Nghiên cứu thu nhận n acetylglucosamine (NAG) bằng chitinase từ penicillium oxalicum 20b định hướng ứng dụng trong sản xuất thực phẩm chức năng

Cơ chế thủy phân chitin bởi chitinase thành NAG Endochitinase phân cắt ngẫu nhiên trong nội mạch chitin và chitooligomer, sản phẩm tạo thành là hỗn hợp các chitooligomer trọng lượng phâ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

ĐẶNG THỊ HƯỜNG

NGHIÊN CỨU THU NHẬN N-ACETYLGLUCOSAMINE (NAG)

BẰNG CHITINASE TỪ PENICILLIUM OXALICUM 20B

ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT

THỰC PHẨM CHỨC NĂNG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ THỰC PHÂM

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận án là trung thực và chƣa từng đƣợc các tác giả khác công bố

Hà Nội, ngày … tháng … năm 2017

Đặng Thị Hường

ii

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới PGS TS Lê Thanh

Hà và PGS TS Phạm Thu Thủy - Bộ môn Công nghệ sinh học - Viện Công nghệ sinh học

và Công nghệ thực phẩm - Trường Đại học Bách khoa Hà Nội đã tận tình hướng dẫn, dìu dắt tôi trong suốt quá trình nghiên cứu Tôi cũng xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành

và sâu sắc tới các thầy, cô giáo trong Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm - Trường Đại học Bách khoa Hà Nội đã tận tình giảng dạy, hướng dẫn tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu vừa qua

Bên cạnh đó, tôi xin chân thành cám ơn PGS TS Nguyễn Tiến Thành - Trường phòng Thu Hồi Sản phẩm, va các cán bộ nghiên cứu ở Trung tâm Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học đã tận tình giúp đỡ, dạy bảo và động viên tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu khoa học

Cuối cùng, tôi xin cám ơn Ban giám hiệu Trường Cao đẳng Cộng đồng Hà tây cùng gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã động viên, khích lệ và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi học tập và nghiên cứu

Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày … tháng … năm 2017

Nghiên cứu sinh

Đặng Thị Hường

iii

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT vii

DANH MỤC CÁC BẢNG viii

DANH MỤC CÁC HÌNH x

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 N- ACETYLGLUCOSAMINE 3

1.1.1 Các đặc tính của N- acetylglucosamine 3

1.1.2 Thực phẩm chức năng 3

1.1.3 Vai trò N- acetylglucosamine trong sản xuất thực phẩm chức năng 4

1.1.4 Các phương pháp sản xuất N- acetylglucosamine 6

1.1.4.1 Phương pháp hóa học 6

1.1.4.2 Phương pháp chuyển hóa sinh học 6

1.1.4.3 Phương pháp enzym 7

1.2 CHITIN 8

1.2.1 Cấu tạo hóa học và tính chất lý hóa của chitin 8

1.2.2 Nguồn thu nhận chitin 10

1.3 CHITINASE 11

1.3.1 Hệ chitinase 11

1.3.2 Đặc tính sinh hóa 11

1.3.3 Cơ chế thủy phân chitin bởi chitinase thành NAG 13

1.3.4 Một số giải pháp kỹ thuật thủy phân chitin thu nhận NAG 15

1.3.4.1 Các giải pháp tiền xử lý chitin 15

1.3.4.2 Điều kiện thủy phân chitin ra NAG bởi chế phẩm chitinase 17

1.4 SINH TỔNG HỢP CHITINASE TỪ VI SINH VẬT 20

1.4.1 Nguồn vi sinh vật sinh tổng hợp chitinase 20

1.4.2 Ảnh hưởng của nguồn cacbon tới sinh tổng hợp chitinase 21

1.4.3 Ảnh hưởng của nguồn và nồng độ nitơ tới sinh tổng hợp chitinase 22

1.4.4 Ảnh hưởng của nguyên tố khoáng tới sinh tổng hợp chitinase 23

1.4.5 Ảnh hưởng của pH tới sinh tổng hợp chitinase 24

1.4.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới sinh tổng hợp chitinase 25

1.4.7 Ảnh hưởng của thời gian tới sinh tổng hợp chitinase 25

1.4.8 Ảnh hưởng của tốc độ lắc và cường độ khuấy tới sinh tổng hợp chitinase 26

1.5 PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN CHITINASE TỪ VI SINH VẬT 27

iv

1.5.1 Phân tách tạp chất rắn thu dịch chiết enzym 27

1.5.2 Cô đặc dịch chiết enzym 28

1.6 CÁC PHƯƠNG PHÁP TINH SẠCH NAG TỪ DỊCH THỦY PHÂN CHITIN 28

1.6.1 Ly tâm, siêu lọc loại tạp chất 28

1.6.2 Cô đặc……… 28

1.6.3 Kết tinh 29

1.6.4 Tinh sạch NAG bằng dung môi 30

1.6.5 Qui trình tinh sạch để thu nhận NAG 30

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 32

2.1.1 Nguyên vật liệu 32

2.1.2 Chủng vi sinh vật 32

2.1.3 Hóa chất 33

2.1.4 Thiết bị… 33

2.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 33

2.2.1 Phương pháp xác định sinh khối nấm mốc 33

2.2.2 Phương pháp phân tích hóa lý 33

2.2.2.1 Phương pháp xác định độ ẩm 33

2.2.2.2 Phương pháp định lượng (NAG)i 34

2.2.2.3 Phương pháp xác định Nitơ tổng số của mẫu chitin 35

2.2.2.4 Phương pháp xác định hàm lượng protein của mẫu chitin 35

2.2.2.5 Cách tính hàm lượng chitin 35

2.2.3 Phương pháp xác định hoạt độ enzym 36

2.2.3.1 Hoạt độ chitinase được xác định theo phương pháp Binod cải tiến 36

2.2.3.2 Hoạt độ endochitinase được xác định theo phương pháp Yabuki cải tiến 36

2.2.3.3 Hoạt độ -N-acetyl-D-hexosaminidase 36

2.2.3.4 Hoạt độ chitobiosidase 37

2.2.4 Phương pháp xác định cấu trúc bề mặt của chitin, NAG 37

2.2.5 Phương pháp xác định đặc tính vật lý của chitin, NAG 37

2.2.6 Phương pháp xác định cấu trúc của chitin, NAG 38

2.2.7 Phương pháp xác định sai số trung bình 38

2.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38

2.3.1 Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng sinh tổng hợp chitinase 38

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu thu nhận chế phẩm chitinase kỹ thuật 38

2.3.3 Khảo sát đặc tính cơ bản của chế phẩm chitinase kỹ thuật 39

2.3.4 Xác định điều kiện bảo quản chế phẩm chitinase kỹ thuật 40

2.3.5 Phương pháp nghiên cứu thủy phân chitin 40

v

2.3.5.1 Phương pháp tiền xử lý chitin 40

2.3.5.2 Phương pháp nghiên cứu điều kiện phản ứng thủy phân chitin 43

2.3.6 Phương pháp nghiên cứu thu nhận N-Acetylglucosamine tinh sạch 43

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 47

3.1 NGHIÊN CỨU SINH TỔNG HỢP CHITINASE TỪ P OXALICUM 20B 47

3.1.1 Ảnh hưởng của môi trường lên men 47

3.1.1.1 Ảnh hưởng của dạng chitin tới sinh tổng hợp chitinase 47

3.1.1.2 Ảnh hưởng nồng độ chất cảm ứng chitin tới sinh tổng hợp chitinase 47

3.1.1.3 Ảnh hường của nguồn nitơ tới sinh tổng hợp chitinase 49

3.1.1.4 Ảnh hưởng của hàm lượng cao nấm men tới sinh tổng hợp chitinase 50

3.1.2 Ảnh hưởng điều kiện lên men 50

3.1.2.1 Ảnh hưởng của pH môi trường lên men tới sinh tổng hợp chitinase 50

3.1.2.2 Ảnh hưởng của tốc độ lắc tới sinh tổng hợp chitinase 51

3.1.3 Nghiên cứu động thái sinh trưởng phát triển và sinh tổng hợp chitinase 52

3.2 NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH CHẾ PHẨM CHITINASE KỸ THUẬT……… 55

3.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng mức độ cô đặc tới hiệu suất thu hồi 55

3.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng tỷ lệ NAHase/Endochitinase tới khả năng tạo NAG 56

3.2.3 Lựa chọn điều kiện bảo quản chế phẩm chitinase kỹ thuật 58

3.2.4 Xác định đặc tính sinh học của chế phẩm chitinase kỹ thuật 59

3.2.4.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt tính enzym 59

3.2.4.2 Ảnh hưởng của pH tới hoạt tính enzym 61

3.3 ỨNG DỤNG CHẾ PHẨM CHITINASE KỸ THUẬT THỦY PHÂN CHITIN 63

3.3.1 Khảo sát lựa chọn chitin phế liệu thủy sản 63

3.3.2 Lựa chọn phương pháp tiền xử lý chitin tôm mũ ni 64

3.3.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng mức độ nghiền đến khả năng thủy phân chitin 64

3.3.2.2 Ảnh hưởng xử lý phối hợp nghiền bi và siêu âm tới khả năng thủy phân chitin 65

2.3.2.3 Ảnh hưởng các giải pháp xử lý chitin tới cơ cấu sản phẩm nhận được sau thủy phân 67

3.3.2.4 Ảnh hưởng của tác động nhiệt độ cao và áp suất 70

3.3.2.5 Ảnh hưởng của tác động xử lý hóa học và vật lý 71

3.3.2.6 Ảnh hưởng của trạng thái chitin tới quá trình thủy phân ra NAG 75

3.3.3 Nghiên cứu điều kiện thủy phân chitin 77

3.3.3.1 Ảnh hưởng nhiệt độ 77

3.3.3.2 Ảnh hưởng pH 78

3.3.3.3 Ảnh hưởng nồng độ gel chitin 78

3.3.3.4 Ảnh hưởng nồng độ enzym 79

3.4 NGHIÊN CỨU THU NHẬN CHẾ PHẨM NAG 82

3.4.1 Ảnh hưởng mức độ cô đặc dịch sau thủy phân tới quá trình kết tinh lần 1 82

3.4.2 Ảnh hưởng tỷ lệ EtOH/ dịch thủy phân cô đặc tới quá trình kết tủa cồn 83 3.4.3 Ảnh hưởng mức độ cô đặc và tỷ lệ EtOH/ dịch thủy phân cô đặc tới hiệu suất thu hồi

vi

và độ tinh sạch chế phẩm NAG 84

3.4.4 Đề xuất và ứng dụng qui trình thu nhận NAG 87

3.4.4.1 Đề xuất qui trình thu nhận NAG 87

3.4.4.2 Ứng dụng qui trình thu nhận NAG với qui mô 5 lit dịch thủy phân 87

3.5 XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH CHẾ PHẨM NAG 91

3.5.1 Xác định vi sinh vật 91

3.5.2 Xác định kim loại nặng 91

3.5.3 Xác định liều độc LD50 91

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 93

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN 94

TÀI LIỆU THAM KHẢO 95

PHỤ LỤC 107

Phụ lục 1 Mẫu nguyên liệu chitin 107

Phụ lục 2 Thành phần môi trường tuyển chọn và nuôi cấy P oxalicum 20B 107

Phụ lục 3 Đồ thị đường chuẩn NAG bằng phương pháp DNS 108

Phụ lục 4 Đồ thị đường chuẩn BSA để xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Lowry………… 108

Phụ lục 5 Đồ thị đường chuẩn p-nitrophenyl N-axetyl-β-D glucosaminidase (pNP-NAG) 108 Phụ lục 6 Đặc tính các phân đoạn enzym sau cô đặc 2, 3, 4 lần 109

Phụ lục 7 Ảnh hưởng của mức độ cô đặc dịch thủy phân đến HSTH NAG 109

Phụ lục 8 Thủy phân gel chitin 40% ra dịch NAG với Bx = 2,2% 110

Phụ lục 9 Ảnh hưởng tỷ lệ EtOH/Dịch thủy phân cô đặc (Bx = 29,3%, V= 4,8 ml) tới NAG thất thoát vào kết tủa bởi EtOH 111

Phụ lục 10 Ảnh hưởng tỷ lệ EtOH/Dịch thủy phân cô đặc (Bx = 29,3%, V= 4,8 ml) tới HSTH NAG và Độ tinh sạch NAG 112

Phụ lục 11 Ảnh hưởng tỷ lệ EtOH/Dịch thủy phân cô đặc (Bx = 29,3%, V= 4,8 ml) tới NAG thất thoát vào dịch không kết tich 112

Phụ lục 12 Kết quả phân tích chỉ tiêu E coli, Salmonella và Pb, Hg, Cd 112

Phụ lục 13 Kết quả xác định LD50 112

Phụ lục 14 Kết quả phân tích hàm lượng NAG bằng HPLC 112

5 DSC Phân tích nhiệt vi sai

6 DNS Acid dinitro salicylic

12 HSTH Hiệu suất thu hồi

13 HSTP Hiệu suất thủy phân

14 HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid

viii

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Ứng dụng và lợi ích của NAG 6

Bảng 2.1 Thành phần hóa học nguyên liệu chitin (% chất khô) 32

Bảng 2.2 Sử dụng chất phụ gia bảo quản chế phẩm chitinase kỹ thuật ở 4oC 40

Bảng 2.3 Xử lý nhiệt, áp suất lên nguyên liệu chitin 40

Bảng 2.4 Các phân đoạn kích thước nguyên liệu chitin 41

Bảng 3.1 Động thái sinh tổng hợp chitinase, endochitinase, NAHase

của Penicillium oxalicum 20B 53

Bảng 3.2 Ảnh hưởng mức độ cô đặc tới hoạt độ chitinase và tỷ lệ chitinase, tỷ lệ NAHase và endochitinase trong các phân đoạn 56

Bảng 3.3 Ảnh hưởng mức độ cô đặc tới hiệu suất thu nhận chitinase, NAHase và

endochitinase trong các phân đoạn 56

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của mức độ cô đặc tới cơ cấu enzym chitinase và khả năng thủy phân chitin……… 58

Bảng 3.5 Hàm lượng chitin của các loại nguyên liệu 63

Bảng 3.6 Ảnh hưởng mức độ nghiền bi tới tính chất các phân đoạn bột nghiền 64

Bảng 3.7 Hàm lượng (NAG)i (với i từ 1 – 3) trong dịch thủy phân chitin tôm mũ ni (được tiền xử lý bằng các phương pháp khác nhau) bởi chế phẩm enzym kỹ thuật trong thời gian 120 h……… 67

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của nhiệt độ, áp suất xử lý chitin tôm mũ ni kích thước 600 µm < MN < 2 mm tới hiệu suất thủy phân (%) 70

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của vi sóng xử lý chitin tôm mũ ni kích thước 600 µm < MN < 2 mm tới hiệu suất thủy phân (%) 70

Bảng 3.10 Ảnh hưởng của nhiệt độ 1500 C kết hợp với áp suất 2 psi; SA gián đoạn 3 lần (mỗi lần 20 phút) có mặt enzym lên chitin tôm mũ ni kích thước 425 µm <MN< 600 µm

tới hiệu suất thủy phân (%) 71

Bảng 3.11 Ảnh hưởng của các phương pháp xử lý hóa học và vật lý lên chitin tôm mũ ni thô tới hiệu suất thủy phân (%) 72

Bảng 3.12 Ảnh hưởng của các phương pháp xử lý hóa học và vật lý lên chitin tôm mũ ni kích thước 425 µm <MN< 600 µm tới hiệu suất thủy phân (%) 73

Bảng 3.13 Ảnh hưởng xử lý vật lý lên gel chitin tới hiệu suất thủy phân (%) 74

Bảng 3.14 Ảnh hưởng xử lý hóa chất lên gel chitin tới hiệu suất thủy phân (%) 74

Bảng 3.15 Ảnh hưởng hóa chất lên gel chitin (qua rửa) tới hiệu suất thủy phân (%) 74

Bảng 3.16 Khảo sát NAG tạo thành khi thủy phân gel chitin MN và bột chitin MN < 63 μm……… 75

Bảng 3.17 Ảnh hưởng tỷ lệ giữa nồng độ enzym so với nồng độ chitin lên hiệu suất thủy phân ra NAG sau 48h thủy phân (khi dịch enzym/dịch chitin là 1/1 (v/v)) 81

ix

Bảng 3.18 Hiệu suất thu hồi NAG sau lọc dòng ngang 82

Bảng 3.19 Ảnh hưởng mức độ cô đặc tới hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch chế phẩm NAG 84 Bảng 3.20 Ảnh hưởng của tỷ lệ EtOH/ Dịch thủy phân cô đặc tới

HSTH và độ tinh sạch chế phẩm NAG 87

Bảng 3.21 Kết quả tinh sạch chế phẩm NAG 89

Bảng 3.22 Qui mô thí nghiệm ảnh hưởng tới HSTH và độ tinh sach chế phẩm NAG 89

Bảng 3.23 Đặc điểm của sản phẩm NAG 92

x

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Công thức cấu tạo NAG 3

Hình 1.2 Sản xuất NAG bằng chuyển hóa sinh học 7

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của chitin, chitosan, cellulose 9

Hình 1.4 Liên kết hydro nội phân tử chitin 9

Hình 1.5 Dạng cấu hình α, β, γ- chitin 10

Hình 1.6 Minh họa cơ chế hoạt động của chitinase 14

Hình 2.1 Khuẩn lạc chủng 20B trên môi trường MS-chitosan (A), ảnh bào tử (B) và cuống sinh bào tử trần (C) 32

Hình 2.2 Quy trình thu nhận N-Acetylglucosamine 44

Hình 3.1 Ảnh hưởng dạng chitin tới hoạt tính chitinase tại các thời điểm lên men 47

Hình 3.2 Ảnh hưởng nồng độ chitin thô tới hoạt tính chitinase tại các thời điểm lên men 48

Hình 3.3 Ảnh hưởng của các nguồn nitơ tới hoạt tính chitinase tại các thời điểm lên men 49

Hình 3.4 Ảnh hưởng nồng độ cao nấm men tới hoạt tính chitinase tại các thời điểm lên men……… 50

Hình 3.5 Ảnh hưởng pH môi trường tới sinh tổng hợp chitinase trong quá trình lên men……… 51

Hình 3.6 Ảnh hưởng tốc độ lắc tới sinh tổng hợp chitinase trong quá trình lên men 51

Hình 3.7 Động thái sinh trưởng phát triển và sinh tổng hợp chitinase của P oxalicum 20B theo thời gian lên men 53

Hình 3.8 Khả năng thủy phân dịch gel chitin 50% thành đường khử bằng dịch lên men

chứa chitinase lấy ở các thời điểm lên men khác nhau (dịch lên men pha loãng 02 lần) 54

Hình 3.9 Sắc ký bản mỏng của các sản phẩm thủy phân từ gel chitin 50% bởi dịch lên men được pha loãng 2 lần trong điều kiện 35ºC, pH 5, thời gian 24 h (1) NAG chuẩn nồng độ 20 mg/ml (dùng 2,5 µl); (2) Đối chứng;( 3), (4), (5), (6), (7), (8) tương ứng thời gian lấy mẫu dịch lên men 72 h; 96 h; 108 h; 120 h; 132 h; 144 h (dùng 2,5 µl) 55

Hình 3.10 Sắc ký đồ sản phẩm thủy phân gel chitin 10% bởi phân đoạn cô đặc 4 lần trên màng và dưới màng (cùng hoạt độ 0,0024 U/ml chitinase) ở điều kiện pH 5 và nhiệt độ 35oC………… 57

Hình 3.11 Ảnh hưởng các giải pháp bảo quản chế phẩm enzym kỹ thuật tới hoạt tính chitinase 59

Hình 3.12 Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng tới hoạt độ tương đối: chitinase (A), endochitinase (C), NAHase (E) và tới hoạt độ tương đối theo thời gian lưu giữ tại 30ºC (); 35ºC (); 40ºC (), 45ºC () và 50ºC (): chitinase (B), endochitinase (D), NAHase (F) 60

Hình 3.13 Ảnh hưởng của pH phản ứng tới hoạt độ tương đối: chitinase (A), endochitinase (C), NAHase (E) và tới độ bền chitinase (C), endochitinase (E), NAHase (F) theo thời gian lưu giữ ở pH 3 (), pH 4 (), pH 5 (), pH 6 (), pH 7 ()……… 62

xi

Hình 3.14 HSTP tương đối chitin tôm S, chitin tôm MN và chitin M; phối trộn dịch chitin

9 mg/ml và dịch chitinase 0,02 U/ml với tỷ lệ 1:1 (v/v) 64

Hình 3.15 Ảnh hưởng kích thước các phần tử chitin MN sau nghiền tới đường khử tạo thành……… 65

Hình 3.16 Ảnh hưởng xử lý siêu âm chitin MN sau nghiền bi tới đường khử tạo thành 65

Hình 3.17 Ảnh hưởng phương thức xử lý chitin từ vỏ tôm mũ ni tới

đường khử tạo thành sau 120 h thủy phân 66

Hình 3.18 Sắc ký đồ HPLC của dịch thủy phân chitin tôm mũ ni (được tiền xử lý bằng các phương pháp khác nhau) bởi chế phẩm enzym kỹ thuật trong thời gian 120 h, pic NAG xuất hiện tại thời gian 13,688 phút 68

Hình 3.19 Ảnh hiển vi điển tử quét của các loại nguyên liệu chứa chitin.A Chitin tôm mũ ni thô (MN thô); B 425 μm < MN < 600 μm; C MN < 63 μm; D 425 μm < MN < 600 μm + SA; E Chitin mực thô (M thô); K Chitin tôm sú thô (S thô) 68

Hình 3.20 Các đường cong phân tích nhiệt vi sai (DSC) đối với chitin MN, ở điều kiện không khí, tốc độ gia nhiệt mẫu 20ºC / phút 69

Hình 3.21 A Các đường cong phân tích nhiệt vi sai (DSC) ở điều kiện không khí, tốc độ gia nhiệt mẫu 20ºC / phút M3_DSC:12,10 mg chitin MN < 63 μm; M5_DSC:21,3 mg gel chitin MN B Phổ FTIR của chitin MN < 63 μm (M3_FTIR) và gel chitin MN (M5_FTIR) …… 76

Hình 3.22 (A) Ảnh hưởng của nhiệt độ 45ºC (), 30ºC (), 35ºC (), 40ºC () tới quá trình thủy phân chitin (B) Ảnh hưởng của nhiệt độ tới sản phẩm nhận được sau 36 h thủy phân gel chitin: (1) Chất NAG chuẩn; (2) 45ºC; (3) 40ºC; (4) 35ºC; (5) dịch enzym; (6) gel chitin…… 77

Hình 3.23 (A) Ảnh hưởng pH tới quá trình thủy phân chitin (B) Ảnh hưởng của pH tới sản phẩm nhận được sau 24 h thủy phân gel chitin: (1) Chất NAG chuẩn; (2) pH 3; (3) pH 4 (4) pH 5; (5) pH 6; (6) pH 7; (7) dịch enzym; (8) gel chitin……… 78

Hình 3.24 Ảnh hưởng của nồng độ gel chitin tới khả năng thủy phân chitin thành NAG (phối trộn dịch enzym 3,867 mU/ml chitinase và gel chitin 40% với tỷ lệ 1/1 (v/v) và thủy phân ở pH 5, 40ºC (A) NAG tạo thành trong dịch thủy phân (mg/ml); (B) Hiệu suất thủy phân tương đối (%) ……… 79

Hình 3.25 Ảnh hưởng của nồng độ chitinase tới khả năng thủy phân gel chitin (nồng độ gel chitin 40%, pH 5, 40ºC) 80

Hình 3.26 Ảnh hưởng nồng độ enzym tới khả năng thủy phân cơ chất 40% gel chitin lên NAG tạo thành trong 24 h ở pH 5, 40ºC., tỷ lệ dịch enzym/dich gel chitin là 1/1 (v/v) 81

Hình 3.27 Ảnh hưởng mức độ cô đặc dịch thủy phân tới lượng tinh thể kết tinh lần 1 và lượng NAG thất thoát vào tinh thể kết tinh lần 1 (%) 82

Hình 3.28 Ảnh hưởng của tỷ lệ EtOH/Dịch thủy phân cô đặc tới NAG thất thoát vào kết tủa và lượng cặn kết tủa thu được 83

xii

Hình 3.29 Sắc ký đồ HPLC A (NAG)i chuẩn với i =1-3; B Dịch thủy phân gel chitin 40% với Bx = 2,2%; C Chế phẩm NAG kết tinh từ dịch thủy phân Bx = 29,3% Ký hiệu 3NAG là mẫu chuẩn của đường triacetyl-chitotriose ((NAG)3), mẫu 2NAG là mẫu chuẩn của diacetyl-chitobiose ((NAG)2), mẫu NAG là mẫu chuẩn của N-acetyl-D- glucosamine (NAG)…… 85 Hình 3.30 Ảnh hưởng tỷ lệ EtOH/ Dịch thủy phân cô đặc tới khả năng thu hồi NAG, NAG thất thoát vào kết tủa bởi EtOH và vào dịch không kết tinh 86 Hình 3.31 Kết quả phân tích HPLC trong mẫu chứa NAG A Mẫu hỗn hợp chất chuẩn 1NAG, 2NAG, 3NAG; B Mẫu sản phẩm sau tinh sạch; C Mẫu kết tủa EtOH; D Mẫu dịch không kết tinh 88 Hình 3.32 A Các đường cong phân tích nhiệt vi sai (DSC) ở điều kiện không khí, tốc độ

gia nhiệt mẫu 20ºC/ phút, M6_DSC: 9,0 mg sản phẩm NAG sau tinh sạch, M7_DSC: 11,21

mg NAG của hãng Sigma B Phổ FTIR của sản phẩm NAG sau tinh sạch (M6_FTIR) và NAG hãng Sigma (M7_FTIR) 90

do tính không tan trong nước

Một trong những sản phẩm được tạo ra từ chitin là N- acetylglucosamine D-glucosamine, hay GlcNAc, hay NAG) NAG có tiềm năng chữa bệnh như viêm khớp, viêm dạ dày, Ngoài ra NAG còn có đặc tính chống ung thư và được dùng trong chữa trị bệnh tự miễn dịch [73]

(N-acetyl-Đa số NAG được sản xuất bằng thủy phân hóa học HCl đậm đặc ở nhiệt độ cao Xử

lý hóa học gây nhiều bất lợi như lượng phế thải acid, hiệu suất tạo NAG thấp (dưới 65%)

và giá thành cao Thêm nữa, NAG có vị mặn và hơi đắng bởi các hợp chất còn dư lại Do vậy, nhiều nghiên cứu đã tập trung thủy phân chitin sản xuất NAG bởi chitinase Công bố sản xuất NAG từ chitin bởi chitinase thô từ vi sinh vật còn khiêm tốn Xuất phát từ nhu cầu

thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu thu nhận

N-acetylglucosamine (NAG) bằng chitinase từ Penicillium oxalicum 20B định hướng

ứng dụng trong sản xuất thực phẩm chức năng”

* Mục tiêu nghiên cứu:

- Thu nhận và xác định đặc tính chế phẩm chitinase kỹ thuật từ Penicillium oxalicum 20B

- Thu nhận NAG từ chitin phế liệu tôm Việt Nam bằng chế phẩm chitinase kỹ thuật

* Nội dung nghiên cứu:

- Nghiên cứu sinh tổng hợp chitinase từ P oxalicum 20B

- Thu nhận và xác định đặc tính chế phẩm chitinase kỹ thuật

- Nghiên cứu thủy phân chitin để thu NAG bằng chế phẩm chitinase kỹ thuật nhận được

- Nghiên cứu thu nhận chế phẩm NAG tinh sạch hướng tới ứng dụng vào thực phẩm chức năng

* Những đóng góp mới của luận án:

- Là công trình công bố đầu tiên một cách hệ thống về đặc tính enzym và điều kiện lên

men sinh tổng hợp chitinase từ P oxalicum 20B

- Đã tạo ra chế phẩm chitinase kỹ thuật từ P oxalicum 20B và xác định các đặc tính

của chế phẩm, ứng dụng để thủy phân chitin thu N-acetylglucosamine Đặc biệt ảnh hưởng của từng cấu tử endochitinase và N-acetylhexosaminidase trong hỗn hợp chế phẩm chitinase

kỹ thuật đến hiệu suất tạo N-acetylglucosamine đã được xem xét

- Đã đưa ra qui trình thu nhận và tinh sạch N-acetylglucosamine từ dịch thủy phân gel chitin và xác định các đặc tính của chế phẩm N-acetylglucosamine để sử dụng làm nguyên liệu sản xuất thực phẩm chức năng

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 N- ACETYLGLUCOSAMINE

1.1.1 Các đặc tính của N- acetylglucosamine

N-Acetylglucosamine là dẫn xuất của đường

glucoza, có nhóm amit liên kết giữa glucosamine

và axit axetic Công thức phân tử C8H15NO6, khối

lượng phân tử là 221,21 g/mol

NAG có dạng bột màu trắng, vị ngọt nhẹ,

nóng chảy ở 221oC, khả năng hoà tan của NAG là

25% trong nước NAG hiếm khi tồn tại ở dạng tự

do, ngoại trừ trong sữa người (khoảng 600 - 1500

mg/ml) Hình 1.1 Công thức cấu tạo NAG NAG là thành phần cấu trúc chính của polysaccharide như chitin Ngoài ra nó có trong thành tế bào vi khuẩn (trong các đơn phân murein) và lipopolysaccharide của màng ngoài Ở vi khuẩn, khi murein phân hủy thì NAG lại hình thành liên quan đến sự phosphoryl hóa, vì GlcNAc-6-phosphate (GlcNAc-6-P) được sử dụng để tổng hợp murein hay lipopolysaccharide hoặc có thể được chuyển hóa bằng con đường đường phân

1.1.2 Thực phẩm chức năng

Khái niệm chung:

Thuật ngữ Dược phẩm dinh dưỡng (Nutraceuticals) do TS Y khoa Stephen DeFelice (người sáng lập ra “Quỹ cải tiến y học”) đặt ra vào năm 1980 Đây là loại thực phẩm có lợi cho sức khỏe bằng cách bổ sung những hoạt chất hay thành phần thiên nhiên đem lại sức khỏe hoặc tăng cường sức khỏe cho cơ thể con người Và cũng vào năm 1980, lần đầu tiên khái niệm thực phẩm chức năng được phát triển ở Nhật Bản khi đất nước này phải đối mặt với chi phí leo thang chăm sóc sức khỏe Bộ Y tế và Phúc lợi nước Nhật đã khởi xướng một hệ thống quản lý phê duyệt thực phẩm nhất định vì lợi ích sức khỏe với hy vọng cải thiện sức khỏe của các quốc gia dân số già [14] Năm 1994 ở nước Mỹ, Viện Hàn Lâm Khoa Học Thực phẩm và Dinh dưỡng định nghĩa thực phẩm chức năng là “bất kỳ thực phẩm biến đổi hoặc nguyên liệu thực phẩm có thể đem lại lợi ích cho sức khỏe ngoài các chất dinh dưỡng truyền thống” [162] Viện Khoa học Đời sống quốc tế định nghĩa thực phẩm chức năng là loại thực phẩm mà nhờ sự hiện diện các thành phần sinh lý có lợi cho sức khỏe ngoài chế độ dinh dưỡng cơ bản [59] Năm 1999, Hiệp hội Dinh dưỡng Mỹ định nghĩa thực phẩm chức năng như là thực phẩm “toàn bộ, vững chắc, làm giàu hoặc tăng cường” nhưng quan trọng hơn thực phẩm đó phải được tiêu thụ như “…phần trong chế độ ăn uống thường xuyên và đa dạng, các cấp độ hiệu quả” cho người tiêu dùng có sức khỏe tốt [10]

Tại Việt Nam, thông tư 08 (năm 2004) của Bộ Y tế định nghĩa: "Thực phẩm chức năng là thực phẩm dùng để hỗ trợ chức năng của các bộ phận trong cơ thể người, có tác dụng dinh dưỡng, tạo cho cơ thể tình trạng thoải mái, tăng sức đề kháng và giảm bớt nguy cơ gây bệnh"

Do đó, thực phẩm chức năng khác với thực phẩm thông thường ở chỗ được sản xuất, chế biến theo công thức: bổ sung một số thành phần có lợi hoặc loại bỏ một số thành phần bất lợi của thực phẩm Việc bổ sung hay loại bớt phải được chứng minh và cân nhắc một cách khoa học và được cơ quan nhà nước có thẩm quyền cho phép

Thực phẩm chức năng có tác dụng với sức khỏe nhiều hơn các chất dinh dưỡng thông thường và liều sử dụng thường nhỏ, thậm chí được tính bằng miligram hoặc gram

Các tiêu chuẩn về nguyên liệu sử dụng cho thực phẩm chức năng Việt Nam:

Thông tư số 02/2011/TT-BYT của Bộ trưởng Bộ Y tế đưa ra: các sản phẩm sữa dạng bột, giới hạn ô nhiễm đối với Cd là 1,0 mg/kg, Pb là 0,02 mg/kg, Hg là 0,05 mg/kg; đặc biệt thực phẩm bổ sung thì giới hạn ô nhiễm đối với Cd là 1 mg/kg, Pb là 3,0 mg/kg, Hg là 0,1 mg/kg Thông tư số 03/2012/TT-BYT của Bộ trưởng Bộ Y tế đưa ra: Chỉ tiêu vi sinh vật gây

bệnh như E coli, Samonella là đều không phát hiện (KPH) trong các sản phẩm sữa dạng

bột,

1.1.3 Vai trò N- acetylglucosamine trong sản xuất thực phẩm chức năng

NAG đã được ứng dụng rộng trong cung cấp dinh dưỡng sử dụng điều trị tổn thương xương khớp, để cải thiện các triệu chứng do thoái hóa khớp, tăng cường khả năng tái tạo sụn khớp, điều trị tận gốc nguyên nhân gây bệnh về khớp NAG được dùng để phục hồi lớp sụn nối, hỗ trợ chữa bệnh viêm khớp mãn tính [56]

Ở người cao tuổi khả năng tổng hợp NAG của cơ thể bị giảm sút dễ mắc bệnh viêm xương khớp, vì thế mà người ta phải đưa từ bên ngoài vào cơ thể dưới dạng thuốc, có tác dụng chống viêm và kích thích sản xuất sụn

Nhiều thử nghiệm lâm sàng đã được thực hiện điều trị cho bệnh nhân rối loạn khớp bao gồm các bệnh: viêm khớp, viêm xương khớp, viêm khớp dạng thấp, tổn thương sụn, tổn thương khớp, thoái hóa khớp Kết quả nghiên cứu cho thấy NAG có vai trò quan trọng trong việc phòng chống tổn thương khớp, chống viêm xương khớp mãn, viêm khớp mãn tính và bệnh tổn thương sụn xương [29]

Bên cạnh đó NAG được dùng như tác nhân chống viêm chữa nhiều bệnh: nhiễm vi khuẩn mãn tính, viêm ruột và dạ dày NAG còn có khả năng tăng cường giải phóng mucopolysaccharide acid nguyên bào sợi, hình thành cấu trúc bảo vệ đường tiêu hóa do vậy làm tăng tính đàn hồi các mô xung quanh mạch và hoạt động như một tác nhân bảo vệ, khôi phục sự toàn vẹn và chức năng bình thường niêm mạc ruột ở người

Một thử nghiệm thí điểm lâm sàng để xác định hiệu quả điều trị của NAG trên bệnh viêm ruột Trẻ em bị bệnh Crohn đã cho thấy sự cải thiện rõ ràng sau khi được dùng NAG đường uống hay đường hậu môn Thực tế, trong thử nghiệm này, 8 trong số 12 trẻ em cho thấy cải thiện rõ rệt khi được cho uống NAG như là một liệu pháp song song với liệu pháp hiện hành, trong khi 4 trường hợp còn lại không thấy chuyển biến Ngoài ra, 7 trẻ bị bệnh viêm ruột khác cũng được dùng NAG đường hậu môn như là một liệu pháp duy nhất đã cho thấy cải thiện rõ rệt ở 5 em và 2 em còn lại không đáp ứng liệu pháp Đáng lưu ý là 2 em không đáp ứng với NAG đường hậu môn trước đó đã đề kháng lại các liệu pháp khác [130]

Do đó, NAG hứa hẹn là một phương pháp điều trị rẻ tiền và không độc hại đối với bệnh viêm ruột mãn tính Gần đây, thử nghiệm lâm sàng giai đoạn III vừa được hoàn thành [91]

Da người gồm ba lớp là lớp biểu bì (lớp ngoài cùng), lớp trung bì và lớp hạ bì (lớp bên trong cùng) để bảo vệ cơ thể khỏi các điều kiện khắc nghiệt của môi trường như thời tiết khô, tia cực tím… Lớp biểu bì đóng vai trò quan trọng trong việc tái tạo tế bào da, duy trì độ ẩm, độ săn chắc cho da Lớp trung bì bao gồm collagen, elastin… được tạo ra bởi các nguyên bào sợi giúp làm tăng khả năng phục hồi, độ bền, độ đàn hồi, săn chắc giúp cho làn

da luôn khỏe mạnh Một trong những nhóm carbonhydrate phức tạp như acid hyaluronic (HA) và proteoglycan có khả năng giữ nước cao và là thành phần quan trọng trong việc duy trì độ ẩm cho da Lượng cabonhydrate giảm dần theo lứa tuổi, khả năng giữ nước và phục hồi của da giảm và do đó làm cho da khô, xuất hiện các nếp nhăn Bổ sung NAG giúp tăng cường sự phát triển và biểu hiện collagen của nguyên bào sợi, thúc đẩy sự gia tăng của tế bào sừng có tác dụng giữ ẩm, giảm sự xuất hiện các sắc tố da trên khuôn mặt, cải thiện nếp nhăn trên da [31]

NAG còn có đặc tính chống ung thư và được dùng trong chữa trị bệnh tự miễn dịch [73] Ngoài ra, dùng NAG trong mỹ phẩm, băng bó vết thương, và như phụ gia thực phẩm sữa Lợi ích và ứng dụng NAG thể hiện trên Bảng 1.1

N-acetyl glucosamine được sử dụng qua đường ăn uống được thẩm thấu qua thành ruột và giúp cơ thể người sản sinh chodroitin và axit hyaluronic Axit hyaluronic là thành phần cần thiết cho độ giữ nước và độ đàn hồi trong cơ thể, là phần không thể thiếu trong chống lão hóa làn da và khớp [135] Trên mô hình thực nghiệm viêm xương khớp, tiêm NAG vào nội khớp đã bảo vệ được sụn [110, 140]

Bổ sung NAG qua đường nước uống đã cải thiện các triệu chứng của những bệnh nhân bị viêm khớp gối có thể là do tăng loại tổng hợp II collagen [69]

Con người sử dụng NAG qua đường thực phẩm ở liều lượng 1000 mg/ ngày giúp cơ thể bảo vệ sụn khớp là do tăng sự tổng hợp collagen loại II và giảm được sự suy thoái collagen loại II [164]

Bissett và cs (2007), Chen và cs (2010) công bố nghiên cứu lâm sàng về NAG lên người bệnh khi uống như: sự hấp thụ, phân phối và đào thải khi uống nó [17] Nghiên cứu

của Chen và cs (2010) đã chỉ ra tỷ lệ hấp thụ đạt 98% và mỗi khi NAG được hấp thụ, nó sẽ phân phối chính vào tế bào khớp nhằm kết nối chặt chẽ thành ma trận tế bào khớp nối của sụn, dây chằng, gân [29]

Trong cơ thể người, NAG giữ nguyên dạng glucoprotein, như chất kích hoạt hàng loạt các chất trong huyết tương có thể hoạt hóa thành plasma [149]

Chế phẩm chứa NAG được sử dụng bằng đường tiêm, uống Một liều lượng lớn NAG (20 g) tiêm tĩnh mạch không hề độc tính và không thay đổi nồng độ glucose trongmáu [138] Người ta cũng đã chứng minh rằng: 54% NAG cung cấp được bài tiết qua đường nước tiểu trong 1 ngày, điều đó chỉ rõ trong chuỗi các phản ứng sinh hóa của NAG

Bảng 1.1 Ứng dụng và lợi ích của NAG

tham khảo

Điều trị bệnh Ung thư và di căn

Bệnh đường ruột Bệnh rối loạn đường ruột Tổn thương khớp

Động vật, con người Con người Con người Con người

[184] [185] [159] [94] Phòng ngừa

bệnh

Ngộ độc thuốc và chất hóa học Thuốc kháng sinh Tác dụng phụ của điều trị hóa trị và điều trị sóng vô tuyến

Say tàu xe

Tế bào vi sinh vật, động vật

Vi khuẩn Con người Con người

[186]

[183] [184] [182] Bệnh ngoài da Vệ sinh da Con người [180] Thực phẩm bổ

sung

Phụ gia trong sữa Phụ gia trong đồ uống thể thao

Động vật, con người Động vật, con người

[181] [175] Làm mỹ phẩm Giữ độ ẩm cho da

Tăng tính đàn hồi và màu sắc Giảm sản xuất melanin

Con người Con người Con người

[29] [135] [17] Các phép thử độc tố cho thấy NAG không độc Ngoài ra NAG được tạo ra bởi enzym

có vị ngọt và bền nhiệt Chính vì vậy, gần đây NAG và dẫn xuất từ NAG đã được sử dụng

để bổ sung vào chế độ ăn uống, phát triển rộng trong chữa bệnh cho con người [7]

1.1.4 Các phương pháp sản xuất N- acetylglucosamine

1.1.4.1 Phương pháp hóa học

Theo phương pháp hóa học, NAG được sản xuất bằng cách dùng axit HCl đậm đặc để thủy phân chitin ở nhiệt độ cao Nhiệt độ và nồng độ axit cần phải kiểm soát một cách chặt chẽ, đủ cao

để thủy phân chitin và tránh phân hủy NAG Thường quá trình thủy phân diễn ra ở nhiệt độ khoảng

từ 40 - 80ºC và nồng độ HCl từ 15 - 36% Sản lượng NAG có thể đạt 6,42 g/l trong 1 h [24] Phương pháp này thường đạt hiệu suất thủy phân thấp (dưới 65%), giá thành cao và thải ra một

lượng lớn axit gây ô nhiễm môi trường xung quanh, sản phẩm cuối có vị mặn và có tác dụng phụ

do quá trình hóa học [133] Đặc biệt nhóm axetyl bị mất đi nên lại phải axetyl hóa trở lại khá phức tạp Do vậy sản phẩm không được coi là tự nhiên bởi sự có mặt các chất hóa học (như O-axetyl, diaxetyl, dung môi) trong sản phẩm đã gây vị đắng [75]

1.1.4.2 Phương pháp chuyển hóa sinh học

Sản xuất NAG qua quá trình chuyển hóa trực tiếp chitin bởi vi sinh vật tổng hợp chitinase không thông qua giai đoạn thu các chế phẩm trung gian Phương pháp này có ưu điểm là ít công đoạn nhưng quá trình khó kiểm soát do sự tạo thành các sản phẩm trao đổi chất khác ngoài NAG

Theo Li và cs (2005) nếu dùng 2% gel chitin làm cơ chất nuôi cấy vi khuẩn Aeromonas caviae DYU-BT4 từ mẫu đất ở Taiwan có thể thu NAG với hàm lượng 7,8 g/l [87]

Theo nghiên cứu khác của Chen và cs (2011), Chitinibacter tainanensis phân lập từ

đất phía Nam Taiwan thủy phân cơ chất -chitin và ß-chitin cho hiệu suất thu hồi NAG lần lượt là 76% và 98% Kết tinh dịch lên men thu NAG với độ tinh sạch trên 99% [32] Các nhân tố phân giải chitin (CDFs) có thể thủy phân chitin và được tạo ra trong suốt thời kỳ

phát triển của C tainanensis khi có mặt chitin Hoạt tính NAHase và endochitinase được

tìm thấy trong vi khuẩn sống và phần tế bào chết Hoạt độ riêng NAHase cao hơn nhiều so với endochitinase Cơ chế hoạt động các nhân tố phân giải chitin được minh họa trên Hình 1.2

Hình 1.2 Sản xuất NAG bằng chuyển hóa sinh học [75]

Ngoài ra NAG được sản xuất thông qua chủng biến đổi di truyền sử dụng glucose làm cơ chất Các đường hướng chuyển hóa D-glucosamin và tổng hợp NAG có thể thay đổi bằng kỹ thuật di truyền nhằm tăng hoạt tính enzym, giảm các sản phẩm kìm hãm và tăng ái lực với cơ chất, nên có thể tạo ra sản phẩm nồng độ cao Dùng vi sinh vật biến đổi gen và không tận dụng được nguồn chitin là nhược điểm của phương pháp

1.1.4.3 Phương pháp enzym

Chitinase là hệ enzym thủy phân chitin để thu nhận NAG bằng phương pháp enzym

Ở qui mô công nghiệp lớn, có thể sản xuất NAG bằng chitinase tinh sạch Tuy nhiên chitinase tinh sạch rất đắt kể cả từ các chủng biến đổi gen Nên trong thực tế hay dùng enzym thô thu nhận NAG

Phân giải chitin thành NAG bởi chitinase diễn ra theo hai giai đoạn Đầu tiên endochitinase (EC 3.2.1.14) phân giải chitin thành các oligomer, sau đó các oligomer bị phân giải thành các monomer bởi NAHase (EC 3.2.1.96) [132] Sáng chế của Haynes và cs (1999) tại nước Mỹ đã thu nhận NAG bằng chitinase (bao gồm chitinase và chitobiosidase) thủy phân vỏ loài giáp xác [53]

Pichyangkura và cs (2002) đã dùng chitinase thô từ Burkholderia cepacia TU09 và Bacillus licheniformis SK-1 thủy phân bột mịn α-chitin, β-chitin tạo NAG Chitinase từ B cepacia TU09 thủy phân β-chitin trong 1 ngày và α-chitin trong 7 ngày đều có hiệu suất thu nhận NAG hơn 85% Chitinase từ B licheniformis SK-1 thủy phân β-chitin trong 6

ngày cho hiệu suất thu nhận NAG khoảng 75% Ngoài ra, hiệu suất thu nhận NAG đạt

41% khi thủy phân α-chitin bằng B licheniformis SK-1 [115]

Bohlmann và cs (2004) đã đưa ra sáng chế: NAG thu được với độ tinh sạch cao bằng cách thủy phân chitin bởi sinh khối nấm sợi [24]

Aiba (2005) đã dùng dịch enzym thô (gồm NAHase và chitinase) từ Aeromonas hydrophila H-2330 để sản xuất NAG với quy mô lớn [7]

Jung và cs (2007) công bố sản xuất NAG và N-acetylchitooligosaccharide bởi dịch

enzym thô từ Paenibacillus illinoisensis KJA-424 [63]

Sau thời gian 48h thủy phân β – chitin bằng chitinase từ nấm Aspergillus sp, hiệu suất thủy phân (HSTP) NAG đạt 65% Pha trộn hai enzym thô từ Trichoderma viride và Acremonium cellulolyticus thủy phân tốt β - chitin dạng bột [60, 137]

Hiện nay, tiềm năng sản xuất NAG là sử dụng hệ enzym tái tổ hợp chitinase được

nhân lên trong E.coli [80]

So với phương pháp hóa học, phương pháp thủy phân chitin bằng enzym diễn ra trong điều kiện nhẹ nhàng, không gây ô nhiễm môi trường và sản phẩm NAG có thể tinh sạch gần 100% nên được ưa thích hơn [78]

Đối với phương pháp thủy phân chitin bằng enzym thì phần chitin vô định hình thủy phân một cách dễ dàng, còn chitin liên kết chặt chẽ được thủy phân từ từ Hỗn hợp endochitinase, exochitinase (chitobiosidase và NAHase) là cần thiết cho sự thủy phân hoàn toàn chitin, khi hàm lượng NAHase cao thì NAG tạo ra có độ tinh khiết cao Do vậy, cấu trúc tinh thể chitin và thành phần enzym là hai yếu tố quan trọng trong sản xuất NAG bằng phương pháp enzym [29]

1.2 CHITIN

1.2.1 Cấu tạo hóa học và tính chất lý hóa của chitin

Chitin là 1 polysaccharide mạch thẳng gồm các β-(1-4)-2-acetamido-2-deoxy-D-glucose Hay nói cách khác: Chitin được cấu tạo từ các đơn phân là NAG liên kết bởi liên kết 1,4- β-glycoside và hình thành một mạng lưới các sợi có tổ chức Cấu trúc hóa học chitin giống với cấu trúc hóa học cellulose, chitosan Chúng chỉ khác nhau bởi các nhóm -OH, -NH2, -NHCOCH3 (Hình 1.3)

Chitin có màu trắng, cứng, không đàn hồi, không tan trong nước và các dung môi hữu cơ thông thường nhưng có thể được hòa tan trong các dung môi như hexafluoro-2-propanol, N,N-dimethylacetamid, hexafluroacetone, lithium thiocyanate Ngoài ra, chitin

có thể tan trong acid trichloroacetic (TCA), acid dichloroacetic (DCA) Muối LiCNS, Ca (CNS)2…có khả năng hydrat hóa mạnh mẽ để phân giải chitin [117]

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của chitin, chitosan, cellulose [74]

Khi ở trong dung dịch HCl đậm đặc, chitin bị phân hủy hoàn toàn thành 88,5% Glucosamine và 11,5% axit acetic, quá trình thủy phân bắt đầu xảy ra ở mối nối glycoside, sau đó là sự loại bỏ nhóm acetyl (-CO-CH3)

D-Đun nóng chitin trong dung dịch NaOH đậm đặc sẽ tạo thành chitosan vì chitin bị mất gốc acetyl: Chitin + n NaOH (đậm đặc) Chitosan + n CH3COONa

Trong cấu trúc tinh thể chitin, các chuỗi chitin tạo thành các tấm qua liên kết hydro Cấu trúc tinh thể chitin ổn định là do liên kết hydro, tương tác kỵ nước trong phân tử và giữa các phân tử Mỗi một chuỗi có nhiều liên kết hydro giữa các phân tử đường lân cận gọi là liên kết nội phân tử gồm liên kết hydro giữa nhóm cacbonyl với nhóm hydroxyl ở vị trí cacbon - 6 và một liên kết hydro thứ hai giữa nhóm OH ở cacbon - 3 và vòng oxi, tương tự như liên kết hydro trong chuỗi cellulose Ngoài ra, các chuỗi còn được giữ vững bởi liên kết hydro mạnh giữa C = O và N – H [101] Liên kết hydro lớn làm tăng cường độ cứng chuỗi tinh thể chitin

Hình 1.4 Liên kết hydro nội phân tử chitin [101]

Chitin có trình tự sắp xếp cao, cấu trúc tinh thể Bằng phương pháp nhiễu xạ tia X [101], người ta đã chứng minh chitin tồn tại ba dạng cấu hình: α-chitin, β-chitin và γ-chitin [47], các dạng này khác nhau về trình tự sắp xếp chuỗi trong vùng tinh thể Dạng chitin khác nhau chỉ do sự sắp xếp khác nhau về hướng của mỗi mắt xích (NAG) trong mạch thể hiện Hình 1.5 Có thể biểu diễn mỗi mắt xích này bằng mũi tên sao cho phần đầu mũi tên chỉ nhóm –CH2OH, phần đuôi chỉ nhóm –NHCOCH3, thì các cấu trúc α, β, γ- chitin được mô tả sau:

Cấu trúc -chitin có thêm các liên kết hydro (được tạo bởi các nhóm hydroxymethyl (CH2OH) của các chuỗi liền kề nhau), trong khi đó không tìm thấy liên kết này ở cấu trúc β – chitin [104]

β-chitin (có nhiều trong mai mực) gồm các chuỗi song song, trong khi γ-chitin (nhiều trong nấm và nấm men) có hai chuỗi song song theo một hướng kết hợp chuỗi thứ ba với hướng đối diện song song, giữa các lớp không có loại liên kết hydro Loại γ-chitin rất ít nghiên cứu vì nó được cho là cấu trúc lỗi của một trong hai dạng α hoặc β – chitin chứ không phải là một dạng cấu trúc thứ ba của chitin hoặc có thể coi nó là biến thể của α-chitin [15]

Sự phân bổ các dạng này không liên quan tới nguyên tắc phân loại vì các dạng khác nhau có thể xuất hiện trong một cơ thể, mặc dù đặc tính chức năng khác nhau: α-chitin là dạng đầy đủ nhất, rất cứng [126] So sánh -chitin với ß-chitin, ß-chitin dễ bị thủy phân bởi enzym hơn nhưng -chitin tồn tại trong tự nhiên phổ biến hơn β-chitin và γ-chitin có tính bền, mềm dẻo và nhiều chức năng sinh lý hơn Dạng β có thể chuyển đổi sang dạng α

bằng xử lý với kiềm nhưng không thể chuyển ngược lại và dạng γ-chitin có thể chuyển đổi sang α-chitin bằng cách xử lý với lithium thiocyanate [103]

1.2.2 Nguồn thu nhận chitin

Chitin được tách lần đầu tiên từ nấm vào năm 1811 [25] Chitin là hợp chất polimer có mặt

từ nhiều nguồn khác nhau Chitin là thành phần cấu trúc quan trọng của vỏ một số động vật không xương sống như: côn trùng, nhuyễn thể, giáp xác và giun tròn Ở động vật bậc cao, chitin

là thành phần chủ yếu trong mô da, nó giúp sự tái tạo và gắn liền các vết trên da Ở thực vật,

chitin có trong thành tế bào nấm họ Zygenmyctes, sinh khối nấm mốc, một số loại tảo…

Các nguồn chitin từ công nghiệp thủy sản bao gồm vỏ tôm, cua, ghẹ, mai mực ống và mực nang Nhìn chung, hàm lượng chitin trong phế liệu giáp xác chiếm khoảng 10 – 60%

so với trọng lượng khô [154]

Hiện nay chitin được tách chiết từ vỏ giáp xác chủ yếu là bằng các phương pháp hóa học; ứng dụng công nghệ điện hóa để tách chiết và tinh chế chitin từ vỏ đầu tôm [6]; trong thời gian gần đây các phương pháp sinh học đã bắt đầu nghiên cứu sử dụng sản xuất chitin [16] Giáp xác là nguồn nguyên liệu thủy sản chiếm 30 – 35% tổng lượng nguyên liệu ở Việt Nam Trong công nghiệp chế biến thủy sản xuất khẩu, tỷ lệ cơ cấu các mặt hàng đông lạnh giáp xác chiếm 70 - 80% công suất chế biến

Các nhà máy chế biến thủy sản tiêu thụ lượng lớn nguyên liệu nên đã thải ra lượng đáng kể phế liệu trong đó phế liệu vỏ - đầu tôm, vỏ cua, vỏ ghẹ là chủ yếu Ở Việt Nam, hàng năm các nhà máy chế biến đã thải bỏ lượng phụ phẩm giáp xác khá lớn khoảng 70000 tấn Riêng tỉnh Khánh Hòa, lượng phế liệu này khoảng 2257 tấn/ năm Phế liệu này thải trực tiếp ra môi trường

và gây ô nhiễm lớn, nếu đem xử lý chất thải thì chi phí rất lớn Chính vì vậy, phế liệu ngành thủy sản Việt Nam (vỏ tôm, ghẹ, ) cần được tận dụng nhằm nâng cao lợi ích kinh tế, đồng thời giải quyết bài toán ô nhiễm môi trường do ngành chế biến thủy sản mang lại

1.3 CHITINASE

1.3.1 Hệ chitinase

Hệ thống chitinase thủy phân chitin gồm: Endochitinase (E.C 3.2.1.14), exochitinase (EC 3.2.1.52) gồm 1,4-β-chitobiosidase (E.C 3.2.1.30) và β-N-acetylhexosaminidase (EC 3.2.1.96)

1.3.2 Đặc tính sinh hóa

Chitinase từ các nguồn khác nhau có đặc tính sinh hóa tương đối khác nhau

Chitinase (E.C 3.2.1.14) có khối lượng phân tử khoảng 20 kDa đến 90 kDa Khối lượng phân tử chitinase vi khuẩn từ 20 kDa đến 60 kDa, nhỏ hơn chitinase côn trùng (khối lượng phân tử từ 40 - 85 kDa); khối lượng phân tử chitinase thực vật giống khối lượng phân tử chitinase côn trùng (khoảng 40 kDa đến 85 kDa) [18] Khối lượng phân tử

chitinase từ nấm mốc khoảng 27 kDa đến 190 kDa Chẳng hạn: khối lượng phân tử

chitinase từ Aspergillus sp và Coccidioides immitis khoảng 83 đến 97 kDa Hầu hết chế

phẩm chitinase từ nấm cho nhiều hơn 1 loại enzym như: 7 loại enzym gồm chitobiosidase (40 kDa) [52], hai loại NAHase (102 và 73 kDa) bốn loại endochitinases

1,4-β-(52, 42, 33 và 31 kDa) trong dịch chitinase từ Trichoderma harzianum [51]; ít nhất hai loại enzym từ Talaromyces flavus [85]; hai loại exochitinase và một endochitinase từ nấm

ký sinh loại lớn Stachybotrys [161] Chế phẩm chitinase chứa ít nhất sáu enzym khác nhau

từ nấm Metarhizium anisopliae [64] Endochitinase và exochitinase trong dịch enzym thô

từ Aeromonas sp PTCC 1691 [60] Dịch chitinase từ Penicillium oxalicum chứa NAHase

(132 kDa) [121] và endochitinase (54,9 kDa) [123]

Nhiệt độ tối ưu đối với chitinase từ Streptomyces sp M-20 là 30ºC [70]; từ Streptomyces rimosus là khoảng 40 - 45ºC [26]; từ Sanguibacter là 37ºC [188]; từ Penicillium ochrochloron MTCC 517 là 40oC [113]; từ Aspergillus sp là 40ºC [137], Hoạt độ chitinase từ Aspergillus sp khi để nhiệt độ ở 45ºC và 50ºC trong 63 h còn tương

ứng lần lượt 90%, 50% so với hoạt độ ở điều kiện nhiệt độ tối ưu [137]

Hoạt độ tương đối của chitinase tinh sạch từ Lactobacillus plantarum WCFS1 đạt

cao nhất ở khoảng nhiệt độ 35ºC - 40ºC trong thời gian 30 phút, nhưng giảm mạnh khi nhiệt độ trên 55ºC; ở nhiệt độ 37ºC và 50ºC, hoạt tính enzym còn lại lần lượt 82% và 58% sau thời gian 168 h; ở nhiệt độ lần lượt 37ºC và 50ºC, hoạt tính enzym còn lại ½ sau thời

gian tương ứng 20 ngày và 8,4 ngày [13] Chitinase tinh sạch từ Vibrio alginolyticus TK-22 hoạt động tối ưu ở 45ºC và ổn định ở 40ºC trong 30 phút [108]; chitinase tinh sạch từ Vibrio

sp P-6-1 ổn định ở 40ºC mất hoàn toàn hoạt tính ở 55ºC trong thời gian 30 phút [157] Nhiệt độ tối ưu của hầu hết chitinase từ nấm mốc khoảng 20 - 40ºC [52, 81, 85, 86,

116, 167] Tuy nhiên, nhiệt độ tối ưu của chitinase chịu nhiệt trong khoảng 45ºC đến 80ºC

như: Nhiệt độ tối ưu đối với chitinase từ Stenotrophomonas maltophilia là 45ºC [168]; từ Serratia marcescens là 50ºC [191]; từ Thermomyces lanuginosus là 55ºC, từ Aspergillus protuberus là 55ºC [50]; từ Talaromyces emersonii là 65ºC [97], hoạt độ chitinase từ Talaromyces emersonii khi để nhiệt độ 70ºC trong 20 phút hoặc để nhiệt độ 65ºC trong 25 phút

đều còn 50% so với hoạt độ ở điều kiện nhiệt độ tối ưu [85] Nhiệt độ tối ưu đối với chitinase từ

Streptomyces thermoviolaceus OPC-520 là 80ºC [165] Endochitinase và

β-N-acetylhexosaminidase từ Aspergillus flavus và Fusarium oxysporum đều có nhiệt độ tối ưu 62ºC, nhưng các enzym này từ Penicillium monoverticillium hoạt động tốt nhất tại 52ºC [153]

Chitinase từ Penicillium thường hoạt động ổn định ở nhiệt độ khá cao tới 45ºC; chitinase từ P aculeatum hoạt động ổn định ở 50ºC [22]

Rodriguez và cs (1993) khẳng định nhiệt độ tối ưu đối với chitobiosidase và chitinase

từ Penicillium oxalicum lần lượt là 45ºC và 50ºC Cả chitobiosidase và chitinase đều bền ở 45ºC trong thời gian 20 h [122] Rodriguez và cs (1995) cho rằng chitinase tinh sạch từ P

oxalicum hoạt động tối ưu tại nhiệt độ 35ºC và ổn định ở nhiệt độ lên tới 45ºC trong thời

gian 120 phút Hoạt tính chitinase bị mất một nửa ở 45ºC và 50ºC trong khoảng thời gian tương ứng 53 phút và 23 phút [121]

Chitinase từ chủng vi sinh vật khác nhau hoạt động trong khoảng pH khác nhau

Khoảng pH hoạt động của chitinase tinh sạch từ Aeromonas hydrophila H- 2330 là pH 5,0

- 8,0 [54]; từ Aeromonas sp No 10S-24 chitinase là pH 4,0 - 9,0 [166]; từ Bacillus sp BG-11 là pH 7,5 - 9,0 [19]; từ Bacillus 13.26 là pH 7,0 - 8,0 [190]; từ Bacillus sp NCTU2

là pH 6,8 - 8,0 [173]; từ Vibrio sp là pH 4,0 - 9,0 [192]; từ Myrothecium verucaria là pH

4,0 - 6,5 [171] Chitinase nấm mốc hoạt động trong vùng pH 4,0 - 7,0 Theo Lee và cs (2009) công bố chitinase từ nấm sợi hoạt động tốt trong vùng axit nhẹ pH 4,0 - 7,0 [84] Chitinase từ từng chủng vi sinh vật hoạt động tốt nhất tại pH tối ưu riêng Chitinase hoạt động tốt nhất tại pH tối ưu trong khoảng pH 3,5 - 5,5 như: pH tối ưu đối với chitinase

từ Aspergillus sp là 3,5 [137], từ Aeromonas sp No 10S-24 là pH 4,0 [166]; từ Sanguibacter là 4,6 [152]; từ Aspergillus protuberus [50] và Streptomyces sp M-20 đều là 5,0 [70]; từ Talaromyces emersonii CBS81470 là pH 5,0 - 5,5 [97]; từ Bacillus cereus

[118] Chitinase hoạt động cao nhất tại pH tối ưu trong khoảng pH 6,0 - pH 7,5 như: từ

Enterobacter sp G-1 là 6,0 [111]; từ Serratia marcescens là 6,0 [191]; từ Bacillus sp NCTU2 là pH 6,3 [173]; từ Vibrio alginolyticus H-8 [108] và Vibrio sp [192] đều là 6,5; từ Stenotrophomonas maltophilia là 6,8 [168]; từ Streptomyces rimosus [26] cũng như từ Penicillium ochrochloron MTCC 517 là 7,0; Chitinase tinh sạch từ Lactobacillus plantarum WCFS1 hoạt động tối ưu tại pH 7,5, bị vô hoạt khi pH < 5, nhưng hoạt tính

chitinase còn lại 80% ở 37ºC và khoảng pH 5 - 10 [13]

Ngoài ra chitinase ưa kiềm hoạt động ở pH tối ưu như pH 8,0 từ Bacillus circulans No.4.1; pH 9,2 từ Beauveria bassianse [152]; pH 11,0 từ Streptomyces sp [119]

So sánh với một số chitinase từ các chủng Penicillium, ta thấy chitinase từ P aculeatum có

pH tối ưu là 5,5 [22]; chitinase từ P citrinum có hoạt tính mạnh nhất tại pH 6, bền ở khoảng pH

từ 6 - 7 [4] β - N - acetylglucosaminidase và chitinase từ P oxalicum có pH hoạt động tối ưu lần

lượt 4,5 và 6,5; bền trong khoảng pH lần lượt 3,5 đến 7,0 và 4,0 đến 8,0 [122] Chitinase tinh

sạch từ P oxalicum hoạt động tối ưu ở pH 5,0 và ổn định ở khoảng pH từ 4,0 đến 6,0 trong thời

gian 120 phút Enzym này bị vô hoạt nhanh khi pH < 4 hoặc pH > 7 [121]

Chitinase bị mất hoạt tính, nhiễm vi sinh vật trong khoảng thời gian bảo quản nhất định, nên với mục đích bảo quản enzym các chất phụ gia như NaCl, glycerol, benzoat natri, được bổ sung kết hợp với giải pháp nhiệt độ thấp Pradeep và cs (2015) đã đưa ra

các phương pháp bảo quản chitinase từ Streptomyces sp CS147: chế độ nhiệt độ 4ºC, nhiệt

độ phòng từ 25 - 30ºC kết hợp với chất phụ gia như Na2S2O4 (0,1% w/v), KCl (15% w/v)

và glycerol (30% v/v) để bảo quản chitinase từ Streptomyces sp CS147 Ở nhiệt độ 4ºC,

chitinase tinh sạch vẫn giữ nguyên 100% hoạt tính trong 18 tuần; nhưng còn lại 80% hoạt

tính khi bổ sung chất phụ gia bảo quản như Na2S2O4, KCl và glycerol và còn lại 60% hoạt tính khi bảo quản bởi chất phụ gia NaN3 Mặt khác ở nhiệt độ phòng (từ 25 - 30ºC), không dùng chất phụ gia bảo quản thì chitinase mất hoàn toàn hoạt tính sau thời gian 14 tuần, nhưng hoạt tính chitinase vẫn giữ gần như 100% khi bảo quản bởi Na2S2O4, KCl và glycerol trong thời gian 14 tuần, hoặc bảo quản bằng NaN3 trong thời gian 11 tuần [119]

1.3.3 Cơ chế thủy phân chitin bởi chitinase thành NAG

Endochitinase phân cắt ngẫu nhiên trong nội mạch chitin và chitooligomer, sản phẩm tạo thành là hỗn hợp các chitooligomer trọng lượng phân tử khác nhau (di-acetylchitobiose, chitotriose, chitotetraose,…), nhưng chiếm đa số là các di-acetylchitobiose (NAG)2 do hoạt tính endochitinase không thể phân cắt thêm được nữa [128] Sau đó 1,4-β-chitobiosidase phân cắt chitin và chitooligomer ở mức trùng hợp lớn hơn hay bằng 3 [(NAG)n với n ≥ 3] từ đầu không khử và cho sản phẩm chính là diacetylchitobiose (NAG)2 [40], không chứa NAG hoặc chitooligomer β-N-acetylhexosamindase phân cắt diacetylchitobiose cũng như các polymer chitin cao hơn gồm chitotriose và chitotetraose thành NAG [80] Chính vì thế, nên phân biệt hoạt tính giữa endochitinase, 1,4-β-chitobiosidase và β-N-acetylhexosaminidase Sản phẩm sau cùng của sự phân cắt là NAG (Hình 1.6)

Hình 1.6 Minh họa cơ chế hoạt động của chitinase

Cơ chế thủy phân chitin thành NAG qua 2 giai đoạn: đầu tiên chitinase thủy phân chitin mạch dài thành các chitooligosaccharide ngắn mạch hơn, sau đó NAHase thủy phân chitooligosaccharide ngắn mạch ngắn thành NAG [60]

Tương tự, một số tác giả đã nghiên cứu quá trình thủy phân chitin bởi chế phẩm enzym chứa cả endochitinase và NAHase thành NAG và đều cho rằng đầu tiên

endochitinase thủy phân chitin thành N-acetyl chitooligosaccharides, sau đó N-acetyl chitooligosaccharides tiếp tục lần lượt được thủy phân bởi NAHase thành NAG [21, 151, 152] Mặt khác, Binod và cs (2007) cho rằng thủy phân chitin thành NAG qua một giai

đoạn thủy phân thì chế phẩm enzym thô từ Penicillium aculeatum NRRL 2129 và từ Trichoderma harzianum TUBF 927 phải chứa cả endochitinase và chitobiosidase Endochitinase hoạt tính cao nhất từ Penicillium aceleatum NRRL 2129 và chitobiosidase hoạt tính cao nhất từ Trichoderuma harzianum TUBF 927 thủy phân chitin thành NAG

đạt hiệu suất thu nhận cao [21] Ngoài ra, để thủy phân chitin bằng enzym thành NAG đạt hiệu suất thu nhận cao chỉ qua một giai đoạn thì chế phẩm enzym phải chứa đồng thời cả endochitinase và NAHase, đặc biệt hoạt tính NAHase cao và hoạt tính endochitinase phải tương đối thấp [9, 21, 154]

Binod và cs (2007) sản xuất NAG bằng cách dùng endochitinase hoạt tính cao nhất từ

Penicillium aceleatum NRRL 2129 và chitobiosidase hoạt tính cao nhất từ Trichoderuma harzianum TUBF 927 để thủy phân chitin thành NAG đạt hiệu suất thu nhận cao [21]

Sashiwa và cs (2002) cũng khẳng định endochitinase và exochitinase trong dịch

enzym thô từ Aeromonas hydrophila H-2330 đều hỗ trợ nhau trong thủy phân cơ chất

chitin thành NAG [134]

1.3.4 Một số giải pháp kỹ thuật thủy phân chitin thu nhận NAG

1.3.4.1 Các giải pháp tiền xử lý chitin

Chitin không hòa tan trong nước bởi tính kỵ nước, độ kết tinh cao, các liên kết hydro bền vững, nên nó khó bị thủy phân bởi enzym Sự thủy phân chitin tự nhiên bởi enzym bị hạn chế có thể là do khả năng tiếp cận với liên kết β-glycosidic trong nội mạch cấu trúc tinh thể gặp khó khăn [29] Mặt khác, khi thủy phân chitin bằng enzym thì phần chitin cấu trúc vô định hình dễ bị thủy phân hơn phần chitin cấu trúc tinh thể liên kết chặt chẽ [29]

Do đó để nâng cao hiệu quả thủy phân chitin thành NAG bởi chitinase, nhiều công trình nghiên cứu đã sử dụng phương pháp xử lý chitin bằng hóa học [67], nghiền bi [105], bằng sóng siêu âm [45] Ajavakom và cs (2012) cho thấy sóng siêu âm và vi sóng làm tăng quá trình thủy phân chitin thành NAG bằng acid [11]

A) Xử lý bởi tác nhân hóa học

Karube và cs (1993) đã nghiên cứu thấy rằng tác động nhiệt lên chitin trong dung môi kỵ nước hoặc chất hoạt động bề mặt sẽ làm suy yếu liên kết hydro, tương tác kỵ nước của cấu trúc tinh thể và do đó tạo thuận lợi cho hoạt động của các enzym phân hủy [67] Nới lỏng cấu trúc chitin bằng xử lý bởi các hydrocacbon mạch thẳng hoạt động bề mặt (như: Triton X-100, Tween 20, hexane, heptane, nonane, decane), hydrocacbon vòng thơm (benzene, toluene, o-oxylene, m-xylene, p-xylene), hoặc xử lý kết hợp làm nóng như đun sôi, nồi hấp, khuấy nhiệt, hoặc kết hợp siêu âm đã được nghiên cứu Phương pháp xử lý

như vậy giúp phá hủy cấu trúc tinh thể và tăng tỷ lệ chuyển đổi của chitin Chitin khuấy nhiệt ở 100ºC với urea 0,1 M; 0,2 M; 0,3 M; trong thời gian lần lượt 30 phút và 2 h làm tăng tỷ lệ chuyển đổi chitin từ 7% đến 13,9% so với nguyên liệu ban đầu không qua xử lý khi thủy phân bằng lysozyme Ngoài ra xử lý chitin với dodecane kết hợp siêu âm giúp tăng tỉ lệ chuyển đổi từ 4,4% đến 13,1% [67]

Bên cạnh đó, liên kết hydro và tương tác kỵ nước là cần thiết để duy trì cấu trúc ba chiều của enzym Các enzym phân hủy chitin có thể bị bất hoạt trong điều kiện nghiêm ngặt Vì vậy cần sử dụng nồng độ thấp các chất hóa học để hoạt động xúc tác enzym vẫn diễn ra trong phản ứng thủy phân chitin [29]

Gần đây, endochitinase chịu nhiệt nóng tốt đã được tìm thấy trong dịch dùng lên men của vi khuẩn, và có khả năng tương thích cao với chất hoạt động bề mặt sodium dodecyl sulfate (SDS) [29] Trong tương lai, những enzym này có thể được áp dụng để nâng cao hiệu quả thủy phân chitin

B) Xử lý bởi tác nhân cơ học

Cellulose từ rơm rạ là polysaccharide với cấu trúc tinh thể giống chitin có thể thay đổi mức độ tinh thể từ 74,2% xuống 4,9% bằng nghiền búa và hơn 50% cellulose từ rơm bị chuyển hóa thành glucose khi thủy phân enzym trong điều kiện nhẹ nhàng Rơm cắt ngắn 5

- 8 cm đưa đi nổ hơi sau đó nghiền thành bột mịn kích thước 60 µm giúp quá trình thủy phân thu đường khử cao nhất Tiến hành nghiền kết hợp nổ hơi có thể thủy phân 100% các chất lignocellulose bằng enzym [156]

Nghiền tác động làm chitin thay đổi cấu trúc và mức độ tinh thể [109] Bên cạnh đó, sau xử

lý bằng phương pháp nghiền, kích thước chitin thường giao động từ 50 µm đến 500 µm [29] Do vậy, nghiền đã làm tăng diện tích bề mặt tiếp xúc của chitin với enzym nên giúp thủy phân tốt

Chitin có kích thước khác nhau bị thủy phân bởi dịch enzym thô từ Aeromonas hydrophila H-2330 trong thời gian 10 ngày thành NAG đạt hiệu suất thu nhận khoảng 64%

- 77% Hầu hết NAG có độ tinh sạch 100% được sản xuất bởi dịch enzym này [134] Ảnh hưởng giải pháp xử lý cơ học hoặc xử lý hóa học lên khả năng thủy phân chitin được Kim

và cs (1998) nghiên cứu so sánh và khẳng định chitin cua hoặc chitin tôm đã xử lý hóa học (gel chitin) cho lượng NAG tạo thành cao hơn so với bột chitin cua hoặc tôm kích thước từ 180 - 250 μm [71] Cùng chung nồng độ cơ chất chitin và thời điểm thủy phân 24 h, chế phẩm chitinase

thô đã được cô đặc từ Penicillium monoverticillium CFR 2, từ Aspergillus flavus CFR 10

và từ Fusarium oxysporum CFR 8 thủy phân cơ chất gel chitin (chitin được xử lý bằng

phương pháp hóa học) thành NAG với nồng độ lần lượt 95,6; 96,6 và 96,1 mmol/l Trong khi đó, các chủng này lần lượt thủy phân cơ chất tinh thể α-chitin thành NAG đạt nồng độ lần lượt 10,11; 6,85 và 10,7 mmol/l [153]

Trong số các dạng chitin (gel chitin, bột chitin kích thước khác nhau, chitin xử lý bởi tiệt trùng với 1,0% dimethylacetamide, chitin xử lý bởi tiệt trùng với 0,1% H2SO4), Kim và cs (1998)

cho rằng bột chitin kích thước 180 - 250 μm giúp Serratia mareescens sinh tổng hợp chitinase cao

nhất, nhưng kích thước < 180 μm hoặc > 250 μm làm giảm sinh tổng hợp chitinase [71]

C) Xử lý bởi tác nhân vật lý

Phương pháp hấp và nổ hơi được sử dụng làm phồng hạt chitin, phương pháp này tăng hiệu quả khi kết hợp với dimethyl acetimide, và H2SO4 nồng độ thấp (0,1%) để phá

vỡ liên kết hydro trong liên kết chuỗi chitin [53]

Nhiệt độ nổ hơi khoảng 160ºC đến 238ºC, giới hạn có thể lên tới 400ºC, sau thời gian

từ 1 đến 10 phút thì hơi được xả đột ngột bởi xilanh, tạo hiện tượng vỡ cấu trúc vật liệu, làm khu vực tiếp xúc bề mặt tăng lên, có thể giúp phản ứng enzym tăng đến 10 lần so với vật liệu không được xử lý Cơ chế dựa vào giảm áp suất đột ngột, nguyên liệu bị nén và nổ [48, 102] Khi thực hiện tiền xử lý chitin ở 400ºC trong 1 phút thì hiệu suất thủy phân đạt 37% cao hơn nhiều so với chitin không qua xử lý chỉ cho hiệu suất thủy phân 5% [109] Chitin đã được quan sát qua sự thay đổi cấu trúc sau nổ hơi cho thấy giảm 11,28% các chỉ số tinh thể khi xử lý với tỷ lệ chitin/nước là 0,1 g/ml [45]

D) Xử lý bởi tác nhân bức xạ

Chiếu xạ bao gồm các tia gamma, chùm tia điện tử (electron), tia bức xạ lò vi sóng

Vi sóng có tần số 0,3 - 300 GHz nằm giữa ranh giới tia hồng ngoại và bức xạ sóng cao tần

có thể chuyển hóa năng lượng điện từ thành năng lượng nhiệt thúc đẩy phản ứng hóa học và phản ứng enzym [125] Roy và cs (2003) đã công bố chitin vừa được khuấy từ liên tục, vừa được chiếu xạ vi sóng (tần số 2,5 GHz) ở 57,5ºC trong 38 phút cho hiệu quả thủy phân cao hơn hẳn so với mẫu đối chứng chỉ được làm nóng ở nhiệt độ tương ứng và không xử lý vi sóng [125] Tia bức xạ có thể ưu tiên phân tách các liên kết glycoside trong chuỗi phân tử Chiếu xạ ở mức cao có thể dẫn đến sự phân hủy các oligosaccharide và các cấu trúc vòng glucose Tuy nhiên, các phương pháp chiếu xạ là tốn kém và khó khăn trong việc áp dụng công nghiệp [102]

E) Xử lý bởi tác nhân sóng siêu âm

Sóng siêu âm gây biến dạng nén giãn môi trường làm cho các phân tử liên tục bị ép lại và giãn ra dao động xung quanh vị trí cân bằng dẫn đến sinh nhiệt Lực tác động này đủ lớn để thắng lực hút giữa các phân tử, tạo thành lỗ vi mô trên nguyên liệu Nếu quá trình này xảy ra trong nước thì những lỗ đó sẽ bị hơi nước hoặc các khí hoà tan choán đầy, hình thành bóng bọt rồi dẫn đến hiện tượng vỡ bóng bọt, tạo nhiệt độ cao trong nguyên liệu [143] Chitosan là dẫn xuất của chitin, xử lý siêu âm làm cấu trúc của nó thay đổi bằng cách giảm liên kết hydro giữa các phân tử và nội phân tử và làm giảm trọng lượng phân tử do tạo thành lỗ hổng và hiện tượng vỡ bóng bọt Khi xử lý chitosan bằng siêu âm kết hợp hóa

chất giúp giảm 22,34% đến 27,26% khối lượng phân tử ban đầu, mức độ tinh thể giảm từ 19,16% xuống 9,04% Có thể thấy nhiều yếu tố tác động lên cấu trúc tinh thể sẽ là hiệu quả hơn nếu kết hợp các tác động khi xử lý Tương tự siêu âm làm giảm mức độ tinh thể của chitin và do vậy nâng cao hiệu quả thủy phân [45]

1.3.4.2 Điều kiện thủy phân chitin ra NAG bởi chế phẩm chitinase

Chế phẩm chitinase từ các nguồn vi sinh vật khác nhau có khả năng thủy phân chitin thành NAG cao nhất ở các điều kiện thủy phân khác nhau

A) Ảnh hưởng nhiệt độ tới khả năng thủy phân chitin thành NAG

Nhiệt độ là yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới khả năng thủy phân chitin thành NAG bởi chitinase Khoảng nhiệt độ thủy phân chitin bằng chế phẩm chitinase thành NAG chính

là khoảng giới hạn nhiệt độ hoạt động chitinase Chitinase được sinh tổng hợp từ vi sinh vật khác nhau sẽ có khoảng nhiệt độ hoạt động khác nhau Ở nhiệt độ hoạt động tối ưu, chitinase có khả năng thủy phân chitin thành NAG là cao nhất Cụ thể: Nhiệt độ tối ưu cho thủy phân cơ chất gel chitin thành NAG là 40ºC bằng chế phẩm chitinase thô từ chủng vi

sinh vật như Aeromonas sp GJ-18 [78], Aspergillus sp [137], Penicillium sp LYG 0704 [84], Penicillium chrysogenum [112], hoặc bằng NAHase tinh sạch từ P oxalicum [121, 123], Chế phẩm chitinase từ Trichoderma harzianum có khả năng thủy phân chitin trong

khoảng nhiệt độ rộng từ 25 - 60ºC và nhiệt độ tối ưu cho thủy phân chitin thành NAG là

40ºC [62] Ở nhiệt độ 37ºC, chế phẩm chitinase từ Aeromonas sp PTCC 1691 thủy phân

gel chitin thành NAG cao nhất đạt hiệu suất thu nhận 79% [60],

Chế phẩm enzym thô từ Aeromonas sp chứa hoạt tính NAHase và chitobiosidase; ở

nhiệt độ trên 50ºC, NAHase bị vô hoạt, nhưng chitobiosidase lại ổn định Nên ảnh hưởng

của nhiệt độ tới thủy phân gel chitin thành NAG bởi chế phẩm enzym thô từ Aeromonas sp

đã được các nhà khoa học nghiên cứu Kuk và cs (2015) cho rằng chế phẩm enzym thô từ

Aeromonas sp GJ-18 thủy phân gel chitin ở nhiệt độ dưới 45ºC cho sản phẩm chính là

NAG, cùng với lượng nhỏ (NAG)2 và (NAG)3, nhưng nhiệt độ thủy phân trên 50ºC thì (NAG)2 là sản phẩm chính [78] Ngoài ra Kuk và cs (2005) cho rằng trong 120 h thủy phân, ở nhiệt độ 45ºC, NAG là sản phẩm chính (chiếm 94%) với hiệu suất thu nhận đạt 74%, nhưng ở 55ºC thì (NAG)2 lại là sản phẩm chính (chiếm 86%) [77] Trong 120 h thủy

phân, enzym thô từ Aeromonas hydrophila H-2330 thủy phân gel chitin cho sản phẩm tạo

thành gồm 74% NAG và 4,8% (NAG)2 ở nhiệt độ 45ºC, nhưng nhiệt độ 55ºC thì sản phẩm tạo thành gồm 3,9% NAG, 34,7% (NAG)2 và 1,6% (NAG)3 [134]

B) Ảnh hưởng pH tới khả năng thủy phân chitin thành NAG

pH môi trường ảnh hưởng trực tiếp tới trung tâm hoạt động của enzym Chế phẩm chitinase thô từ vi sinh vật có khả năng thủy phân cơ chất chitin thành NAG trong khoảng

pH nhất định và khả năng thủy phân này đạt cao nhất tại pH tối ưu pH tối ưu cho sự thủy

phân gel chitin thành NAG bởi chế phẩm enzym từ Aspergillus sp là pH 3,5 [137], bởi chế phẩm chitinase thô từ Aeromonas sp GJ-18 là pH 5 [78], bởi chế phẩm enzym thô từ Aeromonas sp PTCC 1691 là pH 8 Khoảng pH tối ưu cho chitinase từ Penicillium oxalicum thích hợp để thủy phân chitin là 4,5 - 6,5 [121]

C) Ảnh hưởng nồng độ cơ chất tới khả năng thủy phân chitin thành NAG

Ở tỷ lệ gel chitin/ enzym là 10 mg/U trong điều kiện tối ưu và giữ nồng độ enzym

không đổi, Kuk và cs (2005) cho rằng chế phẩm chitinase thô từ Aeromonas sp GJ-18 thủy

phân gel chitin thành NAG đạt HSTP lớn nhất 94,9% [78] Jamialahmadi và cs (2011) khẳng định ở điều kiện tối ưu và tỷ lệ gel chitin/enzym là 0,5 mg/U thì chế phẩm enzym thô từ

Aeromonas sp PTCC 1691 thủy phân gel chitin thành NAG đạt hiệu suất thu nhận lớn nhất

79%; khi giữ nồng độ enzym không đổi, nồng độ cơ chất gel chitin tăng từ 5 đến 10 mg/ml thì HSTP ra NAG tăng mạnh, nhưng nồng độ gel chitin tăng thêm nữa lại làm HSTP NAG giảm xuống [60] Sukwattanasinitt và cs (2002) khẳng định ảnh hưởng nồng độ cơ chất lên NAG tạo thành khi dùng hỗn hợp enzym (9:1 cellulase Ac và lipase An) như sau: tăng nồng độ β-chitin

và giữ nồng độ enzym không đổi dẫn đến hiệu suất thu nhận NAG giảm xuống Cụ thể nồng

độ cơ chất tăng từ 10 đến 40 mg/ml làm hiệu suất thu nhận NAG giảm một nửa từ 61% xuống 28% Và điều này đã được giải thích rằng: nồng độ cơ chất tăng làm tăng độ nhớt, dẫn đến giảm sự khuếch tán giữa enzym và cơ chất nên HSTP NAG giảm [150]

D) Ảnh hưởng thời gian và nồng độ enzym tới khả năng thủy phân chitin thành NAG Thời gian thủy phân không những ảnh hưởng đến chi phí của quá trình mà còn ảnh hưởng đến chất lượng của sản phẩm sau thủy phân Xác định thời gian thủy phân thích hợp

sẽ giúp tiết kiệm chi phí, nâng cao hiệu suất của quá trình

Theo nghiên cứu của Pichyangkura và cs (2002), α-chitin và β-chitin có thể thủy phân hoàn toàn với chitinase (EC 3.2.1.14) và β-N-acetylhexosaminidase (EC 3.2.1.52) để

sản xuất NAG Chitinase từ Burkholderia cepacia TU09 thủy phân β-chitin và α-chitin

tương ứng trong vòng 24 h và 168 h cho hiệu suất thu nhận NAG lớn hơn 85%, trong khi

đó chitinase từ Bacillus licheniformis SK-1 thủy phân hoàn toàn β-chitin trong 144 h đạt

hiệu suất thu nhận NAG cuối cùng là 75% cùng 20% chitobiose [115]

Trong điều kiện thủy phân tối ưu, Kuk và cs (2005b) khẳng định chế phẩm chitinase

từ Aeromonas sp GJ-18 thủy phân gel chitin thu nhận NAG với hiệu suất thu nhận NAG

83,0% và 94,9% tương ứng thời gian thủy phân 120 h và 216 h [78] Bên cạnh đó, Kuk và

cs (2005a) cho rằng enzym thô từ Aeromonas sp thủy phân gel chitin thành NAG với hiệu

suất 74% trong 120 h thủy phân [77]

Hiệu suất thu nhận NAG khoảng 66% - 77% tại thời điểm 240 h thủy phân bột

α-chitin bởi chế phẩm enzym từ Aeromonas hydrophila H-2330 được công bố bởi Sashiwa

và cs (2002) [134]

Khi thủy phân chitin thành NAG bởi chế phẩm enzym với nồng độ càng cao thì thời gian thủy phân càng giảm Để tiết kiệm thời gian và lựa chọn nồng độ enzym hợp lý, nhiều nhà nghiên cứu đã khảo sát nồng độ enzym đối với các loại chế phẩm chitinase thô khác nhau ảnh hưởng tới hiệu suất thủy phân chitin thành NAG trong khoảng thời gian khác nhau như:

Kuk và cs (2005) cho rằng nồng độ enzym của chế phẩm chitinase thô từ Aeromonas

sp GJ-18 càng cao thì NAG tạo thành càng lớn khi cùng chung nồng độ cơ chất gel chitin; tuy nhiên lượng NAG tạo thành không khác nhau đối với tỷ lệ nồng độ enzym và cơ chất khoảng 10 U/100 mg và 8 U/100 mg; hiệu suất thủy phân gel chitin ra NAG tăng mạnh ở

120 h nhưng gần như không đổi sau 168 h [78]

Jamialahmadi và cs (2011) cho rằng ở điều kiện tối ưu, chế phẩm enzym thô từ

Aeromonas sp PTCC 1691 thủy phân gel chitin thành NAG lớn nhất khi tỷ lệ enzym/gel

chitin là 2 U/mg, hiệu suất thu nhận NAG tăng dần và đạt lớn nhất 79% tại thời điểm 24 h nhưng sau đó gần như không đổi; trái lại không khác nhau khi tỷ lệ nồng độ enzym và cơ chất từ 4 U/10 mg và 8 U/10 mg [60] Ngoài ra Jung và cs (2007) công bố enzym thô từ

Paenibacillus illinoisensis KJA-424 thủy phân chitin thành NAG tăng liên tục trong 24 h

và đạt hiệu suất thu nhận NAG cao nhất 62,2% tại 24 h [63]

Chitinase từ Burkholderia cepacia TU09 thủy phân β-chitin (bột chitin mai mực kích

thước 3 µm) và α-chitin (bột chitin vỏ cua kích thước 14 μm) thành NAG với hiệu suất thu

nhận hơn 85% trong thời gian tương ứng 24 h và 168 h Chitinase từ Bacillus licheniformis

SK-1 thủy phân hoàn toàn β-chitin trong 144 h, cho hiệu suất thu nhận NAG 75% Ở tỷ lệ

enzym/cơ chất β-chitin là U/100 mg, B cepacia TU09 thủy phân β-chitin cho hiệu suất thu

nhận NAG 90% trong 24 h thủy phân [115]

Binod và cs (2007) sản xuất NAG bằng cách dùng endochitinase hoạt tính cao nhất từ

Penicillium aceleatum NRRL 2129 và chitobiosidase hoạt tính cao nhất từ Trichoderuma harzianum TUBF 927 để thủy phân chitin thành NAG đạt hiệu suất thu nhận cao [21]

Jamialahmadi và cs (2011) công bố endochitinase và exochitinase trong dịch enzym

thô từ Aeromonas sp PTCC 1691 [60]; Sashiwa và cs (2002) cũng khẳng định endochitinase và exochitinase trong dịch enzym thô từ Aeromonas hydrophila H-2330 đều

hỗ trợ nhau trong thủy phân cơ chất chitin thành NAG [134]

Để enzym thủy phân chitin thành NAG đạt hiệu suất thu nhận cao, thì chế phẩm enzym phải chứa endochitinase với hoạt tính thấp và β-N-acetylhexosaminidase hoạt tính cao [9, 21, 154]

1.4 SINH TỔNG HỢP CHITINASE TỪ VI SINH VẬT

Trong các nguồn thu nhận chitinase thì chitinase từ vi sinh vật là quan trọng và chiếm số lượng nhiều hơn cả Nhiều nghiên cứu thu hồi dịch chitinase thô từ vi sinh vật như: thu hồi

dịch chitinase thô từ Bacillus licheniformis SK-1, Aeromonas hydrophila H2330 [134],

Aeromonas sp GJ-18 [78] Aspergillus niger, Carcica papaya L và Acremonium cellulolyticus [133], Trichoderma viride [7], từ một số chủng nấm mốc như Penicillium monoverticillium CFR 2, Aspergillus flavus CFR 10 và Fusarium oxysporum CFR 8 [152],

1.4.1 Nguồn vi sinh vật sinh tổng hợp chitinase

Vi sinh vật sinh tổng hợp chitinase được phân lập từ nhiều nguồn khác nhau trong đất, phế thải giáp xác, khu vực bón phân, và dòng suối nóng [190] Hầu hết chitinase được tạo ra từ vi sinh vật - phân lập từ mẫu đất biển Chitinase được tạo ra nhằm phân giải chitin trong môi trường cung cấp nguồn cacbon cho sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật Nguồn vi sinh vật đáng kể có khả năng sinh tổng hợp chitinase là vi khuẩn Chitinase

vi khuẩn tạo ra phần lớn từ họ Alteromonas [165], Bacillus (B megaterium, B licheniformis, B circulans, ) [99], Escherchia [174], Pseudomonas (P aeruginosa , P maltophilia) [172], Serratia (S marcescens, S liquefaciens), Arthrobacter, Beneckea, Enterobacter Chromobacterium, Klebriella, Clostridium (C perfringens, C puraputrificum, ), Vibrio (V fluvialis, V harveyi, V vulnificus)

Nguồn xạ khuẩn: Chitinase xạ khuẩn đại đa số được tạo ra từ họ Streptomycetes (S viridificans, S aureofaciens, S coelicolor, S glaucescens, S kanamycitis, S lividans, S parvies và S venezuelae) [46]

Nguồn nấm sợi: Chitinase từ nấm mốc phần lớn do họ Trichoderma và Aspergillus (A nidulans,…) sinh tổng hợp tạo ra, tiếp đó là Penicillium (P citrinum [4], P janthinellum [38], P aculeatum NRRL 2129 [22], P chrysogenum [112], Pencillium sp LYG 0704 [84], Aspergillus sp [137], Aeromonas sp PTCC 1691 [60], A hydrophila H-2330 đều có khả năng sinh tổng hợp cả endochitinase và exochitinase [134], đặc biệt Penicillium oxalicum có khả năng sinh tổng hợp endochitinase [123] và NAHase [121] P monoverticillium CFR 2, Aspergillus flavus CFR 10 và Fusarium oxysporum CFR 8 đều sinh tổng hợp cả

endochitinase và NAHase, tỷ lệ hoạt độ endochitinase so với NAHase là thấp [152]

Penicillium aculeatum NRRL 2129 có khả năng sinh tổng hợp chitinase cao, nhưng Trichoderma harzianum TUBF 927 lại sinh tổng hợp chitobiosidase hoạt tính cao [21] Hiện nay, Penicillium có khả năng sinh tổng hợp hàng loạt các enzym ngoại bào [114]

1.4.2 Ảnh hưởng của nguồn cacbon tới sinh tổng hợp chitinase

Cacbon chiếm tỉ lệ trên 50% trọng lượng khô tế bào, nó tồn tại trong tế bào chất, ở tất cả các phân tử của enzym, axit nucleic và các sản phẩm trao đổi chất Ngoài nhiệm vụ

là nguồn cung cấp năng lượng, tạo thành những tiền chất, hợp chất cacbon còn tạo ra các quá trình oxy hóa khử để biến đổi những tiền chất này thành những sản phẩm trung gian hoặc những sản phẩm cuối cùng dùng xây dựng tế bào, đồng thời tích tụ trong môi trường một vài sản phẩm sinh tổng hợp

Nguồn cacbon là nhân tố chính ảnh hưởng tới sinh tổng hợp chitinase từ các loài vi sinh vật [50, 145]

Khi bổ sung glucose, tinh bột, lamanarin, β-glucan và glycerol vào môi trường lên men thì sinh tổng hợp chitinase từ vi khuẩn bị ức chế Nhưng đối với nấm mốc, sinh tổng hợp chitinase lại tăng do thêm pectin, tinh bột, lamanarin, β-glucan Sinh tổng hợp chitinase ngoại bào từ

Fusarium chlamydosporum với hoạt độ lớn nhất khi sử dụng saccarose 10 mM [95] Streptomyces viridificans sinh tổng hợp chitinase gấp 2 khi môi trường chứa arabinose (trong số

các loại đường pentose và hexose), nhưng chứa glucose lại gây kìm chế sự tạo enzym này [46]

Sinh tổng hợp chitinase cao nhất từ Vibrio alginolyticus ở 2 g/l glucose [108], từ Alcaligenes xylosoxydans sinh tổng hợp chitinase ở 2 g/l tinh bột [170]

Nếu môi trường chỉ chứa nguồn cacbon dễ hấp thụ như glucose, tinh bột tan thì vi sinh vật phát triển về mặt sinh khối, nghĩa là lượng sinh khối thu được nhiều nhưng lượng chitinase mà vi sinh vật tiết ra môi trường là rất ít Muốn thu được enzym thì cần phải có chất cảm ứng Chất cảm ứng cho sinh tổng hợp chitinase là chitin

Dạng chất cảm ứng để sinh tổng hợp chitinase từ vi sinh vật - phân lập ở đất biển có thể là gel chitin, vỏ cua và vỏ tôm đã xử lý [36]

Nguồn cacbon trong môi trường lên men cạn kiệt thì Penicillium oxalicum sinh tổng

hợp cả chitinase và β-N-acetylglucosaminidase Môi trường lên men chứa cả glucose và 6 g/l gel chitin thì β-N-acetylglucosaminidase có hoạt tính cao nhất Chitinase được sinh tổng hợp cao nhất khi môi trường lên men chứa glucose cùng NAG hoặc 2 g/l gel chitin [122]

Kim và Ji (2001) khẳng định bột chitin kích thước từ 180 - 250 µm giúp Streptomyces griseus HUT 6037 sinh tổng hợp chitinase tốt hơn so với gel chitin [72] Ngoài ra, Setthakaset và

cs (2008) cho rằng trong số các dạng chitin cảm ứng như bột α-chitin, β-chitin kích thước khoảng

50 μm - 100 μm, gel chitin thì dạng chất cảm ứng ảnh hưởng tới sinh tổng hợp chitinase từ

Aspergillus sp lớn nhất là dạng bột β-chitin, kém nhất là bột α-chitin [137]

Gel chitin là dạng chất cảm ứng tốt nhất để Streptomyce cinereoruber lên men sinh

tổng hợp chitinase hoạt độ 20,7 U/ml Ngoài ra, gel chitin cũng là chất cảm ứng tốt cho

Aspergillus niger sinh tổng hợp chitinase hoạt độ 16,4 U/ml [155] Mahadevan và Crawford cho rằng chủng Streptomyces sinh tổng hợp chitinase cao nhất khi nồng độ gel chitin khoảng 0,8 - 1,4 g/l [93] Saima và cs (2013) khẳng định Aeromonas hydrophila HS4

và A punctata HS6 sinh tổng hợp chitinase ngoại bào cao nhất lần lượt đạt 64,41 U/ml và

59,41 U/ml khi nồng độ gel chitin 0,3% [129]

Bacillius aminolquefaciens, B megatrium và B subtilis sinh tổng hợp chitinase ở

hoạt độ lần lượt 1,9 mU/l; 3,9 mU/l, 3,6 mU/l và 1,7 mU/l khi sử dụng chất cảm ứng 1% chitin từ phế phẩm vỏ tôm; ngoài ra các chủng này sinh tổng hợp chitinase với hoạt độ cao lần lượt là 2,7 mU/l; 3,4 mU/l; 2,2 mU/l và 4,3 mU/l ở chất cảm ứng 1% chitin thương mại [127]

Sinh tổng hợp chitinase cao nhất từ Fusarium chlamydosporum ở nồng độ 0,5% gel chitin [95], từ Aeromonas sp no 16 ở nồng độ 1,5% gel chitin [57], từ Aeromonas sp GJ-18 ở 1% gel chitin [77], từ Streptomyces viridificans ở 1,5% gel chitin [46], từ Serratia marcescens

XJ-01 ở nồng độ 0,75% gel chitin [179], từ Streptomyces cinereoruber ở nồng độ 5 g/l thành tế

bào Aspergillus niger, từ A carneus ở 10 g/l chitin, từ Cellulosimicrobium cellulans 191 ở 15 g/l chitin [92], từ Vibrio alginolyticus ở 3 g/l chitin mai mực [108], từ Pseudomonas aerogunisa K-187 ở 3% phế thải vỏ tôm và cua và 0,1% carboxymethy chitin [131]

Môi trường lên men chứa chất cảm ứng chitin 10% giúp nấm sợi Penicillium oxalicum sinh tổng hợp chitinase hoạt tính cao nhất [3]

1.4.3 Ảnh hưởng của nguồn và nồng độ nitơ tới sinh tổng hợp chitinase

Thành phần quan trọng của tế bào đều chứa Nitơ (Protein, axit nucleic, enzym, ) Nitơ chiếm 10 - 15% trọng lượng khô Nitơ tham gia cấu tạo protein như: axit amin, glycoprotein, lipitprotein, peptidoglucan Protein chiếm tỷ lệ cao nhất trong thành phần chất khô (phổ biến từ 60 - 85%) Protein giữ chức năng tham gia cấu trúc mọi bào quan của

tế bào, đặc biệt enzym giữ vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi chất ở nấm sợi, trong

đó cả enzym deacetyl hóa chitin thành chitosan trên thành tế bào [44]

Nguồn nitơ là cần thiết để đạt hiệu suất cao và có lợi về mặt kinh tế trong lên men sinh tổng hợp enzym Các loại hợp chất nitơ mà nấm sợi có thể đồng hóa được thường là cao nấm men (CNM), cao malt, cao ngô, và các nguồn nitơ vô cơ như NH4NO3, (NH4)2SO4, NaNO3, urea…Trong đó nguồn cao nấm men, pepton là thành phần mà các loài nấm tiếp hợp và ưa sử dụng nhất [144]

Nguồn nitơ là nhân tố chính ảnh hưởng tới sinh tổng hợp chitinase từ các loài vi sinh vật [50, 145] Trong sinh tổng hợp chitinase, nhu cầu nitơ về nồng độ và nguồn khác nhau đối với

từng chủng vi sinh vật Sinh tổng hợp chitinase cao nhất từ Myrothecium verucaria trên

môi trường (g/l): cao nấm men, 0,5; pepton, 0,5 Đặc biệt bổ sung 0,03% urea thì tổng hợp

chitinase tăng gấp 4 [171] Fusarium chlamydosporum sinh tổng hợp chitinase lớn nhất khi

môi trường chứa NaNO3 15 mM [95] Aspergillus carneus sinh tổng hợp chitinase lớn nhất

ở môi trường chứa cao nấm men 3 g/l [139] Aeromonas sp GJ-18 sinh tổng hợp chitinase

ngoại bào cao nhất trong môi trường lên men chứa 1% tryptone [77]

Peptone 3% là nguồn nitơ tốt nhất để Pseudomonas stulzeri YPL-1 tạo chitinase [55] Môi trường lên men sinh tổng hợp chitinase cao nhất đối với Vibrio alginolyticus

chứa (g/l): pepton, 7,5 và cao nấm men, 2 [108] 0,5% (NH4)2SO4 được xem là nguồn nitơ

tốt nhất cho Serratia marcescens XJ-01 sinh tổng hợp chitinase [179]

Môi trường lên men chứa hỗn hợp 4,0 g/l CNM và 2,0 g/l tryptone sinh tổng hợp

chitinase cao nhất đạt 6,9 U/ml từ Cellulosimicrobium cellulans 191 [92] Alcaligenes xylosoxydans sinh tổng hợp chitinase lớn nhất khi môi trường lên men 4 g/l CNM [170]

Khả năng sinh tổng hợp chitinase từ các loài Streptomyces tăng khi bổ sung

(NH4)2SO4 nhưng giảm khi bổ sung CNM vào môi trường lên men [106] Ngược lại

Bacillus licheniformis TH-1 sinh tổng hợp chitinase tăng khi bổ sung CNM vào môi trường lên men [8] và B pumilus [120, 160]

1.4.4 Ảnh hưởng của nguyên tố khoáng tới sinh tổng hợp chitinase

Ngoài nguồn cacbon, nitơ thì các nguyên tố khoáng cũng có tác dụng nhất định đối với quá trình phát triển của vi sinh vật, chúng cần thiết cho sự duy trì cân bằng sinh lý tế bào Các nguyên tố khoáng bao gồm các nguyên tố vi lượng như Mn, Cu, Fe, Zn…được bổ sung dạng muối vô cơ như KH2PO4, MgSO4… Mỗi nguyên tố khoáng có chức năng riêng đối với vi sinh vật như photpho tham gia thành phần cấu tạo của axit nucleic, phophoprotein, photpholipit và nhiều coenzym quan trọng như ATP, NADP, ADP…Các kim loại này đóng vai trò quan trọng để sinh tổng hợp chitinase từ một số vi sinh vật [76, 106]

Môi trường lên men sinh tổng hợp chitinase lớn nhất từ Streptomyces cinereoruber,

từ Aspergillus niger đều cần lượng nhỏ các thành phần như: 0,2% K2HPO4, 0,1% MgSO4, 0,01% FeSO4 7H2O [155] Sinh tổng hợp chitinase cao nhất từ Cellulosimicrobium cellulans 191 cần 4,0 g/l MgSO4.7H2O; 1,2 g/l KH2PO4; 2,8 g/l K2HPO4 [92], từ

Alcaligenes xylosoxydans cần K2HPO4 0,2%, MgSO4.7H2O 0,1% và FeSO4.7H2O 0,01%

[170], từ Vibrio alginolyticus cần K2HPO4, 2 g/l và nước biển, 75% (v/v) [108], từ

Aeromonas sp GJ-18 cần 1% NaCl [77],

Các ion kim loại đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì cấu trúc và cấu hình của enzym

Ảnh hưởng của các ion kim loại lên sinh tổng hợp chitinase từ Aeromonas hydrophia HS4 và A punctata HS6 đã được công bố bởi Saima và cs (2013) Khi bổ sung một số ion kim loại vào môi

trường thấy: Co2+ và Mn2+ giúp A hydrophia HS4 và A punctata HS6 sinh tổng hợp chitinase tăng;

nhưng Ca2+ và Mg2+ gây ức chế Aeromonas hydrophia HS4 sinh tổng hợp chitinase; Fe2+, Mg2+, và

Hg2+ ức chế A punctata HS6 sinh tổng hợp chitinase [129]

Tương tự MnSO4 and FeSO4 đều đóng vai trò quan trọng để sinh tổng hợp chitinase

từ Aspergillus terreus [43], cũng như từ Bacillus pumilus [160]

Trong môi trường lên men, ở nổng độ Mg2+và PO43- thấp, Streptomyces sinh tổng

hợp chitinase tăng nhưng ở nổng độ Mg2+ và PO43- cao thì ngược lại [106] PO43- đóng vai

trò quan trọng sinh tổng hợp chitinase từ Paenibacillus sp D1 [145],

1.4.5 Ảnh hưởng của pH tới sinh tổng hợp chitinase

pH môi trường lên men ảnh hưởng lớn đến sự phát triển và khả năng sinh tổng hợp enzym của vi sinh vật bởi lẽ ion H+ và OH- tác động trực tiếp lên màng nguyên sinh chất, làm thay đổi sự vận chuyển chất cảm ứng vào tế bào và vận chuyển enzym ra ngoài môi trường Nên những biến đổi dù nhỏ nhất nồng độ của chúng trong môi trường cũng gây những biến đổi rõ rệt về khả năng sinh trưởng và phát triển sinh vật

Mặt khác ion H+ và OH– cũng ảnh hưởng đến hệ enzym trong vi sinh vật, tham gia hoạt động sống của vi sinh vật pH thích hợp cho sinh tổng hợp chitinase từ vi sính vật thường trong vùng axit yếu (từ 4,0 - 6,5), vùng trung tính (pH 7,0), một số ở vùng kiềm yếu (từ 7,5 - 9,0) Tùy vào chủng vi sinh vật mà pH tối thích của nó khác nhau

Môi trường bán rắn sinh tổng hợp chitinase hoạt tính cao nhất từ nấm sợi ở khoảng

pH 4 - 6 như từ Penicillium oxalicum ở pH 4,1 [3], từ Penicillium chrysogenum ở pH 4 [112], từ Trichoderna spp ở pH 5,0 [5], từ Aspergillus protuberus ở pH 5,5 [50]

Ở môi trường lỏng, lên men sinh tổng hợp chitinase hoạt tính lớn nhất đối với chủng vi

sinh vật ưa axit nhẹ pH từ 3,5 - 6 như từ Aspergillus sp ở pH 3,5 [137]; từ Trichoderma

harzianum ở pH 4,9 [37] hoặc ở pH 5,6 [66]; từ Talaromyces emersonii CBS81470 [97], từ

Myrothecium verucaria [171], từ Nocardia orientalis đều ở pH 5,0 [169], từ Talaromyces emersonii đều ở pH 5,0 [97], từ Alcaligenes xylosoxydans ở pH 6 [170],

Một số chủng sinh tổng hợp chitinase lớn nhất ở môi trường trung tính như từ

Streptomyces cinereoruber, từ Aspergillus niger [155] và từ Pseudomonas stulzeri YPL-1 đều ở pH 6,8 [55]; từ Bacillus lichiniformis [158], từ Cellulosimicrobium cellulans 191, từ Aeromonas punctata HS6 đều ở pH 7,0 [129],

Ngoài ra chủng vi sinh vật sinh tổng hợp chitinase tối ưu trong môi trường kiềm nhẹ

pH khoảng 7,5 - 9,0 như từ Vibrio alginolyticus ở pH 7,5 [108]; từ Serratia marcescens [189], từ Aeromonas hydrophila HS4 đều ở pH 8,0 [129], từ Microbispora sp.V2 ở pH 8,5 [107], từ Pseudomonas aerogunisa K-187 ở pH 9,0 [131],

1.4.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới sinh tổng hợp chitinase

Nhiệt độ ảnh hưởng lớn đến tốc độ sinh trưởng và khả năng sinh tổng hợp enzym của vi sinh vật Nhiệt độ từ 28 - 32ºC là tối ưu cho sự sinh trưởng của hầu hết vi sinh vật [36], nhiệt độ tối đa là dưới 50ºC Nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp có thể kìm hãm sự sinh trưởng, thậm chí làm vô hoạt sợi nấm nên quá trình tổng hợp enzym sẽ bị ức chế

Sinh tổng hợp chitinase cao nhất ở khoảng nhiệt độ 25ºC - 35ºC từ chủng vi sinh vật

như từ Cellulosimicrobium cellulans 191 ở 25ºC, từ Streptomyces cinereoruber [155] cũng như Myrothecium verucaria ở 28ºC [171], từ Fusarium chlamydosporum ở 28ºC [95], từ Trichoderma harzianum ở 28ºC [66] và ở 30ºC [37], từ Streptomyces lividans [93] cũng như S viridificans [46] ở 30ºC, từ Aspergillus protuberus ở 30ºC [50], từ Aeromonas sp GJ-18 ở 30ºC [77], từ Paenibacillus sp CHE-N1 ở 34,3ºC [65], từ Microbispora sp V2 cũng như từ Alcaligenes xylosoxydans ở 35ºC [107],

Khoảng nhiệt độ 37ºC - 40ºC là tối ưu cho sinh tổng hợp enzym đối với các chủng vi

sinh vật như Aspergillus sp ở 40ºC [139], Vibrio alginolyticus ở 37ºC [108]; đối với các loài thuộc chi Aeromonas ở 37ºC [76]

Saima và cs (2013) công bố nhiệt độ 37ºC là nhiệt độ tối ưu cho loài Aeromonas [76] (như A hydrophila HS4, A punctata HS6, ) lên men sinh tổng hợp chitinase; khả năng sinh tổng hợp chitinase từ A punctata HS6 giảm ở nhiệt độ trên 40ºC và từ A hydrophila

HS4 khi nhiệt độ trên 50ºC [129]

Ngoài ra một số chủng chịu nhiệt có khả năng sinh tổng hợp chitinase ở nhiệt độ cao

như từ Pseudomonas aerogunisa K-187 ở 45ºC [131], từ Pseudomonas aerogunisa K-187

ở nhiệt độ 45ºC [131], từ Bacillus lichiniformis ở 50ºC [158]

1.4.7 Ảnh hưởng của thời gian tới sinh tổng hợp chitinase

Khi thực hiện lên men, hầu hết vi khuẩn tổng hợp ra chitinase lớn nhất tại giờ thứ 72, nhưng nấm mốc và xạ khuẩn tổng hợp chitinase lớn nhất ở khoảng giờ thứ 144 [36]

Lên men trong môi trường lỏng ở điều kiện tối ưu, các vi khuẩn như: Talaromyces emersonii CBS81470 sinh tổng hợp lần lượt chitinase 1,5 mU/l trong bình tam giác nuôi lắc 96 h và 2,3 mU/l ở bồn lên men 48 h [97] Pseudomonas stulzeri YPL-1 sinh tổng hợp chitinase lớn nhất đạt được sau 84 h lên men [55] Serratia marcescens lên men theo mẻ

cũng như liên tục để sinh tổng hợp chitinase cao nhất đạt 0,027 mU/ml sau thời gian 100 h

[189] Aeromonas sp PTCC1691 sinh tổng hợp chitinase cao nhất đạt 9,2 U/ml tại 48 h lên

men, sau đó khả năng sinh tổng hợp chitinase giảm khi thời gian lên men kéo dài hơn 48 h

[60] Aeromonas hydrophila HS4 sinh tổng hợp chitinase cao nhất sau thời gian lên men 24

h và duy trì không đổi đến tận 48 h lên men đạt 80,9 U/ml, trong khi A punctata HS6 sinh

tổng hợp chitinase cao nhất đạt 82,36 U/ml tại 48 h lên men, sau thời gian 48 h lên men, cả

hai chủng này đều sinh tổng hợp chitinase giảm dần [129] Aeromonas sp GJ-18 sinh tổng

hợp chitinase ngoại bào cao nhất tại 120 h lên men đạt 1,44 U/ml, sau thời gian 120 h lên men khả năng sinh tổng hợp chitinase giảm [77]

Streptomyces viridificans sinh tổng hợp chitinase cao nhất tại thời điểm 144 h lên

men [46]; S cinereoruber sinh tổng hợp 0,85 mU/ml sau 96 h lên men [155]; chế phẩm

chitinase 6,9 U/mL được sinh tổng hợp từ Cellulosimicrobium cellulans 191 ở 72 h lên men [92] Chitinase từ Streptomyces griseus HUT 6037 được sinh tổng hợp bắt đầu ở giờ

thứ 36 và đạt hoạt độ 8,6 U/ml tại 120 h lên men [72]

Sinh tổng hợp chitinase từ nấm sợi ở điều kiện tối ưu như: Aspergillus sp sinh tổng hợp chitinase thô hoạt độ cao nhất 3,1 U/ml tại 120 h lên men [137], Aspergillus sinh tổng hợp chitinase cao nhất 0,0473 mU/ml tại thời điểm 168 h lên men [139]; Trichoderma harzianum [36] sinh tổng hợp chitinase lớn nhất 0,196 mU/ml tại thời điểm 120 h lên men; Myrothecium verucaria sinh tổng hợp chitinase cao nhất tại 168 h lên men [171]; Fusarium chlamydosporum sinh tổng hợp chitinase ngoại bào lớn nhất sau 192 h lên men [95]; Alcaligenes sinh tổng hợp chitinase tại 60 h lên men [170],

Tại 166 h lên men, Penicillium monoverticillium CFR 2, Aspergillus flavus CFR 10

và Fusarium oxysporum CFR 8 đều có khả năng sinh tổng hợp endochitinase và

β-N-acetylhexosaminidase hoạt tính cao nhất [153]

Penicillium sp LYG 0704 bắt đầu sinh tổng hợp chitinase tại 24 h lên men và tiếp

tục tăng dần cho đến khi đạt được hoạt tính cao nhất sau 72 h lên men [84]

1.4.8 Ảnh hưởng của tốc độ lắc và cường độ khuấy tới sinh tổng hợp chitinase

Lên men chìm, sự lắc (khuấy) đóng vai trò quan trọng trong chuyển khối Tốc độ khuấy càng cao thì tốc độ dịch chuyển của dịch càng lớn Cường độ khuấy tối ưu đóng vai trò quan trọng cho sự sống và tăng trưởng tế bào vi sinh vật trong suốt quá trình lên men Tốc độ khuấy cao gây sự dịch chuyển mạnh nên làm các enzym có thể mất chức năng do cấu trúc bị thay đổi [136]

Cường độ khuấy ảnh hưởng lên hình thái học nấm và sự chuyển khối của phản ứng sinh hóa [88] Trong nhiều quá trình lên men nấm, tốc độ khuấy cao là cần thiết đủ cho đảo trộn và chuyển khối, và đặc biệt tế bào nấm tăng trưởng ở dạng khuếch tán tự do Tuy nhiên, lực cơ học có thể gây ra hệ sợi nấm tổn thương Do vậy, tốc độ khuấy được giới hạn trong khoảng nhất định nhằm tránh sức ép dịch chuyển căng thẳng lên hệ sợi nấm

Felse và Panda (2000) cho rằng: tốc độ khuấy 224 vòng/phút (v/p) phù hợp nhất

cho sự tăng trưởng tế bào và sinh tổng hợp chitinase của Trichoderma harzianum [36], và

đã sinh tổng hợp chitinase lớn nhất 0,196 mU/ml ở tốc độ lắc 224 v/p [37] Bồn lên men 2

L có khuấy tốc độ 200 v/p, sử dụng cơ chất gel chitin thì T virens UKM1 sinh tổng hợp chitinase với tốc độ từ 4,1 mU/(ml h) đến 5,97 mU/(ml h) Myrothecium verucaria sinh tổng hợp chitinase cao nhất ở tốc độ lắc 200 v/p [171] Fusarium chlamydosporum sinh

tổng hợp chitinase lớn nhất ở chế độ lắc 75 v/p, với thể tích môi trường lên men 50 ml

trong bình tam giác 250 ml [95] Streptomyces viridificans [46] và Cellulosimicrobium cellulans [92] đều sinh tổng hợp chitinase cao nhất ở tốc độ lắc 200 v/p S cinereoruber

sinh tổng hợp 0,85 mU/ml chitinase khi thông khí 1 L min-1 và tốc độ khuấy 500 v/p [155] Liu và cs (2003) công bố khi tăng tốc độ khuấy giúp sinh tổng hợp chitinase từ

Verticillium lecanii trong bình lên men 5 L và 30 L tăng trong thời gian ngắn [90]

Kao và cs (2007) cho rằng Paenibacillus sp CHE-N1 sinh tổng hợp chitinase lớn

nhất trong bình lên men 5 L ở tốc độ lắc 200 v/p [65]

1.5 PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN CHITINASE TỪ VI SINH VẬT

Chitinase sinh tổng hợp từ vi sinh vật được chia làm hai loại chính: chitinase nội bào

và chitinase ngoại bào

Đối với chitinase nội bào, giải phóng enzym ra khỏi vi sinh vật (cụ thể Garrido (1994) đã tách beta-galactosidase ra khỏi nấm men [42], Illanes (1995) tách lactase ra khỏi