Nghiên cứu xác định các thông số công nghệ xử lý rong lục việt nam và lên men ethanol góp phần phát triển cồn nhiên liệu

Theo các tác giả Goh, Nahak và Jones quá trình nghiên cứu và sản xuất ethanol từ rong biển được thực hiện theo ba bước chính, bước 1 xử lý rong biển sau thu hoạch, bước 2 thủy phân rong

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

Võ Thành Trung

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH CÁC THÔNG SỐ CÔNG NGHỆ XỬ LÝ RONG LỤC VIỆT NAM VÀ LÊN MEN ETHANOL GÓP PHẦN PHÁT TRIỂN

Công trình được hoàn thành tại:

Trường Đại học Bách khoa Hà Nội

Người hướng dẫn khoa học:

sĩ cấp Trường họp tại Trường Đại học Bách khoa Hà Nội Vào hồi 8 giờ 30, ngày 01 tháng 08 năm 2017

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:

1 Thư viện Tạ Quang Bửu - Trường ĐHBK Hà Nội

2 Thư viện Quốc gia Việt Nam

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ

Tạp chí Khoa học và Công Nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam 52 (5B) 597-604

3 Võ Thành Trung, Lê Như Hậu, Nguyễn Thanh Hằng (2015)

Selection of some yeast strains for ethanol fermentation from

hydrolysate solution of green seaweed Chaetomorpha linum Journal of Science and Technology - Viet Nam Academy of Science and Technology 53 (4C) 472-480

4 Võ Thành Trung, Lê Như Hậu, Nguyễn Thanh Hằng (2016)

Nghiên cứu điều kiện thủy phân rong Lục Chaetomorpha linum bằng enzyme và ứng dụng trong sản xuất bioethanol Tạp chí sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Vol

38 (2): 201-206

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan, luận án này là kết quả nghiên cứu của tôi trong thời gian qua. Những kết quả và số liệu trình bày trong luận án là kết quả nghiên cứu của tôi, không sao chép bất kỳ nguồn nào khác, hoàn toàn trung thực và chưa được tác giả khác  công  bố.  Tôi  hoàn toàn  chịu trách  nhiệm  về  kết  quả  trình  bày trong  luận  án này. 

Hà Nội, ngày     tháng     năm 2017  

Thay mặt tập thể hướng dẫn 

LỜI CẢM ƠN

Trong thời gian thực hiện công trình nghiên cứu tôi đã nhận được nhiều sự giúp đỡ, đóng góp ý kiến và chỉ bảo chân tình của các thầy cô, bạn đồng nghiệp và các cơ quan.  

Trước  hết  cho  tôi  gửi  lời  cảm  ơn  chân  thành  và  sâu  sắc  nhất  tới  PGS.  Nguyễn Thanh  Hằng  –  Bộ môn Công  nghệ  Thực  phẩm,  Viện  Công  nghệ  sinh  học  và Công  nghệ Thực phẩm, Trường đại học Bách Khoa Hà Nội và TS. Lê Như Hậu phòng Vật liệu hữu cơ 

từ  Tài  nguyên  Biển,  Viện  Nghiên  cứu  và  Ứng  dụng  Công  nghệ  Nha  Trang    đã  tận  tình hướng dẫn và định hướng cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu để hoàn thành bản luận 

án này.  

Tôi xin cảm ơn tới các thầy cô giáo thuộc Viện Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm, Trường đại học Bách Khoa Hà Nội đã giúp đỡ và góp ý cho tôi rất nhiều trong quá trình học tập và nghiên cứu.  

Nhân  dịp  này  cho  tôi  gửi  lời  cảm  ơn  tới  PGS.  Bùi  Minh  Lý,  Viện  trưởng  -Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang  đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi học tập và nghiên cứu.  

Tôi xin cảm ơn GS. Hee Chul Woo, Viện Công nghệ Sản xuất Sạch, Đại học Quốc gia  Pukyong Hàn  Quốc  đã  tạo  điều  kiện thuận lợi  cho  tôi  được  nghiên  cứu  tại phòng thí nghiệm của giáo sư. 

Tôi xin cảm ơn các giáo sư, phó giáo sư, tiến sĩ là chủ tịch hội đồng, phản biện, thư 

ký và ủy viên hội đồng đã dành thời gian quý báu để đọc tham gia hội đồng chấm luận án với  những  góp  ý  cụ  thể,  những  gợi  ý  bổ  ích,  giúp  tôi  hoàn  thiện  tốt  hơn  các  nội  dung nghiên cứu của luận án. 

Tôi cũng vô cùng cảm ơn sự khích lệ, động viên và giúp đỡ hết sức nhiệt tình của gia đình, bè bạn và đồng nghiệp đã dành cho tôi để tôi hoàn thành bản luận án nghiên cứu này.  

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN I  LỜI CẢM ƠN II 

MỞ ĐẦU 1 

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3 

1.1 RONG BIỂN 3 

1.1.1 Phân loại rong biển 3 

1.1.2 Thành phần hóa học của các loại rong biển 4 

1.1.3 Rong lục 6 

1.2 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ETHANOL TỪ RONG BIỂN 7 

1.2.1 Tiềm năng rong biển để sản xuất ethanol 7 

1.2.2 Quá trình xử lý sơ bộ nguyên liệu rong biển 9 

1.2.3 Quá trình thủy phân rong biển 9 

1.2.4 Quá trình lên men ethanol từ dịch thủy phân rong biển 17 

1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ SẢN XUẤT ETHANOL TỪ NGUYÊN LIỆU RONG BIỂN TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 23 

1.3.1 Tình hình nghiên cứu và sản xuất ethanol từ nguyên liệu rong biển trên thế giới 23 

1.3.2 Tình hình nghiên cứu và sản xuất ethanol từ nguyên liệu rong biển ở Việt Nam 26 

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 

2.1 VẬT LIỆU 29 

2.1.1 Rong lục 29 

2.1.2 Chế phẩm Enzyme 29 

2.1.3 Chế phẩm nấm men 29 

2.2 P HƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 

2.2.1 Các phương pháp phân tích 30 

2.2.2 Phương pháp toán học 40 

2.2.3 Thiết kế các nghiên cứu 42 

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 50 

3.1 LỰA CHỌN RONG LỤC VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC RONG LU ̣ C VIÊ ̣ T NAM 50 

3.1.1 Lựa chọn các loài rong lục ở Việt Nam 50 

3.1.2 Thành phần hóa học của các loài rong được chọn 52 

3.1.3 Nghiên cứu biến động thành phần hóa học của rong Ch linum, Cl socialis theo chu kỳ sống 54 

3.1.4 Thành phần các loại đường của rong Ch linum và Cl socialis 60 

3.2 NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN RONG CH LINUM 63 

3.2.1 Nghiên cứu xử lý nguyên liệu rong Ch linum trước thủy phân 63 

3.2.2 Nghiên cứu quá trình thủy phân rong Ch.linum bằng axit 64 

3.2.3 Nghiên cứu quá trình thủy phân rong Ch linum bằng chế phẩm enzyme thương mại 73 

3.3 NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH LÊN MEN ETHANOL TỪ DỊCH THỦY PHÂN RONG CH LINUM 86 

3.3.1 Tuyển chọn chủng nấm men trên dịch thủy phân rong Ch.linum bằng axit 86 

3.3.2 Tuyển chọn chủng nấm men trên dịch thủy phân rong Ch.linum bằng chế phẩm enzyme 87 

3.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men của dịch thủy phân bằng axit và enzyme bởi chế phẩm nấm men Red Ethanol 89 

3.3.4 Tối ưu hóa điều kiện lên men dịch thủy phân rong Ch.linum bằng axit bởi chế phẩm nấm men Red Ethanol 94 

3.4 KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH ĐƯỜNG HÓA VÀ LÊN MEN ĐỒNG THỜI (SSF) CỦA DỊCH RONG CH LINUM SAU TIỀN XỬ LÝ 100 

4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 103 

4.1 KẾT LUẬN 103 

4.2 KIẾN NGHỊ 104 

TÀI LIỆU THAM KHẢO 106 

PHỤ LỤC 115   

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1. 1 Thành phần hóa học của rong biển  4

Bảng 1. 2 So sánh năng suất nuôi trồng của các nguồn sinh khối  7

Bảng 1. 3 Thành phần hóa học rong biển và đường tạo thành bởi thủy phân của các loài  rong biển   10

Bảng 1. 4 Nấm men lên men ethanol từ sinh khối rong biển   20

Bảng 1. 5 Diện tích và sản lượng tại thời điểm khảo sát (2010) và dự kiến đến năm 2015   27 

Bảng 3. 1 Lựa chọn các loài rong lục ở Việt Nam   50

Bảng 3. 2 Thành phần hóa học của các loài rong lục được chọn   52

Bảng 3. 3 Biến động sinh lượng rong lục trong một vụ trồng vào mùa thuận lợi   55

Bảng 3. 4 Năng suất thu hoạch của các đối tượng rong lục được nuôi trồng luân canh trong  ao đầm tại miền Trung   55

Bảng 3. 5 Thành phần carbonhydrate của sinh khối rong Ch.linum  61

Bảng 3. 6 Thành phần các loại đường của rong Cl socialis   62

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của muối NaCl trong nguyên liệu đến quá trình thủy phân rong Ch linum   63

Bảng 3. 8 Ảnh hưởng của kích thước rong đến quá trình thủy phân rong Ch linum   64

Bảng 3. 9 Ảnh hưởng của tỷ lệ rong trong dung dịch đến thủy phân rong Ch linum   65

Bảng 3. 10 Khoảng xác định của các yếu tố trong tối ưu thủy phân bằng axit   68

Bảng 3. 11 Mức thí nghiệm của các yếu tố trong tối ưu thủy phân bằng axit   68

Bảng 3. 12 Ma trận thực nghiệm và kết quả   69

Bảng 3. 13 Kết quả tính bước chuyển động (∆j) của các yếu tố trong tối ưu thủy phân bằng  axit   69

Bảng 3. 14 Tối ưu hóa điều kiện thủy phân rong theo Box-wilson   70

Bảng 3. 15 Thành phần và hàm lượng của các loại đường trong dịch thủy phân rong Ch linum bằng axit   71

Bảng 3. 16 Thành phần dịch thủy phân rong  lục bằng axit   72

Bảng 3. 17 Ảnh hưởng của nồng độ axit đến quá trình tiền xử lý rong Ch.linum   73

Bảng 3. 18 Hoạt độ các loại enzyme trong chế phẩm  enzyme ViscozymeL và Cellulase . 74 Bảng 3. 19 Khả năng thủy phân rong Ch.limum thành đường bởi các chế phẩm enzyme  thương mại   75

Bảng 3. 20 Khoảng xác định của các yếu tố trong tối ưu thủy phân bằng enzyme   79

Bảng 3. 21 Mức thí nghiệm của các yếu tố trong tối ưu thủy phân bằng enzyme   79

Bảng 3. 24 Tối ưu hóa điều kiện thủy phân rong Ch linum bằng enzyme   81 Bảng 3. 25 Thành phần và hàm lượng của các loại đường trong dịch thủy phân rong Ch linum bằng chế phẩm enzyme Viscozyme L   82 Bảng 3. 26 Thành phần dịch thủy phân rong Ch.linum bằng chế phẩm enzyme   84 Bảng 3. 27 Hiệu suất thủy phân rong Ch linum bằng axit và bằng chế phẩm enzyme 

Viscozyme L   85

Bảng 3. 28 Lên men ethanol từ dịch thủy phân rong Ch.linum bằng axit bởi các chủng nấm 

men khác nhau   86Bảng 3. 29 Hàm lượng ethanol và hiệu suất lên men của các chủng nấm men lên men từ 

dịch thủy phân rong Ch linum bằng axit được xác định bằng HPLC   87 Bảng 3. 30 Lên men ethanol từ dịch thủy phân rong Ch.linum bằng chế phẩm enzyme bởi 

các chủng nấm men khác nhau   88Bảng 3. 31 Hàm lượng ethanol và hiệu suất của các chủng nấm men lên men từ dịch thủy 

phân rong Ch linum bằng chế phẩm enzyme được xác định bằng HPLC   88 Bảng 3. 32 Ảnh hưởng của nguồn nito đến quá trình lên men dịch thủy phân Ch linum   89

Bảng 3. 33 Khoảng xác định của các yếu tố trong lên men dich thủy phân bằng axit   94Bảng 3. 34 Mức thí nghiệm của các yếu tố trong lên men dịch thủy phân bằng axit   94Bảng 3. 35 Ma trận thực nghiệm và kết quả   95Bảng 3. 36 Kết quả tính bước chuyển động (∆j) của các yếu tố trong lên men dich thủy phân bằng axit   96

Bảng 3. 37 Tối ưu hóa điều kiện lên men dịch thủy phân rong Ch.linum bằng axit theo 

Box-wilson   96Bảng 3. 38 Chuyển hóa đường và ethanol trong quá trình lên men từ dịch thủy phân rong 

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Thành phần carbohydrate của rong đỏ, rong nâu, rong lục  5 

Hình 3. 1 Biến động hàm lượng protein theo chu kỳ sống của hai loài rong lục   57

Hình 3. 2 Biến động hàm lượng tro theo chu kỳ sống của hai loài rong lục   58

Hình 3. 3 Biến động hàm lượng lipid theo chu kỳ sống của hai loài rong  58

Hình 3. 4 Biến động hàm lượng carbohydrate và tốc độ sinh trưởng theo chu kỳ sống của  hai loại rong lục   59

Hình 3. 5 Sắc ký đồ thành phần các loại đường của rong Ch linum.   61

Hình 3. 6 Sắc ký đồ thành phần các loại đường của rong Cl socialis   61

Hình 3. 7 Ảnh hưởng nồng độ axit sunfuric đến quá trình thủy phân rong Ch.linum bằng axit   65

Hình 3. 8 Ảnh hưởng nhiệt độ đến quá trình thủy phân rong Ch.linum bằng axit sunfuric 66 Hình 3. 9 Động thái của quá trình thủy phân rong Ch.linum bằng axit   67

Hình 3. 10 Sắc ký đồ các loại đường và ethanol của chuẩn (B) và dịch thủy phân rong Ch linum bằng axit (A)   71

Hình 3. 11 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến quá trình thủy phân rong Ch.linum bằng  enzyme   76

Hình 3. 12 Ảnh hưởng của pH đến quá trình thủy phân rong Ch.linum bằng enzyme   77

Hình 3. 13 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân rong Ch.linum bằng enzyme 78 Hình 3. 14 Động thái của quá trình thủy phân rong Ch.linum bằng enzyme   78

Hình 3. 15 Sắc ký đồ các loại đường và ethanol của chuẩn (B) và dịch thủy phân rong Ch linum bằng chế phẩm enzyme Viscozyme L (A)   82

Hình 3. 16 Sự biến đổi nito tổng số trong quá trình lên men   90

Hình 3. 17 Ảnh hưởng pH đến quá trình lên mendịch thủy phân rong Ch.linum   91

Hình 3. 18 Ảnh hưởng nhiệt độ đến quá trình lên men dịch thủy phân rong Ch.linum   92

Hình 3. 19 Động thái quá trình lên men dịch thủy phân rong Ch.linum   93

MỞ ĐẦU

Khi nhu cầu năng lượng thế giới tiếp tục tăng và nguồn nhiên liệu hóa thạch đang giảm, nhiên liệu sinh học là giải pháp thay thế thích hợp. Ethanol là sản phẩm nhiên liệu được sử dụng phổ biến nhất và được nhiều quốc gia tập trung nghiên cứu. Ethanol thường được sản xuất từ tinh bột, đường mía và phụ phẩm nông nghiệp. Tuy nhiên việc sử dụng các sản phẩm nông nghiệp làm nguồn nguyên liệu sản xuất ethanolcòn có hạn chế là chiếm một lượng lớn đất nông nghiệp, cũng như nguồn nước, thời gian và công chăm sóc, canh tác… Hơn thế nữa vấn đề này cũng đang đối mặt với những ý kiến chỉ trích cho rằng không thể sử dụng các sản phẩm nông nghiệp để sản xuất ethanol trong khi mỗi ngày trên thế giới có hàng triệu người chết đói vì thiếu lương thực. 

Trước tình hình đó, hàng loạt các nghiên cứu nhằm tìm ra một nguồn nguyên liệu mới trong việc sản xuất cồn sinh học được đẩy mạnh. Trong đó rong biển là một lựa chọn thích hợp và đang được nhiều nhà nghiên cứu quan tâm. Rong biểncó sản lượng tự nhiên lớn, vòng đời sinh trưởng ngắn, dễ thu hoạch, giá thành rẻ và nuôi trồng thu được sinh khối lớn. Hàm lượng  carbohydrate  trong  một  số  loài  rong  cao  từ  40  -  79,4  %,  rong  có  lignin  thấp  dễ  thủy phân, thành phần đường chủ yếu là đường 6 carbon nên dễ dàng lên men tạo ethanol.  

Việt Namcó bờ biển dài hơn 3200 km có chứa sinh khối rong biển rất lớn, trong đó rong lục là phổ biến nhất. Ước tính mỗi năm có khoảng 2 triệu tấn khô được tạo thành. Tuy nhiên nguồn  sinh  khối  này  vẫn  chưa  được  sử  dụng  hợp  lý,  chỉ có  số  ít  loài  được  nghiên  cứu  chế biến các sản phẩm sinh học, số còn lại tự phân hủy ngoài tự nhiên gây hiện tượng ô nhiễm. Vì vậy nghiên cứu sản xuất ethanol từ rong lục là một giải pháp thích hợp để tạo ra nhiên liệu sạch, giải quyết ô nhiễm môi trường và gia tăng lợi ích kinh tế cho người dân ven biển. 

Để sản xuất được ethanol nhiên liệu từ rong lục, cần phải tiến hành các bước: lựa chọn đối tượng rong lục thích hợp, đảm bảo sinh khối ổn định bằng tiến hành nuôi trồng gia tăng sinh khối, sử dụng các kỹ thuật xử lý nguyên liệu, tìm các phương pháp thích hợp để đường hóa rong lục và lên men tạo ethanol. Về nghiên cứu sản xuất ethanol nhiên liệu từ rong lục tại Việt Nam hiện nay mới được đề cập tuy vậy vẫn chưa có nghiên cứu cụ thể. Do đó, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu xác định các thông số công nghệ xử lý rong lục Việt Nam và lên men ethanol góp phần phát triển cồn nhiên liệu” để đưa ra được một cách hoàn chỉnh công nghệ lên men ethanol từ nguồn sinh khối rong lục. 

Mục tiêu của đề tài

- Nghiên cứu nguồn rong biển Việt Nam làm nguyên liệu sản xuất ethanol bằng phương pháp thân thiện môi trường là hướng nghiên cứu phù hợp với xu thế của thế giới nhằm thay thế nguồn nhiên liệu hóa thạch 

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 RONG BIỂN

1.1.1 Phân loại rong biển

Tảo được chia thành hai nhóm chính là microalgae và macroalgae, microalgae được gọi là vi tảo hay tảo kích thước bé. Rong biển là macroalgae, được gọi là tảo kích thước lớn. 

Rong biển là thực vật bậc thấp sống tự dưỡng bằng cách quang hợp, hình thái dạng tản. Quá  trình  phát  triển của rong không qua  giai đoạn  phôi, có  ba  hình thức sinh  sản:  sinh  sản dinh dưỡng, sinh  sản  vô tính  bằng bào  tử,  sinh  sản hữu tính  bằng hình  thức  giao phối giữa phối tử đực và cái. Rong biển sinh trưởng phát triển nhanh, có vòng đời sinh trưởng không quá 1 năm, tốc độ tăng trọng nhanh và tạo ra sinh khối lớn. Rong biển chia thành ba ngành chính: rong lục, rong đỏ và rong nâu [12,17]. 

Ngành rong lục: Nét đặc trưng nhất của các loài là có màu lục, sản phẩm quang hợp là tinh bột. Về cấu tạo hình thái có nhiều dạng: dạng phiến, dang sợi, dạng ống. Rong lục có vỏ bằng  chất  pectin  hoặc  xenluloza.  Trong  chất  nguyên  sinh  còn  có  những  túi  nhỏ  chứa  sản phấm của quá trình trao đổi chất. Thể sắc tố chủ yếu là chlorophyll và caroten, trong thể sắc 

tố còn có các hạt tạo bột hình tròn nhỏ và chứa tinh thể protein ở giữa. Trong dịch bào, sản phẩm  của  quá  trình trao đổi chất chủ yếu là  đường, tanin, sunfat canxi  và  các chất có màu antoxyan [12,17]. 

Ngành rong nâu: Hình thái đơn giản là dạng phiến, dạng sợi và hình thái phức tạp là dạng cây có "gốc" "rễ" "thân" và "lá". Vỏ tế bào chia thành hai lớp, lớp trong là xelluloza, lớp ngoài là keo fucoidin hay fucin. Thể sắc tố gồm chlorophyll a, c; xanthophyll, caroten và fucoxanthyll  - loại  sắc  tố  có  riêng  trong  rong  nâu, có  màu nâu,  không tan  trong  nước.  Sản phẩm  đồng  hóa  là  mannitol,  laminarin,  glucoza ,  đặc  tính  cùa  rong  nâu  là  có  túi  đường fucoidan chứa đường fucoza [12,17]. 

Ngành rong đỏ: Rong có dạng trụ tròn, dẹp, phiến, chia nhánh hoặc không. Vỏ tế bào gồm hai lớp, lớp trong là xenluloza, lớp ngoài là chất keo và pectin. Sắc tố của rong đỏ gồm 

có : Sắc tố lục - chlorophyll, sắc tố vàng - xanthophyll, caroten, sắc tố đỏ - phycoerythrin, sắc 

tố xanh lam - phycocyanin. Màu sắc của rong đỏ được quyết định bởi sự phối hợp và thành phần của các sắc tố trên, vì vậy rong đỏ thường có màu đỏ (thẫm đến nhạt), màu hồng, màu vàng lục  nhạt,  màu tím hay màu lam lục  Sản phẩm  quang hợp của tế bào  rong đỏ là một loại đường đôi [12,17]. 

1.1.2 Thành phần hóa học của các loại rong biển

Rong  biển  có  thành  phần  hóa  học  biến  đổi  theo  từng  ngành  rong  và  được tác  giả  Kim miêu tả tóm lược trong bảng 1.1  [51] 

Bảng 1 1 Thành phần hóa học của rong biển Thành phần

70-80 25-35 30-60 (Agar, Carrageenan) 7-15 1-5 

79-90 30-50 30-50 (Alginate, Fucoidan) 7-15 2-5  

Thành  phần  hóa  học  của  rong  biển  có  bốn  thành  phần  chính  tro,  lipid,  protein  và carbohydrate.  Sản  xuất  nhiên  liệu  sinh  học  chủ  yếu  sử  dụng  hai  nguồn  lipid  và  carbohyrate. Trong rong biển carbohydrate chiếm tỷ trọng cao 25-60% w thích hợp cho sản xuất nhiên liệu hơn so với lipid có hàm lượng 1-5 %w.  

 Ở bảng 1.1 cũng cho thấy, thành phần polysaccharide khác nhau giữa các ngành rong biển: rong nâu, lục, đỏ. Rong lục có thành phần polysaccharide như thực vật bậc cao, gồm tinh bột và cellulose.  Rong  nâu  và  rong  đỏ  có  thành  phần  polysaccharide  dưới  dạng  agar,  carrageenan, alginate. Hàm lượng polysaccharide cao trong rong biển thì thích hợp để sản xuất ethanol sinh học.  

Rong biển có thành phần carbohydrate đa dạng, điều này được ghi nhận  trong báo cáo của Kim [51] và thể hiện trong hình 1.1  

Hình 1.1 Thành phần carbohydrate của rong đỏ, rong nâu, rong lục

  Theo  số  liệu  hình  1.1  cho  thấy  carbohydrate  trong  rong  đỏ  gồm:  agar,  carrageenan, xylane,  mannan  và  một  ít  cellulose.  Agar  chiếm  50-70%  trọng  lượng  khô  là  nguồn carbohydrate chính, agar và carrageenan thủy phân tạo thành galactose, xylane thành xylose, mannane thành mannose, và rất ít glucose từ cellulose, qua đó cho thấy hàm lượng glucose được tạo ra từ rong đỏ sau thủy phân là rất thấp, nên rong đỏ không phải là nguyên liệu thích hợp để sản xuất ethanol.  

  Trong rong nâu thành phần carbohydrate gồm alginate, fucoidan, laminaran, cellulose, hàm  lượng  alginate  cao  30-40%  trọng  lượng  khô,  là  nguồn  carbohydrate  chính  trong  rong nâu,  và  5-6%  cellulose,  7-10%  fucoidan  và  laminaran.  Alginate  thủy  phân  thành  D-mannuronic  axit  và  M,D-glucuronic,  fucoidan  thủy  phân  thành  L-fucose,  galactose  và  ít mannitol,  cellulose  thủy  phân  thành  glucose,  laminaran  thủy  phân  thành  glucose,  mannitol. Sản phẩm thủy phân cuối cùng của rong nâu có chứa nhiều loại đường và hàm lượng đường glucose thấp, do vậy việc sản xuất ethanol từ rong nâu không hiệu quả.  

  Carbohydrate trong rong lục gồm cellulose, tinh bột, xylane, ulvan, paramylon, trong 

đó cellulose và tinh bột là 2 thành phần chính, cellulose và tinh bột khoảng 40-50%. Do vậy khi  thủy  phân  rong  lục  sẽ  thu  được  một  lượng  lớn  glucose,  ngoài  ra  glucose  còn  được  thu 

1.1.3 Rong lục 

Theo các mô tả của hai tác giả Nguyễn Hữu Dinh, Phạm Hoàng Hộ,Tsutsuicho đến nay các nhà nghiên cứu đã tìm thấy trong ngành rong lục có trên dưới 360 chi và hơn 5700 loài, 

phần lớn là sống trong nước ngọt, còn nước mặn chủ yếu là những chi sau đây:Monostroma, Enteromorpha, Ulva, Ulothrix, Rhizoclonium, Cladophora, Chaetomorpha, Cladophoropsỉs, Boergesenm, Valonia, Valoniopsis, Struvea, Boodlea, Microdyction, Caulerpa, Bryopsis, Codium, Acetabularia v.v  [12,17, 92]

Nét đặc trưng nhất của các loài trong ngành là có màu lục, sản phẩm quang hợp là tinh bột.  Hình  dạng  một  tế  bào  hoặc  nhiều  tế  bào  có  dạng  phiến,  dạng  sợi,  chia  nhánh  hoặc không; trừ một vài trường hợp rong chỉ là một tế bào trần không có vỏ, còn đại đa số đều có 

vỏ cấu tạo pectin hoặc cellulose.  

Nguyên sinh chất có thành mỏng, ngay sát thành là vỏ tế bào; ở giữa là một túi lớn chứa đầy dịch bào. Trong chất nguyên sinh còn có những túi nhỏ chứa sản phấm của quá trình trao đổi chất. Thành phần nguyên sinh chất: Thể sắc tố có nhiều dạng khác nhau: phiến, đai vành móng ngựa, sao nhiều cạnh, xoắn lò xo, mắt lưới, hạt nhỏ v.v ; sắc tố chủ yếu là chlorophyll 

và carotenoid, trong thể sắc tố còn có các hạt tạo bột hình tròn nhỏ và chứa tinh thể protit ở giữa, hạt tạo bột khi gặp dung dịch KI dễ bắt màu, nên trở thành một trong những tiêu chuẩn phân loại. Nhân thường nằm ở giữa khoang túi dịch bào, hay sát bên thành lớp nguyên sinh, 

thể  nhiễm sắc  hình  que ngắn  hay  hạt  nhỏ.Trong  dịch  bào, sản  phẩm của  quá  trình trao  đổi 

chất chủ yếu là đường, tanin, sunfat canxi và các chất có màu antoxyan. Ở một vài loài, sản phẩm quang hợp không phải là tinh bột mà là những giọt giống như chất bơ. 

Sinh sản bằng nhiều hình thức khác nhau. Sinh sản dinh dưỡng: một tế bào mẹ cắt thành hai  tế  bào  mới;  loại  nhiều  tế  bào  thì  có  thể  một  phần  cơthề  đứt  ra  rồi  phát  triển  thành  cây riêng khác. Sinh sản vô tính: tế bào dinh dưỡng phân chia thành nhiều bào tử, gặp điều kiện thuận lợi hình thành vỏ tế bào và phát triển thành cáthể mới. Sinh sản hữu tính bằng sự thụ tinh giữa phối tử đực với phối tử cái, phức tạp hơn là đã hình thành tinh tử  và trứng  gọi là noãn phối. Sự hiểu biết chi tiết về sinh sản sẽ là tiền đề tạo ra sinh khối bền vững cho phát triển nhiên liệu. [12,17, 92]. 

Rong Chaetomorpha linum (Ch.linum)

Hình  dạng:  Rong  dạng  sợi,  hơi  cứng,  dai,  dài  5-10cm hoặc  hơn,  không chia  nhánh, có màu xanh lục, phần nổi trên mặt nước hơi vàng, sợi rong óng mượt như tơ. Khi về già màu 

xanh  đậm  hơn,  sợi  rong  dày  hơn,  chiều  ngang  100-150  µm,  chiều  dài  các  đốt  không  đều nhau, chiều dài bằng chiều ngang hoặc dài gấp 1,5 lần chiều ngang.  

Tế  bào dinh  dưỡng  khi  hình  thành  túi  bào  tử  phình  rộng ra  160-170  µm,  có  thể  sắc tố dạng lưới, nhiều hạt tạo bột. 

1.2 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ETHANOL TỪ RONG BIỂN

1.2.1 Tiềm năng rong biển để sản xuất ethanol

Rong biển là nguồn sinh khối bền vững cho công nghiệp nhiên liệu xanh được thể hiện qua các ưu thế sau: đã tạo ra nguồn sinh khối vô tận cho tự nhiên, tốc độ tăng trọng nhanh, sinh khối rong biển chiếm ưu thế hơn so với các nguồn sinh khối khác, khả năng chuyển hóa thành các dạng năng lượng từ rong biển tốt hơn các sinh khối khác [34, 97]. So với các loại sinh khối trên cạn, sản lượng rong biển thu hoạch hàng năm gấp 3 so với sản lượng cây lương thực và 60 lần so với cây lấy gỗ. Thời gian thu hoạch liên tục nhiều lần trong năm (4-6 lần /năm).  Rong biển dễ dàng canh tác nuôi trồng, sử dụng vùng biển rộng lớn, không sử dụng vật liệu khó khăn như: thuỷ lợi, phân bón, đất,….[51,78] 

Bảng 1 2 So sánh năng suất nuôi trồng của các nguồn sinh khối

các loại củ 

Gỗ mền và gỗ 

Điều kiện nuôi trồng

Ánh sáng, CO2, thuỷ lợi, đất, phân bón 

Ánh sáng, CO2, thuỷ lợi, đất, phân bón 

Ánh sáng, CO2, nước biển 

Theo  đánh  giá  của  tác  giả  Bruton  rong  biển  không phải  là cây  lương  thực  nên  không ảnh hưởng an ninh lương thực, nguồn nguyên liệu không cạnh tranh đất trồng nông nghiệp, không cần sử dụng phân bón, không gây ô nhiễm môi trường, hấp thụ tốt CO2 và chất dinh dưỡng cải tạo môi trường, khả năng sinh trưởng phát triển tốt, có sinh khối lớn, chu kỳ nuôi trồng ngắn, nuôi trồng đạt năng suất cao, mang lại lợi nhuận cao cho người trồng rong, vì vậy rong là nguồn nguyên liệu lý tưởng để sản xuất bioethanol [33,78]. 

Theo các tác giả Phạm Văn Ty và cs tế bào thực vật trên cạn có thành phần chính gồm cellulose, hemicellulose, lignin; ba thành phần này liên kết chặt chẽ với nhau có sức bền cơ học cao, trong đó lignin là cơ sở tạo ra các mô gỗ của cây, việc phân hủy tế bào hóa gỗ là vô cùng phức tạp [18]. Do vậy nghiên cứu ứng dụng sản xuất nhiên liệu sinh học từ sinh khối gỗ gặp  nhiều  khó  khăn,  đòi  hỏi  công  nghệ  cao.  Trong  khi  đó  theo  báo  cáo của  Kim  vi  tảo  và rong biển lại dễ bị phân hủy do chỉ chứa cellulose và các polysachrid hòa tan. Dưới tác động của nhiệt, enzyme, axit các nhóm polysacchrid này bị thủy phân thành các dạng đường đơn. Đây là nguồn cơ chất quan trọng cho vi sinh vật thực hiện quá trình lên men sản xuất nhiên liệu sinh học, điều này cho thấy sinh khối rong, tảo từ biển được sử dụng dễ dàng hơn so với sinh khối thực vật trên cạn [51]. 

Để  sản  xuất  được  nhiên  liệu  từ  nguồn  sinh  khối  thực  vật  trên  cạn  với  quy  mô  công nghiệp thông thường sử dụng phương pháp kỹ thuật phức tạp trải qua nhiều công đoạn xử lý, những công nghệ này đòi hỏi đầu tư trang thiết bị hiện đại, vì vậy sẽ nâng giá thành sản phẩm lên cao [18]. Ngược lại công nghệ cho sản xuất nhiên liệu từ nguồn sinh khối biển đơn giản hơn. Các phương pháp xử lý nguyên liệu không yêu cầu kỹ thuật phức tạp, các công nghệ này đầu tư trang thiết bị ít tốn kém, hiệu suất ổn định, chất lượng tinh sạch cao.   

Theo báo cáo của John Rojan và Nigam nhiên liệu sinh học sản xuất từ rong biển là một thay thế cho nhiên liệu hóa thạch. Các sản phẩm nhiên liệu từ sinh khối tảo thân thiện với môi trường  và  chất  lượng  ổn  định.  Vì  vậy  nhiên  liệu  sinh  học  từ  rong  biển  đang  được  khuyến khích phát triển tại hầu hết các quốc gia trên thế giới. Các sản phẩm nhiên liệu sản xuất từ tảo: dầu  thực  vật,  dầu  diesel  sinh  học,  ethanol  sinh  học,  biogasoline,  biomethanol,  butanol  sinh học và nhiên liệu khác [28,46, 68, 88]. 

Theo các tác giả Goh, Nahak và Jones quá trình nghiên cứu và sản xuất ethanol từ rong biển được thực hiện theo ba bước chính, bước 1 xử lý rong biển sau thu hoạch, bước 2 thủy phân  rong  biển  đã  được  xử  lý,  bước  3 tiến hành lên men dịch  thủy phân  rong biển  [67;  38; 47]

1.2.2 Quá trình xử lý sơ bộ nguyên liệu rong biển

Theo  báo  cáo  của Bruton  và  Roesijadi  hầu  hết  các  dạng  rong  biển  sau  thu  hoạch  phải được tiền xử lý trước khi ứng dụng sản xuất nhiên liệu sinh học. Bước đầu tiên của tiền xử lý 

là rong biển tươi sau thu hoạch được loại tạp, loại muối bằng cách tách mảnh vụn như đá, cát, 

ốc hoặc rác rồi rửa với nước, sau đó rong được sấy khô đến độ ẩm 10-15%, lưu giữ, chuẩn bị cho quá trình thủy phân. Trước khi thủy phân rong được xử lý cơ học, xay nghiền bằng máy nghiền búa nhằm làm nhỏ kích thước rong (0,5-5mm) giúp cho quá trình  thủy phân diễn ra 

dễ dàng [33, 79].  

1.2.3 Quá trình thủy phân rong biển

Sau  khi  tiền  xử  lý,  rong  biển  được  thủy  phân,  quá  trình  này  chuyển  hóa  các  dạng polysaccharide thành monosaccharid, làm nguyên liệu cho quá trình lên men. Rong biển được thủy phân bằng hai phương pháp, thủy phân bằng axit và thủy phân bằng enzyme.  

Nghiên cứu của Jang cho thấy carbohydrate rong biển của cả ba loại rong (nâu, đỏ, và lục) được thủy phân một cách hiệu quả để tạo ra monosacarid bởi axit sunfuric loãng ở nhiệt 

độ cao [45]. Bốn yếu tố quan trọng tác động đến quá trình trình thủy phân bằng axit sulfuric được xác định là (i) nhiệt độ phản ứng, (ii) thời gian phản ứng, (iii) nồng độ axit và (iv) khối lượng rong biển.  

Nghiên cứu của Kim chứng minh hiệu quả của việc kết hợp tiền xử lý bằng axit sau đó thủy phân  bằng  enzyme trong  quá  trình  đường  hóa  rong  biển,  tạo ra  hàm  lượng  đường  cao 

0,566 g/g rong Gracilaria amansii và 0,376 g/g của rong Laminaria japonica [52] 

Theo Wei N.  thành phần hóa học của  rong biển sau thủy phân được trình bày trong bảng 1.3 [96]. 

Bảng 1 3 Thành phần hóa học rong biển và đường tạo thành bởi thủy phân của các loài

rong biển

Thành 

phần loài 

Ngành rong 

Thành phần Poly -saccharide 

Carbohydra

te tổng số (% w/w) 

Đường dịch thủy phân  (% 

w/w) 

Hiệu suất thủy phân (%) 

Các loại đường dịch thủy phân 

Glucose, Galactose 

Glucose, Mannitol 

Glucose  

Ulva

Bảng 1.3 cho thấy kết quả thủy phân các loại rong biển có nhiều sự khác biệt, có hiệu suất thủy phân dao động 25-90%, kết quả thủy phân phụ thuộc vào thành phần đường của từng đối tượng rong biển. 

1.2.3.1 Thủy phân bằng axit

Theo tổng quan của Wei N., dưới tác động của axit các polysaccharide của rong biển sẽ 

bị  cắt  nhỏ  thành các  oligo  hoặc  monosaccharid.  Các  ion  H+ của  axit  tác  động  trực  tiếp  đến polysaccharide  tại  các  liên  kết  mắt  xích  nối  các  monosacchadid  tạo  ra  các  oligo  hoặc monosaccharid. Quá trình thủy phân  rong của axit tạo ra hỗn hợp dung dịch  đường cần cho quá trình lên men ethanol [96]. 

Theo nghiên cứu của Kalpana rong Kappahycus alvarezii được thủy phân theo tỷ lệ 50 

g rong/l với axit sunfuric 0,9N tương đương 5% v/v trong 1 giờ tại 100  oC [49], theo nghiên 

cứu  của  Wang  thủy  phân  rong  Gracilaria salicornia trong  điều  kiện  thủy  phân  bằng  axit 

sunfuric  2%,  trong  30  phút  ở  nhiệt  độ  120 C,  hiệu  suất  của  quá  trình  thủy  phân  4,3g 

glucose/kg rong tươi  [95], theo  tác giả  Karunakaran  rong  Eucheuma sp.và Hypnea sp. được 

thủy phân  bởi  axit  sunfuric  1%  tại  nhiệt  độ 100  oC  trong  3  giờ  với  nồng  độ  chất  khô 20g/l, dung dịch đường sau thủy phân thu được dịch đường có nồng độ 11,1 g/l. Theo nghiên cứu Michul Yoon đã sử dụng kỹ thuật xử lý mẫu bằng phương pháp chiếu xạ tia gamma đã mang lại hiệu quả tích cực cho công nghệ sản xuất cồn. Thành phần loài được sử dụng trong nghiên 

cứu này là Undaria sp., đây là loài có sinh khối vô cùng lớn được nuôi trồng và khai thác tự 

nhiên  tại Hàn  Quốc.  Mẫu  rong  biển  sau  khi  thu hoạch  ngoài tự  nhiên  sẽ  được  xử  lý  với  tia Gamma với liều chiếu 0, 10, 50, 100, 200 và 500 kGy, sau đó thủy phân trong axit sunfuric 1% w/v ở nhiệt độ 121  oC trong 3 giờ. Sau quá trình thủy phân hỗn hợp rong sẽ được trung hòa  với  CaCO3  rồi  lên  men  với  nấm  men.  Hàm  lượng  glucose  thu  được  vào  khoảng  72- 204g/kg đường tổng số [62]. 

Theo nghiên cứu của Mohammad loại gỗ mền cây Vân Sam theo tỷ lệ gỗ phối trộn 1/3 rồi thủy phân bằng axit sunfuric có nồng độ 10g/l ở nhiệt độ 228 oC trong 11 phút, sau đó lọc thu  dịch  đường.  Tuy  nhiên  hỗn  dịch  này  chứa  5,7g/l  furfural  và  7,3  g/l  HMF  (5-hydroxylmethyl furfural) làm cho quá trình lên men khó diễn ra [63]. Theo Lynd gỗ được xay nhỏ về kích thước 10 mm sau đó được thủy phân trong axit 75% v/v tại nhiệt độ 50  oC, rồi pha loãng nồng độ axit xuống 20-30% v/v và tiếp tục thủy phân trong 1 giờ để tạo ra hỗn hợp đường  glucose  và  xylose  và  bã  gỗ,  sau  đó  thu  hồi  đường  và  tiếp  tục  thủy  phân  bã  lần  hai. Trong  quá  trình  thủy  phân  này  các  loại  đường  tạo  thành  là  70%  glucose  và  30%  xylose [57].Theo  nghiên  cứu  của  Pattana  Laopaiboon  bã  mía  được  thủy  phân  bằng  axit sunfuric3%v/v  trong  2  giờ  ở  120  oC  để  tạo  ra  dịch  đường  sử  dụng  cho  lên  men  axit  lactic [73]. 

Như vậy từ các nghiên cứu trên cho thấy, các sinh khối khác nhau điều kiện thủy phân khác nhau, với đối tượng rong biển thường được thủy phân bằng axit sunfuric có nồng độ 1-5%v/v, nhiệt độ 100 - 120 oC thời gian từ 1-3 giờ. Vì vậy trong nghiên cứu này để thủy phân được nguyên liệu rong lục chúng tôi  khảo sát nồng độ axit  sunfuric từ 1-4% v/v, nhiệt độ 90-

130 oC, thời gian 20-90 phút. 

1.2.3.2 Thủy phân bằng enzyme

Hiện  nay  quá  trình  thủy  phân  sinh  khối  bằng  enzyme  được  nhiều  tác  giả  quan  tâm nghiên cứu, để thực  hiện được quá trình này sinh  khối cần được tiền xử lý rồi bố sung chế phẩm enzyme thực hiện đường hóa. Trong đó phương pháp tiền xử lý và đường hóa của mỗi loại sinh khối là khác nhau. 

Nhóm  nghiên  cứu  đề  tài  Biomass  do  Phan  Đình  Tuấn  trường  đại  học  Bách  Khoa TP.HCM phụ trách đã nghiên cứu công nghệ xử lý các phế phẩm trong sản xuất nông nghiệp như rơm, rạ, trấu  nhằm sản xuất ethanol. Kết quả của nghiên cứu này cho thấy, quá trình thủy phân nguyên liệu theo phương pháp nổ hơi rồi thủy phân với enzyme cellulase ở nhiệt 

độ 50 oC, pH 4.8 thu được 200g glucose từ 1 kg rơm rạ [19]. 

Theo tác giả Nguyễn Thị Minh Phương đã tiến hành nghiên cứu tiền xử lý rơm rạ để nâng cao hiệu suất thủy phân bằng enzyme cho sản xuất etanol sinh học. Nguyên liệu được tiền xử lý NaOH 5% w/w rơm khô và gia nhiệt 100 oC trong 2 giờ, sau đó thu được 56% bã cellulose được thủy phân bằng tổ hợp enzyme (Cellic® CTec2 và Cellic® HTec tỷ lệ 4:1) với hoạt độ sử dụng 16,25 U/g. Thực hiện quá trình thủy phân trong 94,2 giờ, quá trình này thu được  lượng  đường  khử  (có  hàm  lượng  glucose  33,3%;  xylose  13,4%,  galactose  4%  và arabinose 1,3%) đạt 49,2% so với rơm rạ[15]. 

Cùng  hướng  sản  xuất  bioethanol  từ  bã  thải  nông nghiệp,  nhóm nghiên  cứu  của  tác  giả 

Vũ Nguyên Thành đã tiến hành đề tài: Nghiên cứu công nghệ và hệ thống thiết bị sản xuất cồn nhiên liệu từ phụ phẩm nông nghiệp (BIOMASS). Kết quả đề tài đã thu được một số kết quả khả quan về enzyme thủy phân hemicellulose, giống nấm men có khả năng lên men các loại đường từ quá trình thủy phân. Nguyên liệu mà tác giả nghiên cứu là bã mía đã được xay nhỏ về kích thước 6 mm, tiền xử lý với sunfuric 0,75%, nhiệt độ 121  oC trong 1 giờ và tiếp tục  xử  lý  với  NaOH  1,5%  trong  1  giờ  thu  được  88,9%  cellulose  tương  đương  55  g cellulose/100g bã mía. Sau đó cellulose vô định hình được đường hóa và lên men đồng thời ở nồng độ chất khô 15% [23].  

Một  nghiên  cứu  khác  của  tác  giả  Tô  Kim  Anh  đã  tiến  hành  đề  tài:  Nghiên  cứu  tạo enzyme  tái  tổ  hợp  thủy  phânlignocelluloses  phục  vụ  sản  xuất  cồn  nhiên  liệu.  Nguyên  liệu lignocelluloses sử dụng cho nghiên cứu này được thu nhận từ bã mía. Bã mía có kích thước < 5mm, độ ẩm 5%, cellulose 47%. Nguyên liệu được tiền xử lý NaOH 0,1g/1g bã mía, và gia nhiệt 121  oC trong 1 giờ, sau đó thu cellulose mang thủy phân bằng tổ hợp enzyme nồng độ 5Uendoglucanase, 10U CMCase exoglucanase, 30Ubetaglucosidasetheo tỷ lệ chất khô 1/15. Thực  hiện  quá  trình  thủy  phân  tại  pH  4,8,  nhiệt  độ  50  oC  trong  48h,  khuấy  150v/phút.  Kết thúc  thủy  phân  sử  dụng  enzyme  laccase  với  tỉ  lệ  70  U/g  bã  mía  phá  hủy  phenol.  Kết  quả nghiên cứu này thu được 330g glucose/kg bã mía, rồi lên men thu được 120 g ethanol/kg bã mía 

Theo  tác  giả  Nguyễn  Minh  Hải  đã  nghiên  cứu  tối  ưu  hóa  tiền  xử  lý  bã  rong 

Chaetomorpha sp.  bằng  sunfuric  để  sử  dụng  trong  sản  xuấtethanol  sinh  học.  Trong  nghiên 

trong NaOH 0,75% w/v, tỷ lệ rong 1/20, chiết ở 50 C trong 1 giờ sau đó ly tâm thu dịch nổi protein, phần bã được sấy khô sử dụng lên men ethanol. Bã được sấy về độ ẩm 4% sau đó bã rong được được phối trộn tỷ lệ 1/10 rồi xử lý với axit 1,75% w/v tại nhiệt độ 120 oC trong 34 phút,  sau  đó  trung  hòa  với  Ca(OH)2  lúc  này  hàm  lượng  đường  thu  được  là  20,7  g/l  rồi  bổ sung enzyme Cellic Ctec2 nồng độ 20 FPU/g  và Novozyme 188 nồng độ 4 CBU/g và nấm men  tiến hành đường hóa và lên men đồng thời thu được hàm lượng cồn 1,94 % v/v [13]. Quá trình thủy phân sinh khối rong biển bằng enzyme như sinh khối lignocellulose gồm hai  bước  tiền  xử  lý  và  đường  hóa.  Tiền  xử  lý  rong  nhằm  đảm  bảo  khả  năng  tiếp  cận  của enzyme đến các liên  kết của các polysaccharide. Quá trình tiền xử lý sinh khối rong biển phụ thuộc vào cấu trúc sinh học của mỗi loại rong. Quá trình tiền xử lý được sử dụng trong nghiên 

cứu của tác giả Leilei và cs đã tiền xử lý bã rong nâu Laminaria japonica trong điều kiện axit 

sufurid nồng độ 0,1 % w/v, 121 oC, thời gian 1 giờ [37]. Theo nghiên cứu của Isa và cs rong 

lục Ulva sp. được tiền xử lý ở  nhiệt độ 121  oC  trong 20 phút  [44], theo tác giả  Nadja  và  cs 

hủy cellulose, laminaran, caragenan, agar thành đường và các cấu thành khác [96]. Theo Kim 

và cs nhóm phức hệ enzyme này tác động đặc hiệu đến các polysaccharide rong biển và cắt tại các  vị  trí  đặc  hiệu  tạo  ra  các  sản  phẩm  olygosaccharid  và  các  monosaccharid  (glucose, manose,  lanimarin,  rhamnose…).  Đây  là  các  loại  đường  đơn  cần  cho  quá  trình  lên  men ethanol của vi sinh  vật [52].  Một số enzyme được sử  dụng thủy phân  rong biển như  nghiên 

cứu  của  Yanagisawa  và  cs  sử  dụng  enzyme  Meicelase  do  Nhật  sản  xuất  từ  Trichoderma viride,  có  hoạt  tính  cellulase  là  73,3U/g  và  cellobiase  227  U/g,  enzyme  này  thủy  phân  tinh  bột, cellulose, cellobiose, beta glucan trong rong Ulva pertusa. Theo nghiên cứu của  Nitin và 

phẩm Cellusoft L của hãng Novozyme;   theo  nghiên cứu  của Vũ  Nguyên  Thành  thủy phân rơm  rạ  bằng  chế  phẩm  cellulast  1,5  L  của  hãng  Novozyme;  theo  nghiên  cứu  của  Samsuiri thủy  phân  rơm  rạ  bằng  chế  phẩm  Meicellase  của  hãng  Meijii,  Seika;  theo  nghiên  cứu  của Geddes thủy phân rơm rạ bằng chế phẩm Biocellulase W của hãng Novozyme; theo nghiên cứu  của  Nguyễn  Thị  Minh  Phương  thủy  phân  rơm  rạ  bằng  chế  phẩm  Cellic®  CTec2  và 

Cellic® HTec2 của hãng Novozyme; Nguyễn Minh Hải thủy phân bã rong Chaetomorpha sp. 

sử dụng chế phẩm Cellic® CTec2 và Novozyme 188 [13]. Bản chất các chế phẩm này chứa các loại enzyme endoglucanse, exoglucanase, beta glucosidase, xylanase thủy phân cellulose, 

hemicellulose, xylan. Trong nghiên cứu thủy phân rong Ch.linum, chúng tôi chọn chế phẩm 

Viscozyme  L  của  công  ty  Novozyme  và  Cellulase  mã  số  C2605-50ml  của  công  ty  Sigma. Trong đó chế phẩm Cellulase chứa các loại enzyme tương tự như các chế phẩm nêu trên và Viscozyme L có chứa hệ enzyme rộng hơn như cellulase, glucanase, xylanase, glucoamylase, galactosidase. 

1.2.3.3 Ảnh hưởng các yếu tố đến quá trình thủy phân

a Ảnh hưởng của nồng độ axit và nồng độ enzyme

Trong  quá  trình  thủy  phân  rong  biển  bằng  axit,  hàm lượng  axit  bổ  sung  có  vai  trò  rất quan trọng. Hàm lượng axit quá bé quá trình thủy phân cho hiệu suất thấp, thời gian thủy phân kéo dài, tiêu tốn nhiều nhiên liệu phục vụ cho thủy phân. Ngược hàm lượng axit lớn, thời gian thủy phân nhanh, hiệu suất thủy phân cao, nhưng mau hỏng thiết bị, tiêu tốn nhiều hóa chất trung hòa hoặc vận hành và thiết bị tách axit, ngoài ra còn tạo nhiều sản phẩm phụ ức chế quá trình lên men. 

Các  dạng  axit  sử  dụng  thủy  phân  sinh  khối  rong  có  tính  oxi  hóa  mạnh  (HCl,  H2SO4, HCHO….) nhưng đa phần trong các nghiên cứu thủy phân sinh khối rong biển theo tổng quan của Wei. N thường sử dụng axit sunfuric [96] 

Enzyme  là  sản  phẩm  sinh  học  có  khả  năng  thủy  phân  các  loại  cơ  chất  mang  tính  đặc hiệu.  Trong  nghiên  cứu  này  rong  biển  là  nguồn  cơ  chất  cần  được  thủy  phân,  các  loại polysaccharide  rong  biển  có  tính  đa  dạng,  thành  phần  polysaccharide  gồm  có  agar,  ulvan, agilnate,  fucoidan,  cellulose,  tinh  bột….  mỗi  loại  polyme  chịu  tác  động  trực  tiếp  của  các enzyme  như  cellulase,  beta-glucanase,  glucosidase, alginatase,  fucoidanase,  ulvanase…trong 

đó  nồng  độ  các  enzyme  sử  dụng  thủy  phân  luôn  luôn  được  nghiên  cứu  chi  tiết.  Nồng  độ enzyme thủy phân cao quá trình thủy phân diễn ra nhanh và hiệu suất cao và ngược lại, nhưng 

để quá trình thủy phân diễn ra hiệu quả cần phải bổ sung enzyme một cách hợp lý để tránh dư thừa gây lãng phí enyme. Nồng độ enzyme trong các nghiên cứu thủy phân rong biển thường 

b Ảnh hưởng của nhiệt độ   

Nguồn  sinh  khối  rong  biển  chứa  nhiều  polysaccharide  có  cấu  tạo  phức  tạp,  vì  vậy  để chuyển hóa các polyme này thành phân tử đơn giản đòi hỏi cần xúc tác nhiệt trong quá trình thủy phân.  Trong  đó  nhiệt  độ  thủy  phân  cao  thời gian  thủy  phân ngắn,  và ngược  lại.  Trong quá  trình  thủy  phân  rong  biển,  rong  đỏ  và  rong  nâu  dễ  bị  thủy  phân  hơn  rong  lục,  vì  hàm lượng  cellulose  trong  rong  nâu  và  đỏ  thấp  hơn  nhiều  so  với  cellulose  của  rong  lục.  Trong 

nghiên  cứu  của  Wang  nhiệt  độ  thủy  phân  rong  đỏ  Gracilaria salicornia  là  121  oC  trong  30 

phút  [95],  và  theo  nghiên  cứu  của  Minchul  Yoon  nhiệt  độ  thủy  phân  rong  nâu  Laminaria japonica  là  121  oC  trong  3  giờ  [62]  là  thủy  phân  hoàn  toàn.  Nhưng  đối  với  rong  lục,  theo nghiên cứu của Isa ở nhiệt độ 121 oC trong thời gian 20 phút chỉ mới tiền xử lý nguyên liệu cho thủy phân bằng enzyme, nghiên cứu của Nitin 2013 cũng chỉ ra ở nhiệt độ 121  oC trong 

thời gian 1 giờ cho tiền xử lý rong Ulva fasiata, đối với rong Ch linum tiền xử lý ở nhiệt cao 

180-200  oC  trong 10 phút [65]. Vì vậy để  thủy phân rong lục hiệu quả  ở nhiệt độ thích hợp cần  khảo sát hai yếu tố ảnh hưởng là nồng độ axit và thời gian thủy phân.  

Trong  thủy  phân  bằng  enzyme  nhiệt  độ  thủy  phân  đóng  vai  trò  quan  trọng,  nếu  thủy phân  cơ  chất  trong  điều  kiện  nhiệt  độ  thấp  hiệu  suất  thủy  phân  kém,  nguyên  nhân  các  loại polysaccharide luôn có độ nhớt cao, tại nhiệt độ thấp độ nhớt tăng quá trình khuấy đảo khó, enzyme khó tiếp cận với cơ chất dẫn đến hoạt độ enzyme hoạt động không như mong muốn, 

vì vậy cần có điều chỉnh nhiệt hợp lý để enzyme thuận lợi trong tiếp cận cơ chất và sử dụng các loại enzyme chịu nhiệt để có thể nâng cao hiệu suất thủy phân toàn diện. Nhưng cũng cần phải chú ý tránh nâng nhiệt độ quá cao sẽ gây ra hiện tượng phá hủy enzyme và lúc này cơ chất chịu tác động thủy phân bởi nhiệt chứ không phải enzyme gây ra hao phí enzyme, hao phí nhiệt mà hiệu suất lại không cao. Quá trình sử dụng nhiệt trong các nghiên cứu thủy phân 

Thời  gian  cũng  góp  phần  quan  trọng  trong  quá  trình  thủy  phân,  thời  gian  thủy  phân ngắn khi điều kiện thủy phân có nồng độ axit cao và nhiệt độ cao, thời gian dài  khi điều kiện thủy phân có nồng độ axit thấp và nhiệt độ thấp. Ba yếu tố này có quan hệ ràng buộc, thường trong nghiên cứu và sản xuất các tác giả thường cố rút ngắn thời gian thủy phân để tránh hao tốn nhiên liệu vận hành thiết bị, giảm thiểu tạo sản phẩm phụ và gây hỏng thiết bị. Theo các tác giả Wei N. và Wang thời gian thủy phân sinh khối rong biển bằng axit thường diễn ra 20-

60 phút. [96,95] 

Thời gian thủy phân bằng enzyme kéo dài hơn thủy phân bằng axit vì enzyme tiếp xúc 

cơ chất và cắt các liên kết một cách chậm rãi. Thời gian thủy phân sinh khối rong biển theo nghiên  cứu  của  nhiều  tác  giả  thường  30-48  giờ.  Khoảng  thời  gian  này  là  dài  nên  khả  năng nhiễm tạp là rất cao, vì vậy khi thủy phân bằng enzyme cần phải thực hiện các thao tác chuẩn, 

và tiến hành các khảo sát đường hóa lên men đồng thời để thu được các sản phẩm như mong muốn [60,62,98,75]. 

d Ảnh hưởng của nồng độ nguyên liệu

Khối lượng nguyên liệu bổ sung trong quá trình thủy phân có ảnh hưởng nhiều đến hiệu suất  thủy phân.  Trong nghiên  cứu thủy  phân  rong biển, nồng độ rong  biển  khi  sử dụng cho thủy  phân  thường  không  cao  vì  các  polysaccharide  của  rong  biển  có  độ  trương  nở  lớn  ảnh 

hưởng đến hoạt động của axit và enzyme. Theo nghiên cứu của Nitin nồng độ rong lục Ulva faciata sử dụng thủy phân là 50 g/lit [69]. Theo nghiên cứu của Nadja nồng độ rong lục Ch linum  sử  dụng  thủy  phân  là  100  g/lit  [65].  Theo  nghiên  cứu  của  Isa  nồng  độ  rong  lục  Ch linum sử dụng thủy phân là 50 g/lit 

e Ảnh hưởng của pH đến quá trình thủy phân

Trong thủy phân bằng axit pH phụ thuộc nhiều vào nồng độ axit bổ sung ban đầu vì vậy tất cả các đặc tính của yếu tố pH tương tự như của yếu tố nồng độ axit, còn đối với thủy phân bằng enzyme pH là yếu tố quan trọng quyết định đến thủy phân. Yếu tố này chịu ảnh hưởng của quá trình tiền xử lý và  đệm bổ sung,  hai  quá trình này  giúp ổn định pH  trong quá  trình 

thủy phân.  Theo  nghiên  cứu  của   Wang  thủy phân  rong  Gracilaria salicornia  bằng  enzyme  cellulase  (MP  Biomedicals,  LLC)  có  pH  5.0  [95],  theo  Nitin  thủy  phân  rong  Ulva faciata 

bằng  enzyme  Viscozyme  L  và  Cellulase  22086  của  Sigma  có  pH  4.8  [69],  theo  Nadja  thủy 

Sinh khối rong đỏ Gracilaria salicornia được tiền xử lý trong axit sunfuric loãng 2% ở 

nhiệt độ 120 oC trong 30 phút sau đó được đường hóa và lên men nhờ enzyme thủy phân và vi sinh vật [95]. 

Sinh  khối  rong  nâu  Laminaria japonica và Sargassum fulvellum  được  tiền  xử  lý  trong 

axit sunfuric 0,1-0,3 N ở nhiệt độ 120 oC trong 20 phút, sau đó được thủy phân trong các loại enzyme Celluclast 1.5L, Viscozyme L, Novoprime 959. [50] 

Sinh khối rong lục có kết cấu vỏ tế bào bền vững hơn rong nâu và rong đỏ, nguyên nhân sản phẩm cellulose được tổng hợp từ  rong lục cao hơn các loại rong khác, do vậy quá trình tiền xử lý cho thủy phân bằng enzyme phức tạp hơn. 

Rong lục Ch linum được tiền xử lý bằng nhiều phương pháp như là xử lý ở nhiệt độ cao 

180, 190, 200 oC trong 10 phút;  phương pháp thứ hai rong Ch linum được gây nổ bởi áp suất 

hơi (1,9 Mpa) ở nhiệt độ 200-210 oC trong 10 phút; phương pháp thứ ba rong xử lý với bước sóng plasma trong thời gian (20-60 phút), điều kiện bước sóng (ø: 7 cm, length: 2 cm) [65]  Sinh khối rong lục chứa nhiều dạng polysacchrid ( cellulose, tinh bột, ulvan, agar…). Vì vậy  quá  trình  thủy  phân  sinh  khối  rong  lục  bằng  enzyme  tương đối  phức  tạp.  Một  giống  vi sinh vật thường chỉ có khả năng sinh một hoặc một vài loại enzyme thủy phân polysaccharide, 

do vậy để có thể thu nhận enzyme đặc hiệu thủy phân sinh khối rong lục là điều rất khó. Cho nên phương pháp kết hợp dùng nhiều giống vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme là điều kiện rất khả quan để thủy phân sinh khối này. Nhóm phức hệ enzyme này tác động đặc hiệu đến các polysaccharide  bao  gồm  (celluose,  hemicellulose,  xylan,  ulvan,  agar,  tinh  bột),  các polysaccharide này sẽ bị enzyme cắt tại các vị trí đặt hiệu tạo ra các sản phẩm olygosaccharid 

và các monosaccharid (glucose, rhamnose, xylose, galactose). Đây là các loại đường đơn cần cho quá trình lên men ethanol của vi sinh vật. 

Vì  vậy  cần tiến  hành  nghiên  cứu  để  tìm  ra  điều  kiện  thủy  phân  thích  hợp  với  từng  đối tượng rong cụ thể. 

1.2.4 Quá trình lên men ethanol từ dịch thủy phân rong biển

Quá  trình  lên  men  dịch  thủy  phân  từ  rong  biển  cũng  đã  được  nhiều tác  giả  nghiên  cứu, 

theo nghiên cứu của Wang sản xuất cồn sinh học từ loài Gracilaria salicornia, dịch thủy phân  được lên men với Escherichia coli, đây là loại vi khuẩn tái tổ hợp có khả năng lên men nguồn 

cơ chất galactose, cho hiệu suất lên men 79,1g ethanol/kg rong khô [95].Một nghiên cứu khác 

của Ge Le sản xuất cồn từ bã thải rong Laminaria japonica sau khi sản xuất aginate, bã thải  được  đường  hóa  rồi  lên men  bằng  chủng Saccharose cerevisiae.  Kết  quả  thu  được  sau thủy 

phân    277,5  g  glucose/kg  bã  thải  khô  và  lên  men  thu  được  122  g  ethanol/  kg  bã  thãi.  [37]. 

Theo  nghiên  cứu  của  Horn  sản  xuất  ethanol  từ  hai  loài  rong  Laminaria hyperborea  và  

Ascophyllum nodosum,  rong  được  thủy  phân  bằng  enzyme  sau  đó  lên  men  với  hai  chủng  Zymobacter palmae, Pichia angophorae,  kết  quả  lên  men  thu  được  430g  ethanol/kg  đường 

laminaran [41]. Theo nhóm nghiên cứu của tác giả Nag-Jong Kim thuộc trung tâm hóa học và 

kỹ thuật sinh học phân tử đã tái tổ hợp gene mã hóa vào chủng E coli  tạo ra chủng giống có  tên khoa học E.coli K11 để tổng hợp ethanol từ nhiều loại đường glucose, mannose, galactose 

và mannitol. Chủng vi sinh vật này đã được tiến hành lên men thử nghiệm với nguồn cơ chất 

là  hỗn hợp  dung dịch  đường  được  thủy  phân  bằng  enzyme  từ  nguồn  sinh khối  của  các  loại 

rong Ulva lactuca, Gelidium amansii, Laminaria japonica, và Sargassum fulvellum. Trong đó  hiệu suất lên men sinh ethanol với nguồn cơ chất từ rong  Laminaria japonica là cho hiệu suất 

cao nhất, hàm lượng ethanol được xác định 400g ethanol/kg đường laminaran [66]. Ngoài ra, 

theo nghiên cứu của Lee S.M. sử dụng dịch thủy phân rong Laminariajaponica chứa đường  manitol, laminaran được lên men với bốn chủng vi sinh vật gồm: Enterobacter sp., Panotoea agglomerans, Eruinia tasmaniensis, Candida lasitancae. Trong đó chủng Candida lasitancae 

Một  nhóm  nghiên  cứu  của  phòng  công  nghệ  sinh  học  thuộc  trường  cao  đẳng 

Vivekanandha,  đã  nghiên  cứu  sản  xuất cồn  từ  rong  Eucheuma sp và  Hypnea sp.  Mẫu  rong  được thủy phân bởi axit sunfuric sau đó lên men với nấm men Saccharomyces cerevisiae. Kết 

quả sau lên men thu được 200 g ethanol/ kg rong [50]. 

Theo nghiên cứu của tác giả Kalpana, nghiên cứu sản xuất ethanol từ rong Kappahycus alvarezii Rong Kappahycus alvarezii sau khi được thủy phân với axit sunfuric được lên men  với  nấm  men  Saccharomyces cerevisiae (NCIM  3523),  kết  quả  thu  được  218  g  ethanol/kg 

rong[49]..  

Theo nghiên cứu của Nadja đã tiến hành tiền xử lý rong Ch

linum ở nhiệt độ cao 190-200 oC, nổ hơi ở áp suất cao và chiếu plasma trong. Sau đó đường hóa và lên men đồng thời trong 200 giờ. Kết quả của nghiên cứu này đã thu được 180 g ethanol/kg rong khô [65]. Trong quá trình lên men rong biển và các sinh khối khác, các tác giả sử dụng các hướng nghiên cứu khác nhau gồm có lên men từ dịch thủy phân bằng axit, lên men dịch thủy phân bằng  enzyme  và  quá  trình  đường  hóa  lên  men  đồng  thời.  Có  sự  khác  nhau  của  quá  trình 

để  trong  dịch  có  một  lượng  dinh  dưỡng  nhất  định  đủ  đảm  bảo  cho  sự  sinh  trưởng  và  phát triển của nấm men trong giai đoạn ban đầu của quá trình lên men và sau đó quá trình đường hóa và lên men điễn ra đồng thời. Mỗi phương pháp lên men thích hợp với từng nguyên liệu khác nhau, trong đó nguyên liệu rong đỏ, rong nâu thường được đường hóa bằng axit rồi lên men  [37,50,95],  nguyên  liệu  rong  lục  và  rơm  rạ,  bã  mía,  gỗ  mền  được  đường  hóa  bằng enzyme rồi lên men hoặc đường hóa và lên men đồng thời [15,23,58, 98,65]. Như vậy có thể thấy các nguyên liệu giàu cellulose, các tác giả thường tiếp cận theo hai phương pháp đường hóa bằng enzyme rồi lên men hoặc đường hóa và lên men đồng thời.  

1.2.4.1 Nấm men

Rong  biển  giàu  carbohydrate  nên  được  sử  dụng  để  sản  xuất  nhiên  liệu  sinh  học.  Theo nghiên  cứu  của  Kim và  Adam,  quá  trình  thủy phân  chuyển  đổi  carbohydrate  của  rong  biển thành đường lên  men  giúp  cho  vi  sinh  vật dễ  dàng sử  dụng để  sản  xuất  ethanol. Trong các 

nhóm vi sinh  vật sinh ethanol, nấm men Saccharomyces cerevisiae (S cerevisiae) vẫn là  vi  sinh vật có ứng dụng rộng rãi nhất. Nấm men S cerevisiae có thể lên men nhiều đường đơn  như  glucose,  galactose,  manose,  đường  đôi  như  sucrose,  maltose S cerevisiae  là  một  loại 

nấm  men  sử  dụng  rộng  rãi  nhất  trong  quá  trình  lên  men  ethanol,  đã  được  trình  bày  trong nhiều  nghiên  cứu  trước  đây  cho  sản  xuất  ethanol  sinh  học  từ  sinh  khối  rong  biển  [25,52].  Nghiên  cứu  của  Adam  sử  dụng  enzyme  laminarinase  để  thủy  phân  laminaran  trong  rong 

Saccharina latissima  thành  glucose,  rồi  lên  men  để  sản  xuất  ethanol  từ  S cerevisiae[24]. 

kiện oxy thấp  và sản xuất ethanol với hàm lượng 0,38g ethanol/g manitol [42]. Một nghiên 

cứu khác phát hiện ra chủng Pichia angophorae có thể lên men ethanol đồng thời mannitol 

và cả laminaran từ dich thủy phân rong nâu, hàm lượng ethanol tối đa là 0,43 g ethanol/g cơ 

chất [42]. Theo nghiên cứu của Park, chủng Brettanomyces custersii đã được phát hiện là phù  hợp  cho  quá  trình  lên  men  galactose  hơn  S cerevisiae.  Nghiên  cứu  này  cho  thấy  chủng   Brettanomycescustersii  KCTC  18154P  đã  lên  men  dịch  thủy  phân  từ  rong  đỏ  Gracilaria amansii, thành phần  chính của dịch  thủy phân  là galactose  và một số  sản  phẩm  biến  đổi từ 

đường 5 carbon  như 5 - hydroxymethyl -2- furaldehyde (5 HMF) và các axit hữu cơ, kết quả 

hoàn toàn và thu được 27,6 g ethanol/ 72,2 g cơ chất khi đường hóa lên men đồng thời [71].  Một  trong  những  khó  khăn  khi  lên  men  dịch  thủy  phân  sinh  khối  rong  lục  là  rất  ít  vi sinh  vật  có  khả  năng  lên  men  rhamnose  và  arabinose,  xylose  (chiếm  20-30%  lượng  đường 

dịch  thủy  phân  rong  lục).  Các  chủng  nấm  men  S cerevisiae  đều  không  có  khả  năng  này.  Chính vì những lý do đó, hiện nay có nhiều nhóm nghiên cứu đang tập trung vào cải thiện S cerevisiae theo hướng chuyển các gene để có thể lên men arabinose, rhamnose, xylose [40, 

96].  

Bảng 1 4 Nấm men lên men ethanol từ sinh khối rong biển

loài rong biển

Chaetomorpha linum

Glucose, galactose 

[96] 

[42] 

amansii

Galactose, glucose 

[71] 

men kết hợp galactose và cellobiose 

[32,39,56,70] 

1.2.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men ethanol

a Ảnh hưởng của nhiệt độtới quá trình lên men ethanol

rong biển [86]. Trong nghiên cứu tác giả Nitin lên men dịch thủy phân rong lục Ulva faciata  với nấm men S serevisiae ở nhiệt độ 28 oC [69], theo nghiên cứu của Wang dịch thủy phân 

rong đỏ Gracilaria salicornia được lên men với nấm men S serevisiae ở nhiệt độ 30 oC [95], 

tại  nhiệt  độ  này  tác  giả  Lee  S.M.  sử  dụng  lên  men  dịch  thủy  phân  rong  nâu  Laminaria japonica với nấm men Candida tropicalis. Nghiên cứu của Nadja nhiệt độ lên men dịch thủy  phân rong Ch linum là 32 oC với nấm men S serevisiae [65]. 

Giữa nhiệt độ và oxy có sự liên quan chặt chẽ với nhau. Nấm men thường sinh trưởng mạnh  trong  thời  gian  đầu,  trong  thời  gian  này  có  một  lượng  oxy hòa  tan  và  nhiệt  độ  thích hợp là 25- 30 0C. 

b Ảnh hưởng của pH tới quá trình lên men ethanol

  pH có ảnh hưởng tới hoạt động của nấm men. Các ion H+ làm thay đổi điện tích các chất của vỏ tế bào nấm men, làm tăng hoặc giảm mức độ thẩm thấu của các chất dinh dưỡng cũng  như  chiều  hướng  của  quá  trình  lên  men.  Trong  điều  kiện  lên  men  rượu,  nấm  men 

Saccharomyces có pH tối ưu để tạo ethanol nằm trong khoảng 4,5- 5,0. Với khoảng pH này, 

nấm men sẽ sinh trưởng và phát triển mạnh. Nếu pH tăng sẽ làm tăng khả năng nhiễm tạp, tạo ra nhiều glyxerin do đó làm giảm hiệu suất lên men [10]. Theo nghiên cứu của Ge Lee và 

cs  lên  men  dịch  thủy  phân  bã  rong  nâu  Laminaria japonica  sử  dụng  pH  4.8  [37].  Theo  nghiên cứu của Nadja lên men dịch thủy phân rong Ch linum sử dụng pH 4.8 [65]. 

c Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất tới quá trình lên men ethanol

sử dụng để nấm men sinh trưởng và phát triển chiếm 6% so  với  lượng đường có  trong dung dịch;   nếu    nồng độ  đường   là  8,6%    thì    tổn    thất    do   nấm  men sinh  trưởng  và  phát  triển  chiếm  tới  9,84%.  Mặt  khác, lên  men  ở  nồng  độ  thấp  sẽ  làm  giảm  năng  suất  của  thiết  

bị,  tốn nhiều  hơi  khi  chưng  cất  và  làm  tăng  tỉ  lệ  tổn  thất  rượu  trong  bã hèm  và  nước    thải [10,61,86].  Trong nghiên  cứu  lên  men  ethanol  từ  rong  biển, nồng độ  đường  của dịch lên men phụ thuộc vào  nồng độ chất khô sử dụng cho thủy phân.  Các  nghiên cứu  cho thấy rong biển có tính trương nở nên khó nâng cao được nồng độ đường trong dịch lên men.  

d Ảnh hưởng của nguồn nitơ tới quá trình lên men ethanol

Nitơ  rất  cần  thiết cho quá  trình  sinh  trưởng  và  phát  triển của  nấm  men. Thông thường trong dịch thủy phân một số nguyên liệu như rơm rạ, bã mía có hàm lượng nitơ không đảm bảo  cho  phát  triển  của  nấm  men.  Do  vậy  phải  bổ  sung  nguồn  nitơ  từ  ngoài  vào  dưới  dạng (NH4)2SO4 hoặc (NH4)2CO để tăng cường khả năng sinh sản của tế bào nấm men [10,61,86]. 

e Ảnh hưởng của nồng độ nấm men tới quá trình lên men ethanol

        Số lượng tế bào nấm men có trong dịch lên men càng thấp thì thời gian lên men sẽ kéo dài và dễ bị nhiễm khuẩn. Ngược lại, số lượng tế bào nấm men có trong dịch lên men cao thì thời gian lên men sẽ ngắn hạn chế được khả năng nhiễm khuẩn do sự áp đảo của nấm men. Tuy nhiên nếu lượng men giống quá cao sẽ gây ảnh hưởng không tốt tới quá trình lên men [10,23,61].  

f Ảnh hưởng của chất sát trùng tới quá trình lên men ethanol

Quá  trình  lên  men  thường  diễn  ra  trong  một  khoảng  thời  gian  khá  dài,  khả  năng  bị nhiễm khuẩn rất cao. Chính vì vậy người ta thường bổ sung thêm chất sát trùng để ngăn ngừa 

Có thể dùng nhiều hóa chất để sát trùng như: tween, flousilicat natri, formalin…Ở các nhà máy  rượu  hiện  nay  thường  sử  dụng  flousilicat  natri  để  sát  trùng  với  liều  lượng  0,2 

Tại  Trung  Quốc  theo  nghiên  cứu  của  Wang  sản  xuất  cồn  sinh  học  từ  loài  Gracilaria salicornia.  Sinh  khối  của  loài  Gracilaria salicornia  được  thủy  phân  trong  điều  kiện  axit 

sunfuric  2%,  trong  30  phút  ở  nhiệt  độ  120o  C,  hiệu  suất  của  quá  trình  thủy  phân    4,3  g 

glucose/kg  rong  tươi.  Ngoài  ra  sinh  khối  Gracilaria salicornia  còn  được  thủy  phân  bằng 

enzyme  cellulase  và  có    hiệu  suất  13,8  g  (glucose/kg  rong  tươi)  cao  hơn  nhiều  so  với  thủy 

phân bằng axit loãng. Sau khi thủy phân dung dịch đường được lên men với Escherichia coli, 

đây là loại vi khuẩn tái tổ hợp có khả năng lên men nguồn cơ chất galactose, cho hiệu suất lên men 79,1g ethanol/kg rong khô (100,2 ml ethanol/ kg rong khô) [95]. 

Theo  nghiên  cứu  của  Horn  sản  xuất  ethanol  từ  hai  loài  rong  Laminaria hyperborea và  Ascophyllum nodosum, rong được tiền xử lý bằng axit sunfuric sau đó được thủy phân bằng  enzyme  β-(1-3)-glucanase,  sau  đó  lên  men  với  hai  chủng  Zymobacter palmae, Pichia angophorae. Điều kiện tiền xử lý bằng axit sunfuric với nồng độ 0,3%(w/v) trong thời gian 1 

giờ  và  thủy phân  bằng  enzyme  tại  điều  kiện  (450  C,  pH  4.8,  45h)  và  lên men  ở  270C  trong 72giờ. Hiệu suất lên men 0,43g ethanol/g cơ chất (0,54L/kg cơ chất) [41]. 

Hàn  Quốc  là  đất  nước  có  nền  công  nghệ  sinh  học  phát  triển.  Vì  vậy  Hàn  Quốc  đã  ứng dụng nhiều kỹ thuật mới và hiện đại vào sản xuất ethanol. Nhóm tác giả Michul Yoon đã sử 

cho công nghệ sản xuất cồn. Thành phần loài được sử dụng trong nghiên cứu này là Undaria sp., đây là loài có sinh khối vô cùng lớn được nuôi trồng và khai thác tự nhiên tại Hàn Quốc. 

Mẫu rong biển sau khi thu hoạch ngoài tự nhiên sẽ được xử lý với tia Gamma với liều chiếu 0, 

10, 50, 100, 200 và 500 kGy, sau đó thủy phân trong axit sunfuric 1%w/v tại 121 oC trong 3 giờ. Sau quá trình thủy phân hỗn hợp rong sẽ được trung hòa với CaCO3 rồi lên men với nấm men. Hàm lượng glucose thu được vào khoảng 72 -204g/kg đường tổng số [62]. 

Với sự phát triển của kỹ thuật gene, Hàn Quốc đã thành công trong công nghệ tái tổ hợp. Theo nhóm nghiên cứu của tác giả Nag-Jong Kim thuộc trung tâm hóa học và kỹ thuật sinh 

học phân tử đã tái tổ hợp gene mã hóa vào chủng E coli  tạo ra chủng giống có tên khoa học  E.coli K11 để tổng hợp ethanol từ nhiều loại đường glucose, mannose, galactose, và mannitol. 

Chủng vi sinh vật này đã được tiến hành lên men thử nghiệm với nguồn cơ chất là hỗn hợp 

dung  dịch  đường  được  thủy  phân  bằng  enzyme  từ  nguồn  sinh  khối  của  các  loại  rong  Ulva lactuca, Gelidium amansii, Laminaria japonica, and Sargassum fulvellum. Trong đó hiệu suất  lên men sinh ethanol với nguồn cơ chất từ rong  Laminaria japonica là cho hiệu suất cao nhất, 

hàm lượng ethanol được xác định 0,4g ethanol/g cơ chất (506 ml ethanol/ kg)[66]. 

Ngoài  ra,  theo  nghiên  cứu  của  Lee  sử  dụng  rong  nâu  Laminaria japonica cho  sản  xuất 

ethanol, trong rong nâu  chứa  nhiều  loại đường khác  nhau, nhiều nhất  là manitol,  laminaran. Rong  này  sau  khi  thủy  phân  trong  HCl  1-5%  (w  axit/w  rong)  ở  121oC  tạo  ra  lượng  đường 

20g/l,  sau  đó  lên  men  với  bốn  chủng  vi  sinh  vật  gồm:  Enterobacter sp, Panotoea agglomerans, Eruinia tasmaniensis, Candida lasitancae. Trong đó chủng Candida lasitancae 

lên men với  đường manitol cho  hiệu suất cồn cao nhất  2.59 g ethanol/l sau 96 giờ  lên men. Ngoài ra alginate sau khi được thủy phân bằng enzyme alginatelyase cũng được lên men với 

chủng Eruinia tasmaniensis, Candida lasitancae đạt hiệu suất 2,0 g/l[55]. 

Nhật  Bản  cũng  sử  dụng  rong  lục  để  nghiên  cứu  sản  xuất  ethanol.  Theo  tác  giả  Isa  mẫu 

rong  được  thu  rãi  rác  tại  Việt  Nam,  Thái  Lan,  Nhật  bao  gồm  các  chi  Enteromorpha, Chaetomorpha, Cladophora, Caulerpa, Ulva rồi xác định hàm lượng carbohydrate tổng số, và  hàm lượng glucose của từng loài. Sau khi khảo sát, nhóm tác giả đã chọn rong Ulva spp cho 

sản xuất ethanol, các tác giả đã sử dụng tiền xử lý rong Ulva ở 120  oC trong 20 phút rồi bổ sung 1% v/w enzyme cellulase có tên thương mại Acremonium hoạt độ 322 FPU/g, nồng độ polysaccarid 5% w/v thủy phân trong 72 giờ ở 50 oC thu được 95% glucose = 4,7 g/ 100ml và 

tiếp tục lên men với nấm men Saccharomyces cerevisiae IR-2 trong 32 giờ ở 30 oC thu được 2 

g ethanol/100ml [44]. 

Đầu  năm  2011  nhóm  nghiên  cứu  của  Yanagisawa  của  viện  khoa  học  kỹ  thuật  Tokyo 

Nhật  Bản đã  đưa  ra  kỹ thuật  sản xuất  cồn  từ  rong  Ulva pertusa  (Kjellman).  Quá  trình  thủy 

phân các polysaccharide của các loại rong này được thực hiện theo tỷ lệ 75g khô/l rồi tiền xử 

lý  với  nhiệt  0,1  M  citric,  121oC  trong  20  phút,  sau  đó  rong  được  thủy  phân  bởi  enzyme Meicelase là enzyme có cellulase 73,3 U/g và cellobiase 227 U/g của công ty (Avicel, Merck, Germany) liều dùng thủy phân 20g rong/g enzyme trong 120 giờ pH=5.5, nhiệt độ 50 oC Kết  quả  thủy  phân  thu  được 43g  glucose/l  rồi  lên  men  với  Saccharomyces cerevisiae IAM 4178

thu được 18.5 g/l [98]. 

Trong những năm gần đây Ấn Độ đặc biệt chú trọng đến việc phát triển nhiên liệu sinh học từ nguồn sinh khối thực vật nhằm giải quyết vấn đề nhiên liệu cho quốc gia. Các nguồn sinh khối đã được nhà nước Ấn Độ chú trọng phát triển bao gồm cây Jatropha, các cây họ dầu 

cọ, sắn, mía đường và cả rong biển. Tuy nguồn sinh khối rong biển ứng dụng trong sản xuất ethanol vừa mới được nghiên cứu ứng dụng nhưng cũng đã thu được một số kết quả bước đầu. Một nhóm nghiên cứu thuộc phòng công nghệ sinh học thuộc trường cao đẳng Vivekanandha, 

đã nghiên cứu sản xuất cồn từ rong Eucheuma sp và Hypnea sp Mẫu rong được thủy phân 

bởi  axit sunfuric 1% tại nhiệt độ 100oC  trong 3 giờ  theo  nồng độ chất khô 20g/l,  dung  dịch đường  sau  thủy  phân  sẽ  được  trung  hòa  bằng  BaCO3  sau  đó  lên  men  với  nấm  men Saccharomyces cerevisiae.  Kết  quả  sau  lên  men  cho  thấy  1  gram  rong  sẽ  tạo  thành  200mg 

ethanol [50]. 

Theo nghiên cứu của tác giả Kalpana, nghiên cứu sản xuất ethanol từ rong Kappahycus alvarezii.  Đây  là  loài  rong  đỏ  được  nuôi  trồng  phổ  biến  có  sinh  khối  lớn,  có  hàm  lượng  carbohydrate  cao  với  thành  phần  chính  là  polysaccharide  carrageenan.  Rong  Kappahycus

20 FPU/g và 2 g/l nấm men đã chuẩn bị trước rồi lên men trong 200 giờ. Kết quả của nghiên cứu này đã thu được 15-18 g ethanol/100 g rong khô [65]. 

Trên thế giới nhiều quốc gia đang tập trung nghiên cứu sản xuất ethanol từ nguồn sinh khối rong biển, số lượng các dự án nghiên cứu ngày một gia tăng và quy mô ngày một lớn. 

để nuôi trồng rong biển sản xuất bioethanol  [78]. 

Dự án Biomara, phối hợp giữa Hiệp hội Khoa học Biển Scotland và Liên minh châu Âu với sự điều hành của 2 chính phủ Ailen và Scotland, với mục tiêu sản xuất nhiên liệu sinh học thế hệ thứ ba từ sinh khố itảo. Đã đầu tư 8 triệu USD vào năm 2009, để đánh giá tiềm năng rong biển và chọn dòng microalgae để sản xuất quy mô công nghiệp [78]. 

Tại Na Uy, dự án sản xuất ethanol và các sản phẩm lipids, proteins, iodine từ rong biển theo quỹ tài trợ của BAL’s R&D bắt đầu từ cuối năm 2010. 

Tại  Chile,  dự  án  sản  xuất  ethanol  từ  rong  biển  của  Chile  giữa  Bio-Architecture  Lab (BAL) với Công ty dầu khí ENAP và trường Đại học Los Angeles. Đã đầu tư 5 triệu USD từ năm 2010 để sản xuất 165 triệu lít ethanol vào năm 2012. 

1.3.2 Tình hình nghiên cứu và sản xuất ethanol từ nguyên liệu rong biển ở Việt Nam Việt Nam vấn đề nghiên sản xuất nhiên liệu sinh học từ sinh khối tảo là hướng phát triển mới. Hiện tại đã có một số phòng thí nghiệm tiến hành nghiên cứu nhiên liệu sinh học từ tảo. Phòng  nghiên  cứu  tảo  của  Viện  Công  nghệ  Sinh  học  nghiên  cứu  diesel  sinh  học  được  sản xuất từ sinh khối vi tảo  biển của Việt Nam. Vi tảo được tác giả sử dụng cho nghiên cứu là 

Schizochytrium mangrovei PQ6 [2,1]. 

Theo  Hoàng  Kim  Anh  bước  đầu  đã  khảo  sát  được  thành  phần  hóa  học  rong 

Chaetomorpha sp. đồng bằng sông Cửu  Long và định hướng sử dụng protein sản xuất thức 

ăn chăn nuôi và sử dụng bã thải nghiên cứu sản xuất ethanol [3]. 

Theo kết quả nghiên cứu của đề tài “Nghiên cứu đánh giá tiềm năng rong biển Việt Nam 

sử  dụng  làm  nguyên  liệu  sản  xuất ethanol  nhiên  liệu” của  tác  giả  Lê  Như  Hậu,  nguồn sinh khối rong lục được thống kê như sau: 

Bảng 1 5 Diện tích và sản lượng tại thời điểm khảo sát (2010) và dự kiến đến năm 2015

Loài 

Diện tích (ha) 

Sản lượng  (tấn khô)  Diện tích (ha) 

Sản lượng  (tấn khô) 

là  nhóm  Chaetomorpha, Cladophora, Enteromorpha  có  năng  suất  thu  hoạch  18-27 

tấn/ha/năm.  Diện  tích  nuôi  các  đối  tượng  rong  lục  có  thể sử  dụng bất  kỳ nguồn  nước  ngập mặn ven biển như các ao hoang, đầm ngập mặn, ao xử lý nước, kênh dẫn nước, đặc biệt có thể phát triển tốt vùng ngập mặn đồng bằng sông Cửu Long, đồng bằng ven biển sông Hồng, các vùng ven và cửa biển các tỉnh miền trung. Theo bảng 1.5, thành phần polysaccharid của rong lục chủ yếu là các sản phẩm quang hợp như tinh bột và cellulose nên khi thủy phân tạo 

ra đường glucose dễ lên men ethanol. Sự phân bố rộng và thích nghi nhiều loại môi trường và thành phần hóa học dễ lên men chỉ ra rong lục là nguyên liệu thích hợp cho nghiên cứu sản xuất ethanol. 

 Trong khi đó nguyên liệu rong đỏ ở Việt Nam có rong Kappaphycus đã được nuôi trồng 

nhưng chỉ phát triển tốt tại các vùng Nam Trung Bộ năng suất thu hoạch đạt 12 tấn/ha và giá thành nguyên liệu này cao 20.000-25.000 VNĐ/ kg nên không thích hợp cho sản xuất ethanol 

chỉ thích hợp cho sản xuất carragenan. Rong đỏ Gracilaria mặc dù có thể phát triển nhiều nơi 

từ Nam Trung Bộ ra đến Vịnh Bắc Bộ nhưng khả năng sinh trưởng chậm hơn rong lục năng 

suất thu hoạch thấp 15 tấn/ha/năm và rong Gracilaria là nguyên liệu chính cho sản xuất agar. 

Theo Trần Thị Thanh Vân rong đỏ có thành phần polysacharid chính là agar và carragenan [22]. Sản phẩm thủy phân là galactose lên men được ethanol nhưng chậm hơn so với glucose. Giá thành nguyên liệu cao, năng suất thấp, thời gian lên men kéo dài, rong đỏ gặp nhiều hạn chế trong sản xuất ethanol hơn rong lục.  

Nguyên  liệu  rong  nâu  ở  nước  ta  mô  hình  nuôi  trồng  vẫn  chưa  được  triển  khai,  nên nguyên  liệu  này  chủ  yếu  khai  thác  tự  nhiên  và  đối  tượng  khai  thác  chính  là  rong  mơ 

Sargassum, vùng biển khai  thác  nguyên liệu  này chủ yếu  một  số tỉnh  Nam Trung bộ,  năng 

xuất khai thác nhỏ lẻ, giá thành cao 12.000-15.000 VNĐ/kg. Theo Trần Thị Thanh Vân thành phần polysaccharid chủ yếu là alginate 70-80% tạo ra sản phẩm thủy phân là axit gluronic và manuronic [21]. Hai loại đường rất khó lên men ethanol, nên rong nâu thích hợp là nguyên liệu cho sản xuất alginat, thực phẩm chức năng hơn là nguyên liệu cho sản xuất ethanol.  Như vậy, rong lục có nguồn sinh khối dồi dào, có thành phần hóa học thích hợp cho sản xuất ethanol, không cạnh tranh lương thực và chất đốt, vì vậy rong lục là nguồn nguyên liệu tiềm  năng  cho  sản  xuất  nhiên  liệu  sinh  học.  Để  cung  ứng  nhu  cầu  nhiên  liệu,  Quyết  định 177/2007/QĐ-TTg của Thủ tướng Chính phủ ngày 20/11/2007 đã ký thực hiện chương trình KH&CN trọng điểm cấp nhà nước giai đoạn 2011-2015 về Đề án phát triển NLSH đến năm 

2015, tầm nhìn đến năm 2025. Xuất phát từ những phân tích trên, cho thấy rằng cần đưa ra được  công  nghệ  sản  xuất  ethanol  từ  nguồn  nguyên  liệu  rong  biển  phong phú của  Việt  nam nhằm góp phần tăng nguồn nhiên liệu sinh học thay thế nhiên liệu hóa thạch ngày càng cạn kiệt, chính vì vậy chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu xác định các thông số công nghệ

xử lý rong lục Việt Nam và lên men ethanol góp phần phát triển cồn nhiên liệu”

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 VẬT LIỆU

2.1.1 Rong lục

Rong lục được thu ở các tỉnh ven biển Thanh Hóa, Thái Bình, Ninh Bình, Quảng Ngãi, Phú  Yên,  Khánh  Hòa,  Ninh  Thuận,  Bến  Tre,  Cà  Mau  trong  khoảng  thời  gian  từ  năm  2011 đến  năm  2013,  sau  đó  được  định  danh  và  lưu  giữ  mẫu  tại  Viện  Nghiên  cứu  và  Ứng  dụng Công nghệ Nha Trang. 

Rong  Chaetomorpha linum,  Chi  Chaetomorpha, Ngành  Chlorophyta,  Lớp 

Ulvophyceae, Bộ Cladophorales, Họ Cladophoraceae. Rong được sấy khô đến độ ẩm 13% sử dụng cho nghiên cứu. 

Chế  phẩm  Thermosacc  Active  Dry  Yeats  hãng  sản  xuất  Lallemand  là  nấm  men Saccharomyces cerevisiae,  một  loại  nấm  men  khô  được  sử  dụng  trong  sản  xuất  ethanol  từ 

nguồn  nguyên  liệu  tinh  bột  và  nguyên  liệu  giàu  cellulose.  Số  lượng  tế  bào  ≥  2.5  ×1010  tế bào/g.Điều kiện hoạt động thích hợp ở pH =4.5-5 có thể chịu pH 3.5, nhiệt độ 27-32oC  và có thể chịu được nhiệt độ lên đến 40oC  

Chế  phẩm  Red  Ethanol  là  nấm  men  Saccharomyces cerevisiae  của  hãng  Fermentis, 

Pháp được sử dụng trong sản xuất ethanol từ nguồn nguyên liệu tinh bột và nguyên liệu giàu