Phương pháp nhân nhiễm virus NPV trên sâu khoang ăn tạp (spodoptera liture)

Giới thiệu chung về sâu khoang – Spodoptera litura Fab... Đồ án tốt nghiệp iv DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT NPV : Virus đa diện nhân Nuclear polyhedrosis virus.. GV : Virus hạt

Trang 1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP HCM

Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Cán bộ hướng dẫn : Th.S HOÀNG ANH TUẤN Sinh viên thực hiện: VÕ THỊ HUỲNH MAI MSSV: 0851110142 Lớp: 08DSH4

TP Hồ Chí Minh, 2012

Trang 3

Đồ án tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đồ án đây là công trình nghiên cứu khoa học do chính bản thân tôi trực tiếp thực hiện Được thực hiện trên cơ sở nghiên cứu lý thuyết, vận dụng kiến thức thực hành và tiến hành thí nghiệm nghiên cứu thực tiễn dưới sự hướng dẫn của Th Hoàng Anh Tuấn Các nội dung nghiên cứu và kết quả trong đồ án là trung thực, không sao chép số liệu người khác

Nếu phát hiện có bất kỳ sự gian lận nào, tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước Hội đồng, cũng như kết quả đồ án

Thành Phố Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2011

Sinh viên thực hiện

Võ Thị Huỳnh Mai

Trang 4

LỜI CẢM ƠN

Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến:

Ban giám hiệu trường ĐH Kỹ Thuật Công Nghệ TP.HCM đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ em trong quá trình học tập và hoàn thành đồ án

Ban chủ nhiệm Khoa Môi Trường – Công Nghệ Sinh Học, cùng quý thầy cô trong khoa đã truyền đạt những kiến thức quý báu, tạo điều kiện, động viên, giúp đỡ cho em trong quá trình học tập

Thầy Th Hoàng Anh Tuấn và cô TS Nguyễn Thị Hai đã trực tiếp hướng dẫn đề tài Trong suốt quá trình làm đồ án, quý thầy cô đã bỏ ra nhiều thời gian công sức, tận tình giúp đỡ em hoàn thành đồ án tốt nghiệp đúng định hướng ban đầu

Thầy Thành và Thầy Dũng đã tạo tạo điều kiện cũng như hỗ trợ trang thiết bị cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Cô Trần Thị Thiên An cùng cô Oanh Trường ĐH Nông Lâm TP.HCM; thầy Thành và thầy Dũng Trường ĐH Kỹ Thuật Công Nghệ TP.HCM đã tạo điều kiện cũng như giúp đỡ tận tình trong suốt thời gian em thực hiện đề tài

Các bạn chung nhóm đề tài, cùng các bạn trong lớp và các bạn ở trường ĐH Nông Lâm đã giúp đỡ em trong quá trình thực hiện đề tài

Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn, lời chúc sức khỏe đến cha, mẹ cùng hai em là người luôn bên cạnh ủng hộ và chia sẽ mỗi lúc em gặp khó khăn

Em xin chân thành cảm ơn!

Võ Thị Huỳnh Mai

Trang 5

i

MỤC LỤC

Danh mục các từ viết tắt iv

Danh mục các bảng, đồ thị v

Danh mục sơ đồ, hình ảnh vi

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài 2

1.3 Thời gian – địa điểm thực hiện 2

1.4 Phương pháp nghiên cứu 2

1.5 Kết cấu của đồ án tốt nghiệp 3

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược về lịch sử phòng trừ sâu hại nông nghiệp 4

2.1.1 Những nghiên cứu ngoài nước 4

2.1.2 Những nghiên cứu trong nước 5

2.2 Giới thiệu chung về sâu khoang – Spodoptera litura Fab .6

2.2.1 Phân loại 6

2.2.2 Đặc điểm về hình thái – sinh học 7

2.2.2.1 Đặc điểm hình thái 7

2.2.2.2 Đặc điểm sinh học 8

2.2.3 Phân bố – phạm vi ký chủ 9

2.2.4 Các biện pháp phòng trừ 10

2.2.4.1 Biện pháp canh tác .10

2.2.4.2 Biện pháp cơ giới – vật lý 10

2.2.4.3 Biện pháp hóa học 10

2.2.4.4 Biện pháp sinh học 10

2.3 Tổng quan về virus gây bệnh côn trùng 11

2.3.1 Virus gây bệnh côn trùng 11

2.3.2 Lịch sử nghiên cứu virus gây bệnh côn trùng 12

2.3.3 Phân loại virus gây bệnh côn trùng chính 13

Trang 6

ii

2.3.3.1 Nhóm CPV (Reoviridae) 13

2.3.3.2 Nhóm EV (Poviridae) 13

2.3.3.3 Nhóm Irido viruses (Iridoviridae) 13

2.3.3.4 Nhóm Denso virus (Parvoridae) 14

2.3.3.5 Nhóm Virus ARN (Picornaviridae) 14

2.3.3.6 Nhóm Sigma virus (Rhabdoviridae) 14

2.4 Nuclear polyhedrosis virus (NPV) 15

2.4.1 Một số đặc điểm hình thái và cấu trúc của NPV 15

2.4.1.1 Hình thái 15

2.4.1.2 Cấu trúc 15

2.4.1.3 Cấu tạo của thể virus 15

2.4.1.4 Cấu tạo khối đa diện (polyhedral) 16

2.4.2 Cơ chế xâm nhiễm 17

2.4.3 Triệu chứng của côn trùng khi nhiễm NPV 20

2.4.4 Ưu và nhược điểm của chế phẩm NPV 20

2.4.4.1 Ưu điểm 20

2.4.4.2 Nhược điểm 21

2.4.5 Hiệu lực diệt sâu của virus NPV 21

2.5 Phương pháp sản xuất chế phẩm NPV 22

2.5.1 Quy trình sản xuất chế phẩm NPV bằng phương pháp in vivo 23

2.5.2 Phương pháp nhân nhiễm virus 26

2.5.2.1 Những nghiên cứu ngoài nước 26

2.5.2.2 Những nghiên cứu trong nước 27

2.5.3 Thời gian thu nhận virus 28

2.5.4 Phương pháp tinh sạch 30

Trang 7

iii

CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Dụng cụ – Vật liệu thí nghiệm 33

3.1.1 Dụng cụ 33

3.1.2 Vật liệu 33

3.1.2.1 Nguồn sâu thí nghiệm 33

3.1.2.2 Nguồn virus để nhiễm sâu 33

3.1.2.3 Nguồn thức ăn nhân tạo 34

3.2 Nội dung nghiên cứu 34

3.3 Phương pháp nghiên cứu lây nhiễm tạo NPV 35

3.3.1 Xác định mật độ nhiễm sâu hợp lý 35

3.3.2 Xác định thời gian thu nhận sâu chết phù hợp 36

3.3.3 Xác định phương pháp ly tâm phù hợp để trích ly số PIB 37

3.4 Cách kiểm tra số lượng PIB 38

3.5 Phương pháp xử lý số liệu 39

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Xác định mật độ sâu nhiễm hợp lý 40

4.1.1 Tỷ lệ sâu chết của sâu ở các mật độ nuôi nhiễm NPV 40

4.1.2 Sản lượng PIB/sâu thu được ở các mật độ 41

4.1.3 Chi phí sản xuất 43

4.2 Xác định thời gian thu nhận sâu nhiễm thích hợp 44

4.2.1 Sản lượng PIB/sâu thu được 45

4.2.2 Thời gian thu lấy mẫu 45

4.3 Xác định phương pháp ly tâm thích hợp để trích ly các thể PIB 46

4.3.1 Mức độ tinh sạch của dịch virus NPV sau khi ly tâm ở các phương pháp ly tâm 47

4.3.2 Tỷ lệ virus thu nhận từ các phương pháp ly tâm thích hợp 50

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận 52

5.2 Đề nghị 52

Trang 8

iv

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

NPV : Virus đa diện nhân (Nuclear polyhedrosis virus)

GV : Virus hạt (Granuloviruses)

SlNPV : Virus đa diện nhân ký sinh trên sâu khoangn (Spodoptera litura

BVTV : Bảo vệ thực vật

SDS : Sodium dodecyl sulfate

CNSH : Công nghệ sinh học

Bt : Vi khuẩn Bacillus thuringiensis

IPM : Quản lý dịch hại tổng hợp

Trang 9

v

DANH MỤC CÁC BẢNG, ĐỒ THỊ

Bảng 4.1 Tỷ lệ sâu chết do NPV thu nhận được ở các công thức 40

Bảng 4.2 Ảnh hưởng của mật độ sâu nhiễm đến sản lượng và hiệu suất nhân của NPV 42

Bảng 4.3 Giá thành sản xuất cho 100 sâu chết virus ở các công thức 43

Bảng 4.4 Số PIB/sâu ở các công thức 45

Bảng 4.5 Thời gian lấy mẫu của 100 sâu ở các công thức 46

Bảng 4.6 Số PIB/sâu ở các công thức 49

Đồ thị 4.1 Sản lượng PIB/sâu ở các thời điểm khác nhau 44

Đồ thị 4.2 Sảnlượng PIB/sâu ở các công thức 49

Trang 10

vi

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH

Sơ đồ 2.1 Quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm NPV 23

Hình 2.1 Sâu khoang 6

Hình 2.2 Vòng đời sâu khoang 7

Hình 2.3 Cấu trúc của Baculovirus 16

Hình 2.4 Cơ chế xâm nhập của virus NPV 17

Hình 2.5 Chu trình lây nhiễm virus NPV trên sâu khoang 19

Hình 3.1 Hình thể vùi của virus NPV trên buồng đếm hồng cầu bằng kính hiễn vi quang học với độ phóng đại 4000 lần, ở độ pha loãng 102 39

Hình 4.1 Sự thay đổi màu sắc của thức ăn sau 1 ngày nhiễm 47

Hình 4.2 Sự thay đổi màu sắc của thức ăn sau 4 ngày nhiễm 47

Hình 4.3 Hình minh họa mức độ ôi thiu của thức ăn nhiễm NPV 48

Trang 11

Đồ án tốt nghiệp

1

PHỤ LỤC

MỘT SỐ HÌNH ẢNH TRONG QUÁ TRÌNH LÀM THÍ NGHIỆM

Hình 1 sâu khoang 7 ngày tuổi bị bỏ đói 2 giờ trước khi nhiễm

Hình 2 Các giai đoạn nhiễm virus NPV trên sâu khoang

(A): Sâu mới nhiễm virus, hoạt động bình thường

(B) : Sâu có triệu chứng: cơ thể căng phồng, màu thân chuyển sang hồng nhạt, lờ đờ và ngừng ăn

(C) : Sâu vừa chết

(D): Sâu chết và dịch virus chảy ra

Trang 12

2

Hình 2 Một số hình ảnh sâu khoang và nhộng chết do virus NPV

Hình 3 Sâu nuôi tập thể bị nhiễm NPV

Trang 13

3

Hình 4 Các lọ đựng mẫu sâu ở thí nghiệm xác định thời gian thu thich hợp

Hình 5 Lọc virus NPV

Trang 14

4

Hình 6 Ly tâm mẫu

(a): dịch virus mới ly tâm có sự phân tách các lớp

(b): đánh đều mẫu sau khi ly tâm

Hình 7 Các ống COD chứa dịch virus NPV sau khi ly tâm

Trang 15

5

Hình 8 Các PIB của virus NPV quan sát dưới kính hiển vi

MỘT SỐ BẢNG SỐ LIỆU

Bảng 1 Giá thành phần của một mẻ thức ăn và giá trị của 1 sâu khoang

Thành phần

Một mẻ thức ăn nhân tạo

(TANT) Khối lượng Đậu xanh

Trang 16

6

Bảng 2.Giá thành trung bình của một sâu chết – một mẻ thức ăn

STT Tên dụng cụ - hóa chất Số lượng Giá/1 đơn vị (Vnđ) Tổng giá (Vnđ)

1 Cốc lớn 500ml 1 cái 30.000 30.000

2 Cốc nhỏ 100ml 4 cái 22.000 88.000

3 Hũ yaourt, V= 30ml 8 lốc 7.000 56.000

4 Hộp nhựa vuông 16x10,5cm 6 cái 15.000 90.000

5 Thùng giấy A4 20,5x29,5cm 3 cái 5.000 15.000

6 Hộp nhựa tròn đường kính 8cm 20 cái 2.000 40.000

7 Hộp nhựa tròn đường kính 32cm 10 cái 2.000 20.000

8 Lọ thủy tinh V= 100ml 20 lọ 1.000 20.000

9 Cọ quét 3 cây 5.000 15.000

10 Dao 1 cây 10.000 10.000

11 Bông thắm 1 bịt 130.000 130.000

12 Bông không thắm 1 bịt 130.000 130.000

13 Đũa thủy tinh 1 cây 7.000 7.000

14 Máy xay sinh tố 1 cái 700.000 700.000

15 Cân kỹ thuật 1 cái 8.000.000 8.000.000

Trang 17

7

16 Bếp đun 1 cái 484.000 484.000

17 Giấy thấm 2 bịt 30.000 60.000

18 Bao tay 1 hộp 90.000 90.000

19 Khẫu trang 1 hộp 60.000 60.000

20 Ống COD 50 ống 14.000 700.000

21 Eppendor 1 bịt 254.000 254.000

22 Rỗ nhựa lớn 3 cái 58.000 174.000

23 kệ xếp 1 cái 50.000 50.000

24 pipet 1ml 1 cái 9.000 9.000

25 pipet 2ml 2 cái 11.000 22.000

26 pipet 5ml 1 cái 15.000 15.000

27 pipet 10ml 1 cái 18.000 18.000

28 bóp cao su 2 cái 20.000 40.000

29 Phiễu lọc 5 cái 16.000 80.000

30 Kính hiển vi 1 cái 29.000.000 29.000.000

31 Buồn đếm hồng cầu 1 cái 1.300.000 1.300.000

Trang 18

8

32 Kẹp 1 cái 22.000 22.000

33 Muỗng múc hóa chất 1 cái 12.000 12.000

34 Tủ lưu mẫu 1 cái 55.000.000 55.000.000

35 Giá đỡ ống nghiệm 1 cái 96.000 96.000

36 Cối - chày xứ 1 cái 32.000 32.000

37 Nồi inox 1 cái 60.000 60.000

TỔNG CỘNG CHI PHÍ (Vnđ) 96.911.000 Ghi chú: Mỗi thí nghiệm tiến hành lặp lại 3 lần với 15 sâu/ lần nhiễm thì cần một mẻ thức ăn nhân tạo

MỘT SỐ BẢNG XỬ LÝ SỐ LIỆU Ớ CÁC CÔNG THỨC THÍ NGHIỆM Số PIB/sâu ở các công thức

ANOVA Table for PIB/sâu by MAT DO

Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between

groups 3.3818E21 4 8.4545E20 3.08 0.0681 Within

groups 2.74852E21 10 27.7993

Total

(Corr.) 6.13033E21 14 2.74852E20

Có p-Value =0,0681>0,05 nên số PIB/sâu ở các công thức không có sự khác biệt về mặt thống kê với mức ý 5%

Multiple Range Tests for PIB/sâu by MAT DO

Mat do Count Mean Homogeneouus

Groups

15 3 1.75123E9 X

30 3 2.66883E9 X

Trang 19

9

10 3 2.99198E9 X

1 3 3.11667E9 X

5 3 4.01509E10 X

Tỷ lệ sâu chết NPV sau 3 ngày nhiễm ở từng mật độ

ANOVA Table for TY LE SAU CHET by MAT DO

Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between

groups 2647.38 4 661.845 23.81 0.0000 Within

Multiple Range Tests for TY LE CHET by MAT DO

Value Between

P-Groups 106.365 4 26.5913 17.52 0.0002

Within

Groups 15.1817 10 1.51817

Total (Corr.) 121.547 14

Trang 20

10

Vì p-Value = 0,000 < 0,05 nên số LE ở các công thức có sự khác biệt với mức

Multiple Range Tests for LE by mat do

Multiple Range Tests for chi phi san xuat by mat do

Mat do Count Mean Homogeneouus Groups

Trang 21

11

Sản lượng virus thu được ở các mật độ

ANOVA Table for san luong virus thu duoc by MAT DO

Source Sum of

Squares Df

Mean Square F-Ratio P-Value Between

Groups 9.91499E18 4 2.47875E18 12.86 0.0006

Within

Groups 1.93405E18 10 1.93405E17

Total (Corr.) 1.1849E19 14

Có p-value=0,0006< 0,05, suy ra sản lượng virus thu được có sự khác biệt ở mức ý nghĩa 5%

Multiple Range Tests for san luong virus thu duoc by MAT DO

Hiệu suất nhân sinh khối ở các mật độ

ANOVA Table for HSNSK by MAT DO

Source Sum of

Squares Df

Multiple Range Tests for HSNSK by MAT DO

Trang 22

12

Số PIB/SÂU ở các thời điểm khác nhau

ANOVA Table for PIB by THOI GIAN

Source Sum of

Squares Df

Groups 4.45391E16 4 1.11348E16 281.12

0.0000

Within

Groups 3.96091E14 10 3.96091E13

Total (Corr.) 4.49352E16 14

Có p-Value = 0<0,05 Suy ra số PIB/sâu ở các thời điểm khác nhau có mức ý nghĩa thống kê với mức ý nghĩa 5%

Multiple Range Tests for PIB by THỜI GIAN

THOI GIAN Count Mean Homogeneouus Groups

5 NGÀY 3 8.05556E7 X

7 NGÀY 3 1.19444E8 X

RỬA 3 1.80556E8 X

VỪA CHẾT 3 2.10185E8 X

NGỪNG ĂN 3 2.23148E8 X

Số PIB/sâu ở các phương pháp ly tâm

ANOVA Table for PIB by PP LY TAM

Source Sum of

Squares Df

Mean Square F-Ratio P-Value Between Groups 6.42699E16 4 1.60675E16 35.39 0.0000 Within Groups 4.53989E15 10 4.53989E14

Total (Corr.) 6.88098E16 14

Có p_Value=0 <0,05 Suy ra số PIB/sâu ở các phương pháp ly tâm có sự khác biệt về mặt thống kê với mức ý nghĩa 5%

Multiple Range Tests for PIB by PP LY TAM

PP LY TAM Count Mean Homogeneouus Groups

Trang 23

13

Định dạng
Số trang	23
Dung lượng	1,73 MB