Khảo sát ảnh hưởng của dịch chiết lên sự sinh trưởng và phát triển của lan oncidiumsp in vitro

- 1941, Overbeek và cộng sự đã sử dụng nước dừa trong nuôi cấy phôi non ở - Có khả năng tái sinh cây con từ các vùng mô và các cơ quan khác nhau của cây như trục thân, lóng thân, phiến l

Trang 1

Ngành : Công Nghệ Sinh Học

Chuyên ngành : Công Nghệ Sinh Học

TP Hồ Chí Minh, năm 2012

Trang 2

SVTH : Mai Duy Vinh Trang 1

Trang 3

1.1 Sơ lược về hoa lan

1.1.1 Tình hình sản xuất hoa lan trên thế giới và ở Việt Nam

1.1.1.1 Tình hình sản xuất hoa lan trên

thế giới

Hoa lan được mệnh danh là nữ hoàng của

các loài hoa, thị trường tiêu thụ hoa lan rộng

khắp thế giới, mang lại lợi nhuận kinh tế cao

cho nhiều nước

Thị trường tiêu thụ hoa lan của khối châu

Âu rất hấp dẫn Hình 1.1 Giàn treo lan

Năm 2006 khối EU có sản lượng xuất khẩu hoa lan trên thế giới đạt 55 tỉ sản phẩm, mang lại giá trị kim ngạch xuất khẩu hoa lan là 73 tỉ EUR Trong đó, Hà Lan

là một quốc gia duy nhất ở Châu Âu có công nghiệp trồng lan xuất khẩu, do trồng trong nhà kính nên Hà Lan có thể xuất khẩu hoa quanh năm, đồng thời là đầu mối trung gian nhập khẩu hoa lan (37%) từ các nước khác trên thế giới Năm 2006, Hà Lan xuất khẩu hoa lan chiếm 95% tổng sản lượng hoa lan trong khối EU

Mặc dù khối Châu Âu có sản lượng xuất khẩu hoa lan cao hơn so với các khối khác, nhưng do nhu cầu tiêu thụ lan trong khối EU cao nên trong năm 2006 sản lượng nhập khẩu hoa lan từ các nước lên tới trên 155 tỉ sản phẩm, giá trị kinh ngạch nhập khẩu đạt gần 90 tỉ EUR (International Statistics Flowers and Plants, 2007)

Hoa lan hiện nay đang là mặt hàng xuất khẩu chiến lược, mang nguồn lợi kinh tế cho nhiều Quốc gia Châu Á Thái Lan là nước xuất khẩu chủ yếu là hoa lan

nhiệt đới, đặc biệt là Dendrobium, phổ biến nhất là Dendrobium

Sonia và Jumbo White Ngoài ra cũng còn một số loài nổi tiếng khác như Aranda, Mokara, Oncidium và Vanda Hơn 80% Dendrobium trên thị trường thế giới là từ Thái Lan Chỉ với loại hoa lan chủ lực là Dendrobium, Thái Lan đạt doanh thu mỗi

năm gần 600 triệu USD từ giá trị xuất khẩu loại hoa này

Trang 4

Giá trị xuất khẩu năm 2000 khoảng 1.765 triệu baht Dendrobium được chọn

là sản phẩm vô địch bởi vì sản phẩm của nó xuất khẩu liên tục trong năm Hiện tại, Thái Lan là nước đứng đầu thế giới về hoa lan Nó trở thành niềm kiêu hãnh của người trồng hoa lan ở Thái Lan Hiện nay Thái Lan có khoảng 24 triệu m2 trang trại trồng hoa lan

Đài loan là nước đứng đầu thế giới về sản xuất và xuất khẩu hoa lan Hồ Điệp bằng qui trình công nghệ cao, giá trị doanh thu từ xuất khẩu loại hoa này hàng năm khoảng 43 triệu USD Trên thị trường thế giới, sản phẩm chủ yếu của hoa lan Hồ Điệp là hoa chậu, sản phẩm này có giá trị kinh tế cao gấp nhiều lần so với hoa Hồ Điệp cắt cành

Hàng năm, Đài Loan sản xuất được 36 triệu Phalaenopsis Trong đó, 12 triệu

hoa lan được xuất khẩu ra các nước như: 3 triệu đến Nhật Bản, 3 triệu đến Trung Quốc, 2,5 triệu tới Hoa Kì và 3,5 triệu cho các quốc gia khác Trong tháng 6 năm

2004, Hoa Kì đã cung cấp giấy phép xuất khẩu Phalaenopsis cho Đài Loan trên thị

trường Hoa Kì

1.1.1.2 Tình hình sản xuất hoa lan ở Việt Nam

Diện tích trồng hoa ở Việt Nam hiện nay là 2500 ha nhưng hoa lan chỉ chiếm

5 – 6 % Nước ta bắt đầu sản xuất và thương mại hoa lan tập trung khoảng 6 năm trở lại đây nhưng tốc độ phát triển khá nhanh Chỉ riêng Tp.HCM diện tích vườn lan lên tới 80 ha, hoa lan đang mang lại thu nhập cao cho nhiều nông dân Tuy nhiên,

do cây giống trong nước không đủ cung cấp cho sản xuất, các nhà vườn nhập cây giống ồ ạt từ nước ngoài như Thái Lan, Đài Loan, Trung Quốc (Báo cáo điều tra thống kê của Sở NN&PTNT Tp.HCM, 2008)

Theo thống kê của Sở NN & PTNT Tp.HCM trong năm 2003 doanh số kinh doanh hoa lan cây kiểng chỉ đạt 200 - 300 tỉ đồng nhưng đến năm 2005 đã tăng đến

600 - 700 tỉ đồng

Theo TS Dương Hoa Xô – Trung tâm Công nghệ sinh học, đến nay đã hoàn

thiện quy trình nhân giống in vitro cho 7 nhóm giống hoa lan, có khả năng cung cấp 200.000 cây con hoa lan nuôi cấy mô thuộc các nhóm Mokara, Dendrobium,

Trang 5

Phaleanopsis, Catlleya Năm 2007, đã cung cấp cho các nhà vườn khoảng 50.000

cây hoa lan nuôi cấy mô các loại Năm 2008, sản xuất 100.000 cây giống hoa lan

cấy mô, tập trung cho nhóm hoa lan cắt cành Mokara, Dendrobium và một số giống

lan rừng quý

Đến 2009, chiếm lĩnh thị trường hoa Tết là những loại hoa mới là và cao cấp

như tiểu quỳnh, lily, tulip, địa lan, hồ điệp… nhân giống bằng công nghệ in vitro

Hiện nay, rất nhiều loại hoa đã được sản xuất bằng phương pháp nuôi cấy

mô tại Việt Nam, như lan Dendrobium, phalaenopsis, vanda, catlleya, Oncidium,

vạn thọ Pháp, cúc Đài Loan, hoa salem, cẩm chướng, hoàng thảo, hoa đồng tiền

nhập nội (các giống Tamara, Banesa, Caliente…) Thị trường tiêu thụ hoa trong

nước ngày càng mở rộng, mỗi năm tiêu thụ hàng triệu cây hoa các loại, riêng hoa lan cũng gần 2 triệu cây

Đặc biệt Đà Lạt là nơi sản xuất hoa lan sớm nhất cả nước với nguồn cây giống phong phú săn tìm trong rừng sâu Lâm Đồng dẫn đầu cả nước về nguồn lợi lan rừng với 101 chi và 396 loài, chiếm 55,3 % về chi và 76,5 % về loài lan rừng của Việt Nam Không ít loài lan được phát hiện lần đầu tiên trên thế giới mang tên

Đà Lạt, 10/12 loài lan quý của Việt Nam phân bố ở vùng rừng Lâm Đồng Những năm sau 1980, Đà Lạt đã xuất khẩu số lượng lớn cành hoa sang các nước Đông Âu

Những năm gần đây, ngành sản xuất hoa lan ở Đà Lạt đã hồi sinh và phát triển mạnh mẽ nhờ ứng dụng kĩ thuật công nghệ cao và sản xuất Với công nghệ hiện đại, đã giúp làm giảm chi phí trồng từ 40.000 - 70.00 đồng/gốc lan trước đây, xuống chỉ còn 4.000 - 7.000 đồng/gốc Sử dụng công nghệ nuôi cấy mô, và đặc biệt bằng phương pháp gây vết thương kết hợp nuôi cấy lỏng

PGS.TS Dương Tấn Nhựt và cộng sự ở Viện Sinh học Tây Nguyên đã nhân giống thành công Hồng hài - loài lan hài duy nhất trên thế giới có hương thơm, được Tổ chức Bảo vệ động thực vật hoang dã thế giới đưa vào danh mục thực vật cần bảo vệ bởi chỉ phân bố hẹp ở Việt Nam, khó sống, khó sinh sản

Theo PGS TS.Dương Tấn Nhựt, thành phố Đà Lạt là cỗ máy điều hòa khổng

lồ cho phép sản xuất địa lan trong tự nhiên theo hướng công nghiệp với chi phí sản

Trang 6

xuất chỉ bằng 1/10 so với các quốc gia phải trồng lan trong nhà kính, có hệ thống điều hòa nhiệt độ

Lan Đà Lạt đã và đang mở rộng thị trường ra nhiều châu lục, trong đó có những thị trường khó tính như Mĩ, Nhật Bản, Đài Loan… Nhiều doanh nghiệp trong và ngoài nước đang tiến hành khảo sát lập trang trại sản xuất hoa lan quy mô lớn bởi tiềm năng, triển vọng đầu tư tại Đà Lạt là rất lớn so với Trung Quốc và các nước ASEAN khác

1.1.2 Sơ lược về lan Oncidium

Lan Vũ Nữ (Oncidium) là một loại lan gồm

khoảng chừng 600 giống phân bố rộng rãi ở Nam

Mỹ, với hình dạng và màu sắc hoa rất đẹp và đa

dạng Loại lan này có những củ bẹ to hoặc nhỏ,

phía trên có 1 hoặc 2 lá

Hình 1.2 Lan vũ nữ đỏ Tùy theo từng giống, có loài có lá dầy và cứng, có loài dài và mềm Dò hoa

có loài dài như Onc falcipetalum, Onc carthagenense, Onc divaricatum v.v… và cũng có những dò hoa ngắn như Onc cheirophorum Mỗi dò mang từ 30 đến 100 hoa và có nhiều giống hoa lớn đến 4-5 cm Oncidium là giống Lan thích nghi được

với biên độ sinh thái khá rộng, nhiệt độ thích hợp là từ 20 – 25 oC

Trang 7

Chi : Oncidium

Loài : Oncidium sp

1.1.2.2 Đặc điểm hình thái của lan

Oncidium

Oncidium có khoảng 750 loài phân bố rộng

rãi nên đặc điểm hình thái đa dạng, với sự phân bố

rộng rãi như vậy nên hoa của các loài lan thuộc

giống Oncidium thường có nhiều màu sắc khác

nhau

* Rễ Lan

Sự đa dạng về hình thái và cấu trúc rễ làm

cho Oncidium phù hợp với nhiều điều kiện sống:

rễ mảnh mai, thân rễ bò dài hay ngắn khi sống ở

đất

Thông thường rễ thường mọc dưới các nách lá cuối cùng đâm sâu xuống đất

hay giá thể Một vài loài Oncidium: Oncidium sphacelatum rễ mọc thành đám rối

dày đặc

* Thân lan

Oncidium thuộc nhóm đa thân (còn gọi là nhóm hợp trục) Thân lan có thể

ngắn hay kéo dài, đôi khi phân nhánh, mang lá Ở nhóm đa thân thì cây vừa có thân vừa có giả hành Giả hành là nơi dự trữ chất dinh dưỡng và nước để nuôi cây

* Giả hành

Giả hành là những đoạn phình, bên trong có các mô mềm chứa dịch nhày làm giảm sự mất nước và dự trữ chất dinh dưỡng để nuôi cấy trong điều kiện khô

Trang 8

hạn khi cây sống bám trên cao Ngoài ra giả hành còn chứa diệp lục tố nên có thể quang hợp được, giả hành có nhiều hình dạng như: hình cầu, thuôn dài, hình trụ xếp chồng lên nhau

* Lá

Hình dạng và cấu trúc lá rất da dạng, lá có hình kim, trụ có rãnh hay phiến mỏng, dạng lá mềm mại, có màu xanh bóng, đậm hay nhạt tùy thuộc vị trí sống của cây Các lá mọc song song nhau và ôm lấy thân giả

* Hoa

Hoa có vòng bao quanh và ba mảnh bao gồm ba cánh đài và ba cánh tràng

Ba cánh đài thường có dạng ba cánh hoa giống nhau hay cánh đài lưng dài hơn cánh đài bên Các cánh đài dựng đứng hay trải ra Ba cánh tràng có hai cánh bên rất giống với cánh đài, rời hay dính với cánh đài bên, cánh tràng giữa còn được gọi là cánh môi, có màu sắc biến đổi sặc sỡ, hấp dẫn côn trùng giúp hoa thụ phấn Sự đa dạng về màu sắc và hình dạng có sự đóng góp của cánh môi rất lớn Cánh môi có

các dạng như nguyên chia thuỳ, khía răng, có tua viền hay chia thành các sợi mảnh

Những bông hoa của giống Oncidium có sắc thái của màu vàng với đốm nâu,

có thể rất dài Các cánh hoa thường xù trên các cạnh, như là môi Môi là rất lớn, một phần ngăn chặn các cánh hoa và đài hoa nhỏ

Một số hoa lan Oncidium là rất dài: Oncidum altissimum và của Oncidium baueri có thể phát triển lên một tầm cao 5 m, trong khi sarcodes Oncidum có thể đạt

tới 3 m

* Trái

Họ Orchidaceae đều có quả thuộc loại quả nang Khi hạt chín, các nang bung

ra chỉ còn đính lại với nhau ở đỉnh và gốc Ở một số loài, khi quả chín không nứt ra nên hạt chỉ ra khỏi vỏ khi quả bị mục nát

Trang 9

* Hạt

Một quả chứa từ 10.000 đến 100.000 hạt Đôi khi đến 3 triệu hạt nên hạt có kích thước rất nhỏ (trước đây phong lan còn được xem là họ tử vi – microspermeae) nên phôi hạt chưa phân hoá Sau 8 - 12 tháng, hạt chín và phát tán nhờ gió Khi gặp nấm cộng sinh tương thích trong điều kiện phù hợp, hạt nảy mầm

1.1.3 Đặc điểm sinh thái của lan Oncidium

1.1.3.1 Ánh sáng

Oncidium là loài ưa ánh sáng nhưng không chịu được ánh sáng trực tiếp,

những giống này có thể trồng dưới ánh đèn được Những giống lá to và dày cần nhiều ánh sáng hơn là những giống lá nhỏ và mềm

Cường độ ánh sáng khoảng 50% Ánh sáng yếu hơn cây vẫn phát triển tốt như thân, lá xanh đẹp, tuy nhiên cho hoa kém Để cây ra hoa tốt cần 70% ánh sáng

1.1.3.2 Nhiệt độ

Về nhiệt độ thì cây phát triển rất tốt ở nhiệt độ 15 – 35oC đây là khoảng nhiệt

độ trung bình và ấm, nếu giảm nhiệt độ xuống dưới 15oC một vài giờ cây không chết nhưng kéo dài cây sẽ không ra hoa, nếu nhiệt độ tăng quá cao cần tăng độ ẩm

và tích cực thông thoáng gió

1.1.3.3 Ẩm độ

Cần ẩm độ trung bình 50 - 70% Oncidium là cây cần ẩm độ cao, đặc biệt

trong thời kỳ tăng vì vậy trong suốt mùa sinh trưởng cây cần được tưới 3 lần/ngày vào mùa khô, 2 lần/ngày trong mùa mưa Mùa nghỉ (sau khi trổ hoa) chỉ cần tưới

nước cho cây một lần/ngày để duy trì sự sống

Trang 10

Nước giúp duy trì độ ẩm trong giai đoạn tăng trưởng Nếu giữ khô ráo giữa

các lần tưới nước sau giai đoạn tăng trưởng sẽ làm cây cứng cáp hơn

Chế độ nước tưới cần cung cấp cho cây là khoảng 2 - 3 ngày tưới một lần tùy thuộc vào điều kiện thời tiết từng ngày, từng mùa trong năm Vào mùa đông trời rét cần giảm số lần tưới nước, nước tưới cũng cần phải sạch sẽ tránh nguồn nước ô nhiễm sẽ làm chết cây

1.1.3.6 Giá thể

Giá thể dùng trồng lan phải xốp, thoáng khí và không giữ nước quá lâu Có thể sử dụng một loại giá thể hoăc trộn các giá thể với nhau như vỏ cây khô, đá núi

lửa, xơ dừa hoặc đá Để trồng lan Oncidium cần ẩm nhưng thoát nước tốt như than

hoặc xơ dừa

Trang 11

1.1.3.8 Phòng trừ sâu bệnh hại

Sâu bệnh hại chủ yếu trên nhóm lan vũ nữ:

- Ốc: Phòng trừ bằng cách sử dụng Deadline 40 (nồng độ theo khuyến cáo), Dioto

- Bệnh thối mềm vi khuẩn: do vi khuẩn Pseudomonas gladioli gây ra Vết bệnh

có hình dạng bất định, ủng nước, màu trắng đục, thường lan rộng theo chiều rộng của lá Gặp thời tiết ẩm ướt mô bệnh bị thối úng, thời tiết khô hanh mô bệnh khô tóp có màu trắng xám, sử dụng 1 trong 3 hỗn hợp: Saipan + Mexyl.MZ, Saipan + Alpine, Mexyl.MZ + Alpine

Tóm lại:

Việc nuôi trồng và chăm sóc hoa lan không thể bỏ qua giai đoạn thay chậu thường thay chậu vào mùa xuân khi cây còn non đã mọc được khoảng một gang tay đây là giai đoạn thay chậu tốt nhất, dùng vỏ cây loại nhỏ cho các giống cây có rễ nhỏ và những giống có rễ lớn dùng vỏ cây loại trung bình, nén chặt vỏ cây vào chậu trồng sao cho cây đứng thẳng, vững giữ độ ẩm cao và ngừng tưới nước đến khi cây

ra rễ, một số loài lá cứng, dầy như Oncidium mule ears hay Oncidium amplitum…vv

có thể buộc chặt chúng vào các vỏ cây và thân cây, sau một thời gian chúng bám vào thân cây và hút chất dinh dưỡng từ đó

Đối với loài lan vũ nữ hoa có thể nở vào tất cả các mùa trong năm, chúng ưa bóng mát nên tránh để ngoài trời

Công việc tưới phân và tưới nước phải được tiến hành vào buổi sáng sớm hoặc chiều mát nên tưới nước trước khoảng 15 phút sau đó mới tưới phân để cây hấp thụ tốt

Tưới đúng liều lượng nếu không cây sẽ chết hoặc rụng lá

Trang 12

1.2 Nhân giống vô tính in vitro

1.2.1 Khái niệm

Nhân giống in vitro hay nuôi cấy mô đều là thuật ngữ mô tả các phương

pháp nuôi cấy các bộ phận thực vật trong ống nghiệm có chứa môi trường dinh dưỡng trong điều kiện vô trùng (Dương Công Kiên, 2003) Môi trường có chứa các chất dinh dưỡng thích hợp như muối khoáng, vitamin, các hormone tăng trưởng và đường

Kỹ thuật nuôi cấy mô cho phép tái sinh chồi hoặc cơ quan (sự phát sinh cơ quan) từ các mô như: lá, thân, hoa hoặc rễ

Trước kia người ta thường dùng phương pháp nuôi cấy tế bào và mô thực vật

để nghiên cứu về đặc tính cơ bản của tế bào như sự phân chia, sự di truyền và tác dụng của các hóa chất đối với tế bào và mô trong quá trình nuôi cấy (Dương Công Kiên, 2003) Ngày nay phương pháp nuôi cấy mô thực vật đã hướng về những ứng dụng thực tiễn, vì nó liên hệ mật thiết với các giống cây trồng

1.2.2 Lịch sử

Những mốc chính trong lịch sử phát triển của công nghệ tế bào thực vật:

- 1665, Robert Hooke quan sát được tế bào sống dưới kính hiển vi và đưa ra khái niệm tế bào

- 1838, Matthias Schleiden và Theodore Schwann đề xướng học thuyết tế bào

- 1902, Haberlandt lần đầu thí nghiệm nuôi cấy mô cây một lá mầm trong ống nghiệm nhưng không thành công

- 1922, Kotte (học trò của Haberlandt) và Robbins đã thành công trong việc lặp lại thí nghiệm của Haberlandt

- 1926, FW Went chứng minh trong lá bao mầm của lúa mạch có mặt các chất sinh trưởng

- 1934, White thành công khi nuôi cấy mô rễ cà chua trong thời gian dài Kogl

F và cộng sự xác định loại hormone thực vật đầu tiên là IAA

- 1939, Gautheret, Nobecourt và White lần đầu tiên nuôi cấy mô sẹo thành công trong thời gian dài từ mô thượng tầng ở cà rốt và cây thuốc lá

Trang 13

- 1940, Gautheret nghiên cứu sự hình thành chồi bất định trong nuôi cấy mô tế bào thượng tầng cây Ulmus

- 1941, Overbeek và cộng sự đã sử dụng nước dừa trong nuôi cấy phôi non ở

- Có khả năng tái sinh cây con từ các vùng mô và các cơ quan khác nhau của cây như trục thân, lóng thân, phiến lá, cuống lá, chồi phát hoa… mà ngoài tự nhiên không thể thực hiện được

- Nhân nhanh với hệ số nhân giống cao, sản xuất được số lượng lớn cây giống trong thời gian ngắn nhằm đáp ứng nhu cầu cho những người trồng thương mại Từ một cây trong vòng 2 - 3 năm có thể tạo thành hàng triệu cây

- Sản phẩm cây đồng nhất: vi nhân giống về cơ bản là công nghệ nhân dòng

Nó tạo ra quần thể có độ đều cao dù xuất phát từ cây mẹ có kiểu gen dị hợp hay đồng hợp

- Tạo được dòng toàn cây cái (cây chà là) hay toàn cây đực (cây măng tây) theo mong muốn

- Tiết kiệm thời gian: mật độ cây tạo ra trên một đơn vị diện tích lớn hơn rất nhiều so với sản xuất trên đồng ruộng và trong nhà kính theo phương pháp truyền thống

- Dễ dàng vận chuyển

Trang 14

- Sản xuất quanh năm và chủ động kiểm soát được các yếu tố ngoại cảnh, không phụ thuộc mùa vụ

Vì nhân giống được xem là công cụ tối ưu phục vụ cho công nghệ di truyền Giảm được nhiều công sức chăm sóc, nguồn mẫu dự trữ lâu dài và chiếm ít không gian so với phương pháp nhân giống truyền thống

- Hiện tượng biến đổi kiểu hình: do hiện tượng biến dị tế bào soma Tỉ lệ biến

dị thường thấp ở giai đoạn đầu nhân giống, nhưng sau đó có chiều hướng tăng lên khi nuôi cấy kéo dài và tăng hàm lượng các chất kích thích sinh trưởng

- Quá trình nhân giống phức tạp gồm nhiều giai đoạn liên quan và cần khoảng thời gian dài trước khi có thể thích ứng trồng ngoài vườn ươm

1.2.4 Các bước trong kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật

- Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

- Tạo thể nhân giống in vitro

- Nhân giống in vitro

- Tái sinh thành cây hoàn chỉnh in vitro

- Chuyển cây ra vườn ươm để thuần hóa

- Nhân giống in vitro

- Tạo cây con bầu đất

- Đưa các cây ra đồng ruộng

- Chọn lọc cây đầu dòng

Trang 15

♦ Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

Hình 1.4 Sơ đồ lát cắt dọc đỉnh sinh trưởng chồi lan

Mẫu được nuôi cấy thường còn ở giai đoạn non, quá trình phân chia và phân hóa mạnh Đỉnh sinh trưởng và chồi bên được sử dụng ở hầu hết các loại cây trồng Ngoài ra, chồi đỉnh và chồi non của hạt mới nảy mầm cũng được sử dụng Đỉnh sinh trưởng nhỏ được tách bằng kính lúp Môi trường được sử dụng rộng rãi trong nhân giống hiện nay là môi trường MS Đối với mẫu dễ bị hóa nâu môi trường thường được bổ sung than hoạt tính hay ngâm mẫu với hỗn hợp ascorbic acid và citric acid (25 - 150 mg/l)

♦ Tạo thể nhân giống in vitro

Mẫu nuôi cấy được cấy trên môi trường chọn lọc đặc biệt nhằm mục đích tạo

thể nhân giống in vitro Có hai thể nhân giống in vitro: thể chồi (multiple shoot) và thể cắt (cutting) đốt ngoài ra còn có thể giò (protocorm) Tạo thể nhân giống in vitro

dựa vào đặc điểm nhân giống ngoài tự nhiên của cây trồng Tuy nhiên có những cây trồng không có khả năng nhân giống người ta thường nhân giống bằng cách tạo cụm chồi bằng mô sẹo Để tạo thể nhân giống trong môi trường thường bổ sung Cytokinin, Auxin, GA3 và các chất hữu cơ khác

♦ Nhân giống in vitro

Là giai đoạn quan trọng trong việc nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật nhằm mục đích tăng sinh khối thể nhân giống Vật liệu

Trang 16

nuôi cấy là những thể chồi, đôi khi nồng độ chất sinh trưởng giảm thấp cho phù hợp với quá trình nuôi cấy kéo dài Điều kiện nuôi cấy thích hợp giúp cho quá trình

tăng sinh được nhanh chóng Cây nhân giống in vitro có trạng thái sinh lý trẻ và

được duy trì trong thời gian vô hạn

♦ Tái sinh cây hoàn chỉnh in vitro

Đây là giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh có đầy đủ thân lá và rễ chuẩn bị chuyển ra vườn ươm Cây con phải khỏe mạnh nhằm nâng cao sức sống khi ra ngoài môi trường bên ngoài Các chất có tác dụng tạo chồi được loại bỏ thay vào đó

là các chất kích thích quá trình tạo rễ Điều kiện nuôi cấy tương tự với quá trình nuôi cấy ngoài tự nhiên, một bước thuần hóa trước khi được tách ra khỏi điều kiện

in vitro Thường dung các chất thuộc nhóm auxin kích thích ra rễ

♦ Chuyển cây in vitro ra vườn ươm

Đây là giai đoạn khó khăn nhất trong quá trình nhân giống vô tính Cây in vitro được nuôi cấy trong điều kiện ổn định về dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ Khi

chuyển ra đất với điều kiện tự nhiên hoàn toàn khác hẳn, cây con dễ bị mất nước, mau bị héo Để tránh tình trạng này, vườn ươm nuôi cấy mô phải mát, cường độ chiếu sáng thấp, nhiệt độ không khí mát, độ ẩm cao… Cây con thường được cấy trong luống ươm có cơ chất dễ thoát nước, tơi xốp giữ được ẩm Trong những ngày đầu cần được phủ nilon để giảm quá trình thoát hơi nước Rễ được tạo ra trong quá trình nuôi cấy mô sẽ dần lụi đi và rễ mới xuất hiện Cây con thường được xử lý với chất kích thích ra rễ bằng cách ngâm hay phun lên lá để rút ngắn thời gian ra rễ

♦ Nhân giống in vitro

Cây con sau khi được chuyển ra luống ươm hay cấy vào bầu đất sau 7 - 10 ngày thì bắt đầu ra rễ Sau đó được phun dinh dưỡng với hỗn hợp N, P, K (1g/l cho

mỗi loại) Tuy nhiên do quá trình nhân giống in vitro có nhiều tốn kém thì cây con

được sử dụng như là cây mẹ và được tiếp tục nhân giống trên luống ươm Điều kiện nhân giống trên luống ươm phải tiếp tục đảm bảo cây mẹ ở trạng thái bằng cách điều kiện khống chế bằng cách giảm dinh dưỡng, duy trì độ ẩm cao, nhiệt độ không khí thấp… Hệ số nhân giống trên luống ươm phải tiếp tục đảm bảo cây mẹ ở trạng

Trang 17

thái cân bằng, khống chế bằng cách giảm dinh dưỡng, duy trì độ ẩm cao, nhiệt độ không khí thấp… Hệ số nhân giống trên luống ươm càng cao giúp cho việc giảm giá thành càng có ý nghĩa

♦ Cây con bầu đất

Cây con từ ống nghiệm hay được nhân giống trên luống ươm được cấy trên luống đất 15 - 20 ngày cho cây ra rễ và phát triển khỏe, sau đó được cấy vào bầu đất (cây chuối) Bầu đất có cơ chất xốp đầy đủ chất dinh dưỡng tỉ lệ đất/phân là 1/1, ngoài ra hàng tuần được phun dinh dưỡng khoáng 1 - 2 lần/tuần thường dùng phân khoáng có tỉ lệ N - P - K: 20-20-20 Thời gian cây con ở giai đoạn bầu đất phụ thuộc đặc điểm cây trồng khoảng 20 ngày (khoai tây) đến 2,5 tháng (cây chuối) Cây bầu đất được đặt ở nơi có nhiều ánh sáng, độ ẩm cao, nhiệt độ không khí mát

để cây phát triển nhanh và khỏe

♦ Chọn lọc cây đầu dòng

Là vấn đề quan trọng đối với cây ăn trái nhằm tạo ra một quần thể đồng đều

có năng suất cao và ổn định Những cây được chọn đầu dòng được đưa vào nhân giống trở lại bằng nuôi cấy mô

Hiện tại công nghiệp nhân giống được ứng dụng nhiều trong kinh tế để giải quyết nhu cầu về giống cho sản xuất, giống cho cây lâm nghiệp, trồng rừng, rau, ngũ cốc, cây ăn trái, hoa và cây dược liệu

1.2.5 Các phương pháp nhân giống in vitro

- Gieo hạt in vitro

- Nhân giống bằng chồi nách

- Nhân giống bằng chồi đỉnh

- Nhân giống bằng chồi bất định

- Nhân giống qua nuôi cấy mô sẹo

- Nhân giống bằng các đoạn giả hành

- Nuôi cấy bao phấn và hạt phấn

- Nuôi cấy tế bào trần (protoplast)

Trang 18

1.2.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô thực vật

1.2.6.1 Ảnh hưởng của mẫu cấy

- Kiểu di truyền

- Tuổi của cây

- Tuổi của mô và cơ quan

- Tình trạng sinh lí

- Vị trí của mẫu cấy trên cây

- Kích thước mẫu cấy

- Vết thương

- Phương pháp cấy

Không có hướng dẫn cụ thể trong việc chọn mô cấy Về nguyên tắc, trừ những mô cấy đã hóa gỗ, các mô khác trong cơ thể thực vật đều có thể làm mô cấy Tuy nhiên, có thể nhận xét chung là các mô đang phát triển, thịt quả non, lá non, cuống hoa, đế hoa, mô phân sinh khi đặt vào môi trường có chứa một lượng chất sinh trưởng thích hợp đều có khả năng phân chia và phân hóa Để bắt đầu nghiên cứu nhân giống vô tính một cây nhất định, trước tiên phải chú ý đến các chồi nách

và mô phân sinh ngọn

Tuy mang một lượng thông tin di truyền như nhau, các mô khác nhau trên cùng một cây có thể sinh trưởng và phát triển với khả năng tái sinh chồi, rễ hay cây hoàn chỉnh rất khác nhau

Vì vậy, khi khởi sự chọn giống, nhân giống một cây cụ thể bằng phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật, trước hết cần thí nghiệm tìm hiểu phản ứng của các bộ phận khác nhau của cây trong nuôi cấy ở các nồng độ chất sinh trưởng khác nhau

Sau khi cấy, mô cấy cần được đặt trong điều kiện nhiệt độ và ánh sáng ổn định Tùy vào các mục đích nghiên cứu mà có các chế độ chiếu sáng khác nhau, chẳng hạn quá trình tạo callus có thể cần bóng tối hoặc chiếu sáng nhưng quá trình tái sinh và nhân giống vô tính nhất thiết cần ánh sáng Nhiệt độ phòng nuôi nên giữ

ổn định bằng máy điều hòa nhiệt độ Cường độ chiếu sáng khoảng 2000 - 3000 lux

Trang 19

♦ Một số điểm cần lưu ý

- Các dụng cụ dùng cho thí nghiệm nuôi cấy mô sau khi tiệt trùng ở nồi khử trùng đều phải được tiệt trùng sau mỗi lần dùng đến bằng cách nhúng vào cồn 90orồi hơ trên ngọn lửa đèn cồn

- Trước khi cấy, phải vệ sinh toàn bộ khu vực cấy bằng cồn 70o

- Nên để số mẫu cấy trong đĩa petri từ 4 - 5 mẫu, tránh để nhiều không kịp cấy

sẽ bị khô

- Cồn dùng để đốt dụng cụ phải được thay sau mỗi đợt cấy

1.2.6.2 Ảnh hưởng của môi trường

Khi bắt đầu nuôi cấy mô và tế bào một số đối tượng nhất định, vấn đề đặt ra

là chọn môi trường nào và trên cơ sở nào để phối hợp tỉ lệ các chất dinh dưỡng Cách thường làm là qua các tài liệu đã xuất bản, xem các tác giả nuôi cấy mô trên cùng đối tượng ấy hoặc các đối tượng gần gũi về mặt phân loại đã dùng môi trường

gì Bước đầu có thể giữ nguyên môi trường của các tác giả đó hoặc trên cơ sở đó mà cải tiến cho phù hợp

Trong hàng trăm môi trường do nhiều tác giả đề nghị cho nhiều loại cây khác nhau, nhiều mục đích khác nhau, có thể chia ra làm 3 loại:

- Môi trường nghèo dinh dưỡng: Môi trường White, Knop, Knudson C

- Môi trường trung bình: Môi trường B5 của Gamborg

- Môi trường giàu dinh dưỡng: Môi trường Murashige và Linsmaier - Skoog

Vì vậy, khi bắt đầu nghiên cứu nuôi cấy mô một số đối tượng mới, chưa có tài liệu trước thì nên thăm dò so sánh ba loại môi trường trên xem đối tượng nghiên cứu thích hợp với môi trường nào nhất

Hiện nay, môi trường MS được coi là môi trường thích hợp với nhiều loại cây Vì vậy, người mới bắt đầu nuôi cấy thường bắt đầu với môi trường này trước khi tìm ra được môi trường riêng của mình

Trang 20

1.2.6.3 Đảm bảo điều kiện vô trùng

♦ Vô trùng mô nuôi cấy

Mô nuôi cấy có thể là hầu hết các bộ phận khác nhau của thực vật như hạt giống, phôi, noãn sào, đế hoa, lá, đỉnh sinh trưởng, đầu rễ, thân củ… Tùy theo sự tiếp xúc với điều kiện bên ngoài, các bộ phận này chứa ít hay nhiều vi khuẩn và nấm Hầu như không thể vô trùng mô nuôi cấy được nếu nấm khuẩn nằm sâu ở các

tế bào bên trong chứ không hạn chế ở bề mặt

Phương thức vô trùng mô nuôi cấy thông dụng nhất hiện nay là dùng các hóa chất có hoạt tính diệt nấm khuẩn Hiệu lực diệt nấm khuẩn của các chất này phụ thuộc vào thời gian xử lí, nồng độ và khả năng xâm nhập của chúng vào các kẻ ngách lồi lõm trên bề mặt mô nuôi cấy, khả năng đẩy hết các bọt khí bám trên bề mặt mô nuôi cấy

Để tăng tính linh động và khả năng xâm nhập của chất diệt khuẩn, thông thường người ta xử lí mô nuôi cấy trong vòng 30 giây trong cồn 70o sau đó mới xử

lí trong dung dịch diệt khuẩn

Các chất kháng sinh trên thực tế ít được sử dụng vì tác dụng không triệt để

và có ảnh hưởng xấu ngay lên sự sinh trưởng của mô cấy

Trong thời gian xử lí, mô cấy phải ngập hoàn toàn trong dung dịch diệt khuẩn Đối với các bộ phận thực vật có nhiều bụi đất, trước khi xử lí nên rửa kĩ bằng xà phòng dưới dòng nước chảy Khi xử lí xong, mô cấy được rửa nhiều lần bằng nước cất vô trùng (3 - 5 lần) Những phần trên mô cấy bị tác nhân vô trùng làm cho trắng ra cần phải cắt bỏ trước khi đặt mô cấy lên môi trường Để tránh ảnh hưởng trực tiếp của các tác nhân vô trùng lên mô cấy, nên chú ý để lại một lớp bọc ngoài khi ngâm mô vào dung dịch diệt khuẩn Lớp cuối cùng này sẽ được cắt bỏ hoặc bóc đi trước khi đặt mô cấy lên môi trường

Vô trùng mô cấy là một thao tác khó, ít khi thành công ngay lần đầu Tuy nhiên nếu kiên trì tìm được nồng độ và thời gian vô trùng thích hợp thì sau vài lần thử, chắc sẽ đạt kết quả

Trang 21

♦ Vô trùng nơi thao tác cấy và tủ cấy vô trùng

Nguồn nhiễm tạp quan trọng và thường xuyên nhất là bụi rơi vào dụng cụ thủy tinh chứa môi trường trong khi mở nắp hoặc nút bông để thao tác cấy

Buồng cấy thường có diện tích hẹp, rộng từ 10 – 15 m2, có 2 lớp cửa để tránh không khí chuyển động từ bên ngoài vào Sàn và tường lát gạch men để có thể lau chùi thường xuyên Trước khi đưa vào sử dụng, buồng cấy cần được xử lí hơi formol bằng cách rót formaldehyde (formalin) 4 % ra một số nắp đĩa petri để rải vài nơi trong phòng cho bốc hơi tự do Đóng kín cửa phòng cấy trong 24h, sau đó bỏ formaldehyde đi, khử hơi formaldehyde thừa bằng dung dịch NH3 25% trong 24h Mặt bàn cấy, trước khi làm việc phải lau mặt bàn bằng cồn 70o

Các dụng cụ mang vào buồng cấy phải vô trùng trước: áo choàng, mũ vải, khẩu trang của người cấy, đến dao, kéo, forceps, giấy lọc, bình đựng nước cất… Trên bàn thường xuyên có 1 đèn cồn(hay đèn gas) để sử dụng khi cấy và một cốc đựng đèn cồn 90o để nhúng các dụng cụ làm việc

Trước khi cấy, người cấy cần rửa tay bằng xà phòng và lau kĩ đến khuỷu tay bằng cồn 70o Để đảm bảo mức độ vô trùng cao trong phòng cấy cần có một đèn tử ngoại 40W treo trên trần Chỉ cho đèn này làm việc khi không có người trong phòng cấy Nên bật đèn tử ngoại 30 phút trước khi cấy Cần giảm sự chuyển động của không khí trong buồng cấy đến mức tối thiểu, vì vậy tất cả các dụng cụ phục vụ cấy đều phải chuẩn bị đầy đủ để trong khi cấy tránh đi lại

1.2.7 Những vấn đề thường gặp trong nuôi cấy mô

Trang 22

trong điều kiện vô trùng thì không phải dễ Môi trường bên ngoài luôn có rất nhiều

vi sinh vật bám trên bề mặt, các rãnh nhỏ, nách lá, lớp vẩy… của cây mẹ, đây là nơi

cư ngụ khá vững chắc mà chất khử trùng không dễ tiếp xúc được chúng Đặc biệt,

vi khuẩn thường nhiễm vào hệ thống mô mạch và gây nhiễm môi trường sau 1 tuần nuôi cấy Nhiễm khuẩn trong trường hợp này thường gây những vệt trắng sữa xuất phát từ mô cấy và quan sát rõ nhất khi xem từ dưới đáy chai nuôi cấy Vài loài vi

khuẩn thường gây nhiễm: Acinebacter, Aerococcus, Agrobacterium, Bacillus, Clostridium, Curtobacterium, Erwinia, Pseudomonas…

- Điều kiện trồng cây mẹ và vị trí lấy mẫu từ cây mẹ là yếu tố quan trọng thiết lập quá trình nuôi cấy sạch Cây trồng trong nhà kính ít nhiễm vi sinh vật hơn ngoài đồng ruộng Các bộ phận như rễ, củ, thân bò thì thường khó làm sạch hơn các bộ phận khác

- Môi trường không khí phòng sáng, phòng cấy gây nhiễm nghiêm trọng nếu không được xử lý kịp thời, nấm thường là nguyên nhân gây nhiễm chính trong trường hợp này Nấm thường tồn tại dạng bào tử lơ lửng trong không khí, khi phòng nuôi có nhiều người ra vào tạo điều kiện tích lũy vi sinh vật càng nhiều Nếu màng lọc tủ cấy không tốt sẽ gây nhiễm mẫu hàng loạt ngay trong quá trình cấy Ngoài ra, bào tử nấm còn tấn công gây nhiễm những chai môi trường chưa sử dụng hoặc

những bình đã được nuôi 2 - 3 tháng Các loài nấm thường gặp: Aspergillus, Candida, Cladosporium, Microsprium và Phialophra

- Côn trùng, đặc biệt là ve bét là mối nguy hiểm, chúng có nhiều loài khác

nhau: Dermataphagoides pteronyssimus, Dermataphagoides farinae và Tyropharus putrescentiae… Ve bét có thể sống trong ống dẫn của máy điều hòa không khí, góc

phòng, dưới kệ nuôi cấy Nó hoạt động tích cực hơn vào lúc xế chiều ở những nơi

có độ ẩm và chất hữu cơ Vòng đời của chúng kéo dài 2 tuần Khi cấy, ta thường không phát hiện nhiễm chúng, nhưng sau vài ngày ta sẽ thấy những rãnh đường trên

bề mặt bình nuôi cấy và trên bề mặt môi trường, đó là đường di chuyển của chúng

Ve bét xâm nhập vào vào bình nuôi cấy bằng cách chui qua các khe hở miệng bình, khi chúng xâm nhập chúng cũng mang theo nấm làm bình nuôi cấy vừa nhiễm nấm

Trang 23

và ve bét cùng lúc Một điều thường thấy là mẫu cấy bị thối nhũn và chết khi chúng xâm nhập sau khoảng 2 tuần

♦ Tính bất định về mặt di truyền

Kỹ thuật nhân giống vô tính áp dụng với mục đích tạo quần thể cây trồng đồng nhất với số lượng lớn nhưng phương pháp cũng tạo ra những biến dị tế bào soma qua nuôi cấy mô sẹo Những biến dị này cũng là cơ sở nghiên cứu ứng dụng vào cải thiện giống cây trồng nhưng thực tế có rất ít biến dị có lợi được báo cáo

Tần số biến dị thì hoàn toàn khác nhau và không lặp lại (Creissen and Karp 1985;

Fish and Karp 1986) Nuôi cấy mô sẹo cho biến dị nhiều hơn nuôi cấy chồi đỉnh Cây trồng bị biến dị dòng soma qua nuôi cấy thường là biến dị về chất lượng, số lượng và năng suất và biến dị này không di truyền Đến nay việc gây ra biến dị chưa được làm sáng tỏ nhưng được đồng ý nhất là do thay đổi vị trí DNA Nhân tố thường gây ra biến dị tế bào là số lần cấy chuyền Số lần cấy chuyền càng nhiều càng cho độ biến dị cao Biến dị nhiễm sắc thể nhiều hơn khi nuôi cấy kéo dài (Amstrong and Phillips, 1988) Số lần cấy chuyền ít và thời gian giữa hai lần cấy chuyền ngắn làm giảm sự biến dị

♦ Việc sản xuất các chất gây độc từ mẫu cấy

Thường chúng ta hay thấy hiện tượng hóa nâu hay hoá đen mẫu làm sinh trưởng của mẫu bị ngăn chặn hay hư mẫu Hiện tượng này là do mẫu nuôi cấy có chứa các hợp chất Tannin và Hydroxyphenol, có nhiều trong mô già hơn trong mô

non Các phân tử Phenol làm nâu mẫu Cattleya là Eucomic acid và Tyramine Có

vài phương pháp làm giảm sự hóa nâu mẫu:

- Than hoạt tính đưa vào môi trường giúp ngăn cản quá trình hóa nâu hay đen,

đặc biệt có hiệu quả trên các loài phong lan Phalaenopsis, Cattleya và Aerides với

nồng độ thường dùng 0,1 – 0,3 % Tuy nhiên than hoạt tính cũng làm chậm quá trình phát triển của mô do hấp thu các chất kích thích tăng trưởng và các chất khác

- Polyvinylpyrolidone (PVP), một chất thuộc loại polyamide hấp thu phenol qua vòng hydrogen ngăn chặn sự hóa nâu ở nhiều loại cây trồng khác nhau

Trang 24

- Giảm sự hóa nâu bằng cách cho các chất khử quá trình oxy hóa vào môi trường ngăn chặn quá trình oxy hóa phenol, chất khử thường được dùng như ascorbic acid, citric acid, L-cystein hydrochloride, ditheithreitol, glutathione và mecaptoethanol

Để hạn chế ảnh hưởng phenol các nhà khoa học đưa ra một số phương pháp khi thao tác trên mẫu:

- Sử dụng mẫu nuôi cấy nhỏ từ mô non

- Ngâm mẫu vào dung dịch ascorbic acid, citric acid vài giờ trước khi cấy

- Nuôi cấy mẫu trong môi trường lỏng, oxy thấp, không có đèn 1 - 2 tuần

♦ Hiện tượng thủy tinh thể

Trong nuôi cấy mô cũng thường gặp hiện tượng thủy tinh thể mẫu nuôi cấy Khi chuyển ra khỏi bình nuôi cấy, cây con dễ bị mất nước và tỷ lệ sống sót thấp Dạng này thường thấy khi nuôi cấy trên môi trường lỏng hay môi trường bán rắn, đặc biệt khi sự trao đổi khí thấp, quá trình thoát hơi nước tập trung trong cây

Để hạn chế quá trình thủy tinh thể một phương pháp hiệu quả nhất được nhiều người ủng hộ là làm giảm ảnh hưởng của hàm lượng nước trong môi trường nuôi cấy bằng cách:

- Tăng nồng độ đường và tạo điều kiện môi trường nuôi (nhiệt độ, ánh sáng, trao đổi khí) thích hợp

- Giảm nồng độ các chất chứa nitơ trong môi trường

- Giảm sự sản sinh ethylene trong bình nuôi cấy

- Xử lí acid absixic hay một số chất ức chế sinh trưởng

- Tăng cường độ ánh sang và giảm nhiệt độ phòng nuôi

1.3 Thành phần môi trường nuôi cấy

Thành công chính trong các thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào thực vật là tìm

ra thành phần vật chất của môi trường dinh dưỡng cần thiết để tế bào có thể sinh trưởng và phát triển được Thành phần của môi trường dinh dưỡng thay đổi theo loài và bộ phận nuôi cấy, tùy theo sự phát triển và phân hóa của mô cấy, tùy theo

Trang 25

việc muốn duy trì mô ở trạng thái callus, muốn tạo rễ, tạo mầm hay muốn tái sinh cây hoàn chỉnh

Người ta đã đưa ra đất nhiều loại môi trường khác nhau cho các thí nghiệm nuôi cấy mô Đa số chúng có tính đặc hiệu cao, có nghĩa là chúng được nghiên cứu

ra để nuôi cấy những mô đặc hiệu nào đó Một số môi trường khác có ứng dụng rộng hơn và đảm bảo sinh trưởng tốt cho nhiều loài cây, tuy nhiên không có những chỉ dẫn chung nào cho rằng môi trường nào trong chúng đảm bảo sinh trưởng tốt hơn Để bắt đầu, cần phải thử trong những môi trường thông dụng nào đó, chẳng hạn môi trường MS nếu không thành công thì sau đó thử trên các môi trường khác

Tuy vậy, tất cả những môi trường nuôi cấy thì bao giờ cũng gồm 5 thành phần chính:

- Các muối khoáng đa lượng và vi lượng

- Các vitamin

- Các amino acid

- Nguồn carbon: đường

- Các chất điều khiển sinh trưởng

- Các chất hữu cơ bổ sung: nước dừa, lòng trắng trứng , lòng đỏ trứng , dịch chiết cá nục , sữa tươi

- Agar

1.3.1 Các khoáng vô cơ

Với MS: Murashige và Skoog (1962); White (1963); B5: Gamborg (1968); N6: Nitsch và Nisch (1969); WP: Loyd và McCown (1980)

1.3.1.1 Nhóm đa lượng

Nhu cầu muối khoáng của mô và tế bào thực vật tách rời không khác nhiều

so với cây trồng trong điều kiện tự nhiên Trong nhóm này gồm 3 nguyên tố chính:

N, P, K

Trang 26

♦ Đạm

Đạm giữ vai trò tạo lập protein cho cây, giúp hình thành cơ quan, thân, lá, rễ phát triển, giúp cho quá trình quang hợp mạnh Thiếu đạm, cây nhợt nhạt, ốm yếu, sinh trưởng kém, cằn cỗi… Để cung cấp nguồn đạm ta dùng những chất sau:

- CO(NH2)2 : Urea (46% N)

- (NH4)2SO4 : Ammonium sulphate (22% N)

- KNO3 : Potassium nitrate (14% N)

- NH4NO3 : Ammonium nitrate (34% N)

- NaNO3 : Sodium nitrate (16,4% N)

- Ca(NO3)2 : Calcium nitrate (15,5% N)

♦ Lân (P)

Lân giúp cây hô hấp và quang hợp, tạo sự hấp thu đạm được dễ dàng Lân giúp cây ra hoa, rễ, hoa lâu rụng… Các chất cung cấp lân:

- Super lân (20% P2O5)

- (NH4)2HPO4 : Diamonium phosphate DAP (46% P2O5)

- (NH4)3HPO4.3H2O : Trianium phosphate (15,21% P)

- KH2PO4 : Phosphate potassium (10,35% P)

♦ Kali (K)

Kali giúp tạo các bó mạch trong cây, giúp cây đứng thẳng, cứng cáp, chắc… Các chất cung cấp kali như:

- KCl : Potassium chlorua (60% K2O)

- K2SO4 : Potassium sulphate ( 48% K2O)

- KNO3 : Potassium nitrate (44% K2O)

- KH2PO4 : Phosphate ( 40% K2O)

♦ Calcium (Ca)

Calcium giúp tạo vách tế bào, giúp cây cứng chắc… Các chất cung cấp Ca như: CaCl2, Ca(NO3)2 Đối với các chất chứa Ca không nên hòa tan với các chất khác vì dễ gây kết tủa, cây không hấp thu hiệu quả Cây thừa Ca sẽ hấp thu đạm

Trang 27

nhiều, trở nên quá mập, tàn lá rợp xuống, dễ gãy Thừa Ca, cây ít hấp thu đạm làm cho cây không phát triển rễ, lá nhỏ lại, cây ốm yếu không đứng thẳng được

♦ Magnesium (Mg)

Magnesium thành phần tạo nên diệp lục tố cho cây, làm lá cây phát triển, lá xanh Có thể dùng MgSO4 hay MgHPO4 để cung cấp cho cây Nếu dư, lá sẽ có màu xanh đậm nhưng đọt non lại bị héo khô Thiếu Mg, bộ rễ sẽ phát triển to, mập nhưng thân lá èo uột, không cân đối giữa rễ và thân lá

♦ Sulfur (S)

Sulfur là thành phần của tế bào chất giúp cây tăng trưởng Thường S có chứa sẵn trong các chất có gốc SO4 như K2SO4, MgSO4… Thiếu S thì cây cằn cỗi, lá vàng, cây ốm yếu, thiếu sức sống

♦ Đồng (Cu)

Thiếu đồng dễ làm ngọn lá khô, cây không phát triển, ra chồi nhiều ở dưới gốc, lá bạc tái, mất màu xanh và đầu lá đốm trắng rồi héo khô Dùng CuSO4 để cung cấp cho cây

♦ Kẽm (Zn)

Kẽm giữ vai trò sản sinh tổng hợp protein và auxin Thiếu Zn làm thân ngắn lại, lá mọc chụm ở đầu Nguyên nhân là do tưới thúc phân lân quá nhiều để kích thích ra hoa Có thể dùng ZnSO4 để cung cấp Zn cho cây, đồng thời giảm tưới lân

♦ Mangan (Mn)

Thiếu mangan lá vàng nhạt, ở lá già thường có chấm vàng Dùng MnSO4 để cung cấp Mn cho cây

Trang 28

♦ Molyden (Mo)

Mo giúp điều hòa tăng trưởng của cây Có thể dùng Na2MoO4 (Sodium Molypdate) để cung cấp Mo cho cây

1.3.2 Vitamin

Thực vật cần vitamin để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau Khi tế

bào và mô được nuôi cấy in vitro thì một vài vitamin trở thành yếu tố giới hạn sự

phát triển của chúng Tất cả các tế bào nuôi cấy đều có khả năng tổng hợp các vitamin cần thiết cho sự tăng trưởng và phát triển của chúng, nhưng thường là với

số lượng dưới mức yêu cầu Nên phải bổ sung thêm vào môi trường một hay nhiều loại vitamin Các vitamin được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là thiamine (B1), acid nicotinic (PP), pyridoxine (B6) và myo - inositol

Ngoài ra còn có: biotin, acid folic, panthotheic acid, vitamin E (tocopherol), riboflavin… cũng được sử dụng trong một số môi trường nuôi cấy

Nhu cầu vitamin trong môi trường nuôi cấy nói chung không quan trọng và cũng không cản trở sự tăng trưởng của tế bào Các vitamin này được thêm vào môi trường chỉ khi nồng độ thiamin thấp hơn nhu cầu cần thiết hoặc để cho huyền phù tế bào có thể tăng trưởng khi mật độ tế bào khởi đầu thấp

♦ Vitamin B 1 (Thiamin.HCl)

Thiamin là một vitamin căn bản cần thiết cho sự tăng trưởng của tất cả các tế bào Thiamin thường được sử dụng với nồng độ từ 0,1 - 10 mg/l Khi khử trùng bằng cách hấp ở nhiệt độ cao vit B1 bị nhiệt phân thành pyrimidin và thiazol là hai cấu tử của vit B1, nhưng tế bào nuôi cấy có khả năng tổng hợp lại chúng thành phân

tử vit B1

♦ Vitamin B 2 (Riboflavin, Lactoflavin)

Có thể khử trùng bằng nhiệt, nhưng lại dễ bị ánh sáng phân hủy Đối với nuôi cấy sáng chỉ dùng nồng độ 0,01 ppm, nhưng nuôi cấy tối có thể tăng lên 10 -

50 ppm

Trang 29

♦ Vitamin B 6 (Pyridoxine, Adermin)

Là tiền chất của pyridoxal – phosphate - cofactor của các nhóm enzyme như carboxylase và transaminase Khi khử trùng ở nhiệt độ cao xảy ra phản ứng: Pyridoxin + Phosphate -> Pyridoxalphosphate

♦ Myo-Inositol (Bios I)

Inositol thường được nhắc đến như một vitamin kích thích một cách tích cực đối với sự sinh trưởng và phát triển của thực vật, mặc dù nó không phải là vitamin cần thiết trong mọi trường hợp Có vai trò trong sinh tổng hợp tế bào, cụ thể là sinh tổng hợp acid polygalacturonic và pectine Inosit là chất bền vững khi khử trùng Thường được sử dụng ở nồng độ cao 100 ppm Khi phân tích thành phần của nước dừa người ta thu được inosit trong một phân đoạn trung tính

♦ Biotin (Bios II)

Cần thiết cho sự phân bào của một số loại mô Chỉ sử dụng ở nồng độ thấp từ 0,001 - 0,01 ppm

1.3.3 Đường

Trong nuôi cấy nhân tạo, nguồn carbon để mô và tế bào thực vật tổng hợp nên các chất hữu cơ giúp tế bào phân chia tăng sinh khối của mô không phải do quá trình quang hợp cung cấp mà do đường có trong môi trường dinh dưỡng

Hai dạng đường thường được sử dụng là saccharose và glucose Nhưng saccharose được sử dụng phổ biến hơn, tùy mục đích nuôi cấy mà nồng độ saccharose biến đổi từ 1 - 12%, thông dụng là 2 - 3%

Các nguồn carbonhyddate khác cũng được tiến hành thử nghiệm như lactose, galatose, rafinose, maltose và tinh bột nhưng các nguồn cacrbolhydrate này có hiệu quả kém hơn so với glucose và sucrose

Đường có thể bị caramel hóa nếu bị hấp khử trùng quá lâu (Peer, 1971; Ball, 1953) và sẽ ức chế phản ứng với các hợp chất amino (phản ứng Millard) Sự caramel hóa xảy ra khi đường bị đun nóng, hình thành melanoidin, một chất sẫm màu và có phân tử lượng cao, ức chế sự phát triển của tế bào

Trang 30

1.3.4 Vai trò của nước dừa và các dịch chiết

1.3.4.1 Nước dừa

Công bố đầu tiên về sử dụng nước dừa trong môi trường nuôi cấy là công trình nghiên cứu của Van Overbeek và cộng sự (1941,1942) Sau đó, tác dụng tích cực của nước dừa trong môi trường nuôi cấy mô, tế bào thực vật đã được nhiều tác giả ghi nhận

Nước dừa giàu các hợp chất hữu cơ, chất khoáng và các chất kích thích sinh trưởng (George, 1993; George, 1996) Nước dừa chứa nhiều carbohydrate như sucrose, glucose và fructose Môi trường chứa auxin và 10 - 20% nước dừa giúp sự phân chia của tế bào thân đã phân hóa (sự tạo mô sẹo)

Khi nuôi cấy phôi lan, nước dừa thường được sử dụng để giúp phôi tăng trưởng và nảy mầm (Hegarty, 1995; Niimoto và Sagawa, 1961)

Thông thường nước dừa được xử lí để loại trừ các protein, sau đó được lọc qua màng lọc để khử trùng trước khi bảo quản lạnh Tồn dư protein trong nước dừa không gây ảnh hưởng đến sinh trưởng của mô hoặc tế bào nuôi cấy, nhưng có thể kết tủa dung dịch khi bảo quản lạnh Chất cặn có thể được lọc hoặc để lắng dưới đáy bình rồi gạn bỏ cặn

Nước dừa thường sử dụng nồng độ từ 5 - 20% (v/v)

1.3.4.2 Các dịch bổ sung

♦ Lòng trắng trứng

Lòng trắng chiếm khoảng 60% toàn bộ trọng lượng quả trứng và nước là thành phần chính chiếm khoảng 88% Lòng trắng trứng thường có khoảng 9,7-11% protein, trong đó có hơn 40 loại protein khác nhau Ovalbumin là protein chính và chiếm khoảng 54% tổng số protein của lòng trắng trứng Ovotransferrin (conalbumin) và ovomucoid chiếm khoảng 12% và 11% tương ứng (bảng 1) Các loại protein khác là ovomucin, ovoglobulin, lysozyme, ovomacroglobulin, ovoglycoprotein, flavoprotein, ovoinhibitor, cystatin và avidin Carbohydrate chiếm khaỏng 0,5-0,6% lòng trắng trứng, chúng tồn tại ở dạng tự do hay kết hợp với

Trang 31

protein Lượng lipid (0,01%) trong lòng trắng trứng rất nhỏ so với lượng lipid có mặt trong lòng đỏ trứng

♦ Lòng đỏ trứng gà

Lòng đỏ tập trung chủ yếu các chất dinh dưỡng, lòng đỏ trứng gà có 13,6% đạm, 29,8% béo và 1,6% chất khoáng Chất đạm trong lòng đỏ trứng có thành phần các acid amin tốt nhất và toàn diện nhất Thành phần của lòng trắng trứng đa số là nước, có 10,3% chất đạm, chất béo và rất ít chất khoáng

Chất đạm của lòng đỏ trứng chủ yếu thuộc loại đơn giản và ở trạng thái hòa tan; Còn chất đạm của lòng trắng chủ yếu là Albumin và cũng có thành phần các acid amin tương đối toàn diện Chất đạm của trứng là nguồn cung cấp rất tốt các acid amin cần thiết có vai trò quan trọng cho cơ thể, đặc biệt cần cho sự phát triển

cả về cân nặng và chiều cao của trẻ

Trứng có nguồn chất béo rất quí, đó là Lecithin vì Lecithin thường có ít ở các thực phẩm khác Lecithin tham gia vào thành phần các tế bào và dịch thể của tổ chức, đặc biệt là tổ chức não Nhiều nghiên cứu cho thấy Lecithin có tác dụng điều hòa lượng cholesterol, ngăn ngừa tích lũy cholesterol, thúc đẩy quá trình phân tách cholesterol và bài xuất các thành phần thu được ra khỏi cơ thể Trứng cũng chứa lượng cholesterol đáng kể (600mg cholesterol/100g trứng gà), nhưng lại có tương quan thuận lợi giữa Lecithin và cholesterol do vậy Lecithin sẽ phát huy vai trò điều hòa cholesterol, ngăn ngừa quá trình xơ vữa động mạch và đào thải cholesterol ra khỏi cơ thể

Trứng cũng là nguồn cung cấp vitamin và chất khoáng rất tốt Các chất khoáng như sắt, kẽm, đồng, mangan, iod tập trung hầu hết trong lòng đỏ Lòng đỏ trứng có cả các vitamin tan trong nước (B1, B6) và vitamin tan trong dầu (Vitamin

A, D, K) Trong lòng trắng trứng chỉ có một ít vitamin tan trong nước (B2, B6) Cả trong lòng đỏ và lòng trắng trứng đều có chất Biotin Biotin là vitamin B8, tham gia vào chu trình sản xuất năng lượng để đáp ứng nhu cầu của cơ thể Trong lòng trắng trứng tươi, chất Biotin kết hợp với một protein là Avidin làm mất hoạt tính của

Trang 32

Biotin, tạo phức hợp Biotin - Avidin rất bền vững và không chịu tác dụng của men

tiêu hóa Khi nấu chín, Avidin sẽ được giải phóng khỏi phức hợp Biotin - Avidin

♦ Dịch chiết cá nục

Cá nục là một loài cá có thành phần dinh dưỡng khá cao Trong 100g cá nục:

92 kcal, 21,3 g protein, 0,8g lipid, 1,3g tro, 246 mg K, 58 mg Calcium, 2,3 mg Fe,

29 mg Phosphorus, 67 mg Natri, 27mg Vitamin A, 0,23mg Vitamin B2, 304mg

Vitamin PP

Để tránh tình trạng đóng cục cá nục được nghiền nát và cho vào môi trường nuôi cấy

♦ Sữa tươi

Sữa tươi là nguồn cung cấp nhiều chất dinh dưỡng như protein, lipid, các

khoáng chất cần thiết Trong 100ml sữa tươi có 3,1g protein, 3,4g lipid, 9,2 g carbohydrate, 110g canxi, 230 I.U Vitamin A, 40 I.U Vitamin D3, 90,5 mg photphorus, 13,9 mg magiê, 760mcg kẽm, 205 mcg mangan

Với thành phần dinh dưỡng như vậy sữa tươi sẽ là nguồn cung cấp chất dinh dưỡng tốt cho cây được bô sung làm dịch chiết trong nuôi cấy mô

♦ Các dịch chiết khác

Dịch chiết nấm men, dịch chiết mạch nha, casein thủy phân, dịch chiết lúa mì… cũng được sử dụng để làm tăng sự phát triển của mô sẹo hay cơ quan nuôi cấy

- Dịch chiết nấm men (YE):

Với dịch chiết nấm men, White (1934) lần đầu tiên nuôi thành công rễ cà chua trong ống nghiệm kéo dài vô thời hạn Thành phần hóa học của nấm men ít được phân tích Chủ yếu chứa: đường, nucleic acid, amino acid, vitamin, auxin, muối khoáng Tác dụng của YE với rễ rất tốt nhưng với callus thì không rõ ràng

- Dịch thủy phân casein (CH):

Được sử dụng rộng rãi trong kỹ thuật vi sinh vật, ở nuôi cấy mô và tế bào thực vật, chủ yếu làm nguồn bổ sung amino acid

Trang 33

1.3.5 Amino acid

Việc sử dung amino acid đặc biệt quan trọng trong môi trường nuôi cấy tế bào và nuôi cấy tế bào trần Amino acid cung cấp cho tế bào thực vật nguồn amino acid sẵn cho nhu cầu của tế bào và nguồn nitrogen này được tế bào hấp thu nhanh hơn nitrogen vô cơ Các nguồn nitrogen hữu cơ thường sử dụng trong môi trường nuôi cấy tế bào thực vật là hỗn hợp amino acid như casein hydrolysate, L-glutamine, L-asparagine và adenine Khi amino acid được cung cấp riêng rẽ thì cần phải cẩn thận vì nó có thể cản trở sự tăng trưởng của tế bào

Dựa vào những kết quả phân tích các hỗn hợp chất tự nhiên nói trên nhiều tác giả đã đề ra những công thức pha chế hỗn hợp amino acid nhân tạo để bổ sung vào môi trường dinh dưỡng Kết quả sử dụng các hỗn hợp này còn rất khác nhau, có thể do yêu cầu của từng loại tế bào không giống nhau

Trong môi trường lỏng để nuôi callus lúa và môi trường tái sinh cây lúa từ callus thì proline là một thành phần quan trọng

1.3.6 Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật

Chất điều hòa sinh trưởng thực vật hay còn gọi là Phytohormone đóng vai trò điều hòa sinh trưởng và phát triển của thực vật bao gồm tái sinh thực vật từ những

tế bào và mô tách rời Phytohormone gồm các chất như: auxin, abscising, ethylene, gibberelline, cytokinene Trong đó, hai loại hormone quan trọng nhất là auxin và cytokinine quyết định sự kích thích phân chia và biệt hóa tế bào của các mô được

nuôi cấy in vitro

♦ Auxin

Là một hợp chất tương đối đơn giản: indol-3-acetic acid (IAA) Các chất có cấu trúc gần giống IAA là dẫn xuất hay tiền chất của IAA và cũng có cùng vai trò với IAA trong cơ quan đều được gọi là auxin theo nghĩa rộng Auxin tự nhiên được tổng hợp trong ngọn thân, trong mô phân sinh (ngọn và lóng) và lá non, nơi có sự phân chia tế bào nhanh (trừ tryptophan được tổng hợp trong lá trưởng thành dưới ánh sáng) Sau đó, auxin di chuyển tới rễ và tích tụ trong rễ

Trang 34

Cơ chế tác động của auxin lên sự giãn của tế bào:

Hình 1.5 Cơ chế tác động của auxin lên sự giãn của tế bào

Auxin là nhóm chất điều hòa sinh trưởng được sử dụng rất thường xuyên trong nuôi cấy mô - tế bào thực vật Đặc tính chủ yếu của auxin là kích thích sự tăng trưởng và kéo dài của tế bào Ở một số loài, auxin làm tăng sự tổng hợp enzyme (peroxidase ở lõi thuốc lá, cellulose synthegtase ở kiều mạch), auxin có khả năng khởi đầu sự phân chia tế bào (Mai Trần Ngọc Tiếng, 2002) Trong nuôi cấy

mô thực vật, auxin kết hợp chặt chẽ với các thành phần dinh dưỡng khác trong môi trường nuôi cấy để kích thích sự tăng trưởng mô sẹo, NAA, IBA được sử dụng phổ biến thay thế 2,4 - D vì hạn chế được hiện tượng đột biến Auxin còn là yếu tố ngăn cản sự tổng hợp diệp lục tố (Nguyễn Đức Lượng, 2002)

Trang 35

Trong quá trình nghiên cứu người ta cũng nhận thấy một số ảnh hưởng của auxin đối với thực vật:

- Kích thích cho tế bào nở lớn và sinh trưởng thân

- Kích thích phân bào ở thượng tầng phát sinh gỗ và kết hợp với cytokinin trong nuôi cấy mô tế bào thực vật

- Kích thích phát sinh rễ trên đoạn thân, phát triển rễ nhánh và biệt hóa phát sinh rễ trong nuôi cấy mô tế bào thực vật

- Ức chế sinh trưởng chồi bên

- Biệt hóa nhu mô libe và nhu mô gỗ

- Ức chế hay thúc đẩy sự rụng lá và trái phụ thuộc vào thời gian và vị trí lá, trái

- Sinh trưởng hoa - được kích thích bởi auxin

- Tạo môi trường phản ứng về dinh dưỡng của chồi và rễ với ánh sáng và lực hấp dẫn

♦ Cytokinin

Các cytokinin gồm kinetin, BA, zeatin… Sau zeatin, 30 cytokinin khác đã được cô lập Ngày nay, người ta gọi cytokinin để chỉ một nhóm chất thiên nhiên hay nhân tạo, có đặc tính sinh lí giống nước dừa hay kinetin Cytokinin được tổng hợp

từ adenine, xuất hiện ở chóp rễ và hạt đang phát triển

Ảnh hưởng của cytokinin đến thực vật:

- Phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô và khối u, thúc đẩy phát sinh chồi

- Tác động sự nở lớn tế bào

- Tác động trực tiếp đến phân bào của trái và chồi đỉnh

- Làm chậm lão hóa lá

- Kích thích sự mở khí khổng ở vài loài thực vật

- Kích thích phát sinh chồi bên trong điều kiện có ưu thế ngọn

- Tích tụ diệp lục và chuyển hóa etioplast vào diệp lục

Trang 36

♦ Gibberelline (GA)

Chỉ có acid gibberellinic A3 (GA3) được sử dụng Nó không có bán ở dạng nguyên chất Đây là một chất tự nhiên, phân hủy nhanh trong dung dịch nhầy và ưu tiên bảo quản trong cồn 96% và để trong tủ lạnh Chúng ta cần lưu ý là các chất điều hòa tăng trưởng bị phân hủy hoặc trong lúc bảo quản chúng hoặc trong lúc hấp khử trùng ở autoclave Các GA quan trọng ở thực vật là GA1, là GA đầu tiên tác động đến sự vươn thân, kích thích kéo dài tế bào Các GA được tổng hợp từ mevalonic acid ở mô non của chồi và hạt đang phát triển Một số ảnh hưởng của

- Kích thích sản xuất nhiều loại enzyme

- Kích thích sự hình thành và phát triển trái như nho

♦ Abscisic acid (ABA)

ABA là một phân tử đơn, được tổng hợp từ mevalonic acid ở lá thuần thục

để thích ứng với stress nước Vì quy luật tác động của ABA trên sự rụng và lão hóa, nên ABA được nghĩ như một chất ức chế Ảnh hưởng của ABA:

- Trong nước có nhiều ABA sẽ làm đóng khí khổng

- ABA gây nên sự vận chuyển sản phẩm quang hợp để phát triển hạt và được hấp thu bởi phôi đang sinh trưởng

- ABA phát sinh tổng hợp protein dự trữ trong hạt

- ABA tác động ngược lại ảnh hưởng của gibberellin đến tổng hợp enzyme amylase ở hạt ngũ cốc đang nảy mầm

- ABA phát sinh và duy trì sự nảy mầm ở hạt và chồi

♦ Hexitol

Các hexitol như myo - inositol được xem là có vai trò quan trọng trong nuôi

cấy mô (Pollar et al., 1961 và Steinhard et al., 1962) Myo -inositol là một hexitol

Định dạng
Số trang	73
Dung lượng	4,11 MB