Nghiên cứu lên men axit lactic từ xylose, cellobiose và dịch thủy phân rơm rạ bởi một số chủng lactobacillus

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI PHÍ THỊ THANH MAI NGHIÊN CỨU LÊN MEN AXIT LACTIC TỪ XYLOSE, CELLOBIOSE VÀ DỊCH THỦY PHÂN RƠM RẠ BỞI MỘT SỐ CHỦNG LACTOBACILLUS

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

PHÍ THỊ THANH MAI

NGHIÊN CỨU LÊN MEN AXIT LACTIC TỪ XYLOSE, CELLOBIOSE

VÀ DỊCH THỦY PHÂN RƠM RẠ BỞI MỘT SỐ CHỦNG

LACTOBACILLUS

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

HÀ NỘI - 2017

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

PHÍ THỊ THANH MAI

NGHIÊN CỨU LÊN MEN AXIT LACTIC TỪ XYLOSE, CELLOBIOSE

VÀ DỊCH THỦY PHÂN RƠM RẠ BỞI MỘT SỐ CHỦNG

Công trình được hoàn thành tại:

Trường Đại học Bách khoa Hà Nội

Người hướng dẫn khoa học

1 PGS TS Trần Liên Hà

2 PGS TS Nguyễn Thanh Hằng

Phản biện 1: PGS.TS Lê Mai Hương

Phản biện 2: GS TS Nguyễn Thị Hiền

Phản biện 3: PGS TS Bùi Phương Thuận

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:

1 Thư viện Tạ Quang Bửu - Trường ĐHBK Hà Nội

2 Thư viện Quốc gia Việt Nam

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN

1 Phí Thị Thanh Mai, Trần Liên Hà, Nguyễn Thanh Hằng (2014), Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn sản xuất axit lactic từ

cellobiose, Hội thảo nghiên cứu và phát triển các sản phẩm tự nhiên

lần thứ IV, Nhà xuất bản Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, tr 203 -

208

2 Phí Thị Thanh Mai, Trần Liên Hà, Nguyễn Thanh Hằng, Nguyễn Thị Thùy (2015), Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng lên men sản xuất axit lactic từ xyloza, Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển

nông thôn, số 10, tr 91 - 94

3 Phí Thị Thanh Mai, Trần Liên Hà, Nguyễn Thanh Hằng (2015), Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình lên men axit

lactic của chủng Lactobacillus fermentum Y6 từ xylose, Tạp chí khoa

học và công nghệ, Viện hàn lâm khoa hoc và công nghệ Việt Nam, Tập 53, số 4B, tr 282 -289

4 Phí Thị Thanh Mai, Trần Liên Hà, Nguyễn Thanh Hằng, Trương Thành Luân (2016), Nghiên cứu điều kiện lên men axit lactic của

thủy phân rơm rạ, Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, số

291, tr 83 - 89

5 Phí Thị Thanh Mai, Trần Liên Hà, Nguyễn Thanh Hằng, Thạch Thị Quyên (2016), Tối ưu hóa quá trình lên men axit lactic từ cellobiose của chủng Lactobacillus plantarum HC2, Tạp chí khoa học và công nghệ, số 114, tr 118 - 125

LỜI CẢM ƠN

Trong thời gian thực hiện công trình nghiên cứu tôi đã nhận được nhiều sự giúp đỡ, đóng góp ý kiến và chỉ bảo chân tình của các thầy cô, bạn đồng nghiệp và các cơ quan

Trước hết cho tôi gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới PGS TS Trần Liên

Hà, PGS TS Nguyễn Thanh Hằng thuộc Bộ môn Hóa sinh – Vi sinh – Sinh học phân tử

và Bộ môn Công nghệ thực phẩm, Viện Công nghệ sinh học – Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã tận tình hướng dẫn và định hướng cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu để hoàn thành bản luận án này

Tôi xin cảm ơn tới các thầy cô giáo thuộc Viện Công nghệ sinh học – Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã giúp đỡ và góp ý cho tôi rất nhiều trong quá trình học tập và nghiên cứu

Nhân dịp này cho tôi gửi lời cảm ơn tới ban lãnh đạo Học viện Hậu cần, đoàn 871

và các bạn bè đồng nghiệp, đã hết sức giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi học tập

và nghiên cứu

Tôi xin cảm ơn các giáo sư, phó giáo sư, tiến sĩ là chủ tịch hội đồng, phản biện, thư

ký và ủy viên hội đồng đã dành thời gian quý báu để đọc tham gia hội đồng chấm luận án với những góp ý cụ thể, những gợi ý bổ ích, giúp tôi hoàn thiện tốt hơn các nội dung nghiên cứu của luận án

Tôi cũng vô cùng cảm ơn sự khích lệ, động viên và giúp đỡ hết sức nhiệt tình của gia đình, bè bạn đã dành cho tôi để tôi hoàn thành bản luận án nghiên cứu này

LỜI CAM ĐOAN

Là người tham gia trực tiếp các nội dung thuộc đề tài được trình bày trong luận án này, tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác Việc tham khảo các nguồn tài liệu đã được thực hiện trích dẫn và ghi nguồn tài liệu tham khảo theo đúng yêu cầu

Hà Nội, ngày 12 tháng 6 năm 2017

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

LỜI CAM ĐOAN ii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii

DANH MỤC CÁC BẢNG ixx

DANH MỤC CÁC HÌNH x

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Axit lactic 3

1.1.1 Đặc tính hóa học của axit lactic 3

1.1.2 Ứng dụng của axit lactic 3

1.1.3 Các phương pháp sản xuất axit lactic 5

1.1.3.1 Tổng hợp axit lactic bằng con đường hóa học 5

1.1.3.2 Sản xuất axit lactic bằng phương pháp lên men 5

1.2 Lignocellulose 6

1.2.1 Thành phần hóa học của lignocellulose 8

1.2.1.1 Cellulose 8

1.2.1.2 Hemicellulose 10

1.2.1.3 Lignin 11

1.2.2 Rơm rạ 12

1.3 Lên men axit lactic từ rơm rạ 13

1.3.1 Quá trình tiền xử lý 13

1.3.1.1 Tiền xử lý rơm rạ bằng axit hữu cơ 15

1.3.1.2 Tiền xử lý rơm rạ bằng kiềm 15

1.3.2 Quá trình thủy phân 15

1.3.3 Quá trình lên men sản xuất axit lactic từ xylose, cellobiose và dịch thủy phân rơm rạ bằng vi khuẩn lactic 17

1.3.3.1 Nguồn cơ chất 18

1.3.3.2 Chủng giống vi sinh vật 23

1.3.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng lên men axit lactic 29

1.4 Tình hình nghiên cứu sản xuất axit lactic từ xylose, cellobiose và dịch thủy phân rơm rạ trên thế giới và ở Việt Nam 34

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38

2.1 Vật liệu, hóa chất và thiết bị 38

2.1.1 Vật liệu 38

2.1.2 Môi trường 38

2.1.3 Hóa chất và enzyme 39

2.1.4 Thiết bị 39

2.2 Phương pháp nghiên cứu 40

2.2.1 Phương pháp vi sinh và sinh học phân tử 40

2.2.1.1 Phân lập chủng vi khuẩn sinh axit lactic từ đường xylose và cellobiose 40

2.2.1.2 Tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh axit lactic 41

2.2.1.3 Quan sát đặc điểm hình thái, sinh lí và sinh hóa của chủng vi khuẩn được chọn 41

2.2.1.4 Định danh vi khuẩn theo phương pháp sinh học phân tử 42

2.2.1.5 Kiểm tra khả năng đối kháng của 2 chủng vi khuẩn Y6 và HC2 42

2.2.2 Phương pháp lên men 42

2.2.3 Phương pháp hóa lí - sinh 43

2.2.3.1 Định lượng đường khử bằng DNS 43

2.2.3.2 Xác định hàm lượng axit tổng theo Therner 43

2.2.3.3 Xác định hàm lượng axit lactic, hàm lượng đường theo phương pháp sắc kí lỏng cao áp (HPLC) 43

2.2.3.4 Phương pháp tiền xử lý rơm rạ bằng kiềm (NaOH) theo phương pháp nấu kín 44

2.2.3.5 Phương pháp thủy phân rơm rạ bằng hỗn hợp enzyme thương phẩm Cellic® Ctec2 và Cellic® Htec2 44

2.2.3.6 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men axit lactic của chủng vi khuẩn được lựa chọn 45

2.2.3.7 Ảnh hưởng của duy trì pH trong quá trình lên men 47

2.2.3.8 Xác định dạng D, L axit lactic trong dịch lên men từ dịch thủy phân rơm rạ 48

2.2.4 Phương pháp toán học 49

2.2.4.1 Tối ưu hóa quá trình lên men axit lactic từ xylose của chủng L fermentum Y6 và từ cellobiose của chủng L plantarum HC2 49

2.2.4.2 Phương pháp thống kê 52

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 53

3.1 Lên men axit lactic từ xylose 53

3.1.1 Phân lập, tuyển chọn và định tên chủng vi khuẩn có khả năng lên men axit lactic từ đường xylose 53 3.1.1.1 Phân lập chủng vi khuẩn có khả năng lên men axit lactic từ đường xylose 53 3.1.1.2 Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng lên men axit lactic từ đường xylose 54 3.1.1.3 Định tên chủng vi khuẩn Y6 59 3.1.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men axit lactic từ đường

xylose của chủng L fermentum Y6 61

3.1.2.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lên men axit lactic từ đường xylose

của chủng L fermentum Y6 61

3.1.2.2 Ảnh hưởng của pH ban đầu đến quá trình lên men axit lactic từ đường

xylose của chủng L fermentum Y6 62

3.1.2.3 Ảnh hưởng của nồng độ đường đến quá trình lên men axit lactic từ đường

xylose của chủng L fermentum Y6 63

3.1.2.4 Ảnh hưởng của tỉ lệ cấp giống đến quá trình lên men axit lactic từ đường

xylose của chủng L fermentum Y6 64 3.1.3 Tối ưu điều kiện lên men axit lactic từ đường xylose của chủng L fermentum

Y6 65 3.1.4 Ảnh hưởng của tốc độ lắc và duy trì pH ban đầu trong điều kiện tối ưu 68 3.1.4.1 Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến quá trình lên men axit lactic từ đường xylose

của chủng L fermentum Y6 69

3.1.4.2 Ảnh hưởng của duy trì pH đến quá trình lên men axit lactic từ đường xylose

của chủng L fermentum Y6 70

3.2 Lên men axit lactic từ cellobiose 73 3.2.1 Phân lập, tuyển chọn và định tên chủng vi khuẩn có khả năng lên men axit lactic từ đường cellobiose 73 3.2.1.1 Phân lập chủng vi khuẩn có khả năng lên men axit lactic từ đường cellobiose 73 3.2.1.2 Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng lên men axit lactic từ cellobiose 74 3.2.1.3 Định tên chủng vi khuẩn HC2 77 3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ, pH ban đầu, nồng độ đường và tỉ lệ cấp

giống đến khả năng lên men axit lactic của chủng L plantarum HC2 từ đường

3.2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng lên men axit lactic từ đường

cellobiose của chủng L plantarum HC2 80

3.2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của pH ban đầu đến khả năng lên men axit lactic từ

cellobiose của chủng L plantarum HC2 81

3.2.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ đường đến khả năng lên men axit lactic từ

cellobiose của chủng L plantarum HC2 82

3.2.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ cấp giống đến khả năng lên men axit lactic từ

cellobiose của chủng L plantarum HC2 82

3.2.2.5 Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ lắc đến khả năng lên men axit lactic của

chủng L plantarum HC2 83 3.2.3 Tối ưu hóa quá trình lên men axit lactic từ cellobiose của chủng L plantarum

HC2 84 3.2.4 Ảnh hưởng của duy trì pH đến quá trình lên men axit lactic từ cellobiose của

chủng L plantarum HC2 87

3.3 Lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ 90 3.3.1 Tiền xử lý rơm rạ bằng kiềm (NaOH) theo phương pháp nấu kín và thủy phân rơm rạ sau tiền xử lý bằng hỗn hợp enzyme Ctec2 và Htec2 90 3.3.2 Lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ bởi các chủng đơn hoặc hỗn hợp

chủng L plantarum HC2 và L fermentum Y6 91 3.3.2.1 Lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ bởi chủng L plantarum HC2.

92

3.3.2.2 Lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ bởi chủng L fermentum Y6 93 3.3.2.3 Lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ bởi hỗn hợp chủng L plantarum HC2 và L fermentum Y6 93 3.3.3 Nghiên cứu động học của quá trình lên men axit lactic bởi hỗn hợp chủng L plantarum HC2 và L fermentum Y6 từ dịch thủy phân rơm rạ 101

3.3.4 Xác định dạng D, L axit lactic 102 3.3.4.1 Thu hồi và tinh sạch axit lactic từ dịch lên men thu được từ quá trình lên

men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ bởi hỗn hợp chủng L fermentum Y6 và L plantarum HC2 102

3.3.4.2 Phân tích sản phẩm axit lactic bằng sắc kí lỏng cao áp HPLC 102 3.3.4.3 Phân tích so sánh xác định thành phần D, L lactic và độ quay phân cực của axit lactic 103

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 105

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN 107 TÀI LIỆU THAM KHẢO 108 PHỤ LỤC 122

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần hóa học trong các nguồn lignocellulose 8

Bảng 1.2 Một số chủng vi khuẩn lên men axit lactic từ đường xylose 24

Bảng 1.3 Một số chủng vi khuẩn lên men axit lactic từ cellobiose 26

Bảng 2.1 Hóa chất, dụng cụ chính và enzyme 39

Bảng 2.2 Máy, thiết bị 40

Bảng 2.3 Các yếu tố tối ưu trong nghiên cứu lên men axit lactic từ xylose của chủng

L fermentum Y6 50

Bảng 2.4 Các yếu tố tối ưu trong nghiên cứu lên men axit lactic từ cellobiose của chủng

L plantarum HC2 50

Bảng 2.5 Ma trận thực nghiệm tối ưu hóa lên men axit lactic từ xylose 51

Bảng 2.6 Ma trận thực nghiệm tối ưu hóa lên men axit lactic từ cellobiose 51

Bảng 3.1 Đặc điểm các chủng lên men axit lactic từ đường xylose 53

Bảng 3.2 Đặc điểm các chủng vi khuẩn lên men axit lactic từ đường xylose bằng phương pháp đục lỗ thạch, cấy chấm điểm và định lượng axit 57

Bảng 3.3 Hàm lượng axit lactic tạo thành của 2 chủng bằng phương pháp HPLC 58

Bảng 3.4 Đặc tính sinh lý – sinh hóa của chủng Y6 59

Bảng 3.5 Ma trận thực nghiệm Box-Behnken với ba yếu tố và hàm lượng axit thu được trong các điều kiện nuôi cấy khác nhau 66

Bảng 3.6 Kết quả phân tích phương sai mô hình tối ưu bằng phần mềm DX 7.1.5 66

Bảng 3.7 Đặc điểm các chủng lên men axit lactic từ đường cellobiose 73

Bảng 3.8 Đặc điểm của các chủng lên men axit lactic từ đường cellobiose bằng phương pháp đục lỗ thạch, cấy chấm điểm và định lượng axit 76

Bảng 3.9 Đặc tính sinh lí, sinh hóa của chủng HC2………77

Bảng 3.10 Ma trận thực nghiệm Box-Behnken với 3 yếu tố và hàm lượng axit thu được trong các điều kiện nuôi cấy khác nhau 84

Bảng 3.11 Kết quả phân tích phương sai mô hình tối ưu bằng phần mềm DX7.1.5 85

Bảng 3.12 Thành phần đường trong dịch thủy phân rơm rạ 91

Bảng 3.13 Tỉ lệ hỗn hợp của các đồng phân quang học trong sản phẩm lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ bởi chủng L plantarum HC2 và chủng L fermentum Y6 103

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Đồng phân quang học của axit lactic 3

Hình 1.2 Cấu trúc của lignocellulose 7

Hình 1.3 Cấu trúc chuỗi phân tử cellulose 9

Hình 1.4 Phân tử xylan và cơ chế thủy phân thành xylose 10

Hình 1.5 Các dạng của đường xylose 11

Hình 1.6 Các đơn vị cơ bản của lignin 12

Hình 1.7 Sơ đồ sản xuất axit lactic từ rơm rạ 14

Hình 1.8 Cơ chế thủy phân của cellulose 16

Hình 1.9 Cơ chế thủy phân của hemicellulose 17

Hình 1 10 Cơ chế lên men axit lactic từ đường xylose 20

Hình 1 11 Cơ chế lên men axit lactic từ đường cellobiose 21

Hình 2.1 Sơ đồ qui trình tiền xử lý và thủy phân rơm rạ 45

Hình 2.2 Sơ đồ qui trình thu hồi axit lactic 48

Hình 3.1 Định tính axit lactic bằng thuốc thử Uffelmann của các chủng vi khuẩn có khả năng lên men axit lactic từ đường xylose 55

Hình 3.2 Hình ảnh cấy chấm điểm của 9 chủng vi khuẩn có khả năng lên men axit lactic từ xylose 55

Hình 3.3 Hình ảnh đục lỗ thạch của 9 chủng vi khuẩn có khả năng lên men axit lactic từ xylose 56

Hình 3.4 Hàm lượng axit tạo thành của 9 chủng vi khuẩn có khả năng lên men axit lactic từ xylose 56

Hình 3.5 Sắc kí đồ HPLC của dịch lên men axit lactic từ xylose của chủng Y5 58

Hình 3.6 Sắc kí đồ HPLC của dịch lên men axit lactic từ xylose của chủng Y6 58

Hình 3.7 Hình thái tế bào và khuẩn lạc của chủng Y6 59

Hình 3.8 Phổ điện di DNA tổng số tách chiết từ sinh khối chủng Y6 60

Hình 3.9 Phổ điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen 16S rRNA từ DNA tổng số chủng Y6 60

Hình 3.10 Vị trí phân loại của chủng Y6 với các loài có quan hệ họ hàng gần 61

Hình 3.11 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lên men axit lactic từ đường xylose của chủng L fermentum Y6 62

Hình 3.12 Ảnh hưởng của pH ban đầu đến quá trình lên men axit lactic từ đường xylose của chủng L fermentum Y6 63

Hình 3.13 Ảnh hưởng của nồng độ đường xylose đến quá trình lên men axit lactic của

chủng L fermentum Y6 64

Hình 3.14 Ảnh hưởng của tỉ lệ cấp giống đến quá trình lên men axit lactic từ đường xylose của chủng L fermentum Y6 64

Hình 3.15 Ảnh hưởng đồng thời của nhiệt độ và pH ban đầu 67

Hình 3.16 Ảnh hưởng đồng thời của nhiệt độ và nồng độ đường 67

Hình 3.17 Ảnh hưởng đồng thời của pH ban đầu và nồng độ đường 67

Hình 3.18 Hàm kỳ vọng và điều kiện tối ưu để lên men axit lactic từ xylose của chủng

L fermentum Y6 68

Hình 3.19 Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến quá trình lên men axit lactic từ đường xylose của chủng L fermentum Y6 69

Hình 3.20 Ảnh hưởng của việc duy trì pH và không duy trì đến mức độ sử dụng đường trong lên men axit lactic từ xylose của chủng L fermentum Y6 70

Hình 3.21 Ảnh hưởng của duy trì và không duy trì pH đến sự hình thành axit và sử dụng đường khi kết thúc quá trình lên men 70

Hình 3.22 Sắc kí đồ HPLC của dịch lên men axit lactic từ xylose của chủng………

L fermentum Y6 71

Hình 3.23 Định tính axit lactic bằng thuốc thử Uffelmann của các chủng vi khuẩn có khả năng lên men axit lactic từ đường cellobiose 75

Hình 3.24 Hình ảnh cấy chấm điểm của 5 chủng vi khuẩn có khả năng lên men axit lactic từ đường cellobiose 75

Hình 3.25 Hình ảnh đục lỗ thạch của 5 chủng vi khuẩn có khả năng lên men axit lactic từ đường cellobiose 76

Hình 3.26 Hàm lượng axit tạo thành của 5 chủng vi khuẩn có khả năng lên men axit lactic từ đường cellobiose 76

Hình 3.27 Sắc kí đồ HPLC của dịch lên men axit lactic từ cellobiose của chủng HC2 77

Hình 3.28 Hình thái tế bào và khuẩn lạc của chủng HC2 78

Hình 3.29 Phổ điện di DNA tổng số tách chiết từ sinh khối của chủng HC2 78

Hình 3.30 Phổ điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen 16S rRNA từ DNA tổng số chủng HC2 78

Hình 3.31 Vị trí phân loại của chủng HC2 với các loài có quan hệ họ hàng gần 79

Hình 3.32 Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng lên men axit lactic từ đường cellobiose của chủng L plantarum HC2 80

Hình 3.33 Nghiên cứu ảnh hưởng của pH ban đầu đến khả năng lên men axit lactic từ

cellobiose của chủng L plantarum HC2 81

Hình 3.34 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ đường cellobiose đến khả năng lên men

axit lactic của chủng L plantarum HC2 82

Hình 3.35 Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ cấp giống đến khả năng lên men axit lactic từ

cellobiose của chủng L plantarum HC2 83

Hình 3.36 Nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ lắc đến khả năng lên men axit lactic từ

cellobiose của chủng L plantarum HC2 83

Hình 3.37 Ảnh hưởng đồng thời của pH ban đầu và nhiệt độ đến quá trình lên men axit

lactic từ cellobiose của chủng L plantarum HC2 85

Hình 3.38 Ảnh hưởng đồng thời của nồng độ đường và nhiệt độ đến quá trình lên men axit

lactic từ cellobiose của chủng L plantarum HC2 86

Hình 3.39 Ảnh hưởng đồng thời của nồng độ đường và pH ban đầu quá trình đến lên men

axit lactic từ cellobiose của chủng L plantarum HC2 86

Hình 3.40 Hàm kỳ vọng và điều kiện tối ưu để lên men axit lactic từ cellobiose 87Hình 3.41 Ảnh hưởng của duy trì pH đến quá trình lên men axit lactic từ cellobiose của

chủng L plantarum HC2 87

Hình 3.42 Sắc kí đồ HPLC của dịch lên men axit lactic từ đường cellobiose của chủng

L plantarum HC2 88

Hình 3.43 Sắc kí đồ HPLC của dịch đường thủy phân rơm rạ với các điều kiện tối ưu 90

Hình 3.44 Lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ của chủng L plantarum HC2 92 Hình 3.45 Lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ của chủng L fermentum Y6 92

Hình 3.46 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm

rạ của hỗn hợp chủng L plantarum HC2 và L fermentum Y6 94

Hình 3.47 Ảnh hưởng của hàm lượng cao nấm men đến quá trình lên men axit lactic của

L fermentum Y6 99

Hình 3.52 Động thái quá trình lên men axit của 2 chủng L plantarum HC2 và…………

L fermentum Y6 từ dịch thủy phân rơm rạ 101

Hình 3.53 Qui trình thu hồi và tinh sạch axit lactic từ dịch lên men 102

Hình 3.54 Phổ HPLC mẫu axit lactic của sản phẩm lên men 103

Hình 3.55 Phổ HPLC mẫu L- axit lactic chuẩn 103

MỞ ĐẦU

Axit lactic là một trong số những chất hóa học rất quan trọng, được sử dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp thực phẩm, dược phẩm, mĩ phẩm và công nghiệp hóa học Trong đó, hơn 70% axit sản xuất ra được ứng dụng vào trong thực phẩm và các ngành có liên quan đến thực phẩm

Hiện nay, 90% lượng axit lactic được sản xuất bằng quá trình lên men bởi vi khuẩn Nguyên liệu truyền thống để sản xuất axit lactic thường là sản phẩm từ cây lương thực như tinh bột khoai tây, tinh bột bắp, tinh bột mì, Tuy nhiên, nguồn nguyên liệu này có giá thành cao và cạnh tranh với nguồn nguyên liệu của nhiều ngành chế biến thực phẩm khác

Do đó, lên men sản xuất axit lactic từ nguồn nguyên liệu biomass đã được tập trung nghiên cứu Trong số các nguồn sinh khối biomass, sinh khối lignocellulose có sẵn với số lượng lớn, phân bố rộng rãi và giá thành khá thấp Tuy nhiên, cellulose và hemicellulose trong lignocellulose không thể trực tiếp lên men axit lactic bởi vi khuẩn lactic (LAB) vì lignocellulose có cấu trúc phức tạp và thiếu các enzyme cellulolytic trong LAB Do đó, lignocellulose phải qua quá trình tiền xử lý và thủy phân để thu được dịch thủy phân bao gồm hỗn hợp đường: glucose, cellobiose, xylose, arabinose,… Như vậy, dẫn xuất đường thu được từ quá trình thủy phân lignocellulose ngoài đường glucose còn có đường xylose

và cellobiose

nghiên cứu có tính khả thi bởi lẽ nó không những tận dụng được nguồn nguyên liệu phong phú làm giảm giá thành sản phẩm mà còn nâng cao hiệu suất của quá trình lên men axit lactic từ vật liệu lignocellulose

Việt Nam là nước nông nghiệp, phế phụ phẩm nông nghiệp thải ra hàng năm rất lớn Trong số các loại phế phụ phẩm nông nghiệp, rơm rạ là loại nguyên liệu có sản lượng lớn và dễ thu gom Ước tính, mỗi năm có khoảng 61 triệu tấn rơm rạ Tuy nhiên, phần lớn rơm rạ được thải bỏ khi còn tươi hoặc phương thức phổ biến nhất hiện nay là đốt trên đồng ruộng điều này gây lãng phí nguồn nguyên liệu và ô nhiễm môi trường nghiêm trọng Nghiên cứu sản xuất axit lactic từ rơm rạ cũng đã có những bước tiếp cận nhưng mới chỉ dừng lại ở nguồn đường glucose mà chưa tận dụng hết được các nguồn đường khác như

cellobiose (thủy phân cellulose), xylose (thủy phân hemicellulose) Do đó, đề tài “Nghiên

cứu lên men axit lactic từ xylose, cellobiose và dịch thủy phân rơm rạ bởi một số

chủng vi khuẩn Lactobacillus” đã được tiến hành nhằm khai thác những thế mạnh của

nguồn nguyên liệu lignocellulose trong đó tập trung vào nguyên liệu rơm rạ - nguồn phế phụ phẩm nông nghiệp

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài:

- Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng lên men axit lactic từ đường cellobiose và xylose

- Nghiên cứu lên men axit lactic từ đường xylose, cellobiose và dịch thủy phân rơm

rạ bởi các chủng vi khuẩn đã chọn ở trên

Nội dung nghiên cứu

- Phân lập, tuyển chọn và định danh các chủng vi khuẩn có khả năng lên men axit lactic từ đường cellobiose và xylose

- Khảo sát và tối ưu các điều kiện thích hợp lên men axit lactic từ xylose và cellobiose bởi các chủng được chọn

- Khảo sát các điều kiện thích hợp lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ bởi hỗn hợp chủng vi khuẩn, xác định dạng D, L axit lactic tạo thành

Những đóng góp mới của đề tài

- Luận án phân lập được 2 chủng vi khuẩn từ các sản phẩm lên men truyền thống ở

Việt Nam: L fermentum Y6 có khả năng lên men axit lactic từ xylose và chủng L plantarum HC2 có khả năng lên men axit lactic từ đường cellobiose

- Luận án nghiên cứu một cách có hệ thống về quá trình lên men sinh axit lactic từ xylose và cellobiose (phân lập, tuyển chọn, định tên chủng vi khuẩn, tối ưu hóa các điều kiện lên men axit lactic) và lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ bởi 2 chủng đã được lựa chọn

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Axit lactic

1.1.1 Đặc tính hóa học của axit lactic

xuất hiện rộng rãi nhất trong tự nhiên và được phát hiện bởi nhà hóa học Thụy điển - Scheele vào năm 1780 [31]

- Công thức hoá học: C 3 H 6 O 3

- Khối lượng phân tử: 90,08 g/mol

- Axit lactic không màu ở dạng lỏng, ở dạng bột hoặc chất rắn có màu từ màu trắng đến màu vàng Ở dạng lỏng, axit tan được trong nước và etanol Ở dạng rắn, axit ít hòa tan

DL - axit lactic có chứa 50% của mỗi đồng phân [51]

Axit lactic được sản xuất trong cơ thể người, động vật, thực vật và vi sinh vật Trong cấu tạo phân tử của chúng có một carbon bất đối xứng nên chúng có hai đồng phân quang học: D - axit lactic và L - axit lactic Hai đồng phân quang học này có tính chất hóa

lý giống nhau chỉ khác nhau khả năng làm quay mặt phẳng phân cực ánh sáng, một sang phải (D - axit lactic) và một sang trái (L - axit lactic) dẫn đến tính chất sinh học của chúng hoàn toàn khác nhau Trong đó, đồng phân dạng L thích hợp trong công nghiệp thực phẩm

và dược phẩm bởi vì cơ thể con người chỉ hấp thụ loại đồng phân này [32]

L - axit lactic D - axit lactic

Hình 1.1 Đồng phân quang học của axit lactic [51]

1.1.2 Ứng dụng của axit lactic

Axit lactic là một trong số những chất hóa học rất quan trọng, được sử dụng rộng rãi trong các ngành thực phẩm, dược phẩm, mĩ phẩm, và ngành nông nghiệp,… [31, 43, 83] Trong đó, ứng dụng chính của axit lactic vẫn là thực phẩm và các ngành liên quan đến thực phẩm chiếm tới 85% [103]

- Ứng dụng trong thực phẩm bao gồm [126]

+ Kiểm soát pH: Kiểm soát độ pH của sản phẩm có thể kéo dài thời hạn sử dụng Ngoài ra, axit lactic được sử dụng trong món salat và nước sốt để làm tăng tính axit của sản phẩm

+ Tạo mùi: Tăng cường và bảo vệ hương vị thịt Tạo hương vị chua nhẹ trong bánh kẹo, nước giải khát, bia, súp, các sản phẩm sữa,…

Clostridium botulinum, Listeria monocytogenes trong thực phẩm

khác thường đóng gói trong dung dịch muối, axit lactic và nước Axit lactic đóng vai trò như một chất bảo quản và cải thiện độ trong của dung dịch ngâm muối và hương vị của sản phẩm Hỗn hợp của axit axetic và axit lactic trong các sản phẩm muối chua: dưa chuột bao

tử, hành muối,… tạo ra mùi và vị nhẹ hơn, cải thiện sự ổn định của vi sinh vật Muối canxi lactate được ghi nhận là muối có tác dụng làm săn chắc sản phẩm, đã được sử dụng cho các loại trái cây và rau đóng hộp

+ Tác nhân tạo nhũ tương: Este của axit lactic và axit béo mạch dài có tác dụng tạo

hệ nhũ tương đặc biệt trong các sản phẩm bánh qui

- Ứng dụng trong y học

Trong phẫu thuật chỉnh hình, người ta thường sử dụng loại vật liệu là purasord, được sử dụng như những đinh ghim, gắn các phần xương lại với nhau, khi xương định hình purasord sẽ tự tiêu hủy Axit lactic có khả năng trùng hợp thành polymer là polylactic axit (PLA) PLA được dùng làm chỉ tự tiêu, nó cũng được dùng làm thiết bị cố định các vết gãy xương nhỏ và sau đó nó tự phân hủy Nhờ khả năng này của PLA mà chúng đang được nghiên cứu để có thể thay thế các polymer có nguồn gốc từ dầu mỏ [126]

- Ứng dụng làm mỹ phẩm

Các muối lactat kim loại (như lactat natri) được sử dụng trong thành phần của một

số mỹ phẩm chăm sóc da như punosal của hãng mỹ phẩm Punac Mỹ phẩm này có tác dụng chống lại các vi sinh vật có trên bề mặt da, làm ẩm và làm sáng da [126]

- Ứng dụng trong ngành công nghiệp hóa học

Trong những năm gần đây, axit lactic là nguyên liệu cho sản xuất polylactic axit (PLA) PLA là một polyeste nhiệt dẻo, nó có thể quay để tạo thành sợi, tạo màng cứng,

phẩm (bao bì đựng salat, bao bì gói kẹo, chai,…) Năm 2008, khối lượng PLA đạt 0,26

Trong công nghiệp nhẹ: Axit lactic là dung môi cho công nghiệp sản xuất sơn, vecni, nhuộm, thuộc da,…

1.1.3 Các phương pháp sản xuất axit lactic

1.1.3.1 Tổng hợp axit lactic bằng con đường hóa học

Tổng hợp axit lactic bằng con đường hóa học dựa trên lactonitrile, bao gồm các bước sau [22]:

- Bổ sung hydrogen cyanide (HCN) vào dung dịch acetaldehyde (trong môi trường kiềm) để tạo ra lactonitrile Phản ứng này xảy ra trong pha lỏng ở áp suất cao Lactonitrile thô được thu lại và tinh sạch bởi quá trình chưng cất

CH3COONa + HCN CH3CHOHCN

Acetaldehit Hydrogencianua Lactonitrile

- Thủy phân lactonitrile bằng HCl hoặc H2SO4 tạo ra axit lactic cùng với muối amonium

2CH3CHOHCN + 4H2O + H2SO4 2CH3CHOHCOOH + (NH4)2SO4 Lactonitrile Axit sulphuric Axit lactic Muối ammonium

- Este hóa axit lactic với methanol để tạo ra methyl lactate Methyl lactate được thu

và tinh sạch bằng chưng cất

CH3CHOHCOOH + CH3OH CH3CHOHCOOCH3 + H2O Axit lactic Methanol Methyl lactate

- Thủy phân methyl lactate bằng nước dưới xúc tác của axit để tạo ra axit lactic và methanol Methanol được tạo ra từ quá trình trên lại được quay vòng cho quá trình tiếp sau

CH3CHOHCOOCH3 + H2O CH3CHOHCOOH + CH3OH Methyl lactate Axit lactic Methanol

Sản xuất axit lactic theo phương pháp tổng hợp hóa học xuất phát từ nguồn nhiên liệu dầu mỏ, tuy nhiên nguồn nguyên liệu này đang ngày một cạn kiệt Ngoài ra, sản xuất axit lactic bằng phương pháp hóa học tạo ra hỗn hợp racemix DL - axit lactic, quá trình phân tách hai đồng phân đòi hỏi chi phí lớn [43]

1.1.3.2 Sản xuất axit lactic bằng phương pháp lên men

Lên men lactic là quá trình ôxy hóa- khử sinh học nhờ vi khuẩn lactic Qua quá trình lên men này, một lượng đáng kể axit lactic được tích tụ trong môi trường làm giảm mạnh pH của môi trường tạo ra hiệu ứng ức chế mạnh mẽ các vi sinh vật khác Vì vậy, lên men bởi vi khuẩn lactic được sử dụng rộng rãi như một phương pháp để bảo quản thực phẩm và quá trình này thường không có hoặc cần ít nhiệt [22]

Nguồn carbon cho sản xuất axit lactic theo phương pháp lên men có thể là đường như glucose, saccarose, lactose,… hoặc các vật liệu chứa đường như rỉ đường, bã mía, bã sắn, tinh bột và nguyên liệu giàu tinh bột từ khoai tây, khoai mì, lúa mì, lúa mạch, cà rốt [14, 88] Lên men sản xuất axit lactic là một phương pháp thân thiện với môi trường và axit tạo ra có độ tinh khiết cao [37] Tuy nhiên, nguyên liệu tinh bột và đường lại có giá thành cao điều đó làm tăng giá thành sản xuất axit, đây chính là một trong những hạn chế khi so sánh sản xuất axit lactic bằng phương pháp lên men với phương pháp tổng hợp axit lactic bằng con đường hóa học [32] Do đó, việc nghiên cứu tìm kiếm nguồn nguyên liệu giá rẻ là hướng đi cần thiết và có ý nghĩa thực tiễn Gần đây, quá trình lên men axit lactic

từ nguyên liệu không có nguồn gốc thực phẩm, chẳng hạn như biomass đã được tập trung nghiên cứu, do chúng không có bất kì tác động nào tới chuỗi cung cấp thực phẩm cho con người và giá thành thấp

Lignocellulose chiếm hơn 90% sinh khối thực vật trên trái đất Hàng năm, ước tính 200 ×

Lignocellulose có nguồn gốc từ nông nghiệp và nguồn rừng đại diện cho nguồn nguyên liệu có khả năng tái tạo, giá thành thấp và có nguồn carbohydrate sẵn có với hàm lượng

polysaccharide cao [104, 133]

Thành phần hóa học của lignocellulose có nguồn gốc từ nông nghiệp bao gồm khoảng 10% - 25% lignin, 20% - 30% hemicellulose và 40% - 50% cellulose [102] Hemicellulose và cellulose là những phân đoạn giàu đường và những đường này có thể lên

men tạo ra các sản phẩm có giá trị như ethanol, phụ gia thực phẩm, các chất hóa học, enzyme,…[21]

Hình 1.2 Cấu trúc của lignocellulose [21]

Nói chung, tỉ lệ các thành phần hóa học của lignocellulose cao hay thấp phụ thuộc vào loại thực vật, điều kiện canh tác,… Lignocellulose có một cấu trúc bên trong phức tạp

và bao gồm số lượng lớn các thành phần chính cũng có cấu trúc phức tạp Bảng 1.1 cho thấy phần trăm các thành phần hóa học trong các nguyên liệu lignocellulose khác nhau

Bảng 1.1 Thành phần hóa học trong các nguồn lignocellulose [47]

Nguồn lignocellulose

Lignin (%)

Hemicellulose (%)

Cellulose (%)

35 - 40% trong rơm lúa mì và rơm rạ Cellulose gồm những đơn vị (1, 4) - D- glucopyranose gắn bởi liên kết β-1,4 - glycosidic, với trọng lượng phân tử trung bình

độ trùng hợp (DP), đại diện cho số lượng các nhóm glucose từ hàng trăm đến hàng ngàn hoặc thậm chí hàng chục ngàn) Cellulose gồm các đơn vị D - glucose lặp đi lặp lại (hình 1.3) và đơn vị lặp lại của cellulose được gọi là cellobiose

Hình 1.3 Cấu trúc chuỗi phân tử cellulose [146]

Cellobiose là disaccharide được hình thành bởi 2 phân tử β - D - glucose liên kết

với nhau bởi mối liên kết β -1,4 - glycosodic Cellobiose là đơn vị cấu trúc của các phân tử cellulose và cũng là sản phẩm chính trong quá trình thủy phân cellulose Tuy nhiên nồng

độ cellobiose cao có thể ức chế phản ứng thủy phân của cellulase [144]

Công thức hóa học: C 12 H 22 O 11

Tính chất của cellobiose

Tính chất vật lý

- Khối lượng phân tử: 342,3 g/mol

- Trạng thái: Cellobiose ở dạng kết tinh là bột màu trắng, không mùi, vị ngọt nhẹ

- Khối lượng riêng: 1,768 g/cm3 (20oC)

- Độ hòa tan trong nước: 12g/ 100ml

- Tan ít trong rượu, không tan trong ete, cloroform

Tính chất hóa học

- Tính khử: Khả năng nhường điện tử của nhóm –OH và –CO

- Tính oxy - hóa: Dưới tác nhân khử, nhóm CHO hay –CO bị khử thành polyalcol

- Phản ứng tạo liên kết glycosid: Nhóm –OH glycosid của đường đơn tham gia phản ứng với OH glycosid/alcol tạo este tương ứng

Sinh khối cellulose đã thu hút được sự chú ý trên toàn thế giới như là một nguồn tài nguyên có thể được chuyển đổi thành các sản phẩm có ích [102] Ngoài ra, sinh khối cellulose là nguồn nguyên liệu phong phú, giá thành rẻ, có khả năng tái tạo, dễ dàng có sẵn nguồn đường và có khả năng đáp ứng nhu cầu ngày càng lớn của thị trường về nguồn nguyên liệu sản xuất axit lactic [130] Vì vậy, cellulose đã được sử dụng như một nguồn nguyên liệu tiềm năng cho quá trình lên men axit lactic

1.2.1.2 Hemicellulose

Hemicellulose là polymer phổ biến thứ 2 (sau cellulose), chiếm từ 20 - 30% trong sinh khối lignocellulose, có trọng lượng phân tử trung bình < 30.000 Dalton Hemicellulose là một polymer dị thể có độ phân nhánh cao, ngắn, có thể tồn tại ở bốn loại cấu trúc là xylan, mannan, β-glucan với hỗn hợp các mối liên kết và xyloglucan Bốn nhóm này có sự thay đổi về cấu trúc trong từng loại chuỗi, được phân theo vị trí hay loại liên kết của glycosid trong mạng lưới phân tử Hemicellulose được thủy phân dễ dàng hơn so với cellulose vì tính chất phân nhánh và vô định hình của nó Các đường pentose và hexose trong hemicellulose tạo thành một cấu trúc hoạt động lỏng lẻo, rất ưa nước như một chất

Xylan là một heteropolymer được tạo thành bởi một chuỗi các nhóm xylose liên kết với nhau qua liên kết β-1,4-glycosidic và phân nhánh bởi các chuỗi carbohydrate ngắn Xylan chiếm phần lớn khối lượng trong hemicellulose Trong quá trình xử lý lignocellulose, xylan ít bị phá vỡ cấu trúc hơn nên điều này sẽ góp phần nâng cao hiệu quả thu hồi đường sau quá trình thủy phân Sau thủy phân xylan người ta thu được monomer là đường xylose [35]

Hình 1.4 Phân tử xylan và cơ chế thủy phân thành xylose [35]

Xylose được phân loại là một monosaccharide của nhóm aldopentose, có nghĩa là

nó có năm nguyên tử carbon và một nhóm formyl Xylose là đường chủ yếu của hemicellulose trong gỗ cứng và phế thải của nông nghiệp [111]

Công thức phân tử: C 5 H 10 O 5

Giống như hầu hết các loại đường, xylose có nhiều đồng phân cấu trúc khác nhau Với nhóm carbonyl tự do, xylose là một loại đường khử

- Trong tự nhiên thường có 2 dạng: Mạch vòng và mạch thẳng Đối với dạng mạch thẳng, người ta chia thành 2 dạng đồng phân: Đồng phân dạng D - xylose (nhóm OH của

carbon bất đối xứng ở phía bên phải) và đồng phân dạng L - xylose (nhóm OH của carbon bất đối xứng ở phía bên trái)

D - xylose L - xylose Xylose dạng mạch vòng

Hình 1.5 Các dạng của đường xylose [111]

Tính chất của xylose

Tính chất vật lý

- Khối lượng phân tử: 150,13 g/mol

- Trạng thái: Xylose ở dạng kết tinh là bột màu trắng, có vị ngọt

- Khối lượng riêng: 1,525 g/cm3 (20oC)

- Góc cực quay: 22,5o (CHCl3)

- Tan trong nước và cồn

Tính chất hóa học

- Tính khử: Khả năng nhường điện tử của nhóm –OH và –CO

- Tính oxy-hóa: Dưới tác nhân khử, nhóm CHO hay –CO bị khử thành polyalcol

- Phản ứng tạo liên kết Glycosid: Nhóm –OH glycosid của đường đơn tham gia phản ứng với OH glycosid/alcol tạo ester tương ứng

1.2.1.3 Lignin

Lignin là một trong các polymer hữu cơ có nguồn gốc sinh học phổ biến nhất trong

tự nhiên Lignin là hợp chất cao phân tử có cấu trúc mạng không gian và không có cấu tạo hóa học nhất định [111]

Lignin là một phức hợp gồm các đơn vị phenylpropan phức tạp tuyến tính và liên kết ngẫu nhiên; ba monomer chính là rượu p-coumaryl, rượu coniferyl và rượu sinapyl [131]

Hình 1.6 Các đơn vị cơ bản của lignin [131]

Lignin liên kết với hemicellulose bằng liên kết hóa trị nhưng không liên kết trực tiếp với cellulose Lignin có đặc tính polyphenol nên có tính kị nước và sát khuẩn, là thành phần gây cản trở quá trình thủy phân bằng enzyme Lignin không được vi sinh vật sử dụng như một cơ chất để lên men và ảnh hưởng đến quá trình thủy phân bằng enzyme của lignocellulose [111] Chính vì vậy, trong quá trình tiền xử lý sinh khối lignocellulose nên lựa chọn phương pháp hiệu quả nhất để loại bỏ lignin

1.2.2 Rơm rạ

Rơm rạ là một sản phẩm phụ của quá trình sản xuất lúa gạo và cũng là tài nguyên sinh học có tiềm năng nhất Rơm rạ là một trong những vật liệu lignocellulose phong phú trên thế giới Theo tính toán với các giống lúa đang canh tác hiện nay thì để thu được 1 tấn thóc sẽ thải ra 1 - 1,5 tấn rơm rạ [20] Năm 2014, theo số liệu thống kê của FAO, sản lượng thóc trên thế giới đạt khoảng 746 triệu tấn Do đó, lượng rơm rạ trên thế giới có thể lên tới 746 - 1119 triệu tấn Tại Việt Nam, theo số liệu của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn năm 2014, sản lượng thóc đạt khoảng 45 triệu tấn tương ứng với khoảng 45 - 67,5 triệu tấn rơm rạ

Như vậy, hàng năm lượng rơm rạ trên thế giới và ở Việt Nam là khá lớn Tuy nhiên, thực tế cho thấy không chỉ trên thế giới mà cả ở Việt Nam, phần lớn rơm rạ được thải bỏ khi còn tươi Phương thức phổ biến nhất để xử lý rơm rạ đó là đốt trực tiếp trên đồng ruộng, điều đó sẽ lãng phí tài nguyên, gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng và ảnh hưởng đến đời sống sinh hoạt của nhân dân [20]

Thành phần chính của rơm rạ chủ yếu chứa cellulose 32 - 47%, hemicellulose 27%, lignin 5-24% và chất tro 10-18% [20] Rơm rạ được tạo thành từ các carbohydrate phức tạp, phần carbohydrate chiếm khoảng 60% trọng lượng [127] Thành phần carbohydrate trong rơm rạ bao gồm: glucose 41-43,4%, xylose 14,8 - 20,2%, arabinose 2,7- 4,5%, mannose 1,8% và galactose 0,4% [70, 97] Tuy nhiên, các phương pháp tiền

19-xử lý khác nhau và đường hóa bằng enzyme khác nhau sẽ cho các hỗn hợp đường khác nhau về thành phần và tỉ lệ

Tóm lại, sử dụng rơm rạ làm nguyên liệu cho sản xuất axit lactic không những giải quyết được vấn đề tính bền vững lâu dài của nguồn nguyên liệu mà còn không có bất kì tác động nào tới chuỗi cung cấp thực phẩm cho con người Ngoài ra, còn giải quyết được vấn

đề về môi trường và xã hội

1.3 Lên men axit lactic từ rơm rạ

Sử dụng lignocellulose trong đó có rơm rạ để sản xuất axit lactic là một con đường đầy hứa hẹn Tuy nhiên, hiệu quả chuyển đổi lignocellulose thành axit lactic vẫn phải đối mặt những thách thức đáng kể Quá trình sinh hóa để biến đổi cấu trúc sinh khối thực vật thành các loại đường như: glucose, cellobiose, xylose, arabinose và mannose cần phải được thiết kế, tính toán kỹ lưỡng Những đường này có thể lên men thành axit lactic bởi chủng vi sinh vật tự nhiên hoặc tái tổ hợp [7] Quá trình chuyển hóa để sản xuất axit lactic

từ rơm rạ bao gồm 4 bước chính (Hình 1.7)

- Tiền xử lý: Mục đích của quá trình tiền xử lý là bẻ gãy các khối cấu trúc của thực vật thành những cấu trúc nhỏ hơn thuận lợi cho bước xử lý tiếp theo

- Thủy phân bằng enzyme: Mục đích của quá trình là cắt các cấu trúc polymer của thực vật thành những cấu trúc nhỏ hơn cho quá trình lên men như: glucose, cellobiose và xylose, đây là sản phẩm chính của quá trình thủy phân

- Lên men: Các loại đường glucose, cellobiose và xylose thu được từ quá trình thủy phân sẽ lên men để tạo thành axit lactic nhờ vi khuẩn lactic

- Thu hồi và tinh sạch sản phẩm: Quá trình thu hồi và tinh sạch axit lactic theo những phương pháp đã được ứng dụng và thương mại hóa

1.3.1 Quá trình tiền xử lý

Mục tiêu chính của tiền xử lý là để loại bỏ lignin, tách cellulose và hemicellulose thành những phần riêng biệt, tăng diện tích bề mặt tiếp xúc, làm tăng độ xốp của vật liệu

mà vẫn giữ được phần lớn carbohydrate cho quá trình thủy phân bằng enzyme [111]

Tiền xử lý rơm rạ bao gồm các quá trình tiền xử lý bằng các tác nhân khác nhau: Phương pháp vật lý (xay, nghiền), tiền xử lý bằng hóa chất (kiềm, axit loãng, chất oxi hóa

và các dung môi hữu cơ), tiền xử lý hóa lí (nổ hơi nước / thủy phân cao áp, nhiệt thủy phân

và oxy hóa ướt) và phương pháp sinh học (sử dụng nấm mục nâu, nấm mục trắng, vi nấm)….Tuy nhiên một số phương pháp tiền xử lý lại có nhược điểm: Phương pháp vật lí

và hóa lí (nghiền, nổ hơi,…) tiêu hao năng lượng cao, yêu cầu phải có thiết bị chuyên dụng

và năng suất thấp; phương pháp sinh học hạn chế ở điểm thời gian kéo dài và khó thực hiện ở qui mô công nghiệp, ngoài ra một số phương pháp tiên tiến như tiền xử lý bằng chất lỏng ion, nước siêu tới hạn,… thì không có tính khả thi Những phương pháp thường gặp nhất là các qui trình tiền xử lý kết hợp hai hay nhiều tác nhân với nhau như vật lí - hóa học, vật lí - sinh học,… nhưng hiệu quả còn chưa được cao [100] Tiền xử lý bằng phương pháp hóa học đã được chứng minh là phương pháp hiệu quả cho việc tách các chất vô cơ, lignin, các chất trích ly có trong rơm rạ và cải thiện bề mặt của rơm rạ, góp phần thúc đẩy quá trình thủy phân bằng enzyme [46]

Hình 1.7 Sơ đồ sản xuất axit lactic từ rơm rạ [7]

Lignocellulose (Rơm rạ)

Axit lactic

1.3.1.1 Tiền xử lý rơm rạ bằng axit hữu cơ

Tác nhân dùng để tách loại lignin trong quá trình tiền xử lý rơm rạ bằng axit hữu cơ

loãng (axit axetic, axit focmic) Tuy nhiên, khi sử dụng axit loãng thì các loại đường của hemicellulose có thể tiếp tục suy thoái đến furfural và hydroxymethyl furfural, là những chất ức chế mạnh tới quá trình lên men bởi vi sinh vật Tiền xử lý bằng axit đặc có nhược điểm ăn mòn thiết bị và chi phí cao nếu như không tái sử dụng được axit [111]

1.3.1.2 Tiền xử lý rơm rạ bằng kiềm

Tiền xử lý sinh khối lignocellulose bằng kiềm dựa trên tác động của một số bazơ lên vật liệu Phương pháp này làm tăng khả năng thủy phân của cellulose và tách loại lignin Cellulose và hemicellulose bị hao hụt ít hơn so với phương pháp tiền xử lý axit Phương pháp này sẽ có hiệu quả cao khi xử lý chế phẩm nông nghiệp [61] Các tác nhân kiềm thường sử dụng trong phương pháp kiềm là các hydroxit của natri, kali, canxi và amoni

Parameswaran B và cộng sự đã nghiên cứu tiền xử lý rơm rạ bằng NaOH ở các

phân bằng enzyme Hàm lượng đường thu được là 24,6% so với rơm rạ khô ban đầu Tuy nhiên do nồng độ kiềm cao, quá trình tiền xử lý diễn ra ở nhiệt độ trung bình trong điều kiện dư hóa chất dẫn đến sự phân hủy cellulose và làm giảm lượng đường thu được [89]

Nutawan Y và cộng sự nghiên cứu tiền xử lý rơm rạ bằng NaOH và tìm ra được điều kiện thích hợp để thu được lượng đường glucose cao nhất đạt hiệu suất 25,45% so với

C; thời gian 56,7 phút [81]

Nguyen T.M.P và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu quá trình tiền xử lý rơm rạ bằng NaOH theo phương pháp nấu kín và đưa ra kết quả tối ưu của quá trình là: Mức dùng

48,7% so với rơm rạ khô ban đầu [79]

1.3.2 Quá trình thủy phân

Quá trình thủy phân là một bước quan trọng để nâng cao hiệu suất thu hồi đường lên men từ lignocellulose sau quá trình tiền xử lý, đồng thời nó cũng là điều kiện cần thiết cho vi khuẩn lactic sử dụng các loại đường lên men như là nguồn carbon [66, 113, 138]

Có 2 loại enzyme cần thiết để chuyển đổi cellulose và hemicellulose thành các loại đường hòa tan: cellulase và hemicellulase [56, 121, 141]

Cellulose được thủy phân bởi hỗn hợp 3 enzyme [80, 85, 91, 120]

- Endoglucanase (EGS) thủy phân liên kết β - 1,4 glucoside của cellulose tinh thể ở

vị trí bất kì để tạo ra các đầu không khử và giải phóng ra cellodextrin, cellobiose và glucose tạo điều kiện thuận lợi cho enzyme cellobiohydrolase hoạt động

- Cellobiohydrolase (CBHs) cắt chuỗi cellulose từ đầu không khử, giải phóng ra chủ yếu cellobiose

- β - 1,4 glucosidase thủy phân cellobiose và các cello - oligosaccharide thành glucose và enzyme này bị kìm hãm bởi chính glucose (sản phẩm thủy phân của nó) Do đó, dịch thủy phân cellulose luôn bao gồm 2 sản phẩm: glucose và cellobiose

Như vậy, để tăng hiệu quả kinh tế và tính khả thi của quá trình lên men lactic từ sinh khối cellulose đòi hỏi phải có chủng vi sinh vật có khả năng sử dụng đường cellobiose

có trong dịch thủy phân cellulose [5] Vì vậy, phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng lên men axit lactic từ đường cellobiose là hướng đi tích cực

Hình 1.8 Cơ chế thủy phân của cellulose [85]

Không giống như cellulose, hemicellulose có bản chất hóa học khá phức tạp và quá trình thủy phân của nó đòi hỏi nhiều enzyme Trong tự nhiên, hemicellulose thường ở dạng xylan Enzyme thủy phân hemicellulose bao gồm: endo-1,4-xylanase, β-xylosidase, β-glucuronidase, α-l-arabinofuranosidase và acetylxylan esterase, chúng tác động lên quá

Hình 1.9 Cơ chế thủy phân của xylan [110]

Hiệu quả quá trình thủy phân lignocellulose của một hỗn hợp enzyme phụ thuộc vào tính chất của mỗi enzyme và tỉ lệ của chúng trong hỗn hợp enzyme [48, 54]

Nguyen T.M.P và cộng sự tối ưu hóa quá trình thủy phân rơm rạ sau tiền xử lý bằng quy hoạch thực nghiệm Box - Behnken, sử dụng phần mềm Design Expert 7.0 và đưa

ra kết luận: Nồng độ cơ chất 10,7%; mức sử dụng enzyme 15,6U/g (hỗn hợp enzyme thương phẩm Cellic® Ctec2 và Cellic®Htec2 với tỉ lệ tương ứng 4:1 về thể tích); thời gian thủy phân 94,2h thì thu được 107,86 g/l đường trong đó có 49,42% glucose, 29,41% cellobiose, 17,87% xylose, 0,32% galactose và 2,97% arabinose [79]

1.3.3 Quá trình lên men sản xuất axit lactic từ xylose, cellobiose và dịch thủy phân rơm rạ bằng vi khuẩn lactic

Quá trình lên men được mô tả bởi sự phân giải của cơ chất (glucose, xylose, cellobiose,…) do vi sinh vật thành các chất như axit lactic, ethanol, axit axetic,… Axit lactic được sản xuất từ các loại đường monosaccharide hoặc disaccharide qua con đường đường phân EMP Trong điều kiện yếm khí, axit pyruvic sẽ tạo thành axit lactic bởi các enzyme lactate dehydrogenase [74]

Thủy phân và lên men riêng biệt (SHF) là một quá trình trong đó giai đoạn thủy phân bằng enzyme sẽ tách riêng với giai đoạn lên men Ưu điểm của SHF là mỗi giai đoạn đều thực hiện được trong điều kiện tối ưu Tuy nhiên, nhược điểm chính của phương pháp

của các enzyme trong quá trình thủy phân [52, 92]

Lên men sản xuất axit lactic từ đường xylose, cellobiose và dịch thủy phân rơm rạ phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: Chủng vi sinh vật, nguồn cơ chất và điều kiện lên men (chế độ lên men, pH, nhiệt độ, tỉ lệ cấp giống,…)[43]

1.3.3.1 Nguồn cơ chất

Theo Smerilli và cộng sự, đến năm 2020, nhu cầu axit lactic toàn cầu ước tính

ở quy mô công nghiệp đó là: Giá thành của cơ chất (nguồn carbon) và chi phí vận hành, đặc biệt là đối với thiết bị khử trùng, tiêu thụ năng lượng, chi phí nhân công [37]

Trong những năm gần đây, có nhiều nghiên cứu tập trung tìm ra các nguồn nguyên liệu để hạn chế những nhược điểm của nguyên liệu hóa thạch cũng như nguyên liệu truyền thống cho ngành sản xuất axit lactic [7] Lignocellulose là nguồn sinh khối phong phú nhất trên trái đất với các ưu điểm có sẵn với số lượng lớn và chi phí thấp, có tiềm năng thay thế nguồn tài nguyên hóa thạch và truyền thống Ngoài ra, lignocellulose có hàm lượng

polysaccharide cao (hemicellulose: 23 -32%; cellulose 38 -50%) [129] Dưới tác dụng của

hệ enzyme hemicellulase và cellulase, dịch thủy phân của lignocellulose ngoài đường glucose sẽ thu nhận được thêm 2 loại đường chiếm tỉ lệ khá lớn đó là đường xylose và cellobiose [7]

Trong số các nguồn sinh khối lignocellulose đa dạng thì rơm rạ là nguồn sinh khối chiếm số lượng khá lớn Hiện nay, nghiên cứu lên men sản xuất axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ mới chỉ tập trung vào khai thác nguồn đường glucose mà chưa sử dụng triệt để

2 nguồn đường xylose và cellobiose do đó mà hiệu suất lên men thấp và lãng phí 2 nguồn đường xylose, cellobiose Như vậy, để tăng giá trị kinh tế của rơm rạ, hạn chế ảnh hưởng của rơm rạ đến môi trường và tăng hiệu quả cho quá trình sản xuất axit lactic thì hỗn hợp đường trong dịch thủy phân rơm rạ cần phải được sử dụng triệt để

a Cơ chế quá trình lên men axit lactic từ đường xylose

Cũng giống như lên men axit lactic từ đường glucose, lên men axit lactic từ đường xylose cũng có 2 con đường là lên men đồng hình và lên men dị hình Enzyme chìa khóa cho lên men axit lactic từ xylose là enzyme xylose isomerase và xylulokinase [112]

- Cơ chế lên men axit lactic đồng hình từ xylose (con đường pentozaphotphat (PP))

Theo con đường chuyển hóa này, ribose 5 photphat được hình thành thông qua enzyme transketolase và thông qua một loạt các phản ứng với sự tham gia của các enzyme transketolase và transaldolase để tạo ra fructose - 6P Đến giai đoạn này, quá trình chuyển hóa tiếp theo giống như chuyển hóa glucose và sản phẩm cuối cùng tạo ra axit lactic

Con đường PP sản xuất ra 5 mol của axit lactic từ 3 mol của xylose mà không mất carbon, do đó cung cấp một năng suất axit lactic lý thuyết của xylose là 1,0 g/g hoặc 1,67 mol/mol [86, 112]

3Xylose + 2Pi + 2ADP 5 Lactic + 2ATP

- Cơ chế lên men axit lactic dị hình từ đường xylose (con đường phosphoketolase (PK))

Trong con đường PK, xylose ban đầu được chuyển đổi sang xylulose 5-phosphate (5 carbon) và carbon dioxide (1 carbon) được xúc tác bởi một số enzyme, kết quả xylulose 5-phosphate được phân tách thành 1 mol của glyceraldehyde 3-phosphate (GAP) và acetyl phosphate (acetyl-P) Sau đó GAP được chuyển thành axit pyruvic và tiếp theo thành axit lactic (3 carbon) là một sản phẩm cuối cùng, trong khi acetyl-P được chuyển hóa tổng hợp axit acetic hoặc ethanol (cả 2 nguyên tử carbon) Do đó, năng suất chuyển hóa lý thuyết các đường xylose thành axit lactic là 0,6 g/g hoặc 1,0 mol/mol theo con đường PK [90]

Xylose + 2 ADP + 2 Pi Lactic + Acetic + 2 ATP + 2 H2O

Hình 1 10 Cơ chế lên men axit lactic từ đường xylose [8]

Các enzyme: (1) Xylose isomerase; (2) Xylulokinase; (3) Transketolase; (4) Transaldolase; (5) 6-phosphofructokinase; (6) Triosephosphate isomerase; (7) Fructose -bisphosphate aldolase; (8) Lactate dehydrogenase; (9) Phosphoketolase; (10) Acetat kinase (11) Phosphotransacetylase; (12) Aldehyde dehydrogenase; (13) Alcohol dehydrogenase

b Cơ chế quá trình lên men axit lactic từ đường cellobiose

Hình 1 11 Cơ chế lên men axit lactic từ đường cellobiose [8]

Các enzyme: (1) Hexokinase; (2) phosphate isomerase; (3) phosphatedehydrogenase; (4) 6-phosphogluconate dehydrogenase; (5) Ribolose-5-phosphate; (6) Phosphoketolase; (7) Acetate kinase; (8) Phosphotransacetylase; (9) Aldehyde dehydrogenase; (10) Alcohol dehydrogenase; (11) Lactate dehydrogenase; (12)

transketolase; (13) Transaldolase; (14) 6-phosphofructokinase; (15) Fructose - bisphosphate aldolase; (16) Triosephosphate isomerase

- Cơ chế lên men axit lactic đồng hình từ cellobiose

Dưới tác dụng của enzyme β - glucosidase, cellobiose chuyển hóa thành glucose Sau đó quá trình lên men đồng hình cellobiose tương tự như quá trình lên men đồng hình của glucose Con đường này thường gọi là con đường pentose phosphate (PP) Các enzyme tham gia chuyển hóa glucose thành axit lactic chính là glucose-6P isomerase (EC 5.3.1.9), 6-phosphofructokinase (EC 2.7.1.11) và fructose - bisphosphate aldolase (EC.4.2.1.13)

Quá trình chuyển hóa diễn ra theo 2 hướng

+ Cellobiose dưới tác dụng của enzyme β - glucosidase và hexokinase sẽ chuyển hóa thành glucose 6-P Sau đó dưới tác dụng của enzyme glucose-6-phosphate isomerase

sẽ tạo thành fructose 6-P và enzyme 6-phosphofructokinase để tạo thành fructose 1,6-P Sau đó dưới tác dụng của enzyme fructose - bisphosphate aldolase, triosephosphate isomerase và lactate dehydrogenase để tạo ra axit lactic

+ Qua 1 chuỗi các phản ứng sinh hóa, kết quả là từ xylulose 5-P tạo thành 1 phân tử glycealdehyde 3-P (GAP) Sau đó, mỗi phân tử GAP lại tạo thành 1 phân tử piruvate bằng các con đường chuyển hóa khác nhau Cuối cùng 1 phân tử piruvat sẽ tạo thành 2 phân tử axit lactic là sản phẩm cuối cùng của quá trình lên men

Sản phẩm của lên men đồng hình từ đường cellobiose chủ yếu là axit lactic (chiếm

- Cơ chế lên men axit lactic dị hình từ cellobiose

Không có sự tham gia của các loại enzyme transketolase mà thay vào đó là enzyme phosphoketolase, do đó con đường chuyển hóa này có tên là phosphoketolase, ngoài ra còn

có sự tham gia của 1 số loại enzyme khác

Sản phẩm của quá trình này là GAP và acetyl - P Từ GAP tạo thành 1 phân tử piruvate rồi thành 1 phân tử axit lactic

Từ acetyl - P, nếu nhường 1P cho phân tử ADP trong quá trình tạo thành 1 phân tử cao năng ATP sản phẩm sẽ tạo thành là axit acetic Nếu có sự tham gia của CoA thì sản phẩm sẽ là ethanol

Sản phẩm của lên men dị hình đường cellobiose ngoài axit lactic còn có axit axetic, ethanol,…

1.3.3.2 Chủng giống vi sinh vật

Axit lactic có thể được sản xuất từ các nguồn nguyên liệu có khả năng tái tạo bởi các loài vi sinh vật (VSV) khác nhau bao gồm vi khuẩn, nấm mốc, nấm men, vi tảo và vi khuẩn lam Lựa chọn các chủng VSV là rất quan trọng, đặc biệt ảnh hưởng đến độ tinh khiết quang học của axit lactic và hiệu suất sản xuất axit lactic [8] Ngoài ra, sử dụng tổ hợp các chủng VSV trong quá trình lên men lactic có thể tạo ra sự kết hợp của các con đường trao đổi chất và do đó nâng cao hiệu quả sản xuất axit lactic [30, 60, 76, 114]

Vi khuẩn sản xuất axit lactic bao gồm các chủng tự nhiên và chủng đột biến Những sinh vật này có thể được chia thành 4 nhóm chính: Vi khuẩn lactic (LAB), các chủng của

chi Bacillus, loài Escherichia coli và Corynebacterium glutamicum [8] Tuy nhiên, trong

quá trình lên men ở qui mô công nghiệp, việc sử dụng các loài khác nhau của chi

Lactobacillus được lựa chọn nhiều hơn vì khả năng chuyển hóa, năng suất và tốc độ trao

đổi chất cao hơn các chi khác [71]

a Vi khuẩn lactic (LAB)

Vi khuẩn lactic là những vi khuẩn thường Gram dương, không di động, không tạo thành bào tử và không có hình thái cố định (bao gồm hình que và hình cầu) nhưng về mặt sinh lí chúng tương đối đồng nhất, bao gồm 20 chi trong đó có những chi chính như

Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Oenococcus, Tetragenococcus, Vagococcus, Weisella và Streptococcus Trong đó, Lactobacillus là chi lớn nhất bao gồm 80 loài

Vi khuẩn lactic thu nhận năng lượng nhờ phân giải carbohydrat và sinh ra axit lactic Vi khuẩn lactic không chứa xitocrom và enzyme catalase, chúng là các vi khuẩn sống từ kị khí đến vi hiếu khí [132]

Vi khuẩn lactic có nhu cầu về các chất dinh dưỡng rất phức tạp bởi vì chúng không

có nhiều khả năng tự sinh tổng hợp nên các chất dinh dưỡng Nhu cầu về dinh dưỡng của

vi khuẩn lactic khác nhau là khác nhau, đặc biệt là nhu cầu về vitamin và nitơ Vi khuẩn lactic thường có ở trong sữa và các sản phẩm từ sữa, trên bề mặt của xác thực vật đang

phân giải, trong ruột và ở vài lớp màng nhầy của người và động vật Lactobacillus, Leuconostoc có nhiều trong thực vật thối rữa như rau bị hỏng hoặc phân động vật,…[140]

LAB có điều kiện phát triển trong phạm vi pH 3,5-10,0 và nhiệt độ 5- 45°C [8] Theo mô hình lên men và sản phẩm cuối cùng của quá trình lên men, vi khuẩn lactic chia thành 2 loại: Vi khuẩn lên men đồng hình và vi khuẩn lên men dị hình [116] Vi khuẩn lên men đồng hình tạo ra sản phẩm cuối cùng là axit lactic chiếm hơn 85%, trong khi đó vi khuẩn lên men dị hình ngoài axit lactic chiếm khoảng 40%, còn tạo ra axit axetic, ethanol,