Lạp staphyle nghĩa là chùm nho là

các cầu khuẩn kị khí tuỳ ý Vi khuẩn Gram dương, không di động, không sinh nha bào và thường không có vỏ,có hình cầu, đường kính 0.8 - 1 µm, hình thức tập hợp này do vi khuẩn phân bào theo nhiều chiều trong không gian; trong bệnh phẩm vi khuẩn có thể đứng lẻ, từng đôi hoặc đám nhỏ

Staphylococcus aureus có trong nhiều môi trường sống trước đây, thường sống ký sinh vô hại, nhưng cũng có thể gây bệnh, đặc biệt là khi Staphylococcus aureus xâm nhập hoặc xuyên qua da, chúng có thể gây ra nhiều loại nhiễm trùng khác nhau, chẳng hạn như các sự nhiễm trùng da, làm loét, phỏng da hoặc các sự nhiễm trùng nặng trong máu, phổi hoặc các mô khác

Stahylococcus aureus phân bố rộng rãi trong tự nhiên có nhiều trong các

thực phẩm như: thịt, trứng, sữa và trên da, tóc, lông của người và động vật Một

số Staphylococcus được tìm thấy khắp nơi và có thể phân lập từ không khí, bụi,

thực phẩm, thường trú ở vùng da và niêm mạc của người

Giống Staphylococcus có hơn 20 loài khác nhau, trong đó có 3 loài tụ cầu

có vai trò trong y học:

+ Staphylococcus aureus (S aureus): Tụ cầu vàng được xem là tụ cầu gây

bệnh

+ Staphylococcus epidermidis (Tụ cầu da)

+ Staphylococcus saprophyticus

2 Mục đích nghiên cứu

- Nghiên cứu tính kháng khuẩn của cao chiết lá dâm bụt

- Nghiên cứu tính kích ứng của cao chiết đối với da chuột

- Giúp học sinh có hoạt động trải nghiệm sáng tạo khoa học kỹ thuật, vận dụng kiến thức vào xở lý các tình huống thực tiễn, biết được các phương pháp nghiên cứu khoa học và kỹ năng làm việc nhóm

III NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1 Nội dung nghiên cứu

1.1 Đối tượng nghiên cứu:

Cây dâm bụt Hibiscus rose sinensis L

1.2 Vật liệu nghiện cứu:

Hóa chất:

- Hoá chất thu nhận cao lá dâm bụt: Ethanol 98%, methanol 98%

- Môi trường nuôi cấy vi khuẩn: Môi trường TSA (triptic Soya Agar): Trypticase peptone 15g/L; Phyto peptone 5 g/L; NaCl: 5 g/L; Agar 15g/L; PH=7,2±0,2

- Môi trường LB: Peptone 10g/L; Yeast Extract 5g/L; NaCl 10g/L; PH=7,2±0,2

Trang thiết bị:

- Tủ cấy vô trùng, nồi hấp autoclave, tủ sấy, máy đo pH, cân phân tích, máy lắc

- Dụng cụ: Ống đong 1L; bình thủy tinh 5 L; phễu, đĩa petri, que cấy, đèn cồn, micropipette, ống nghiệm, giá ống nghiệm,…

Vi khuẩn Stahylococcus aureus: Được cung cấp bởi Viện Môi trường và Công nghệ Sinh học đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh

Chuột nhắt trắng đực (chủng Swiss albino): Được cung cấp bởi Viện

Vắc xin và Sinh phẩm Y tế Nha Trang

2 Nội dung nghiên cứu:

- Thu nhận cao dâm bụt từ dung môi ethanol và methanol

- Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của hai loại cao methanol và ethanol từ lá

cây dâm bụt đối với vi khuẩn Staphylococcuc aureus

- Xác định được nồng độ chế tối thiểu và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu của

cao ethanol đối với vi khuẩn Staphylococcuc aureus

- Đánh giá sự kích ứng da của cao ethanol đối với da chuột

3 Phương pháp nghiên cứu

3.1 Thu nhận cao lá dâm bụt

Sử dụng phương pháp ngâm dầm trong dung môi:

- Quy trình thu nhận cao lá dâm bụt sử dụng dung môi ethanol (cao ethanol): Lấy 0.4 kg bột lá dâm bụt ngâm trong 2L ethanol (980 ) trong 72 giờ Lọc qua màng lọc sau đó đem cô quay ở 440 để loại bỏ hết ethanol thu được cao ethanol

- Quy trình thu nhận cao lá dâm bụt dùng dung môi methanol (cao methanol): Lấy 0.4 kg bột lá dâm bụt ngâm trong 2L methanol 980 trong 72 giờ Lọc qua màng lọc sau đó đem cô quay ở 440 để loại bỏ hết ethanol thu được cao ethanol

- Cao ethanol và cao methanol được bảo quản trong điều kiện nhiệt độ 40 C

3.2 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn

Sử dụng phương pháp kháng sinh đồ khuếch tán trên đĩa thạch của Bauer

và cộng sự: Hút 100l dịch huyền phù chủng vi khuẩn thử nghiệm có số lượng tế bào vi khuẩn khoảng 108 CFU/ml nhỏ vào đĩa môi trường và trải đều mặt thạch cho đến khi khô bằng que thủy tinh vô trùng Đục lỗ thạch 9mm, 4 lỗ trên 01 đĩa thạch Nhỏ vào lỗ thạch 30l dung dịch cao chiết lá dâm bụt nồng độ 40mg/ml vào giữa lỗ thạch vừa đục Đặt ở tủ ấm 370 trong 24 giờ Lặp lại 03 lần với mỗi loại cao thử và đối chứng

Chỉ tiêu đánh giá:

Tiến hành đo đường kính vòng kháng vi khuẩn Staphyococcus aureus của

cao chiết bằng thước độ chính xác đến mm

3.3 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu

Cao chiết ethanol được pha với dung môi ethanol nồng độ 40mg/ml; Cho 5 ống nghiệm mỗi ống 1ml dung dịch cao pha loãng bằng môi trường LB để nồng

độ dung dịch cao lần lượt là: 20mg/ml; 10mg/ml; 5mg/ml; 2,5mg/ml; 1,25mg/ml

Vi khuẩn được cấy vào môi trường TSA, ủ các đĩa thạch trong 24 giờ ở

370C Dùng que cấy vô trùng lấy 1 khuẩn lạc hòa tan vào 3 ml môi trường LB, trộn đều bằng máy trộn Vortex Pha loãng dịch vi khuẩn để được nồng độ

106 CFU /ml

Hút 0.5 ml huyền dịch vi khuẩn nồng độ 106 vi khuẩn/ml cho vào mỗi ống nghiệm chứa dung dịch cao đã pha loãng lắc đều sau đó để 24h

Dùng que cấy ria, cấy mỗi nồng độ trên các đĩa thạch, để ở nhiệt độ phòng sau 30 phút cho khô sau đó đảo ngược các đĩa và ủ ấm ở 370C trong 24 giờ Quan sát khuẩn lạc ở các nồng độ khác nhau để đọc kết quả

3.4 Thử nghiệm sự kích ứng của cao chiết trên chuột

Lấy 20 mg mẫu thử vào ống eppendorf sạch, bôi trực tiếp lên vùng da đã làm sạch lông (áp dụng trên số lượng 01 con) Chọn những chuột có da khỏe mạnh và lành lặn Khoảng 24 giờ trước thử nghiệm, làm sạch lông chuột ở vùng lưng gồm 2 ô với kích thước 1,5 cm x 1,5 cm/ ô Mỗi mẫu thử được thử trên 08 chuột Liều chất thử trên mỗi chuột là 20 mg, chất đối chiếu gây kích ứng (KOH 5%) là 100 μL Dùng cọ bôi một lớp mỏng đều trên da chuột ít nhất trong 4 giờ Sau đó, dùng nước cất làm sạch mẫu thử và chất đối chiếu còn lại

Quan sát và ghi điểm phản ứng trên vùng da bôi mẫu thử so với vùng da kế bên đặt nước cất (hoặc dung dịch KOH 5%) ở các thời điểm 1 giờ, 24 giờ, 48 giờ

và 72 giờ sau khi làm sạch bằng nước cất Có thể kéo dài hơn thời gian quan sát khi có tổn thương sâu để có thể đánh giá đầy đủ hơn về khả năng hồi phục hoặc không hồi phục của vết thương nhưng không nên quá 14 ngày Đánh giá phản ứng trên da ở các mức độ gây ban đỏ, phù nề

3.7 Phương pháp xử lý số liệu

Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại Các số liệu thu được

xử lý thống kê theo chương trình excell 2010

IV SỐ LIỆU VÀ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

1 Tách chiết thu nhận cao methanol và cao ethanol

Kết quả thu nhận cao methanol và cao ethanol được tóm tắt theo quy trình sau:

Bột lá khô (400g)

Lọc, Cô quay 440 Cao Ethanol

(37,8g)

Sơ đồ 1 Quy trình thu cao chiết từ dung môi ethanol

Bột lá khô (400g)

2 L Methanol , 72h Lọc, Cô quay 440 Cao Methanol

(37,5g)

Sơ đồ 2 Quy trình thu cao chiết từ dung môi methanol

Bảng 1 Hàm lượng thu nhận cao từ dung môi ethanol và methanol

Dung môi Hàm lượng cao (g) Hiệu suất (%)

Hiệu suất thu nhận cao từ dung môi ethanol 980 là 9,45%; hiệu suất thu nhận cao từ dung môi methanol 980 là 9,40% Như vậy dung môi ethanol và dung môi methanol có sự chênh lệch không đáng kể đến hiệu suất cao lá cây dâm bụt

2 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của hai loại cao methanol và

ethanol từ lá cây dâm bụt đối với chủng Staphylococcuc aureus

Thí nghiệm được tiến hành đối với dịch cao dâm bụt được pha vào methanol và ethanol nồng độ 40mg/ml, đối chứng là ethanol và methanol nguyên chất

Bảng 1: Kết quả đường kính vòng vô khuẩn

Mẫu

Đường kính vòng vô khuẩn

vòng vô khuẩn (mm)

Lần 1 Lần 2 Lần 3 Đối chứng

Cao

Đối chứng

Cao

Như vậy ở cao chiết ethanol và cao chiết methanol đều có khả năng kháng khuẩn điều này giống với kết quả nghiên cứu của tác giả Arullappan Từ kết quả

ở bảng 1 cho thấy trung bình đường kính vòng vô khuẩn ở dịch chiết ethanol 21mm cao hơn so với vòng vô khuẩn ở dịch chiết methanol 14,7mm Tuy nhiên

do ethanol có khả năng kháng khuẩn cao hơn so với methanol vì vậy kích thước vòng vô khuẩn của dịch chiết ethanol cao hơn dịch chiết methanol

Bảng 2: Kết quả thống kê đường kính vòng vô khuẩn của dịch cao methanol

và ethanol

Tên dịch chiết

Trung bình đường kính vô khuẩn của dung dịch cao (mm)

Trung bình đường kính

vô khuẩn của dịch cao đã loại trừ khả năng kháng khuẩn của dung môi (mm)

**: Khác biệt rất có ý nghĩa (P<0,01); *: Khác biệt rất có ý nghĩa (P<0,05)

Từ kết quả bảng 2 cho thấy đường kính vòng vô khuẩn của dịch cao ethanol so với dịch cao methanol có sự khác biệt ở mức ý nghĩa Đường kính vòng vô khuẩn của dịch cao sau khi đã trừ ảnh hưởng của dung môi có sự khác biệt ở mức rất ý nghĩa, điều này chứng tỏ dịch cao ethanol có khả năng kháng khuẩn cao hơn so với dịch cao methanol Mặt khác sử dụng dung môi ethanol sẽ

an toàn hơn so với dùng dung môi methanol vì methnol là chất độc Như vậy dịch chiết ethanol thích hợp hơn dịch chiết methanol trong hiệu quả kháng khuẩn

và tính an toàn trong các thao tác và sử dụng

Hình 2: Đường kính vòng vô khuẩn của các dịch cao và đối chứng: MB: dịch methanol; EB: Dịch methanol; M: methanol; E: Ethanol

2 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu

Cho 5 ống nghiệm mỗi ống 1ml dung dịch cao pha loãng bằng môi trường

LB để nồng độ dịch cao lần lượt là: 20mg/ml; 10mg/ml; 5mg/ml; 2,5mg/ml; 1,25mg/ml

Hình 3: Dịch cao sau khi được pha loãng

Dùng que cấy ria, cấy mỗi nồng độ trên vào các đĩa thạch, để ở nhiệt độ phòng sau 30 phút cho khô sau đó lôn ngược các đĩa và ủ ấm ở 370C trong 24 giờ Kết quả đĩa thạch có nồng độ 20mg/ml và nồng độ 10mg/ml không mọc khuẩn lạc, các nồng độ 5 mg/ml; 2,5mg/ml và 1,25mg/ml có khuẩn lạc hình 4 Điều này

chứng tỏ ở nồng độ tối thiểu 10mg/ml có thể diệt vi khuẩn Staphylococcuc

aureus Kết quả nồng độ diệt khuẩn tối thiểu của nghiên cứu giống với kết quả

của tác giả Lương Thị Mỹ Ngân, 2016 trên cao tổng ethanol

Hình 4 Khuẩn lạc của các dịch cao ở các nồng độ khác nhau

A Nồng độ 20mg/ml, B Nồng độ 10mg/ml, C Nồng độ 5mg/ml, D Nồng độ 2,5

mg/ml, D Nồng độ 1,25mg/ml

3 Kết quả nghiên cứu tính kích ứng của cao lên da chuột

Sau khi cho da chuột tiếp xúc với các tác nhân trong vòng 4 giờ, vùng da được làm sạch bằng nước cất Tiến hành đánh giá điểm kích ứng theo các thời điểm sau 1h, sau 24h, sau 48h và sau 72h kể từ sau khi làm sạch thu được kết quả

ở bảng 3

Bảng 3 Kết quả nghiên cứu

Lô thí nghiệm

Điểm trung bình

Loại phản ứng Sau 1h Sau

24h

Sau 48h

Sau 72h Đối chứng – nước muối

Không kích ứng

Đối chiếu – KOH 5%

3,50 3,50 3,25 3,00 Kích ứng vừa

phải Mẫu cao ethanol

A

C

B