Phân lập vi khuẩn có khả năng phân huỷ cellulose trong mụn dừa và vỏ tiêu

Thí nghiệm: Phân lập vi sinh vật có khả năng phân hủy cellulose trên môi trường thạch chứa CMC .... Thí nghiệm: Chuẩn bị môi trường tăng sinh khảo sát ảnh hưởng của oxy đến hoạt tính enz

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

GVHD: TS NGUYỄN HOÀI HƯƠNG SVTH: NGÔ HOÀNG HUY

MSSV: 0851110095

Tp Hồ Chí Minh, năm 2012

MỤC LỤC

1 Đặt vấn đề 1

2 Tình hình nghiên cứu 2

2.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 2

2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 4

3 Mục đích nghiên cứu 5

4 Nhiệm vụ nghiên cứu 5

5 Phương pháp nghiên cứu 5

6 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài 5

7 Kết quả đạt được 6

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 7

1.1 Hiện trạng của vỏ tiêu và mụn dừa 7

1.1.1 Vỏ tiêu 7

1.1.2 Mụn dừa 8

1.2 Thành phần và tính chất hóa học của mụn dừa 13

1.2.1 Lignin 14

1.2.2 Hemicellulose 16

1.2.3 Tannin 18

1.2.4 Cellululose 19

1.2.4.2 Enzyme phân giải cellulose (enzyme cellulase) 22

1.2.4.3 Nguồn gốc enzyme cellulase 26

1.2.4.4 Ảnh hưởng của môi trường đến khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase 34

1.2.4.5 Ứng dụng của enzyme cellulase 36

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 40

2.1.1 Thời gian 40

2.1.2 Địa điểm 40

2.2 Vật liệu 40

2.2.1 Nguồn mẫu 40

2.2.2 Hóa chất 40

2.2.3 Dụng cụ và thiết bị 41

2.2.3.1 Dụng cụ 41

2.2.3.2 Thiết bị 42

2.2.4 Thiết kế thí nghiệm 42

2.2.4.1 Mục tiêu 42

2.2.4.2 Thiết kế thí nghiệm 43

2.2.5 Các môi trường sử dụng trong thí nghiệm 47

2.3 Tiến hành thí nghiệm 49

2.3.1 Mục tiêu 1: Phân lập vi khuẩn chịu nhiệt phân hủy cellulose trong mụn dừa và vỏ tiêu 49

2.3.1.1 Thí nghiệm:Tăng sinh mẫu có xử lý nhiệt 49 2.3.1.2 Thí nghiệm: Sàng lọc mẫu tăng sinh chứa quần thể vi sinh vật bằng phương pháp đục lỗ thạch 51 2.3.1.3 Thí nghiệm: Phân lập vi sinh vật có khả năng phân hủy cellulose trên môi trường thạch chứa CMC 52

2.3.2 Mục tiêu 2: Sàng lọc vi khuẩn phân hủy cellulose từ các chủng phân lập 53 2.3.2.1 Thí nghiệm: Khảo sát hoạt tính enzyme CMCase từng chủng trên đĩa thạch chứa CMC 53 2.3.2.2 Thí nghiệm: Khảo sát khả năng mọc của các chủng trên môi trường thạch có chứa giấy lọc 54

2.3.3 Mục tiêu 3: Khảo sát hình thái khuẩn lạc tế bào, bào tử và phản ứng sinh hóa vi khuẩn phân lập có hoạt tính cellulase 56 2.3.3.1 Thí nghiệm: Khảo sát hình thái khuẩn lạc,bào tử vi khuẩn phân lập có hoạt tính cellulase 56 2.3.3.2 Thí nghiệm: Khảo sát một số phản ứng sinh hóa các chủng phân lập có hoạt tính cellulase 58

2.3.4 Mục tiêu 4: Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có enzyme cellulase có tiềm năng sử dụng ủ compost từ mụn dừa 58 2.3.4.1 Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme CMCase

và FPase 58

a Chuẩn bị môi trường tăng sinh ở các pH khác nhau 59

b Thí nghiệm: Định tính hoạt tính enzyme CMCase của các chủng ở

c Thí nghiệm: Định lượng hoạt tính enzyme CMCase của các chủng ở các pH 61

d Thí nghiệm: Định lượng hoạt tính enzyme FPase của các chủng ở các

pH 64

e Thí nghiệm: Khảo sát khả năng thủy phân giấy lọc của các chủng vi khuẩn 67 2.3.4.2 Khảo sát ảnh hưởng oxy đến hoạt tính enzyme CMCase và enzyme FPase của các chủng phân lập 68

a Thí nghiệm: Chuẩn bị môi trường tăng sinh khảo sát ảnh hưởng của oxy đến hoạt tính enzyme CMCase và enzyme FPase của các chủng phân lập

a Chuẩn bị môi trường tăng sinh ở pH7 71

b Thí nghiệm: Định tính hoạt tính enzyme tannase trên đĩa thạch chứa tannic acid ở điều kiện pH7 và lắc 150 vòng/phút 72

c Thí nghiệm: Xác định hoạt tính enzyme tannase của các chủng vi khuẩn ở pH7 và lắc 150 vòng/phút 74 Bảng 2.8: Thành phần môi trường hóa chất cho từng ống nghiệm của thí nghiệm khảo sát hoạt tính enzyme tannase 75

d Thí nghiệm: Khảo sát khả năng chịu tannic acid của các chủng phân lập ở các nồng độ khác nhau 1 %, 3 %, 5 % 75 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 78 3.1 Mục tiêu 1: Phân lập vi khuẩn chịu nhiệt phân hủy cellulose trong mụn dừa và vỏ tiêu 78

3.1.1 Thí nghiệm:Tăng sinh mẫu có xử lý nhiệt 78 3.1.2 Sàng lọc mẫu tăng sinh quần thể vi sinh vật bằng phương pháp đục lỗ thạch 78 3.1.3 Thí nghiệm: Phân lập vi sinh vật có khả năng phân hủy cellulose trên môi trường thạch chứa CMC 80 3.2 Mục tiêu 2: Sàng lọc vi khuẩn phân hủy cellulose từ các chủng phân lập

83 3.2.1 Thí nghiệm: Khảo sát hoạt tính enzyme CMCase từng chủng trên đĩa thạch chứa CMC 83 3.2.2 Thí nghiệm: Khảo sát khả năng mọc của các chủng trên môi trường thạch có chứa giấy lọc 85 3.3 Mục tiêu 3: Khảo sát hình thái khuẩn lạc, tế bào, bào tử và phản ứng sinh hóa vi khuẩn (hoặc xạ khuẩn) phân lập có hoạt tính cellulase 87

3.3.1 Thí nghiệm: Khảo sát hình thái khuẩn lạc, tế bào, bào tử vi khuẩn phân lập có hoạt tính cellulase 87 3.3.2 Thí nghiệm: Khảo sát một số phản ứng sinh hóa các chủng phân lập

có hoạt tính cellulase 92 3.4 Mục tiêu 4: Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có enzyme cellulase có tiềm

3.4.1 Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme

CMCase và FPase 95

3.4.1.1 Chuẩn bị môi trường tăng sinh ở các pH khác nhau 95

3.4.1.2 Thí nghiệm: Định tính (bán định lượng) hoạt tính enzyme CMCase của các chủng ở các pH khác nhau trên đĩa thạch chứa CMC 96

3.4.1.2 Định lượng hoạt tính enzyme CMCase của các chủng ở các pH 103

3.4.1.3 Định lượng hoạt tính enzyme FPase của các chủng ở các pH 107

3.4.1.4 Khảo sát khả năng thủy phân giấy lọc của các chủng vi khuẩn 111

3.4.2 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ oxy đến hoạt tính enzyme CMCase và enzyme FPase của các chủng phân lập 113

3.4.2.1 Chuẩn bị môi trường tăng sinh khảo sát ảnh hưởng của oxy đến hoạt tính enzyme CMCase và enzyme FPase của các chủng phân lập 114

3.4.1.2 Định lượng hoạt tính enzyme CMCase của các giống ở 2 chế độ không lắc và lắc 150 vòng/phút 114

3.4.1.3 Xác định hoạt tính enzyme FPase của các giống ở 2 chế độ không lắc và lắc 150 vòng/phút 115

3.4.3 Khảo sát khả năng sinh enzyme tannase của các chủng vi khuẩn ở pH7 và lắc 150 vòng/phút 116

3.4.3.1 Chuẩn bị môi trường tăng sinh ở pH7 116

3.4.3.2 Định tính hoạt tính enzyme tannase trên đĩa thạch chứa tannic acid ở điều kiện pH7 và lắc 150 vòng/phút 116

3.4.3.3 Xác định hoạt tính enzyme tannase của các chủng vi khuẩn ở pH7 và lắc 150 vòng/phút 118

3.4.3.4 Khảo sát khả năng chịu tannic acid của các chủng phân lập ở các nồng

độ khác nhau 1 %, 3 %, 5 % 119

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 123

4.1 Kết luận 123

4.2 Kiến nghị 124

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Diện tích và sản lượng tiêu của vùng Đông Nam Bộ và Tây Nguyên………7

Bảng 1.2: Diện tích dừa ở tỉnh Bến Tre (ha)………9

Bảng 1.3: Diện tích, năng suất và sản lượng dừa cả nước……….10

Bảng 1.4: Sản lượng dừa (đơn vị 1.000 trái) của các nước trên thế giới 12

Bảng 1.5: Một số ứng dụng của mụn dừa 12

Bảng 1.6: Phân loại enzyme phân cắt β-1,4-glucan 24

Bảng 1.7: Enzyme cellulase nguồn gốc từ vi sinh vật 27

Bảng 1.8: Danh sách một số vi khuẩn (kể cả xạ khuẩn) phân hủy cellulose và đặc điểm của chúng 28

Bảng 2.1: Thành phần môi trường hóa chất cho từng ống nghiệm của thí nghiệm dựng đường chuẩn glucose trên cơ chất là CMC 62

Bảng 2.2: Thành phần môi trường hóa chất cho từng ống nghiệm của thí nghiệm khảo sát hoạt tính enzyme CMCase theo pH……… 63

Bảng 2.3: Thành phần môi trường hóa chất của thí nghiệm chuẩn bị dung dịch glucose chuẩn 64

Bảng 2.4: Thành phần môi trường hóa chất cho từng ống nghiệm của thí nghiệm dựng

đường chuẩn glucose trên cơ chất giấy lọc 65

Bảng 2.5: Thành phần môi trường hóa chất cho từng ống nghiệm của thí nghiệm khảo sát hoạt tính enzyme FPase ở các pH 66

Bảng 2.6: Thành phần môi trường hóa chất cho từng ống nghiệm của thí nghiệm khảo sát hoạt tính CMCase ở hai chế độ không lắc và lắc 70

Bảng 2.7: Thành phần môi trường hóa chất cho từng ống nghiệm của thí nghiệm khảo sát hoạt tính FPase 71

Bảng 2.8: Thành phần môi trường hóa chất cho từng ống nghiệm của thí nghiệm khảo sát hoạt tính enzyme tannase 75

Bảng 3.1: Các chủng thu được từ mẫu mụn dừa ở Cao Lãnh 81

Bảng 3.2: Các chủng thu được từ mẫu mụn dừa ở Lai Vung 82

Bảng 3.3: Các chủng thu được từ mẫu vỏ tiêu ở Bà rịa Vũng Tàu 82

Bảng 3.4: Hoạt tính enzyme CMCase từng chủng trên đĩa thạch chứa CMC 83

Bảng 3.5: Quan sát hình thái khuẩn lạc 87

Bảng 3.6: Kết quả nhuộm gram và nhuộm bào tử các chủng vi khuẩn phân lập 91

Bảng 3.7: Tổng kết kết quả phân lập và test sinh hóa các chủng 94

Bảng 3.8: Hình ảnh đường kính vòng phân giải cellulose trên môi trường ĐT của vi khuẩn BHM3 ở pH khác nhau 97

Bảng 3.9: Hình ảnh đường kính vòng phân giải cellulose trên môi trường ĐT của vi khuẩn BHM4 ở pH khác nhau 97

Bảng 3.10 : Hình ảnh đường kính vòng phân giải cellulose trên môi trường ĐT của vi khuẩn BHM5 ở pH khác nhau 98

Bảng 3.11 : Hình ảnh đường kính vòng phân giải cellulose trên môi trường ĐT của vi khuẩn BHM8 ở pH khác nhau 99 Bảng 3.12 : Hình ảnh đường kính vòng phân giải cellulose trên môi trường ĐT của vi khuẩn BHM10 ở pH khác nhau 100

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Các thành phần cấu tạo lignin thực vật……… 15

Hình 1.2: Cấu trúc lignin……… 16

Hình 1.3:Một số đường monomer cấu tạo hemicellulose……… 17

Hình 1.4: Cấu trúc hemicellulose……… 18

Hình 1.5: Cấu trúc tannic acid……… 19

Hình 1.6: Cấu trúc của cacboxyl methyl cellulose (CMC) ……… 21

Hình 1.7: Công thức cấu tạo của cellulose……… 22

Hình 1.8: Cơ chế cắt cơ chất cellulose của enzyme cellulase……… 26

Hình 2.1: Sơ đồ thiết kế thí nghiệm của mục tiêu 1……… 43

Hình 2.2: Sơ đồ thiết kế thí nghiệm của mục tiêu 2……… 44

Hình 2.3: Sơ đồ thiết kế thí nghiệm của mục tiêu 3……… 45

Hình 2.4: Sơ đồ thiết kế thí nghiệm của mục tiêu 4……… 46

Hình 2.5: Các mẫu mụn dừa thu thập……… 49

Hình 2.6: Sơ đồ tăng sinh vi sinh vật chịu nhiệt……… 50

Hình 2.7: Sơ đồ sàng lọc mẫu tăng sinh chứa quần thể vi sinh vật phân huỷ cellulose

……… … 51

Hình 2.8: Sơ đồ phân lập vi sinh vật trên môi trường thạch chứa

……… 53 Hình 2.9: Sơ đồ khảo sát hoạt tính enzyme CMCase từng chủng………… 54

Hình 2.10: Sơ đồ tiến hành khảo sát khả năng mọc trên môi trường thạch có chứa giấy lọc……… 55 Hình 2.11: Mẫu enzyme ở các pH sau khi lọc……… 59 Hình 2.12: Sơ đồ chuẩn bị môi trường lỏng ở các pH khác nhau……… 60

Hình 2.13: Sơ đồ định tính hoạt tính enzyme CMCase của các chủng ở các pH khác nhau bằng phương pháp đục lỗ thạch……… 61 Hình 2.14: Xác định hoạt tính enzyme CMCase……… 64 Hình 2.15: Xác định hoạt tính enzyme FPase……… 67 Hình 2.16: Sơ đồ khảo sát khả năng thủy phân giấy lọc của các chủng phân lập 68

Hình 2.17: Chuẩn bị môi trường khảo sát hoạt tính enzyme ở hai chế độ lắc và không lắc……… 69 Hình 2.18: Sơ đồ định tính khả năng sinh enzyme tannase của các chủng… 73 Hình 2.19: Sơ đồ khảo sát khả năng tăng sinh khối của các chủng phân lập trong tannic acid ở các nồng độ khác nhau……… 77

Hình 3.1: Sàng lọc quần thể vi sinh vật tăng sinh bằng phương pháp đục lỗ

thạch……… 80

Hình 3.2: Khả năng mọc khuẩn lạc của các chủng trên môi trường thạch có chứa giấy lọc……… 86

Hình 3.3 :Hình thành sinh khối trong các mẫu môi trường tăng sinh…… 96

Hình 3.4 : So sánh kích thước vòng halo của các chủng ở bốn pH …… 102

Hình 3.5 : So sánh kích thước vòng halo của các chủng ở pH7…… 102

Hình 3.6: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính CMCase của chủng BHM3……… 104

Hình 3.7: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính CMCase của chủng BHM4… ……… 104

Hình 3.8: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính CMCase của chủng BHM5……… …… 105

Hình 3.9: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính CMCase của chủng BHM8……… 105

Hình 3.10: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính CMCase của BHM10……… 106

Hình 3.11: So sánh hoạt tính enzyme CMCase của các chủng ở pH7……… … 106

Hình 3.12: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính FPase của chủng BHM3……… …… 108

Hình 3.21: Hoạt tính CMCase của các chủng ở hai chế độ lắc và không lắc…… 114 Hình 3.22: Hoạt tính FPase của các chủng ở hai chế độ lắc và không lắc… 115

Hình 3.23: Khảo sát hoạt tính enzyme tannase trên môi trường thạch … …118

Hình 3.24: Hoạt tính enzyme tannase của các chủng vi khuẩn ở pH7 và lắc 150 vòng/phút……… ……… …119 Hình 3.25 Sinh khối sau khi ly tâm……….….120 Hình 3.26: Sinh khối của các chủng ở nồng độ tannic acid khác nhau

……… … 121

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Nông nghiệp là ngành kinh tế quan trọng của Việt Nam Hiện nay, Việt Nam vẫn

là một nước nông nghiệp Năm 2009, giá trị sản lượng của nông nghiệp đạt 71,473 nghìn tỷ đồng (giá so sánh với năm 1994), tăng 1,32 % so với năm 2008 và chiếm 13,85 % tổng sản phẩm trong nước Tỷ trọng của nông nghiệp trong nền kinh tế bị sụt giảm trong những năm gần đây, trong khi các lĩnh vực kinh tế khác gia tăng Đóng góp của nông nghiệp vào tạo việc làm còn lớn hơn cả đóng góp của ngành này vào GDP Trong năm 2005, có khoảng 60 % lao động làm việc trong lĩnh vực nông, lâm nghiệp,

và thuỷ sản Sản lượng nông nghiệp xuất khẩu chiếm khoảng 30 % trong năm 2005 Việc tự do hóa sản xuất nông nghiệp, đặc biệt là sản xuất lúa gạo, đã giúp Việt Nam là nước thứ hai trên thế giới về xuất khẩu gạo và nằm trong những nước xuất khẩu các nông sản quan trọng khác là tiêu, sợi bông, đậu phộng, cao su, đường và trà

Tuy nhiên trong sản xuất nông nghiệp hằng năm có khoảng 232 tỷ chất hữu cơ được thực vật tổng hợp thành nhờ quá trình quang hợp Trong số này có 172 tỷ tấn được tạo thành ở trên đất liền và 60 tỷ tấn được tạo thành trong các đại dương Trong

số này có đến 30 % là màng tế bào thực vật mà thành phần chủ yếu là cellulose Cellulose chiếm đến 89 % trong bông là 40 - 50 % trong gỗ Ở cấp độ sinh quyển, hàng

tỷ tấn cellulose được tạo ra mỗi năm cần phải được phân hủy, nếu không chúng sẽ tích

tụ lại và gây nguy hiểm cho hệ sinh thái

Mặt khác đứng trước áp lực rút ngắn thời gian nhưng hiệu quả canh tác trên một diện tích đất nông nghiệp phải không ngừng tăng lên người nông dân đã áp dụng các tập quán canh tác mới như cải thiện giống, bón phân, Hiện nay có rất nhiều loại phân bón sử dụng trong nông nghiệp như: phân hữu cơ, phân sinh học, phân vi sinh Tuy nhiên việc phụ thuộc quá nhiều vào phân hóa học và loại bỏ rơm rạ, phụ phế phẩm vừa

gây ảnh hưởng đến môi trường sống vừa lãng phí một nguồn nguyên liệu sản xuất phân bón thân thiện với môi trường Do vậy sử dụng phân bón hữu cơ vi sinh sẽ thay thế dần việc bón phân hoá học trên đồng ruộng, đất trồng trọt mà vẫn đảm bảo được nâng cao năng suất thu hoạch Sử dụng phân bón hữu cơ vi sinh về lâu dài sẽ dần dần trả lại độ phì nhiêu cho đất như làm tăng lượng phospho và kali dễ tan trong đất canh tác, cải tạo, giữ độ bền của đất đối với cây trồng nhờ khả năng cung cấp hàng loạt các chuyển hoá chất khác nhau liên tục do nhiều quần thể vi sinh vật khác nhau tạo ra Việc sử dụng phân bón hữu cơ vi sinh còn có ý nghĩa rất lớn là tăng cường bảo vệ môi trường sống, giảm tính độc hại do hoá chất trong các loại nông sản thực phẩm do lạm dụng phân bón hóa học

Trên thế giới, có hai phương pháp phổ biến để xử lý nguồn cellulose trong tự nhiên: thứ nhất là xử lý bằng vật lý và hóa học; thứ hai là xử lý các chất thải hữu cơ cellulose bằng công nghệ sinh học đặc biệt là sử dụng các enzyme cellulase ngoại bào

từ các nguồn vi sinh vật, phương pháp này tỏ ra hiệu quả hơn trong việc sản xuất phân bón, chi phí phù hợp và các điều kiện thực hiện đơn giản hơn rất nhiều so với xử lý bằng hóa học chính vì thế hiện nay có nhiều nghiên cứu tối ưu quy trình này nhằm đưa

ra sản xuất rộng rãi Một trong những yếu tố đó là nguồn giống vi sinh, yếu tố đóng vai trò chủ đạo để nâng cao hiệu quả sản xuất phân bón, rút ngắn thời gian ủ,

Từ các vấn đề đặt ra ở trên tôi đi đến chọn đề tài “Phân lập vi khuẩn có khả năng

phân hủy cellulose trong mụn dừa và vỏ tiêu”

2 Tình hình nghiên cứu

2.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Trên thế giới hiện nay đã có rất nhiều nghiên cứu về ứng dụng của vi nhuẩn phân hủy cellulose Trong số đó có nghiên cứu về triển vọng của vi khuẩn phân hủy

nguyên tái tạo phong phú với tiềm năng lớn cho bioconversion để gia tăng gía trị chế

phẩm sinh học

Việc đốt cháy dầu mỏ nhiên liệu hóa thạch đã trở thành một mối quan tâm đối với khí hậu toàn cầu Đốt nhiên liệu hóa thạch cũng đã tạo ra một mối quan tâm đến nguồn dầu khí không ổn định, cũng như, việc tăng chi phí nhiên liệu Những mối quan tâm này dẫn đến sự nỗ lực toàn cầu nghiên cứu sử dụng nguồn tài nguyên tái tạo mà vẫn đáp ứng nhu cầu năng lượng ngày càng cao của thế giới Tại Canada tiêu chuẩn nhiên liệu tái tạo được nâng lên để các nhiên liệu sẽ chứa 5 % ethanol (năm 2010), còn ở Hoa

Kỳ Cơ quan Bảo vệ môi trường tăng tiêu chuẩn nhiên liệu tái tạo của họ để sản xuất ethanol 10,21 % hỗn hợp nhiên liệu vào năm 2009, trong khi hiện tại tỷ lệ ethanol trộn trong nhiên liệu ở Brazil là 25 % (quy định tại 2007) [2,501-507]

Sinh khối chứa lignocellulosic là một nhiều tiềm năng tài nguyên để sản xuất nhiên liệu sinh học bởi vì nó phần lớn là dồi dào, rẻ tiền Phế phẩm nông nghiệp là một nguồn chứa lignocellulosic dồi dào và rẻ tiền nguồn tài nguyên có thể thu từ: lá, thân của một số cây nông nghiệp như: phế thải ngô, bã mía, vỏ trấu, cây thân gỗ Ngoài ra, một số cây chuyên dụng để sản xuất năng lượng sinh học như một số loại cỏ như: cỏ Miscanthus, cỏ Bermuda,

Để chuyển đổi nguồn nguyên liệu giàu của lignocellulose tới những đường dễ lên men gồm 3 bước:

Giảm kích thước

Phân đoạn

Thủy phân enzyme (Pluz Wyman, 1999; Zhang và Lynd, 2004 B)

Một trong những quan trọng nhất và khó khăn thách thức công nghệ là để khắc phục tính bền của vật liệu tự nhiên chứa lignocelluloses, enzyme có khả năng thủy thủy phân để sản xuất các loại đường lên men ở điều kiện thường (Chang và cộng sự, 1981;

Demain et al, 2005; Fan et al, 1982 Grethlein, 1984; Hsu, năm 1996; Lin và cộng sự, 1981; McMillian, năm 1994; Millett et al, 1976; Moreira, 2005;.Mosier et al, 2005; ngựa để cởi và cộng sự, 1993; Weil và cộng sự, 1994 ; Wyman, năm 1999; Wyman

và cộng sự, 2005a)

Gần đây, các công ty công nghệ sinh học Genencor và Novozymes đã cho ra một quy trình công nghệ làm giảm chi phí sản xuất enzyme cellulase từ đó làm giảm chi phí cho quá trình lên men phế phẩm từ 5,40 USD/gallon ethanol xuống khoảng 20 cent/gallon ethanol (Moreira, 2005) Công nghệ này ngoài giảm chi phí sản xuất cellulase còn nhằm nâng cao hiệu suất lên men và rút ngắn thời gian lên men

2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Vấn đề môi sinh ngày càng trở nên trầm trọng trên phạm vi toàn cầu Ở Việt Nam, lượng rác thải ra ngoài môi trường ngày càng lớn, nguy cơ ô nhiễm môi trường ở nhiều nơi là rất cao Việc sử dụng biện pháp vi sinh học trong xử lý rác thải đã và đang mang lại nhiều giá trị to lớn Tuy nhiên, việc sử dụng các vi sinh vật có sẵn trong tự nhiên để xử lý rác thải, thời gian thường kéo dài gây nên tình trạng ô nhiễm môi trường, tốn nhiều diện tích và công sức Để xử lý rác triệt để hơn, giảm giá thành và thời gian xử lý, ngoài việc tạo điều kiện tối ưu cho vi sinh vật phát triển tốt thì việc tuyển chọn các vi sinh vật có khả năng sinh trưởng nhanh, hoạt tính phân giải mạnh, chịu được nhiệt độ cao để bổ sung vào các bể rác là một trong những hướng nghiên cứu đã và đang được nhiều nhà khoa học quan tâm

Năm 1999, Nguyễn Lan Hương và cộng sự đã phân lập và tuyển chọn được các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn có hoạt tính cellulase, sau đó bổ sung vào bể ủ rác thải đã rút ngắn được chu kỳ xử lý rác thải sinh hoạt từ 5 - 7 ngày

Năm 1999, Tăng Thị Chính và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu các điều kiện lên

Cũng trong năm này, Phạm Thị Ngọc Lan và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu và tuyển chọn được một số chủng xạ khuẩn ưa ấm phân lập từ mùn rác ở một số nơi có khả năng phân giải cellulose mạnh

Nghiên cứu về phân lập và định danh các dòng vi khuẩn trong dạ cỏ bò của Võ Văn Phước Duệ và Cao Ngọc Diệp năm 2011

Nghiên cứu phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose trên địa bang tỉnh Thừa Thiên Huế của tác giả Phạm Thị Ngọc Lan

Ngoài ra còn có nghiên cứu khác về phân lập vi khuẩn phân hủy cellulose từ các nguồn giàu xơ khác như: trong trấu đang hoai mục, vỏ và bã tiêu,

3 Mục đích nghiên cứu

Nhằm tìm và chọn ra được chủng vi khuẩn và xạ khuẩn có khả năng phân giải cellulose tốt nhất để tổng hợp thành chế phẩm sinh học và sử dụng nó để sản xuất phân compost, ứng dụng để xử lý rác thải môi trường giàu xơ

4 Nhiệm vụ nghiên cứu

Phân lập vi khuẩn phân hủy cellulose từ mụn dừa và vỏ tiêu

Sàng lọc và tuyển chọn các chủng làm nguồn giống cho quá trình ủ compost từ mụn dừa

5 Phương pháp nghiên cứu

Ý nghĩa khoa học: việc chọn chủng vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose nhằm nâng cao hiệu quả xử lý phụ phế phẩm giàu xơ, cải thiện ô nhiễm môi trường, đồng thời sản phẩm sau quá trình ủ compost sử dụng làm phân bón phân hữu cơ vi sinh cho quá trình bón lót nhằm cải tạo và làm tăng dinh dưỡng trong đất

Ý nghĩa thực tiễn: ứng dụng công nghệ sinh học vào đời sống sản xuất, bảo vệ môi trường và xây dựng nền nông nghiệp ngày càng phát triển bển vững

7 Kết quả đạt được

Thu được 5 chủng (4 chủng vi khuẩn và 1 chủng xạ khuẩn) có khả năng phân hủy cellulose và tannic acid, và tuyển chọn các chủng có tiềm năng ủ compost mụn dừa Gồm 4 chương:

Chương 1: Tổng quan đề tài nghiên cứu

Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 4: Kết luận và kiến nghị

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Hiện trạng của vỏ tiêu và mụn dừa

1.1.1 Vỏ tiêu

Trong những năm gần đây, Việt Nam luôn nằm trong các nhóm nước dẫn đầu về xuất khẩu hồ tiêu trên thế giới, theo báo cáo mới công bố của Hội đồng hạt tiêu quốc tế (IPC) ước tính lượng tiêu xuất khẩu của Việt Nam trong cả năm 2011 đạt 115.000 tấn,

và dự báo năm 2012 là 120.000 tấn Diện tích trồng hồ tiêu trong nước chủ yếu tập trung tại các vùng Tây Nguyên, Đông Nam Bộ (trong đó Đông Nam Bộ và Tây

Nguyên chiếm hơn 78 % diện tích trồng hồ tiêu cả nước), đảo Phú Quốc

Bảng 1.1: Diện tích và sản lượng tiêu của vùng Đông Nam Bộ và Tây Nguyên

Diện tích thu

Năng suất

Sản lượng

Diện tích trồng

Diện tích thu

Đăk Nông 7.915 6.130 2,15 13.096 8.000 6.022 2,29 13.814

Bà Rịa

(Nguồn: theo thống kê của Hiệp hội Hồ tiêu Việt Nam (VPA))

Sở dĩ hồ tiêu Việt Nam có thể phát triển một cách rực rỡ như vậy là do Việt Nam hội tụ tất cả các điều kiện thuận lợi về tự nhiên, về con người, về ứng dụng khoa học

kỹ thuật trong sản xuất và chế biến

Tuy nhiên, song song với những phát triển về sản lượng và chất lượng, người nông dân trồng hồ tiêu đã và đang đối mặt với tình trạng sâu hại, bất lợi về thời tiết và đặc biệt là giá thành phân bón tăng cao Mặc khác lượng phế phẩm từ hồ tiêu (chủ yếu

là vỏ tiêu) với số lượng lớn khoảng 16.666 tấn/năm nếu không có các biện pháp xử lý thì chúng là nguồn gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng Việc nghiên cứu phương pháp compost để xử lý phế phẩm này vừa giải quyết được ô nhiễm vừa tạo ra giá trị kinh tế cao Sỡ dĩ vỏ tiêu được chọn làm nguyên liệu để ủ compost vì trong vỏ tiêu chứa hàm lượng chất dinh dưỡng cao nên người ta có thể sử dụng bã cà phê như một chất bón cây rất hữu hiệu Trong thành phần của nó chứa nhiều canxi, phốt pho, nitơ cũng như các chất khoáng khác giúp ích cho sự phát triển của cây Khi đó giá thành của loại phân bón hữu cơ này chỉ bằng khoảng 30 % so với các loại phân khoáng bán trên thị trường Hơn nữa, sử dụng các loại phân hữu cơ sinh học từ xác, bã thực vật nói chung và vỏ quả cà phê nói riêng bón cho các loại cây trồng sẽ góp phần cân bằng hệ sinh vật trong đất Từ đó, cải thiện được kết cấu, độ xốp, độ phì nhiêu của đất

1.1.2 Mụn dừa

Bến Tre có diện tích và sản lượng dừa lớn nhất Việt Nam, với hơn 52.000 ha dừa (chiếm 51,23 % diện tích cây lâu năm; 24,795 % đất nông nghiệp và chiếm 19,07 % diện tích tự nhiên) chiếm 2/3 diện tích, sản lượng dừa cả nước và đứng hàng đầu về chất lượng, sản lượng thu hoạch hàng năm đạt trên 390 triệu trái, chiếm 36 % sản lượng cả nước là cây có diện tích lớn nhất và ổn định nhất so với các cây khác trên địa bàn tỉnh Bến Tre Giá trị sản xuất các sản phẩm dừa chiếm hơn 25 % tổng giá trị sản xuất công nghiệp toàn tỉnh; kim ngạch xuất khẩu các sản phẩm từ dừa không ngừng gia tăng, có lúc chiếm tới hơn 40 % tổng kim ngạch xuất khẩu của tỉnh, sản phẩm dừa đã xuất khẩu đến trên 50 quốc gia và vùng lãnh thổ trên thế giới Ngành dừa luôn đóng vai trò quan trọng trong phát triển kinh tế - xã hội tỉnh

Trái dừa ngoài đáp ứng cho nhu cầu giải khát ngày càng tăng nhất là ở các thành phố lớn Bến Tre cung cấp khoảng 150 – 200 triệu trái/năm, hiện nay một số ngành nông nghiệp phát triển từ nguồn nguyên liệu dừa cũng tăng theo từng năm cho ra nhiều sản phẩm có giá trị như: cơm dừa nạo sấy, dầu dừa, kẹo dừa, thạch dừa, chỉ xơ dừa, thảm xơ dừa, vỏ dừa cắt lát, mụn dừa, than hoạt tính và khoảng 100 sản phẩm hàng thủ công mỹ nghệ từ cây dừa, trái dừa, gáo dừa, cọng dừa, chà dừa, nhen dừa được xuất khẩu sang nhiều quốc gia trên thế giới

Bảng 1.2: Diện tích dừa ở tỉnh Bến Tre (ha)

(Theo Niên giám thống kê của Cục Thống kê tỉnh Bến Tre, tính đến năm 2011)

Bảng 1.3: Diện tích, năng suất và sản lượng dừa cả nước

Sản lượng dừa thế giới hiện nay đạt 11.439 triệu tấn cơm dừa khô (trong đó các nước thuộc APCC đạt 9.442 triệu tấn, chiếm 82,54 %) Indonesia là nước dẩn đầu về diện tích dừa với 3,98 triệu ha, Philippines xếp thứ hai với 3,26 triệu ha, Ấn Độ xếp thứ

ba với 1,92 triệu ha dừa, kế tiếp là Sri Lanka với 394.836 ha Sản lượng dừa ở các quốc gia quy ra trái giai đoạn 2000 - 2004:

Bảng 1.4: Sản lượng dừa (đơn vị 1.000 trái) của các nước trên thế giới

và bón lót cho cây nhưng số lượng không đáng kể so với nguồn phế liệu khổng lồ này Hiện nay có một số ứng dụng mụn dừa vào trong nông như nghiệp như:

tháng sử dụng, đất sạch trở nên “mùn hoá” có ích cho

hiệu quả

1.2 Thành phần và tính chất hóa học của mụn dừa

Mụn dừa là chất hữu cơ và có thể tái sử dụng

Mụn dừa là chất nền trên mặt đất, do đó có thể ngăn chặn những tác nhân có hại cho đất

Độ pH của mụn dừa khoảng 5.5 Chất lượng mụn dừa không bị ảnh hưởng nếu

pH thấp hơn

Tỷ lệ C/N khoảng 80:1

Độ xốp khoảng 10 - 12 %

Chất hữu cơ khoảng 94 - 98 %

Tổng lượng tro khoảng 3 - 6 %

Cellulose khoảng 20 - 30 %

Lignin khoảng 69 - 70 %

Tannin khoảng 8 – 8,5 %

Trong thành phần của mụn dừa, tannin chiếm tỷ lệ tương đối lớn so với các loài thực vật khác

1.2.1 Lignin

Là một hợp chất cao phân tử đặc biệt của thực vật đặc biệt là thực vật bậc cao (hạt trần, hạt kín), thường tập trung ở những mô hóa gỗ, là chất kết dính tế bào, làm tăng độ bền cơ học, lignin chiếm tỷ lệ cao ở những mô mạch được chuyển hóa để vận chuyển chất lỏng chúng có chức năng chống thấm nước qua vách tế bào mô xylem, ngăn cản

sự xâm nhập của vi sinh vật gây bệnh Khác với cellulose và hemicellulose, lignin hình thành từ các dẫn xuất của phenyl, propan, một chất thơm có mạch nhánh

Lignin là một polymer gốc rượu, có cấu trúc 3 chiều rất phức tạp và có nhiệm vụ nâng đỡ tế bào Sau cellulose, lignin là một polymer phong phú trong tự nhiên được thực vật tổng hợp và chiếm khối lượng rất lớn nguồn chất thơm trên trái đất Lignin giúp tế bào thực vật cứng hơn và giúp cho thực vật tránh được sự xâm nhiễm của vi sinh vật Lignin được tìm thấy trong vách tế bào ở dạng phức hợp các polysaccharide khác như cellulose và hemicellulose, nó cũng giúp bảo vệ các polysaccharide này khỏi

sự phân hủy sinh học

Có thể phân loại lignin theo thành phần chứa nó như lignin gỗ cứng, lignin gỗ mềm và lignin cỏ Thực vật càng già, lượng lignin tích tụ càng lớn

Lignin gỗ mềm (thực vật hạt trần): bao gồm những cấu trúc chủ yếu bắt nguồn từ rượu coniferyl, một ít từ p-coumaryl, không có sinapyl

Lignin gỗ cứng (thực vật hạt kín) chứa số lượng cân bằng coniferyl và sinapyl (46

%) và một lượng nhỏ (8 %) coniferyl p-hydroxylferylpropan (có nguồn gốc từ coumaryl)

Lignin cỏ là hợp chất của coniferyl, sinapyl và p-hydroxyphenylpropan với coumaric acid (5 - 10 %) chủ yếu là ester với nhóm hydroxyl tận cùng của rượu p-coumaryl

Thành phần của lignin gồm 62 - 65 % cacbon, 5 - 6 % hydro, nhiều nhóm metoxyl (-OCH3) và nhiều nhóm hydroxyl (-OH) tự do

Hình 1.1: Các thành phần cấu tạo lignin thực vật Rượu oxyhydro coniferilic là nhân tố cấu tạo chủ yếu của lignin Các liên kết phổ biến trong lignin là aryl-aryl, aryl-glycerol, diarylete Ngoài ra còn các kiểu liên kết phenyl-cumaryl, biphenyl, diarylete Vì dẫn xuất của các hợp chất thơm có mạch bên nhiều nhóm chức hoạt động, đặc biệt là –OH của nguyên tử cacbon (đối với vòng thơm) nên lignin tham gia vào nhiều loại phản ứng đặc trưng khác hẳn với cellulose và hemicellulose như: phản ứng thế, phản ứng ester hóa, oxy hóa, dimetyl hóa

Lignin có cấu tạo vô định hình, không tan trong nước và tan trong acid vô cơ Dưới tác dụng của kiềm bisulfitnatri và acid sulfuric thì lignin mới bị phân giải một phần và chuyển sang dạng hòa tan

Hình 1.2: Cấu trúc lignin

1.2.2 Hemicellulose

Khác với cellulose, phân tử hemicellulose nhỏ hơn nhiều thông thường không quá

150 gốc đường, được nối với nhau không chỉ bằng liên kết 1,4 mà còn liên kết 1,3 và 1,6-glucoside tạo ra mạch ngắn và phân nhánh

Hemicellulose là một heterpolymer có ở trong vách tế bào thực vật cùng với cellulose Hemicellulose không tan được trong nước chỉ tan được trong dung dich kiềm Hemicellulose có cấu trúc vô định hình và ít bền vững Nó dễ bị phân hủy bởi các enzyme hemicellulase

Tùy theo trong thành phần của hemicellulose có chứa monosaccharide nào mà nó

sẽ có những tên tương ứng như manan, galactan, glucan và xylan Các polysaccharide như manan, galactan, glucan hay xylan đều là các chất phổ biến trong thực vật, chủ yếu

ở các thành phần của màng tế bào của các cơ quan khác nhau như gỗ, rơm rạ, v.v…

Trong thiên nhiên loại hemicellulose dễ gặp nhất là xylan Xylan thường thấy nhiều trong rơm, rạ Xylan là một polymer chính của thành tế bào thực vật trong đó các gốc D-xylopyranose kết hợp với nhau qua liên kết β-1,4-D-xylopyranose, là nguồn năng lượng dồi dào thứ hai trên trái đất Đa số phân tử xylan chứa nhiều nhóm ở trục chính và chuỗi bên Các gốc thay thế chủ yếu trên khung chính của xylan là các gốc acetyl, arabinosyl và glucuronosyl Các nhóm này có đặc tính liên kết tương tác cộng hóa trị với lignin, cellulose và các polymer khác

Hemicellulose chứa nhiều đơn phân đường khác Ngoài glucose, các phân tử đường trong hemicellulose có thể là nhóm hexose (mannose, galactose) và nhóm pentose ( xylose, arabinose) Hemicellulose chứa hầu hết các đường D-pentose và một

ít các đường dạng L

Hình 1.3:Một số đường monomer cấu tạo hemicellulose

Hình 1.4: Cấu trúc hemicellulose

1.2.3 Tannin

Tannin (tannin thực vật - phân tử sinh học, hoàn toàn khác so với tannin tổng hợp) là chất làm se, đắng Là nhóm các polyphenol tồn tại phổ biến trong thực vật, có khả năng tạo liên kết bền vững với protein và một số hợp chất cao phân tử thiên nhiên (cellulose, pectin)

Tannin có phân tử khối từ 500 - 3000 đvC, có khả năng kết tủa với gelatin (protein loại collagen được chiết xuất từ da, xương động vật, ở nhiệt độ thường có thể rắn) và các protein khác trong môi trường nước

Tannin tan trong nước đặc biệt là nước nóng, cồn hay kiềm loãng, không tan trong dung môi hữu cơ, tạo tủa với protein, gellatin, không bay hơi

Trong trà, tiêu, rượu vang (đặc biệt là rượu vang đỏ), lựu, hồng, dâu, trong các

thường đắng hơn quả bơ chín) đều chứa tannin, đặc biệt trong các thực vật già, thân đã hóa gỗ thì tannin càng nhiều

Trong thực vật có 2 loại tannin sau:

Tannin thủy phân được (hydrolysable tannin), tiêu biểu đó là acid gallic HOOCC6H2(OH)3 (IUPAC: acid 3,4,5-trihydroxybeoic)

Tannin không thủy phân được (Condzensed Tannin) còn gọi là proanthyocyanidins, tiêu biểu đó là flavones C15H10O2 (IUPAC: 2-phenylchromen-4-one (2-phenyl-1-benzopyran-4-one)

Hình 1.5: Cấu trúc tannic acid

1.2.4 Cellululose

1.2.4.1 Giới thiệu

Cellulose cũng là hợp chất hữu cơ nhiều nhất trong sinh quyển, hàng năm thực vật tổng hợp được khoảng 1011 tấn cellulose (trong gỗ, cellulose chiếm khoảng 50 % và trong bông chiếm khoảng 90 %), là thành phần chủ yếu cấu tạo nên vách tế bào thực vật, đó chính là nguồn năng lượng vô tận cho sự phát triển cho sự phát triển xã hội Theo đó, cellulose được tìm thấy trong hầu hết các loại chất thải hữu cơ và chiếm tỉ lệ cao trong thành phần cấu trúc từ các chất thải của ngành công nghiệp gỗ, nông nghiệp

và chất thải gia đình

Cellulose có công thức cấu tạo là (C6H10O5)n hay [C6H7O2(OH)3]n mức độ polymer hóa của cellulose rất cao tới 10000 - 140000 đơn vị glucose/phân tử Cellobiose là lặp đi lặp lại đơn vị nhỏ nhất của cellulose và có thể cuối cùng được chuyển đổi thành glucose Về bản chất hóa học cellulose là một rượu đa chứa có phản ứng với kiềm hay kim loại kiềm tạo cellulose-alcolate Nguyên tử hydro ở các nhóm

OH bậc một và hai trong phân tử cellulose cũng có thể bị thay thế bởi các gốc metyl, etyl, tạo ra những chất có độ kết tinh và độ hòa tan cao trong nước khác nhau

Cellulose là polymer thẳng của các đơn vị β-D-glucose được nối với nhau qua liên kết β-D-1,4-glucoside Nhờ phương pháp phân tích bằng tia Rơnghen người ta biết rằng cellulose có cấu tạo dạng sợi Các sợi này liên kết lại thành những bó nhỏ gọi là các microfibril có cấu trúc không đồng nhất Các mạch cellulose được liên kết với nhau nhờ liên kết hydro và liên kết Van Der Waals, hình thành hai vùng cấu trúc chính là tinh thể và vô định hình

Trong vùng tinh thể, các phân tử cellulose liên kết chặt chẽ với nhau theo một trật

tự đều đặn nhờ liên kết hydro nối nhóm hydroxyl thứ nhất của mạch này với nhóm hydroxyl ở mạch cacbon của mạch khác, vùng này khó bị tấn công bởi enzyme cũng như hóa chất Ngược lại, trong vùng vô định hình, cellulose liên kết bằng kiên kết Van der Waals nên dễ bị tấn công

Chiều dài phân tử cellulose trong vùng vô định hình thường lớn gấp hàng chục lần so với chiều dài phân tử cellulose kết tinh Các cây gỗ lâu năm thường chứa hàm lượng cellulose kết tinh nhiều, các cây thảo mộc thì ngược lại, chứa nhiều cellulose vô định hình

Trong vách tế bào thực vật, cellulose tồn tại trong mối liên kết chặt chẽ với các polysaccharide khác: hemicellulose, pectin và lignin tạo thành liên kết bền vững

Cellulose bị oxy hóa bởi một số tác nhân tạo thành sản phẩm oxy hóa một phần là oxy-cellulose Tác nhân oxy hóa chọn lọc nhất là acid iodic (HIO4) Đặc biệt cellulose hòa tan trong dung dịch cupri hydrate (Cu(NH3)4(OH)2), và hàng loạt các phức chất của đồng, niken, kẽm

Trong phân tử cellulose có nhiều liên kết hydroxyl tồn tại dạng tự do, hydro của chúng dễ bị thay thế bởi một số gốc hóa học như metyl hoặc gốc acetyl tạo nên các dẫn xuất este hoặc este của cellulose Một trong những dẫn xuất được ứng dụng nhiều là CMC (cacboxyl methyl cellulose), trong đó một số nhóm hydroxyl của cellulose được thay thế bằng gốc –OCH2COOH

Hình 1.6: Cấu trúc của cacboxyl methyl cellulose (CMC) Cellulose có cấu trúc rất bền và khó bị thủy phân Người và động vật không có enzyme phân giải cellulose (cellulase) nên không tiêu hóa được cellulose, vì vậy cellulose không có giá trị dinh dưỡng Tuy nhiên, một số nghiên cứu cho thấy cellulose

có thể có vai trò điều hòa hoạt động của hệ thống tiêu hóa Vi khuẩn trong dạ cỏ của gia súc, các động vật nhai lại và động vật nguyên sinh trong ruột của mối sản xuất enzyme phân giải cellulose Nấm đất cũng có thể phân hủy cellulose Vì vậy chúng có thể sử dụng cellulose làm thức ăn

Hình 1.7: Công thức cấu tạo của cellulose

1.2.4.2 Enzyme phân giải cellulose (enzyme cellulase)

Sự phân giải cellulose rất phức tạp, đòi hỏi sự có mặt của nhiều enzyme như endoglucanase, β-glucosidase, cellobiohydrolase

Mỗi dạng enzyme trong phức hệ cellulase tham gia thủy phân phân tử cơ chất theo một cơ chế riêng Tuy nhiên, những enzyme này thường phối hợp hoạt động để thủy phân hoàn toàn phân tử cơ chất thành sản phẩm đơn giản nhất là glucose

Cellulase là enzyme thuộc nhóm enzyme thủy phân (hydrolase) hoạt động phối hợp trong việc thủy phân cellulose thành glucose ở nhiệt độ thường hoặc 40 - 50 oC

Hệ cellulase gồm ba thành phần chính:

Enzyme thứ nhất là 1,4 β -D-glucan cellobiohydrolase (tên khoa học khác:

cellobiohydrolase, enzyme C1, exoglucanase, exocellulase, cellobiosidase và avicellase) – EC.3.2.1.4 (CBH) Enzyme này cắt hai đầu khử và đầu không khử của chuỗi cellulose để tạo thành cellobiose Trọng lượng phân tử của enzyme này là từ 53 -

75 kDa Enzyme này không có khả năng phân giải cellulose dạng kết tinh mà chỉ làm thay đổi tính chất hóa lý của chúng

Enzyme thứ hai là 1,4 β-D-glucan- 4 -glucanohydrolase (tên gọi khác: endoglucanse, endo 1,4-β-glucanase, enzyme Cx)- EC 3.2.1.6 (EG) chứa 418 acid amine, có trọng lượng phân tử từ 42 – 49 KDa Chúng hoạt động ở nhiệt độ khá cao và

tham gia phân giải liên kết β-1,4 glucoside trong cellulose trong lichenin và β

-D-glucan Sản phẩm của quá trình phân giải là cellodextrin, cellobiose, và glucose

Enzyme thứ ba là β-D-glucoside glucohydrolase (tên khác là cellobiase và β

-glucosidase) có khả năng hoạt động ở pH rất rộng (pH 4,4 – 4,8) EC.3.2.1.21, trọng lượng phân tử khoảng 50 – 98 KDa, pI = 8,4 và có thể hoạt động ở nhiệt độ cao Chúng tham gia phân hủy cellobiose, tạo thành glucose, không có khả năng phân hủy cellulose nguyên thủy

Nhiều nghiên cứu cho rằng các enzyme EG có tác dụng phân cắt tốt trên cellulose

vô định hình và đặc biệt có tác dụng trên cơ chất celluolose biến tính CMC, HEC Vì vậy, để xác định hoạt tính enzyme này người ta sử dụng cơ chất là CMC Còn các enzyme CBH thì có tác dụng trên cellulose kết tinh, ít trên cellulose vô định hình và hầu như không có tác dụng phân cắt cellulose biến tính

Cơ chế phối hợp cắt cellulose: Đầu tiên enzyme EG tấn công vào giữa mạch cellulose Tiếp sau đó enzyme CBH tiếp tục phân cắt để tạo các sản phẩm cuối là

cellobiose Việc phân cắt cuối cùng tạo thành glucose là nhờ vào enzyme thứ ba là glucosidase Tuy enzyme β-glucosidase không tác dụng trên chuỗi cellulose nhưng vẫn được xếp vào hệ thống enzyme cellulase

β-Bảng 1.6: Phân loại enzyme phân cắt β-1,4-glucan