Ứng dụng thử nghiệm công nghệ RNA interference vào nghiên cứu chuyển đổi giới tính tôm càng xanh

Điều này thể hiện rằng việc nuôi tôm càng xanh toàn đực đã làm tăng sản lượng một cách đáng kể và mang lại lợi nhuận cao hơn việc nuôi toàn cái hay hỗn hợp đực và cái.. 2 Kỹ thuật bất h

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện : Nguyễn Thị An

1

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii) (De Man, 1879) là loài tôm

nước ngọt có giá trị quan trọng và đóng vai trò lớn trong nghề nuôi trồng thủy sản ở nhiều nước nhiệt đới và cận nhiệt đới Trong những năm gần đây, việc nuôi tôm càng xanh ở Việt Nam đang phát triển một cách mạnh mẽ, đặc biệt là những khu vực nuôi tôm thương mại ở lưu vực sông Mê Kông đang mở rộng hơn 8000 ha và sản lượng đã đạt 10000 tấn trong năm 2010 (Hai, 2010) Do đó nhu cầu về con giống cho việc nuôi đại trà là rất lớn

Tuy nhiên, nghề nuôi tôm càng xanh đã và đang gặp nhiều khó khăn do những đặc điểm sinh học của chúng Những con tôm càng xanh đực thường lớn nhanh gấp bốn hoặc năm lần tôm cái trong cùng quần thể và thời gian nuôi, điều này dẫn tới sự cạnh tranh về thức ăn, môi trường sống và gây ra hiện tượng ăn thịt đồng loại Thông thường, sự khác nhau về kích thước của tôm có thể thấy bằng mắt trong giai đoạn trưởng thành về giới tính, con cái ngưng phát triển và tập trung dưỡng chất cho việc sinh sản (Cohen, 1984), trong khi đó con đực vẫn tiếp tục phát triển và đạt kích thước lớn hơn so với con cái khi trưởng thành Những vấn đề này ảnh hưởng tới sản lượng thu hoạch và lợi ích kinh tế do kích thước tôm càng lớn thì giá thành càng cao

Việc nuôi tôm càng xanh toàn đực đạt sản lượng cao hơn việc nuôi toàn cái hay đực và cái trong cùng quần thể (Sagi và Ra’anan, 1988) Khối lượng trung bình của mỗi quần thể lần lượt là 473 g/m2, 248 g/m2 và 260 g/m2 Những nhà khoa học

Ả Rập Xê Út cũng đã báo cáo những kết quả tương tự khi tiến hành thí nghiệm nuôi tôm toàn đực, toàn cái và hỗn hợp cả đực và cái (Siddiqui, 1997) Điều này thể hiện rằng việc nuôi tôm càng xanh toàn đực đã làm tăng sản lượng một cách đáng kể và mang lại lợi nhuận cao hơn việc nuôi toàn cái hay hỗn hợp đực và cái Vì thế, việc nghiên cứu và phát triển một số kỹ thuật tạo quần thể tôm càng xanh toàn đực là nhu cầu cần thiết hiện nay

2

Kỹ thuật bất hoạt RNA (Guo và Kempheus, 1995) đã được sử dụng như một công cụ hiệu quả để hiểu rõ về chức năng của những gene quy định tính trạng bằng cách tiêm RNA mạch đôi vào trong cơ thể của giáp xác (Tiu, 2007; Hiu, 2008) Ý tưởng tạo ra con cái giả bằng cách làm bất hoạt RNA thông tin mã hóa gene tuyến

đực insuline–like của tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii insulin–like

androgeneic gland, Mr–IAG) bằng RNA mạch đôi (dsRNA) đã được thực hiện thành công tại quy mô phòng thí nghiệm (Ventura và ctv, 2009) Kể từ đó, kỹ thuật bất hoạt RNA hứa hẹn như là một hướng tiếp cận mới để tạo ra quần thể tôm toàn đực cho việc nuôi tôm càng xanh thương mại

Chính vì những lý do đó mà đề tài “Ứng dụng thử nghiệm công nghệ iRNA

vào nghiên cứu chuyển đổi giới tính tôm càng xanh Macrobrachium rosenbergii”

được tiến hành

1.2 Mục đích của đề tài

Mục đích của việc nghiên cứu này là ứng dụng kỹ thuật bất hoạt RNA để tạo

ra con cái giả phục vụ cho công tác tạo tôm càng xanh toàn đực với Mr–IAG là gene mục tiêu

1.3 Nội dung của đề tài

Nghiên cứu công nghệ bất hoạt RNA thông qua quy trình tổng hợp double stranded RNA theo bộ Kit của hãng Promega và Ambion

Kiểm tra hiệu quả của sợi đôi dsRNA trong thực nghiệm chuyển đổi giới tính

của tôm càng xanh Macrobrachium rosenbergii

Hình 2.1 Chân bơi thứ 2 của tôm càng xanh đực

2.1.2 Tuyến đực

Những tế bào thuộc tuyến đực được quan sát đầu tiên bởi Faxon (1884) trong

tôm nước ngọt Cambarus montanus (Faxon, 1884) Tuyến hormon đã được xác định sau đó ở giáp xác Orchestia gammarellus vào 1953 và mô đó được gọi là

tuyến đực (Charniaux–Cotton, 1953) Những nghiên cứu sau này đã cho thấy rõ hơn

về tuyến đực, nó là một lớp mô mỏng gắn ở phần cuối ống dẫn tinh của tôm nước

ngọt Procambarus blandingii, P viaeviridis, Camb bartonni và Camb diogenes (Puckett, 1964) Những cấu trúc tương tự cũng đã được quan sát ở cua Scylla

serrata(King, 1964)

Ở giáp xác tinh sào là nơi tạo tinh trùng còn cơ quan tạo hormon là tuyến đực Nếu ở con đực động vật có xương sống, tuyến sinh dục (tinh sào) có hai chức năng căn bản là tạo tinh trùng và nội tiết như testosterone thì ở tôm càng xanh và có

thể ở nhiều động vật giáp xác thuộc bộ mười chân Decapoda khác hai chức năng

4

này thực hiện bởi hai cơ quan riêng lẻ Tinh sào ở tôm càng xanh chuyên tạo tinh, còn tuyến đực (androgenic gland) – một cơ quan biệt lập khác có chức năng tiết ra hormon, tham gia vào sự biệt hoá giới tính và phát triển những đặc điểm sinh dục thứ cấp, ảnh hưởng lên kích thước và sự tăng trưởng (Sagi, 2001)

Ở những tôm đực lớn người ta có thể thấy được tuyến đực tương đối rõ Đó

là một khối tế bào có hình kim tự tháp, dính với phần sau ống phóng tinh Cũng như tuyến sinh dục và ống dẫn tinh, tuyến đực chịu sự ức chế của một tuyến nội tiết nằm

ở cuống mắt tôm

Hình 2.2 Tuyến đực ở tôm càng xanh có hình kim tự tháp ở cuối ống dẫn tinh

Sự tồn tại của tuyến đực được xác nhận ở nhiều loài giáp xác, chúng tiết ra hormon có tác động lên sự biệt hoá giới tính (Chaniaux–Cotton và Payen, 1985; Katakura, 1989)

Tuyến AG có vai trò lên sự biệt hóa giới tính và quá trình lột xác

Charniaux– Cotton đã chứng minh rằng việc cắt bỏ tuyến AG ở Orchestia

gammarella làm giảm sự sinh tinh trùng ở con đực (Charniaux–Cotton, 1954)

2.1.3 Hormon tuyến đực

Hormon tuyến đực tinh chế đã được tìm ra trên nhóm giáp xác chân đều

Armadilidium vulgare là một protein gồm có ba chuỗi peptid A (chứa 29aa), B

(44aa), và C (45aa), ngoài ra trên chuỗi A ở aa thứ 18 còn có thêm một nhóm carboxyl (Martin và ctv, 1999) Trọng lượng phân tử hormon khoảng 16.570 Da Khi tiến hành tiêm hormon tuyến đực cho con cái còn nhỏ, sau này con cái này phát triển thành con đực, khi cho giao vĩ với con cái thì có chức năng sinh sản cho ra thế

hệ con

5

Hình 2.3 Cấu trúc phân tử hormon tuyến đực (Martin và ctv, 1999)

2.1.4 Tác động của tuyến đực lên sự phân hóa giới tính ở tôm càng xanh

Tuyến androgenic (AG) là cơ quan nội tiết của con đực, có vai trò quan trọng trong việc hình thành giới tính và các đặc tính sinh dục thứ cấp (Ohs và ctv, 2006)

AG nằm cuối ống dẫn tinh, gần lỗ mở sinh dục và liên kết lõng lẻo với ống dẫn tinh AGH là hormon điều khiển biệt hóa giới tính thành con đực và phát triển các đặc điểm sinh dục đực thứ cấp Sự tiết GSH và GIH được cho là do quy định của một số chất dẫn truyền thần kinh và tác động trực tiếp vào buồng trứng của con cái Ở con đực, GIH tác động lên tinh hoàn gián tiếp bởi sự điều khiển AG và sau đó giảm tiết AGH Hormon kích thích tuyến sinh dục là cần thiết để có sự sinh tinh xảy ra trong tinh hoàn (Fingerman, 1997)

AG tham gia vào quá trình biệt hóa giới tính ở con đực thông qua việc tiết hormon AGH là tín hiệu ban đầu của tất cả các bước cần thiết trong quá trình biệt hóa giới tính và phát triển đặc điểm của con đực (Ohs và ctv, 2006) Nếu không có

AG hoặc sự tiết AGH không đủ thì tuyến sinh dục sẽ biệt hóa thành tuyến sinh dục cái (Sagi và ctv, 1995) Sự phát triển của AG được cho là dấu hiệu của tín hiệu di truyền (Ohs và ctv, 2006) Sự cắt bỏ tuyến androgenic ở tôm càng xanh

Macrobrachium rosenbergii giai đoạn còn non có thể gây đảo giới hoàn toàn, với sự

cái hóa các tính trạng sinh dục sơ cấp và thứ cấp và con vật có thể sinh sản như con cái (Sagi và ctv, 1990; Sagi và ctv, 1997)

6

2.2 Công nghệ chuyển đổi giới tính tôm càng xanh

2.2.1 Cơ sở lý thuyết tạo dòng tôm càng xanh toàn đực

Cặp nhiễm sắc thể giới tính ở tôm càng xanh đực là đồng giao tử (ZZ) và con cái là dị giao tử (WZ) Để tạo dòng đơn tính toàn đực (100% tôm đực ZZ) thì cần

có tôm bố và tôm mẹ có cùng NST ZZ Để tạo dòng toàn đực việc cần thiết để tạo tôm cái giả mang NST ZZ

Male: ♂ (ZZ) X Female: ♀ (ZZ)

100% ♂ (ZZ)

Hình 2.4 Sơ đồ tạo dòng đơn tính đực

Sagi và Cohen đã cho biết khi cho những con cái chuyển giới khoẻ mạnh khi lai với con đực thông thường sẽ cho ra một dòng con toàn đực (Sagi, Cohen, 1990)

2.2.2 Các phương pháp tạo tôm càng xanh cái giả

2.2.2.1 Vi phẩu loại bỏ tuyến đực

Tôm chưa trưởng thành có thể thực hiện vi phẫu loại bỏ tuyến androgene ở tôm đực, dẫn đến sự tạo trứng, sự phát triển của vòi trứng và lỗ sinh sản của con cái trong con đực đã chuyển giới trong giai đoạn phát triển còn non nhất Tôm đực sau

đó sẽ phát triển thành con cái (Nagamine và ctv, 1980) Việc loại bỏ AG ở con đực, làm mất AGH gây nên hiện tượng: con đực thành con cái mang NST ZZ Kỹ thuật

vi phẫu loại bỏ tuyến androgenic được thực hiện lần đầu tiên bởi Sagi (Sagi và ctv, 1990) Ở Việt Nam, kỹ thuật vi phẫu đã được thực hiện và thành công năm 2004 (Nguyễn Văn Hảo và ctv, 2004)

Kỹ thuật vi phẫu là kỹ thuật tạo ra tôm cái giả để sản xuất tôm toàn đực phổ biến hiện nay Tuy nhiên kỹ thuật này cần có kỹ thuật viên có tay nghề cao, cần nhiều người để sản xuất một số lượng tôm cái giả lớn, chi phí sản xuất lớn, tỷ lệ tôm

vi phẫu thành tôm cái giả có thể sinh sản được thì không ổn định Vì vậy, cần tìm ra các phương pháp mới để cải thiện các hạn chế của kỹ thuật vi phẫu nhằm tạo nguồn tôm toàn đực để tăng sản lượng cho người nuôi

7

2.2.2.2 Cấy tuyến đực vào tôm cái

Sự biệt hóa giới tính ngược của con cái isopod Armadillidium vulgare, được

gây ra do việc cấy AG vào trong con cái, sau đó đã bắt đầu biệt hóa hình thái giới tính Ở tôm càng xanh, việc cấy AG của con đực trưởng thành vào trong con cái chưa trưởng thành, kết quả là con cái đã biệt hóa ngược thành con đực (Nagamine

và ctv, 1980) Tuy nhiên, khả năng sống sau khi cấy AG thấp (Ohs và ctv, 2006)

2.2.2.3 Sử dụng hormon

Hiện nay, steroid được sử dụng để thay đổi kiểu hình giới tính cá khi ngâm hoặc tiêm hoặc qua chế độ ăn trước khi biệt hóa giới tính Điều này mang lại hy vọng trong việc sử dụng hormon để điều khiển giới tính ở động vật giáp xác Điều khiển chế độ ăn chứa hormon được xem là phương pháp thiết thực nhất trong quy

mô thương mại Tuy nhiên, phương pháp này mang lại những thách thức do khả năng mất các hormon do sự rò rỉ từ các viên thức ăn hoặc từ sự cố tiêu hóa, đặc biệt

là mất do sự thay đổi của thức ăn chế biến trước khi tiêu thụ (Ohs và ctv, 2006) Dewi và cộng sự đã dùng hormon 17β–estradiol bổ sung vào thức ăn để điều khiển giới tính tôm càng xanh Kết quả thu được là 17β–estradiol không ảnh hưởng đến tỷ lệ đực cái ở tôm càng xanh (Dewi và ctv, 2006)

Baghel và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng chuyển đổi giới tính khi cho ấu

trùng tôm càng xanh ăn artemia đã làm giàu với 17α–methyltestosterone, dạng

steroid của động vật có xương sống, kết quả cho thấy 17α–methyltestosterone có tác dụng chuyển đổi giới tính của tôm càng xanh từ cái thành đực (Baghel và ctv, 2004) Nhưng sau đó, Ohs và cộng sự dùng 17α–methyltestosteron bổ sung vào thức ăn để chuyển giới tính tôm càng xanh Tuy nhiên, kết quả lại cho thấy 17α–methyltestosteron không có tác dụng trong việc chuyển đổi giới tính tôm càng xanh (Ohs và ctv, 2006) Như vậy, 17α–methyltestosterone có tác dụng chuyển đổi giới tính ở tôm càng xanh là chưa xác định

cái) ăn thức ăn có bổ sung dopamine với 3 nồng độ 0,15; 1,5; và 15 ppm trong vòng

60 ngày (Ohs và ctv, 2006) Kết quả ở nhóm đối chứng có tỷ lệ tôm cái là 62,6%,

2.3 Giới thiệu cộng nghệ iRNA và ứng dụng trong tạo tôm càng xanh cái giả

2.3.1 Giới thiệu về iRNA

Công nghệ iRNA gây bất hoạt gene là một công cụ đầy hứa hẹn và là cơ chế điều khiển hoạt hóa gene phổ biến ở các cơ thể sống nhân thực iRNA là quá trình làm bất hoạt gene một cách đặc thù, nó chỉ làm bất hoạt một gene (gene đích) có trình tự tương đồng với các tác nhân gây bất hoạt gene (các sợi RNA ngắn khoảng 21–27 nucleotide) iRNA có thể tham gia điều khiển hoạt hóa gene ở giai đoạn phiên mã gene – ngăn cản sinh tổng hợp RNA hoặc ở giai đoạn sau phiên mã – phân hủy mRNA và làm triệt tiêu sinh tổng hợp protein (Đỗ Năng Vịnh, 2007)

Can thiệp RNA (iRNA) là sợi đôi RNA (dsRNA), nó có tác động đặc hiệu với một trình tự mục tiêu, thúc đẩy sự phân hủy và ngăn chặn sự biểu hiện của trình

tự mục tiêu (Chen và ctv, 2003) Sự can thiệp RNA thông qua trung gian dsRNA là một cơ chế bất hoạt gene sau phiên mã (PTGS) và bảo tồn trong suốt quá trình phát triển Nó cũng có thể biểu hiện ở mức độ phiên mã hoặc dịch mã của quá trình sao chép nội sinh và ở mức nhiễm sắc bằng cách hình thành vùng chất nhiễm sắc thể trong nhân (Hannon, 2002)

iRNA là một hiện tượng trong Neurospora crassa, trình tự RNA tương đồng

có khả năng chế ngự gene nội sinh (Romano và Macino, 1992)

Dựa trên thành tựu của chương trình Geneomics trình tự của hầu hết các gene quan trọng đều có thể xác định, từ đó thiết kế các dsRNA tương đồng để gây bất hoạt mọi gene đích Công nghệ iRNA có thể tạo ra cuộc cách mạng trong nghiên cứu y sinh và chữa bệnh Ý nghĩa khoa học và tiềm năng ứng dụng to lớn của công nghệ iRNA đã được nhiều tác giả đề cập, họ cho đây là “một công nghệ đầy uy lực”, “cuộc cách mạng iRNA” (Archana, 2003; Ajit, 2007) Năm 1998, hai nhà

9

khoa học Mỹ Fire và Mello đã xuất bản công trình nghiên cứu đột phá về cơ chế

gây bất hoạt gene bởi iRNA đăng trên tạp chí Nature (Fire và Mello, 1998)

2.3.2 Lịch sử nghiên cứu iRNA

Trong lịch sử, sự can thiệp RNA hay iRNA được biết đến với những tên gọi khác như : RNA silencing, quelling, cosuppresion, RNA inteference

Lần đầu tiên, các nhà nghiên cứu nhận thấy rằng RNA sense có hiệu quả cũng như là RNA antisense trong việc ức chế sự biểu hiện gene ở loài giun với tên

khoa học là C elegans (Guo và Kemphues, 1995)

Nghiên cứu iRNA được mô tả là một hiện tượng trong C.elegans, bằng cách tiêm dsRNA vào trong C elegans đã dẫn đến sự bất hoạt trình tự gene đặc hiệu và

tạo ra thuật ngữ “iRNA – Can thiệp RNA” (Fire và ctv, 1998)

Nghiên cứu quá trình bất hoạt gene hậu phiên mã (PTGS) ở thực vật được báo cáo bởi Hamilton và Baulcombe (Hamilton và Baulcombe, 1999)

Phát hiện hiện tượng PTGS ở cây trồng và khả năng kháng virus được gây ra bởi dsRNA Hiện tượng bất hoạt gene sau dịch mã trong cây có tương quan với phân tử RNA nhỏ (mỗi phân tử có chiều dài khoảng 21–25 nucleotide) Trong quần thể các phân tử RNA nhỏ có cả các trình tự sense RNA và antisense RNA (Hamilton và Baucombe, 1999)

Quá trình xử lý dsRNA mạch dài thành những đoạn ngắn 21–23 nucleotide

là nhờ enzyme Dicer RNase III ở ruồi giấm Drosophila (Zamore và ctv, 2000)

Lần đầu tiên mô tả iRNA trên tế bào động vật có vú (Tuschl và ctv, 2001) Nghiên cứu những đoạn RNA ngắn có cấu trúc kẹp tóc (shRNAs) là nguyên nhân gây ra sự bất hoạt trình tự đặc hiệu ở những tế bào động vật có vú (Paddison

10

iRNA kiểm soát hoạt hóa gene ở giai đoạn phiên mã (TGS – transcriptional gene silencing), các phân tử siRNA ngăn cản phiên mã khống chế số lượng phân tử mRNA Cơ chế này xảy ra trong nhân tế bào và mục tiêu tác động là DNA (Matzke

và ctv, 2004; Huettel và ctv, 2007)

Ở tế bào sinh vật nhân thực, iRNA là một bộ máy sinh hóa quan trọng đóng vai trò điều hòa hoạt hóa gene và bảo vệ cơ thể (Hannon, 2002; Mello và ctv, 2004; Meister và Tuschl, 2004; Hammond, 2005)

Giải thưởng Nobel trong sinh học và y học trong việc khám phá cơ chế iRNA (Andrew Fire và Craig Mello, 2006)

Nghiên cứu những đoạn dsRNA nhỏ tạo ra sự hoạt hóa gene phiên mã “hoạt hóa RNA” (Li và ctv, 2006)

Chứng minh được siRNA giúp con người có thể sản xuất một gene đặc hiệu làm giảm lượng mRNA và protein nhờ cơ chế hoạt động của iRNA (Davis và cộng

sự, 2010)

2.3.3 Cơ chế bất hoạt gene của iRNA

Nghiên cứu hóa sinh iRNA ở ruồi giấm cho thấy RNA sợi kép (dsRNA) đã được phân cắt thành các đoạn dsRNA ngắn gồm 21–23 nucleotide (Tuschl và ctv, 1999) Họ cho rằng các phân tử dsRNA ngắn (siRNA–small interfering RNA) đóng vai trò phân hủy mRNA Sau đó, nhóm Fire và Mello; Parrish và cộng sự đã xác minh rằng dsRNA dài đã được cắt thành đoạn RNA ngắn khoảng 25 nucleotide và tiếp theo siRNA gây ra sự phân hủy mRNA thông qua việc bắt cặp với mRNA (Fire, Mello và ctv, 2000)

 Cơ chế bất hoạt gene được mô tả như sau:

RNA sợi kép (dsRNA) bị cắt thành những mảnh nhỏ (siRNA) bởi một endonuclease gọi dicer Sau đó, sợi kép ngắn lại được mở xoắn để tạo ra 2 sợi đơn ngắn và 1 trong 2 sợi đó là sợi antisense (sợi đối nghĩa) Sợi antisense ngắn (siRNA) được nạp vào phức hợp RISC Sau đó, phức hợp RISC có gắn antisense RNA này bắt cặp với mRNA bằng liên kết tương đồng giữ các base Phần dư ra của sợi mRNA sẽ bị RISC phân cắt Điều này có nghĩa sợi mRNA thông tin bị phân hủy

11

và kết quả là protein được dịch mã từ mRNA này không được tổng hợp Quá trình dịch mã gene bị bất hoạt

Hình 2.5 Cơ chế hoạt động của iRNA [68]

A Trong tế bào, quá trình sao chép nội sinh và ngoại sinh mở đầu cho hoạt động của những sợi dsRNA dài, chúng được xem như là một chất kích hoạt quá trình can thiệp RNA (iRNA)

B Đây là quá trình đầu tiên mà dsRNA được xử lý dưới tác dụng của enzyme RNase III và ATP

C dsRNA dài bị cắt thành những đoạn siRNA có kích thước 21–23 nucleotide với 2 nucleotide nhô ra ở đầu 3’ siRNA cũng có thể được tổng hợp bên

E và F Còn lại là sợi antisense của siRNA mạch kép, được xem là sợi chỉ dẫn, hướng dẫn RISC bám vào và bắt cặp với mRNA có trình tự tương đồng với

nó, phân hủy mRNA đích Kết quả là không có mRNA cho quá trình giải mã tổng hợp protein hay hormon của gene đó

2.3.4 Vai trò của iRNA

iRNA kìm hãm tổng hợp protein và điều hòa sự phát triển của cơ thể sinh vật Hiện nay đã phát hiện khoảng 500 gene ở người và động vật có vú tổng hợp khoảng 500 phân tử miRNA khác nhau có chiều dài khoảng 21 nucleotide và khoảng 30% tổng số gene được điều khiển bởi các phân tử miRNA (Ajit, 2007)

iRNA là cơ chế bảo vệ cơ thể khỏi sự xâm nhiễm của virus Các công trình nghiên cứu công bố năm 1997 cho thấy cây trồng có hàng rào bảo vệ hiệu quả chống lại sự xâm nhiễm của virus dựa trên cơ chế PTGS (Covey và ctv, 1997;

nhập và ngăn chặn RNA virus bằng cách phân hủy RNA virus, nhận biết sự xâm nhập của sinh vật ký sinh, tạo ra các phản ứng gây bất hoạt gene ban đầu và sau đó khuếch đại phản ứng để loại bỏ hoàn toàn các nhân tố bên ngoài xâm nhập

iRNA bảo đảm sự bền vững của genome thông qua sự bất hoạt gene nhảy (Fire, Melo và ctv, 1998) Các gene nhảy gây ra rất nhiều các đột biến bất lợi trong

cơ thể sống Trong vùng chứa gene nhảy của genome, cả hai sợi DNA được sao chép, dsRNA được tạo thành và dẫn đến quá trình iRNA loại bỏ những sản phẩm không mong muốn từ gene nhảy Những phần tử dsRNA ngắn tác động trực tiếp lên sợi nhiễm sắc và ngăn chặn sự dịch mã (Tabara và ctv, 1999) Cơ chế bất hoạt gene iRNA tạo nên hệ thống miễn dịch của genome (Plasterk, 2002)

13

2.3.5 Các nghiên cứu ứng dụng của iRNA trong nuôi trồng thủy sản

Can thiệp RNA (iRNA) là một hiện tượng bất hoạt đặc hiệu của gene trong

các sinh vật đa bào gồm Drodophia, Caenorhabditis elegans, động vật có vú và ký

sinh… Công nghệ iRNA là một phương pháp nghiên cứu hiệu quả về chức năng

gene trên động vật thủy sản, điển hình trên cá ngựa vằn Danio rerio,…[71]

iRNA đã được nghiên cứu trên luân trùng Brachionus plicatilis nhằm tăng

cường khả năng đánh giá những tính năng di truyền đặc biệt quan trọng ảnh hưởng đến vòng đời của chúng (Snell và ctv, 2010)

Cơ chế của iRNA là làm bất hoạt gene sau phiên mã, chức năng này của nó trong tự nhiên chịu trách nhiệm chống lại sự nhiễm trùng virus ở đa số loài Kết quả

là làm bất hoạt gene của Dicer–1 của virus trong tôm sú (Penaeus mondon) làm

tăng tỷ lệ chết của virus, cơ chế iRNA hoạt động mạnh mẽ và có chức năng miễn dịch tốt trên tôm (Su, Oanh, Lyons và ctv, 2008) Mức cao hơn là các Dicer ở tế bào bạch cầu nó đóng vai trò làm miễn dịch tự nhiên ở trong tôm (Zhang, Song, Zhao và ctv, 2010)

Ở tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) Dicer–2 bao gồm miễn dịch

không đặc hiệu chống lại virus (Chen, Jia, Zhao và ctv, 2011) Dicer–2 góp phần vào chức năng miễn dịch không đặc hiệu ở tôm bằng cách nâng cao hiệu lực của iRNA (Kim, Behlke và ctv, 2005)

Ứng dụng siRNA trong nghiên cứu ức chế TFV (tiger frog virus) trong tế bào cá, cung cấp tiềm năng trong điều trị bệnh do virus trong nuôi trồng thủy sản (Junfeng Xie và ctv, 2004) iRNA còn được nghiên cứu để bất hoạt gene của virus gây bệnh đốm trắng (WSD–white spot disease) ở tôm biển (Krishn và ctv, 2009) iRNA đặc hiệu (21bp) được ứng dụng để ức chế gene mã hóa protein vỏ (VP28)

của virus WSSV trong cơ thể tôm Penaeus japonicas

Làm bất hoạt gene đích và có hiệu lực cao, miễn dịch đặc hiệu chống lại virus đốm trắng (WSSV) hoặc virus Taura ở tôm thẻ chân trắng Thái Bình Dương

(Penaeus vannamei) bằng cách tiêm dsRNAs sợi dài có trình tự mã hóa cấu trúc

protein của virus Sử dụng dsRNAs tác động vào gene mục tiêu của virus đầu vàng

14

(YHV) sẽ thu được hiệu quả miễn dịch đặc hiệu giống như ở virus trên tôm sú

Penaeus monodon (Vincent, Breland và Lotz, 2004)

dsRNA can thiệp gián tiếp vào hầu hết các quá trình phiên mã gene, làm bất hoạt gene Chức năng của gene có thể được nghiên cứu trong các sinh vật dưới nước bằng cách sử dụng iRNA Kỹ thuật iRNA đã được ứng dụng trong 2 sinh vật ở

dưới nước: cá ngựa vằn (Danio rerio) và tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus schimitti)

Đại Tây Dương Kết quả đã chứng minh iRNA được sử dụng như là công cụ để nghiên cứu chức năng sinh học của các gene có liên quan đến sự phát triển của cá

ngựa vằn Danio rerio Các nghiên cứu gần đây đã chứng minh tính hữu ích của

dsRNA trong cơ thể tôm trưởng thành Hơn nữa, khả năng dsRNA ức chế chức năng của hormon hyperglycemic (CHH) trong tôm Đại Tây Dương cũng đã được nghiên cứu (Estrada và ctv, 2007)

Ảnh hưởng iRNA trong tôm được giải thích bằng các thí nghiệm in vivo

bằng cách tiêm dsRNA có trình tự tương đồng với gene mã hóa gonad inhibiting

hormon (GIH) trong tôm cát Metapenaeus ensis dsRNA làm giảm sự biểu hiện của

GIH (Guan, Mark, Chan và ctv, 2004)

Công nghệ iRNA đã được nghiên cứu trên động vật thân mềm hai mảnh, nó

quyết định chức năng của gene ở sò Crassostrea gigas Việc tiêm dsRNA tương

ứng với gene Oyster vasa–like gene (Oyvlg) vào trong tuyến sinh dục sẽ làm ức chế

quá trình giảm phân và làm bất hoạt sự sản sinh các tế bào phôi ở sò Crassostrea

gigas (Fabioux và ctv, 2009)

iRNA có ảnh hưởng đến các yếu tố tạo cơ ở các tua khác nhau trên loài bạch

tuộc Sepia oficinalis (Grimaldi và ctv, 2004)

Nghiên cứu tiêm dsRNA vào tôm Macrobrachium rosenbergii ngăn cản sự

phát triển đặc điểm sinh dục thứ phát “gai phụ sinh dục đực” và giảm thông số tăng trưởng vốn thể hiện mạnh ở con đực (Ventura, 2009)

15

2.3.6 Phương pháp chuyển dsRNA, shRNA, siRNA vào trong tế bào

2.3.6.1 Phương pháp chuyển không cần virus

Phương pháp này sử dụng những siRNA bình thường và siRNA biến đổi bằng

phương pháp hóa học, được sao chép trong môi trường in vitro siRNA, shRNA,

dsRNA được biểu hiện bởi plasmid đóng vai trò là vector Chuyển bằng cách sử dụng liposome, lipid, protein–antibody, peptide … Các cách trên được phân ra thành hai dạng: hệ thống và cục bộ (Aigner, 2007)

Những phương pháp chuyển cục bộ chỉ cần một lượng nhỏ siRNA để tránh việc chuyển nhầm đến những bộ phận khác và giảm thất thoát do sự bài tiết của thận

Phương pháp chuyển hệ thống có thể thực hiện nhiều cách như gắn siRNA vào liposome, lipoplexe, và cationic lipid, tiêm siRNA, xung điện (Aigner, 2007)

Cũng có thể chuyển siRNA hay dsRNA vào vật chủ bằng phương pháp ngâm

như trứng của loài Drosophila melanogaster hấp thu được siRNA/dsRNA trong

những giai đoạn phát triển sớm (Tabara và ctv, 1998; Timmons và ctv, 1998)

2.3.6.2 Phương pháp chuyển bằng plasmid

Chuyển shRNA hay siRNA vào trong plasmid, khi đó, plasmid này sẽ mã hóa shRNA, siRNA với hai mạch sense và antisense riêng biệt, có thể biểu hiện dưới sự kiểm soát của promoter được chọn

Promoter có thể là RNA polymerase II (pol–II)–dependent hay RNA polymerase III (pol–III)–dependent

sao chép của nó bắt đầu tại chính xác một điểm và kết thúc tại nucleotide uredine Một chuỗi nhiều hơn bốn thymidine cũng có thể được xem như là điểm kết thúc Việc này rất có lợi trong việc biểu hiện những đoạn gene ngắn như shRNA nhằm tránh những nucleotide không mong muốn tại điểm kết thúc

Pol–II promoter có nhiều ưu điểm trong việc biểu hiện shRNA Những promoter này có thuận lợi trong việc điều chỉnh sự bất hoạt RNA một cách nhất thời, tùy thuộc vào tính chất của chúng Những promoter hoạt hóa như tetracycline

16

promoter và metallothionine promoter được sử dụng để hoạt hóa và kiểm soát quá trình iRNA nhưng những sản phẩm của pol–II promoter không kết thúc tại vị trí chính xác Vì vậy, những mạch sao chép sẽ có nhiều nucleotide dư thừa tại điểm kết thúc Chúng có thể can thiệp vào quá trình hoạt hóa đoạn RNA đích Những đoạn

dư thừa này có thể làm cho quá trình iRNA không nhận biết được đoạn gene mục tiêu

Do tác dụng phụ gây độc khi siRNA/shRNA bị biểu hiện quá mức nên promoter phải được lựa chọn cẩn thận dựa vào chiều dài của chúng để tránh tác dụng gây độc

Peng và cộng sự đã phát triển một hệ thống kết hợp những thuận lợi của của hai phương pháp trên (sự chính xác của của T7 RNA polymerase và điều chỉnh sự biểu hiện bằng pol–II promoter) Họ tạo ra một plasmid cấu trúc có thể biểu hiện shRNA bằng T7–RNA polymerase promoter và pol–II promoter kiểm soát sự biểu hiện của T7–RNA polymerase, nên T7 RNA polymerase có thể được điều chỉnh bởi pol–II promoter Kết quả là shRNA được chỉnh sửa biểu hiện trong tế bào Một trong những nhược điểm của quá trình này là hiệu quả của phương pháp chuyển có

sự khác biệt giữa những tế bào và các điều kiện thí nghiệm khác nhau (Singh và ctv, 2009)

Quá trình iRNA có thể thực hiện bằng cách chuyển dsRNAs vào vi khuẩn Vi khuẩn có thể biểu hiện dsRNA dưới sự kiểm soát của T7 RNA polymerase promoter Khi tế bào chủ hay sinh vật hấp thụ chúng, dsRNA được biểu hiện trong

vi khuẩn có thể kích hoạt quá trình iRNA trong từng tế bào chủ hay sinh vật tương ứng (Singh và ctv, 2009)

2.3.6.3 Phương pháp chuyển nhờ virus

Thế mạnh của việc chuyển siRNA/shRNA bằng virus là có thể chuyển vào những tế bào mà khó bị nhiễm bởi những phương pháp khác và ngay cả những tế bào không phân chia Vector của virus tải nạp vào tế bào một cách tự nhiên và hiệu quả cao hơn so với cảm nhiễm hay bất kì những cách chuyển không dùng virus Những virus vector được sử dụng phổ biến nhất để chuyển shRNA bao gồm:

17 Adenovirus, Adeno Associated Virus (AAV), Lentivirus, Retrovirus, Herpes và Baculovirus vector (Singh và ctv, 2009)

18

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian thực hiện từ ngày 01 tháng 02 năm 2012 đến ngày 21 tháng 07 năm

2012

Địa điểm nghiên cứu: Phòng Sinh Học Thực Nghiệm, Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản 2, 116 Nguyễn Đình Chiểu, phường Đa Kao, quận 1, thành phố Hồ Chí Minh

ACG

3.2.2.2 Hóa chất dùng trong ly trích RNA tổng số

 Trizol (phenol pH8, guanidinium thiocyanate, glycerol, sodium acetate)

19

 Chloroform

 Isopropanol lạnh (bảo quản ở –250C)

 Nước DEPC (nước khử RNase)

3.2.2.4 Hóa chất dùng trong điện di agarose

 Agarose (Bio basic)

 Dung dịch TBE 0,5X

 Gel red

 6X DNA Loading Dye (Promega)

3.2.2.5 Hóa chất dùng trong tổng hợp Mr–IAG dsRNA

 RNase A: phân hủy RNA mạch đơn

 RNase III: phân hủy RNA mạch đôi

 DNase: phân hủy DNA

 Primer Mr–IAG sense (T7P) forward và reverse

 Enzyme Mix T7 Express

3.2.3 Dụng cụ – thiết bị thí nghiệm

 Eppendorf 0,2 ml; 0,5 ml; 1,5 ml

 Máy hút và tủ cấy vô trùng (Astec Microflow)

 Micropipet các loại (Bio – rad)

 Đầu tip các loại

 Bộ dụng cụ vi phẩu

 Máy ly tâm lạnh

 Máy luân nhiệt (Bio – rad)

 Máy điện di (Bio – rad)

 Máy chụp ảnh điện di DNA – RNA (Bio – rad)

 Lò vi sóng (Electrolux – Thụy Điển)

21

3.3 Phương pháp nghiên cứu

Tổng hợp cDNA mạch khuông của gene M.rosenbergii insulin–like androgeneic gland (Mr–IAG)

Trizol

RT–PCR

RT–PCR

Hình 3.1 Sơ đồ nghiên cứu

Tổng hợp cDNA mạch khuôn cho gene Macrobrachium

rosenbergii insulin–like androgen gland (Mr–IAG)

Tổng hợp Mr–IAG dsRNA bằng phương pháp in vitro

Thí nghiệm tiêm Mr–IAG dsRNA vào tôm PL 25

Tôm càng xanh đực trưởng thành (18–30) g

Tách chiết RNA tổng số Kiểm tra sản phẩm có kích thước 163 bp

Nồng độ 5 µg Mr–IAG dsRNA/g

Dòng hóa và giải trình tự cDNA Dòng hóa sản phẩm PCR Giải trình tự 2 chiều cDNA cDNA mạch khuôn

22

3.3.1 Tổng hợp cDNA mạch khuôn cho gene Macrobrachium rosenbergii insulin–like androgene gland (Mr–IAG)

3.3.1.1 Tách chiết RNA tổng số từ tuyến đực của tôm càng xanh

RNA được tách chiết từ tuyến đực bằng phương pháp tách chiết phenol – chloroform (Trizol – Invitrogene, California, Mĩ)

Hình 3.2 Sơ đồ tách chiết RNA tổng số từ tuyến đực tôm càng xanh bằng Trizol –

23

 Tiến hành

Mẫu: 2 con tôm đực và 2 con tôm cái trưởng thành có trọng lượng khoảng 30

g Tiến hành vi phẩu lấy tuyến đực – gốc chân bò số 5 hoặc có thể cắt lấy phần mô – khu vực tương đương ở con cái, cho vào 2 eppendorf sạch 1,5 ml, đánh dấu eppendorf chứa mẫu tôm đực và tôm cái

Tiến hành ly trích RNA: dùng micropipette loại 100 – 1000 µl, hút 1000 µl

trizol cho vào mỗi eppendorf đã chứa mẫu, tiến hành vortex, ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút Khi đó, trizol sẽ được hòa trộn trong mẫu giúp phá vỡ màng tế bào Sau đó, tiếp tục thêm vào 200 µl chloroform giúp tạo micel phân tán và tiếp xúc đều với dung dịch chất tẩy rửa tăng hiệu quả biến tính protein, đem vortex mạnh trong

20 giây để tách rời các thành phần, rồi đem ủ ở nhiệt độ phòng trong 3 phút Đem

ly tâm, hỗn hợp sẽ tách thành 3 pha: lớp dưới cùng có màu đỏ gồm phenol–chloroform, lớp giữa là lớp hữu cơ và lớp dung dịch không màu chứa RNA ở trên cùng Ly tâm xong tiến hành thu hết dịch nổi (khoảng 500 µl) cho vào eppendorf 1,5 ml khác Tiếp tục cho 500µl isopropanol lạnh vào các eppendorf chứa dịch nổi vừa thu được, đảo nhẹ 6 – 7 lần Sau đó, đem các eppendorf này đi ủ ở nhiệt độ

khi ly tâm, tiến hành loại bỏ dịch nổi và hòa tan cặn lóng RNA bằng 1 ml ethanol 70% lạnh, rửa loại muối và isopropanol Đem các eppendorf này đi vortex, sau đó tiếp tục ly tâm 7500 vòng trong 5 phút Sau ly tâm, cẩn thận loại bỏ dịch nổi và làm

3.3.1.2 Kiểm tra sản phẩm tách chiết RNA tổng số bằng cặp mồi đặc hiệu Mr–IAG khuếch đại cho sản phẩm 163 bp

Sau khi tách chiết RNA tổng số, tiến hành chạy RT–PCR với cặp mồi đặc hiệu cho tuyến đực Mr – IAG khuếch đại đoạn sản phẩm 163 bp Nếu vật liệu mẫu chứa sản phẩm có kích thước 163 bp thí chứng tỏ rằng mẫu RNA tổng số tách chiết được

24

có chứa tuyến đực Mục đích kiểm tra đảm bảo chất lượng mẫu vật liệu trước khi sử

dụng để thực hiện các bước tiếp theo

 Chu trình luân nhiệt

25

3.3.1.3 RT–PCR tổng hợp cDNA mạch khuôn

 Nguyên tắc của phương pháp tổng hợp cDNA bằng quy trình RT–PCR

Áp dụng quy trình RT–PCR, sử dụng hóa chất trong bộ hóa chất thương mại của hãng Promega Quy trình RT–PCR gồm 2 bước được thực hiện trong cùng 1 eppendorf 0,2 ml bằng máy luân nhiệt iCycle (BioRad)

Bước 1 Reverse Transcriptase (RT): RNA được phiên mã ngược thành

trong 30 phút với mồi reverse Mr–IAG sense (T7P) Tất cả các trình tự RNA của Mr–IAG trong mẫu sẽ được phiên mã ngược thành cDNA

Bước 2 PCR: Nguyên tắc giống phản ứng PCR thông thường, cDNA

được khuếch đại thành hàng triệu bản sao nhờ Flexi Taq DNA polymerase Cặp mồi phát hiện đặc hiệu trình tự nucleotide của Mr–IAG là Mr–IAG sense forward and reverse Kết thúc phản ứng RT–PCR sản phẩm thu được là đoạn trình tự nucleic acid của Mr–IAG dài khoảng 550 bp

 Chu kỳ luân nhiệt

Hình 3.4 Chu trình luân nhiệt của RT–PCR với cặp mồi Mr–IAG khuếch đại sản

3.3.1.4 Tinh sạch cDNA mạch khuôn

Sau khi có kết quả chạy điện di trên gel agarose 1,5%, phần gel chứa cDNA template sẽ được cắt ra và tinh sạch bằng Wizard® SV Gel and PCR Clean–Up System Kit (Promega, Mĩ)

 Tiến hành

Cho phần gel bị cắt vào 1 eppendorf 1,5 ml sạch và được hòa tan hoàn toàn bằng dung dịch Membrane binding solution (cứ 1 mg tương đương 1 µl dung dịch),

column và để ở nhiệt độ phòng trong 1 phút Ly tâm 14.000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ phần dịch bên dưới ống SV Cho 700 µl Membrane wash solution vào ống

SV để rửa DNA, ly tâm 14.000 vòng/phút trong 1 phút và tiếp tục đổ bỏ phần dịch bên dưới ống Sau đó, cho thêm 500 µl Membrane wash solution vào ống SV, tiếp tục ly tâm 14.000 vòng/phút trong 5 phút để rữa DNA một lần nữa Đổ bỏ phần dịch bên dưới ống và ly tâm tiếp 14.000 vòng/phút trong 1 phút để bay hơi hết

27

Membrane wash solution Sau đó cẩn thận chuyển ống SV mini–column vào một eppendorf 1,5 ml vô trùng Cho 50 µl nuclease–free water vào trực tiếp chính giữa màng lọc của cột, để ở nhiệt độ phòng 1 phút, ly tâm 14.000 vòng/ phút trong 1 phút

3.3.2 Dòng hóa và giải trình tự cDNA

 Nguyên tắc

Một lượng cDNA sau khi tinh sạch sẽ được nối với vector pGEM–T Easy và

chuyển vào E.coli JM109 Giải trình tự 2 chiều của đoạn cDNA được dòng hóa sau

khi vector được tinh sạch và kiểm tra kết quả trên Genebank

3.3.2.1 Chuyển sản phẩm PCR vào plasmid pGEM–T Easy

nối được mô tả theo bảng sau

Bảng 3.4 Thành phần mix của phản ứng nối sản phẩm PCR vào plasmid pGEM–T

28

vector pGEM–T Easy chứa đoạn trình tự Mr–IAG di chuyển vào trong tế bào chất Sau khi được phục hồi, vector mang gene được nhân lên cùng sự phân chia của tế bào vi khuẩn

 Hút 50 µl vi khuẩn khả nạp E.coli JM 109 cho vào ống eppendorf chứa

vector tái tổ hợp, búng nhẹ vào thành ống để hòa tan hỗn hợp

 Giữ hỗn hợp trong đá 20 phút

 Sốc nhiệt ở 42oC trong 45 giây Lập tức đưa ống trở lại đá và giữ yên 2 phút

 Thêm 950 µl dung dịch Soc medium (bảo quản ở nhiệt độ phòng), trộn đều

để tế bào phục hồi

 Sau đó, trải hỗn hợp trên môi trường LB thạch chứa kháng sinh Ampicilin với nồng độ (100 µg/ml) Trải 2 đĩa với thể tích khác nhau (100 µl và 900 µl) Ủ

37oC qua đêm

3.3.2.3 Kiểm tra dòng tế bào E.coli JM 109 mang vector tái tổ hợp

Một phản ứng PCR được thiết kế nhằm mục đích kiểm tra dòng tế bào E.coli

JM 109 có chứa vector pGEM–T Easy hay không và vector có mang đúng trình tự

Mr– IAG hay không

 Chu trình luân nhiệt

Bảng 3.5 Thành phần mix cho phản ứng PCR kiểm tra khuẩn lạc mang vector tái tổ

Mr–IAG sense (T7P) F Mr–IAG sense R Flexi Taq Nước DEPC Khuẩn lạc

Dùng que cấy lấy sinh khối của khuẩn lạc dương tính cấy vào 4 ml môi trường

Hút 815 µl dịch vi khuẩn đã nuôi cấy trộn đều với 185 µl glycerol 80%, giữ chủng ở –80oC, phần còn lại ly tâm (4.000 vòng/ phút trong 20 phút ở 4oC) thu sinh khối tách vector pGEM–T mang Mr–IAG

3.3.2.5 Tinh sạch vector tái tổ hợp

Vector pGEM–T mang Mr–IAG được tinh sạch theo bộ Kit Wizard®Plus SV Minipreps của Promega

 Nguyên tắc

Nguyên tắc của phương pháp này dựa vào khả năng phá hủy các liên kết peptide của protease trong môi trường kiềm và khả năng kết dính của DNA với màng silica trong môi trường muối có nồng độ thích hợp

Tiến hành

Sinh khối vi khuẩn chứa vector tái tổ hợp được tinh sạch bằng cách:

 Cho 250 µl dung dịch huyền phù cell resuspension solution, hòa tan hoàn toàn sinh khối để tách rời các tế bào

 Tiếp tục, cho 250 µl dung dịch cell lysis solution vào, đảo trộn đều 4 lần Ủ 1–5 phút đến khi dịch tế bào trong suốt, dung dịch này có độ kiềm cao sẽ làm DNA tách mạch

 Thêm 10 µl alkalin protease đảo trộn 4 lần, ủ 5 phút ở nhiệt độ phòng để phá

vỡ các liên kết peptide làm vụn các thành phần của tế bào, giải phóng DNA

 Tiếp đó, cho 350 µl neutralization solution, đảo trộn đều 4 lần ngay sau đó Dung dịch này giúp môi trường trung hòa, DNA tái kết cấu sẽ vón cục lại