Khảo sát ảnh hưởng của một số chất bổ sung vào môi trường lên sự hình thành củ lily (lilium sorbonne) từ vảy củ in vitro

Nhưng sự sinh trưởng, phát triển của cây Lily trồng từ củ in vitro và khả năng tạo củ giống thương phẩm của chúng hầu như chưa được đề cập tới.. Chỉ cần một lượng nhỏ nguyên liệu ban đầ

Lily (Lilium Sorbonne) từ vảy củ in Vitro

Nguyễn Thị Hảo

Trịnh Thị Lan Anh (Giảng viên hướng dẫn)

Tp.HCM, năm 2013

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Thiên nhiên là nơi đã mang đến cho con người nhiều quà tặng vô giá, một trong những món quà vô giá đó là hoa Hoa làm cho cuộc sống của con người thêm phần thi vị và ý nghĩa Khi đời sống đang ngày càng được nâng cao, con người ngày càng hướng tới sự hưởng thụ, thưởng thức cái đẹp thì nhu cầu về hoa lại càng không thể thiếu Từ đó mà một nghề mới đã được ra đời và đem lại lợi nhuận lớn đó là nghề trồng và kinh doanh hoa Hoa Lily mang vẻ đẹp sang trọng, tao nhã, rất đa dạng về màu sắc, hình dạng, nhiều loại hoa có hương thơm nồng, hoa lớn, bền thích hợp dùng làm hoa cắt cành Do những đặc điểm nêu trên, Lily ngày càng được ưa chuộng và có giá trị thương mại rất cao

Ở Việt Nam hoa Lily đã trồng thành công ở nhiều tỉnh như Lâm Đồng, Lào Cai, Hà Nội Tuy nhiên, chúng ta phải thường xuyên nhập giống từ nước ngoài với chí phí khá cao (10.000 – 15.000đồng/củ giống) và không chủ động được

nguồn giống Việc nhân giống bằng phương pháp tạo củ in vitro đã được thực

hiện trên hoa Loa Kèn (Nguyễn Thị Nhẫn và cộng sự, 1999 ) và trên một số giống hoa Lily nhập nội (Nguyễn Thái Hà và cộng sự, 2003) Nhưng sự sinh

trưởng, phát triển của cây Lily trồng từ củ in vitro và khả năng tạo củ giống

thương phẩm của chúng hầu như chưa được đề cập tới

Kỹ thuật nhân giống vô tính in vitro với ưu điểm nhân nhanh những cá thể

đồng nhất về mặt di truyền, sinh trưởng và phát triển một cách đồng đều và cho

hệ số nhân giống cao Chỉ cần một lượng nhỏ nguyên liệu ban đầu, nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng trong điều kiện thích hợp có thể thu được một lượng lớn cây (hoặc củ) giống trong thời gian ngắn hơn rất nhiều so với các phương pháp truyền thống khác

Để một giống Lily có năng suất, chất lượng cao thì ngoài các biện pháp kỹ thuật và điều kiện tối ưu cho cây sinh trưởng và phát triển thì cần chọn được giống hoa phù hợp với điều kiện tự nhiên nơi sản xuất Các chỉ tiêu về năng suất, chất lượng hoa phụ thuộc phần nhiều vào chất lượng củ giống đem trồng Số nụ/cây và số hoa/cây là hai chỉ tiêu quan trọng đánh giá năng suất, chất lượng hoa Đối với sản xuất hoa Lily hai chỉ tiêu này phụ thuộc rất nhiều vào cỡ củ

trồng Với điều kiện thời tiết khí hậu tại Đồn Đèn Ba Bể Bắc Kạn ở nước ta,

trồng hoa Lilium Sorbonne thì trồng cỡ củ có chu vi từ 18 – 20 cho năng suất

hoa cao, chất lượng hoa tốt (chiều cao cây 112,2 cm; 54,6 lá/cây; 6,4 hoa/cây; thời gian sinh trưởng 115 ngày; đường kính hoa 19,6 cm, ) phù hợp với thị hiếu người tiêu dùng (Phan Thị Dung, 2009)

Từ những vấn đề nêu trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Khảo sát ảnh hưởng của một số chất bổ sung vào môi trường lên sự hình thành củ Lily

(Lilium Sorbonne) từ vảy củ in vitro”

2 Mục đích nghiên cứu

Xác định được môi trường tối ưu cho sự hình thành củ và nâng cao chất

lượng củ Lilium Sorbonne bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Đề tài xác định được ảnh hưởng của nồng độ đường, dịch chiết khoai tây,

dịch chiết cá nục lên sự tạo củ và làm tăng chất lượng củ Lilium Sorbonne trong

điều kiện in vitro

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Đề tài đã chứng minh được điều kiện môi trường ảnh hưởng đến khả năng tạo củ Lily, tìm ra được môi trường tốt để tăng chất lượng củ Lily

Kết quả nghiên cứu của đề tài có thể sử dụng để thử nghiệm trong công tác duy trì nguồn giống các loài Lily khác, góp phần nâng cao hiệu quả nhân giống đem lại giá trị kinh tế cao

5 Phương pháp nghiên cứu

Thí nghiệm được bố trí theo phương thức hoàn toàn ngẫu nhiên và độc lập Kết quả thu được sau 5 – 8 tuần nuôi cấy tùy từng thí nghiệm Kết quả được

xử lý thống kê bằng phần mềm Statgraphic ở mức độ ý nghĩa 0.005

6 Các kết quả đạt được của đồ án

- Xác định được nồng độ đường Saccharose thích hợp lên khả năng hình

thành củ của mẫu cấy Lilium Sorbonne

- Xác định được nồng độ dịch chiết khoai tây thích hợp lên khả năng hình

thành củ của mẫu cấy Lilium Sorbonne

- Xác định được nồng độ dịch chiết cá nục (nguồn nitrogen hữu cơ) thích

hợp lên khả năng hình thành củ của mẫu cấy Lilium Sorbonne

7 Kết cấu của đồ án tốt nghiệp

Đồ án tốt nghiệp bao gồm các chương sau:

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương 2: Vật liệu và phương pháp

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 4: Kết luận và đề nghị

CHƯƠNG 1:

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật

từ mô thượng tầng (cambium) ở cà rốt và thuốc lá, mô sẹo có khả năng sinh trưởng liên tục

Năm 1941, Overbeek và cộng sự đã sử dụng nước dừa trong nuôi cấy phôi

non ở cây cà rốt Daruta Năm 1955, Miller đã phát minh cấu trúc và sinh tổng

hợp của kinetin – cytokinin đóng vai trò quan trọng trong phân bào và phân hóa chồi ở mô nuôi cấy Đến năm 1957, Skoog và Miller đã khám phá vai trò nồng

độ của tỷ lệ auxin: cytokinin trong môi trường đối với sự phát sinh cơ quan (rễ hoặc chồi) Khi tỷ lệ auxin/cytokinin nhỏ hơn 1 và càng nhỏ, mô có xu hướng tạo chồi Ngược lại lớn hơn 1 có xu hướng tạo rễ Tỷ lệ nồng độ auxin và cytokinin thích hợp sẽ kích thích phân hóa cả chồi và rễ, tạo cây hoàn chỉnh

Năm 1949, Limmasets và Cornuet đã phát hiện rằng virus phân bố không đồng nhất trên cây và thường thấy có virus ở đỉnh sinh trưởng Năm 1952, Morel

và Martin đã tạo ra cây sạch bệnh virus của 6 giống khoai tây từ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Ngày nay, kỹ thuật này với một số cải tiến đã trở thành phương pháp loại trừ bệnh virus được dùng rộng rãi đối với nhiều loại cây trồng khác nhau

Năm 1952, Morel và Martin lần đầu tiên thực hiện vi ghép in vitro thành công

Kỹ thuật vi ghép sau đó được ứng dụng rộng rãi trong tạo nguồn giống sạch bệnh

virus và tương tự virus ở nhiều cây trồng nhân giống bằng phương pháp vô tính

khác, đặc biệt tạo giống cây ăn quả sạch bệnh Năm 1960, Morel đã thực hiện

bước ngoặt cách mạng trong sử dụng kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh truưởng trong

nhân nhanh các loài địa lan Cymbidium, mở đầu công nghiệp vi nhân giống thực

vật

Năm 1960, Cooking lần đầu tiên sử dụng emzyme phân giả thành tế bào

và đã tạo ra số lượng lớn tế bào trần ở nhiều cây trồng khác nhau Năm 1971, Takebe và cộng sự đã tái sinh được cây từ tế bào trần mô thịt lá (mesophill cell)

ở thuốc lá Năm 1972, Carlson và cộng sự lần đầu tiên thực hiện lai tế bào soma

giữa các loài, tạo được cây từ dung hợp tế bào trần của 2 loài thuốc lá Nicotiana glauca và N langsdorfii Năm 1978, Melchers và cộng sự tạo được cây lai soma

“ Cà chua – Thuốc lá” bằng lai xa tế bào trần của 2 cây này Đến nay việc tái sinh cây hoàn chỉnh từ tế bào trần hoặc từ lai tế bào trần đã thành công ở nhiều loài thực vật

Năm 1959, Tulecke và Nickell đã thử nghiệm sản xuất sinh khối mô thực vật quy mô lớn (134 lít) bằng nuôi cấy chìm Năm 1977, Noguchi và cộng sự đã nuôi cấy tế bào thuốc lá trong bioreacter dung tích lớn 20,000 lít Năm 1978, Tabata và cộng sự đã nuôi cấy tế bào cây thuốc ở quy mô công nghiệp phục vụ sản xuất shikonin Họ đã chọn lọc được dòng tế bào cho sản lượng các sản phẩm thứ cấp (shikonin) cao hơn

1.1.3 Cơ sở lý luận của nuôi cấy mô tế bào thực vật

Năm 1990, Haberlandt (Đức) là người đầu tiên đề xướng học thuyết tính toàn năng về tế bào trong cuốn “Thực nghiệm về nuôi cấy mô tế bào tách rời Theo ông: “Mỗi tế bào của một cơ thể đa bào đều mang trong mình đầy đủ các thông tin di truyền để kiến tạo nên một cơ thể hoàn chỉnh Vì vậy khi đặt tế bào vào trong điều kiện thuận lợi, nó có thể phát triển thành một cơ thể” Dựa trên cơ

sở đó hàng trăm loài đã được nhân giống nhằm mục đích bảo quản, lưu trữ cũng như thương mại cây giống bằng cách nuôi cấy trong điều kiện vô trùng và tái sinh thành cây con

1.1.4 Một số kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào

Để nhân giống hoa Lily thì có thể thực hiện theo con đường hữu tính và vô tính

1.1.4.1 Phương pháp nhân giống hoa Lily bằng con đường nhân giống hữu tính

Nhân giống bằng phương pháp hữu tính có ưu điểm là có thể thu được nhiều hạt trong một thời gian ngắn từ một vài cây mẹ có chất lượng cao, đặc biệt

là ở chi Lilium thì virus không thể lây lan từ cây mẹ sang cây con bằng hạt Do

vậy, mức độ nhiễm virus của các cây nhân giống bằng hạt là khá thấp Tuy nhiên,

do cây nảy mầm từ hạt thường không đồng nhất và hay xuất hiện các biến dị di truyền và mất nhiều thời gian, từ gieo hạt đến khi cây ra hoa có chất lượng tốt phải mất 3 – 4 năm, vì vậy phương pháp nhân giống này ít được ứng dụng

1.1.4.2 Phương pháp nhân giống hoa Lily bằng con đường nhân giống vô tính

a Giâm vảy (cắm vảy)

Đây là phương pháp nhân giống cổ truyền Trên thân vảy (củ) của Lily có rất nhiều vảy, mỗi vảy có thể sinh ra vài vảy nhỏ ở gốc, mỗi thân vảy nhỏ sẽ hình thành một cơ thể mới

b Nhân giống bằng cách tách củ

Tách củ là phương pháp nhân giống bằng cách tách củ con được sinh ra từ

củ mẹ Có thể trồng cây chuyên để nhân giống Cũng có thể kết hợp với sản xuất hoa vụ hè để nhân giống, nhưng do trong thời điểm này, khí hậu nóng nên chất lượng củ loại này kém Mỗi củ mẹ đều có thể có 3 – 5 củ con tương đối lớn (chu

vi 5cm trở lên) và 4 – 8 củ nhỏ (chu vi 1 – 3cm) Những củ có chu vi 5cm trở lên đem trồng sau một vụ có thể thành củ nhỡ để sản xuất hoa (10 cm trở lên), củ

có chu vi 1 – 3cm thì phải trồng hai vụ mới thành củ sản xuất hoa được

c Nhân giống bằng mầm hạt

Có một số Lily nách lá có thể sinh ra nhiều mầm hạt màu đen tím Mầm hạt

là do một số vảy hợp lại, nó có thể ra rễ, ra lá; nếu hái xuống rồi trồng có thể thành cây con, cách trồng tương tự như trồng bằng hạt

Tóm lại, các phương pháp nhân giống trên có rất nhiều ưu điểm nhưng nếu nhân giống liên tục nhiều năm thì virus tích luỹ lại và truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác, làm hoa sinh trưởng, phát triển yếu, hoa nhỏ và hệ số nhân giống chưa có thể đáp ứng nhu cầu trồng và sản xuất hoa Lily trong nước ta Đặc biệt là quy mô sản xuất công nghiệp đang phát triển mạnh Hiện nay, nếu phải nhập nội

củ giống từ Hà Lan, Hàn Quốc, Trung Quốc, với giá thành 10.000 – 15.000 đồng/củ thì chi phí bỏ ra cho sản xuất là rất cao Phương pháp nuôi cấy mô tế bào

là phương pháp nhân giống mới hiện nay trên thế giới và rất mới ở Việt Nam, phương pháp này có thể khắc phục được các nhược điểm trên và đáp ứng được nhu cầu của sản xuất

1.1.5 Quy trình nhân giống in vitro

Bước 1: Lấy mẫu và xử lý mẫu

- Chọn cây mẹ để lấy, mẫu thường là cây ưu việt, khỏe, có giá trị kinh tế

cao

- Chọn cơ quan để lấy mẫu thường là chồi non, đoạn thân có chồi ngủ, hoa

non, lá non,…

- Mô chọn để nuôi cấy thường là các mô có khả năng tái sinh cao, sạch

bệnh, giữ được các đặc tính sinh học qúy của cây mẹ và ổn định Tùy điều kiện, giai đoạn này có thể kéo dài 3 – 6 tháng

Bước 2: Tái sinh mẫu nuôi cấy

- Khử trùng bề mặt mẫu vật và chuẩn bị môi trường nuôi cấy

- Cấy mẫu vô trùng vào môi trường nhân tạo trong ống nghiệm hoặc bình

nuôi

- Các mẫu nuôi cấy nếu không bị nhiễm khuẩn, nấm hoặc virus sẽ được

lưu giữ trong phòng với điều kiện nhiệt độ, ánh sáng phù hợp Sau một thời gian nhất định, từ mẫu nuôi cấy băt đầu xuất hiện các cụm tế bào hoặc cơ quan (chồi, cụm chồi, rễ) hoặc phôi vô tính có đặc tính gần như phôi hữu tính Giai đoạn 2 thường yêu cầu 2 – 12 tháng

Bước 3: Nhân chồi

Môi trường ở giai đoạn này được bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật (cytokinin, auxin), tăng thời gian chiếu sáng lên 16h/ngày, cường độ ánh sáng

tối thiểu là 1000 lux Ánh sáng tím là thành phần kích thích phân hóa mạnh, nhiệt

độ thích hợp từ 20 – 30oC Mục tiêu quan trọng nhất của giai đoạn này là xác định phương thức nhân nhanh nhất bằng môi trường dinh dưỡng và điều kiện khí hậu tối thích

Bước 4: Tạo rễ

Khi chồi đạt đến một kích thước nhất định, mẫu được chuyển sang môi trường tạo rễ Môi trường này thường được bổ sung auxin (IBA, α-NAA, 2,4-D)

ở liều lượng thích hợp nhằm kích thích tạo rễ, bước này mất khoảng 2- 4 tuần

Bước 5: Đưa cây in vitro ra vườn ươm

Giai đoạn này cây được chuyển từ trạng thái dị dưỡng sang tự dưỡng Vì vậy cần đủ rễ, đủ lá và phải huấn luyện cho cây thích nghi với sự biến đổi của môi trường, đồng thời thay đổi những đặc điểm sinh lý và giải phẫu của cây con

giúp cây thích nghi dần với điều kiện ex vitro, hạn chế tối đa cây bị chết

1.1.6 Ưu nhược điểm của nuôi cấy in vitro

- Tạo được dòng thuần của các cây tạp giao

- Tạo được cây có genotype mới (đa bội, đơn bội)

- Bảo quản và lưu giữ tập đoàn gen

- Có khả năng sản xuất quanh năm

- Hệ số nhân giống cao

- Tạo cây sạch virus nhờ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

1.1.6.2 Nhược điểm

Theo Nickell (1973) nhược điểm chính của phương pháp nuôi cấy in vitro

là đòi hỏi trang thiết bị đắt tiền và kỹ thuật cao nên chỉ có hiệu quả đối với những cây có giá trị cao hoặc khó nhân gống bằng phương pháp khác

Mặc dù số lượng cây giống thu được có thể rất cao nhưng cây con có kích thước nhỏ, đòi hỏi phải có chế độ chăm sóc đặc biệt ở giai đoạn sau ống nghiệm

Cây có thể có những đặc tính không mong muốn

Khả năng tạo đột biến tăng

Cây giống có thể nhiễm bệnh đồng loạt

1.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô tế bào

1.2.1 Điều kiện nuôi cấy mô tế bào thực vật

Môi trường nuôi cấy là điều kiện tối cần thiết, là yếu tố quyết định cho sự phân hoá tế bào và cơ quan nuôi cấy

- Mô nuôi cấy: theo lý thuyết tất cả các mô chưa hoá gỗ đang sinh trưởng

mạnh như mô phân sinh ngọn, thượng tần, đầu rễ, phôi đang phát triển, Khi đặt vào môi trường có chứa một lượng hormone thích hợp đều có khả năng tạo mô sẹo Tuy nhiên, mỗi tế bào ở mỗi mô khác nhau có khả tạo mô sẹo, phân hoá thành rễ, thân, cành, lá, rất khác nhau

Do đó các kết quả thu được cũng rất khác nhau ở những mẫu khi đưa vào nuôi cấy Việc chọn mẫu thực vật để sử dụng trong quá trình nuôi cấy có vai trò quyết định, nếu chọn sai mẫu chúng ta sẽ không thu nhận được kết quả, hoặc thu được những cây không phát triển mạnh, thậm chí cây có thể ngưng phát triển ở một giai đoạn nhất định Các kết quả nghiên cứu cho thấy để bắt đầu nghiên cứu nhân giống vô tính cho một cây nhất định, người ta chú trọng đến các chồi bên,

mô phân sinh đỉnh,

-Vô trùng trong nuôi cấy: môi trường nuôi cấy mô thực vật có chứa

đường, muối khoáng và vitamin rất thích hợp cho các loài nấm, vi khuẩn nấm phát triển Nếu môi trường nuôi cấy bị nhiễm vài bào tử nấm hoặc vi khuẩn thì sau vài ngày đến một tuần thì toàn bộ bề mặt môi trường nuôi cấy và mẫu cấy bị phủ đầy nấm, khuẩn thì phải loại bỏ vì trong điều kiện này mô cấy không thể phát triển và chết dần Khác với thí nghiệm vi sinh có thể kết thúc vài ngày, còn trong thí nghiệm nuôi cấy mô đòi hỏi mức độ vô trùng cao mới có hi vọng thành công

Để đảm bảo điều kiện vô trùng trong quá trình nuôi cấy đòi hỏi chúng ta phải thực hiệu các yêu cầu sau:

+ Vô trùng mô cấy

+ Vô trùng dụng cụ thuỷ tinh, môi trường và nút đậy

+ Trong thao tác nuôi cấy cần phải tránh làm rơi nấm, khuẩn lên bề mặt môi trường nuôi cấy

Phương pháp vô trùng mẫu cấy phổ biến hiện nay là dùng các chất hoá học có hoạ tính diệt nấm, diệt khuẩn Hiệu lực diệt nấm, diệt khuẩn tuỳ thuộc vào thời gian xử lý, nồng độ và khả năng xâm nhập của chúng lên bề mặt nuôi cấy Các chất kháng sinh ít được sử dụng vì tác dụng không triệt để và ảnh hưởng xấu lên sự sinh trưởng của mô cấy Ngoài ra, ta còn sử dụng các chất làm giảm sức cãng bề mặt : Tween 20, Fotoflo, teeppol bổ sung vào dung dịch diệt nấm, diệt khuẩn

Trong quá trình xử lý mô cấy phải nhập hoàn toàn trong dung dịch diệt nấm, diệt khuẩn, với các bộ phận có bám nhiều cách, bụi trước khi sử lý cần rửa sạch bằng xà phòng, nước máy Sau khi xử lý xong, mô cấy được rửa lại bằng nước vô trùng (tối thiểu 3 lần), loại bỏ những phần bị hoại tử bởi tác nhân vô trùng trước khi đặt mô cấy lên môi trường nhằm tránh ảnh hưởng trực tiếp của tác nhân vô trùng lên mô cấy

1.2.2 Môi trường nuôi cấy in vitro

Mô nuôi cấy bị tách rời ra khỏi cơ thể mẹ nên mất khả năng tự dưỡng vì vậy để cho mô tồn tại và phân hóa thì trong gia đoạn nuôi cấy phải tạo ra được môi trường nuôi cấy có đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết cho mô nuôi cấy Cho đến nay, đã có nhiều loại môi trường dinh dưỡng được tìm ra: Môi trường Murashige và Skoog (1962) viết tắt là MS, môi trường Linsmainer và Skoog (1963), môi trường Gramborg (1968) Môi trường Knop (1974),… Đây là những môi trường cơ bản và sẽ được cải biến ra nhiều loại môi trường khác nhau cho phù hợp với đối tượng nghiên cứu và mục đích thí nghiệm Trong số đó môi trường MS được đánh giá là phù hợp nhất cho đa số các loài thực vật

Thành phần của môi trường nuôi cấy tế bào thay đổi tùy theo từng loại thực vât, loại tế bào, mô, cơ quan được nuôi cấy, các giai đoạn sinh trưởng, phát triển của mẫu cấy, cũng như mục đích nuôi cấy Tuy nhiên môi trường nuôi cấy

mô tế bào thực vật đặc trưng đều chứa các thành phần sau:

1.2.2.1 Các nguyên tố đa lượng

a Khoáng đa lượng

Khoáng đa lượng bao gồm các nguyên tố đa lượng: N, P, K,Ca, Mg, S tồn tại ở dạng muối khoáng Tất cả các nguyên tố này đều cần cho quá trình phát triển mô và tế bào thực vật N, S, P là thành phần không thể thiếu của acid nucleic và nhiều chất hữu cơ khác, Ca có nhiệm vụ ổn định màng sinh học, Mg là thành phần của diệp lục, K điều hòa tính thấm lọc của tế bào, duy trì điện thế và tham gia hoạt hóa nhiều enzyme

b Nguồn carbonhydrate

Sucrose là nguồn cacbon chủ yếu và được sử dụng hầu hết trong các môi trường nuôi cấy mô Mô thực vật có khả năng hấp thu một số đường khác như maltose, galactose, lactose, mannose, thậm chí tinh bột, nhưng các loại đường này hầu như rất ít được sử dụng trong môi trường nuôi cấy tế bào và mô thực vật Nguồn carbon thông dụng nhất đã được kiểm chứng là sucrose, nồng độ thich hợp phổ biến là 2 – 3%

1.2.2.3 Các vitamin

Để mô có sức sinh trưởng tốt phải bổ sung thêm vào môi trường một hay nhiều loại vitamin Các vitamin là cần thiết cho các phản ứng sinh hóa Các vitamin được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: thiamine (B1), acid nicotinic (PP), pyridoxine (B6), biotin và myo-inositol Thiamin là một vitamine căn bản cần thiết cho sự tăng trưởng của tất cả các tế bào Thiamin thường được

sử dụng với nồng độ 0,1 – 10 mg/l B6 là tiền chất của pyridoxal – phosphate – cofactor của nhóm enzyme như carboxylase transaminase Có vai trò trong sinh tổng hợp thành tế bào, cụ thể là sinh tổng hợp acid polygalacturonic và pectine Inositol là chất bền vững khi khử trùng Thường được sử dụng ở nồng độ cao 100 ppm,…

1.2.2.4 Chất điều hòa sinh trưởng thực vật

Bên cạnh các chất cung cấp dinh dưỡng cho nuôi cấy mô, việc bổ sung một hoặc nhiều chất điều hòa sinh trưởng như auxin, cytokinin và giberenin là rất cần thiết để kích thích sinh trưởng, phát triển và phân hóa cơ quan, cung cấp sức sống tốt cho mô và các tổ chức Tuy vậy, yêu cầu đối với những chất này thay đổi tùy theo loài thực vật, loại mô hàm lượng chất điều hòa sinh trưởng nội sinh

củ chúng Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật được chia thành các nhóm chính sau đây:

a Nhóm auxin

Môi trường nuôi cấy được bổ sung auxin khác nhau như: IAA, NAA, IBA, 2,4-D và NOA IAA là auxin tự nhiên có trong mô thực vật, còn lại NAA, 2,4-D và NOA là các auxin nhân tạo, thường thì các auxin nhân tạo có hoạt tính mạnh hơn vì do đặc điểm phân tử của chúng nên các enzyme oxy hóa auxin (auxin- oxydase) không có tác dụng Những auxin có hiệu lực riêng biệt trong nuôi cấy tế bào thực vật là 4-CPA hoặc PCPA, 2,4,5-T, MCPA, picloram và dicamba Đặc điểm chung của các auxin là tính chất phân chia tế bào Các hormon thuộc nhóm này có hoạt tính như: tăng trưởng chiều dài thân, lóng, tính hướng (sáng, đất), tính ưu thế ngọn, tạo rễ, phân hóa mạch dẫn Nói chung auxin được hòa tan hoặc trong ethanol hoặc trong NaOH loãng

b Nhóm cytokinin

Các cytokinin là dẫn xuất của adenine, đây là những hormone liên quan chủ yếu đến sự phân chia tế bào, sự thay đổi ưu thế ngọn và phân hóa chồi trong nuôi cấy mô Các cytokinin được sử dụng thường xuyên nhất là BAP hoặc BA, 2-iP, kinetin và zeatin Zeatin và 2-iP là cytokinin tự nhiên, còn BA và kinetin là cytokinin nhân tạo Nói chung chúng được hòa tan trong NaOH hoặc HCl loãng

Tỷ lệ auxin/cytokinin rất quan trọng đối với sự phát sinh hình thái

(morphogenesis) trong các hệ thống nuôi cấy Đối với sự phát sinh phôi (embryogenesis), để tạo callus và rễ cần có tỷ lệ auxin/cytokinin cao, trong khi ở trường hợp ngược lại sẽ dẫn đến sự sinh sản chồi và chồi nách Vấn đề quan trọng là nồng độ của hai nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật này Chẳng hạn

2,4-D cùng với BA ở nồng độ 5,0 ppm kích thích sự tạo thành callus ở Agrostis

nhưng nếu dùng ở nồng độ 0,1 ppm chúng sẽ kích thích tạo chồi mặc dù trong cả

2 trường hợp tỷ lệ auxin/cytokinin là bằng 1 Cơ chế họa động của cytokinin là chưa được biết rõ ràng mặc dù có một số kết quả về sự có mặt của các hợp chất mang hoạt tính cytokinin trong RNA vận chuyển (transfer RNA) Các cytokinin cũng có hoạt tính ổng hợp RNA, tăng hoạt tính enzyme và protein trong các mô nhất định

c Gibberellin

Gibberellin được phát hiện vào những năm 1930 Lịch sử phát hiện nhóm hormone thực vật này bắt đầu từ 1895 khi người Nhật nói về bệnh lúa von Năm

1926, xác định được bệnh đó do loài nấm Gibberellin fujikuroi gây ra Đến

những năm 30, mới phân lập và tinh chế được hoạt chất, được gọi là gibberellin Mãi đến chiến tranh thế giới thứ II năm 1950, người Anh và người Mỹ mới biết đến công trình này của người Nhật Ngày nay, người ta đã phát hiện được trên 60 loại thuộc nhóm gibberellic acid Loại gibberellic acid thông dụng nhất trong nuôi cấy mô thực vật là GA3

Trong đời sống thực vật gibberenin đóng vai trò quan trọng đối với nhều quá trình sinh lý như: sinh lý ngủ nghỉ của hạt và chồi, sinh lý phát triển của hoa, làm tăng sinh trưởng chiều dài của thực vật

d Abscisic acid (ABA)

ABA thuộc nhóm các chất ức chế sinh trưởng tự nhiên gây ra sự ngủ nghỉ của chồi, làm chậm sự nảy mầm của hạt và sự ra hoa, đóng khí khổng ABA còn

có tác dụng tăng cường khả năng chống chịu của tế bào thực vật đối với điều kiện ngoại cảnh bất lợi, vì vậy ABA được đưa vào môi trường nuôi cấy và mang lại hiệu quả nhất định

Trong nuôi cấy mô tế bào, ABA có tác dụng tạo phôi vô tính, kích thích

sự chín của phôi, kích thích sự phát sinh chồi ở nhiều loài thực vật

e Ethylene

Một số chức năng cơ bản của ethylene như:

- Gây già hóa lá, kích thích sự rụng lá và quả

- Làm chín quả

- Sinh tổng hợp ethylene được tăng cường khi quả đang chín, cây đang bị úng, lão hóa, tổn thương cơ giới và bị nhiễm bệnh

- Điều khiển sự chín của một số loài quả

- Kìm hãm sự ra hoa của đa số cây Tuy vậy, sự ra hoa của xoài, dứa, một

số cây cảnh lại được kích thích bởi ethylene

- Kích thích nở hoa, kích thích sự lão hóa của hoa và lá

Ngoài những nhóm chất điều tiết sinh trưởng kể trên, trong nuôi cấy in vitro còn sử dụng một số chất khác như : agar, than hoạt tính, một số amino acid,

nguồn nitrogen,…

- Agar được chiết xuất từ rong bổ sung vào môi trường nhằm tạo giá thể đứng cho cây, tránh cho mẫu bị ngập úng trong nước vì thếu oxy, đồng thời phân

bố chất dinh dưỡng một cách đều đặn trong môi trường

- Than hoạt tính được bổ sung vào môi trường nuôi cấy nhằm mục đích khử độc cho chính mẫu cấy tiết ra Than hoạt tính có tác động tích cực đối với các loại cây như phong lan, Lily, cà rốt,… tuy nhiên tác động tiêu cực đến đậu nành, thuốc lá nếu bổ sung vào môi trường nuôi cấy Hàm lượng than hoạt tính thích hợp bổ sung khoảng 0,5 – 3% Nếu quá nhiều than hoạt tính sẽ dẫn đến cản trở sự hút dinh dưỡng của mẫu đồng thời than hoạt tính sẽ hấp thu chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong môi trường

- Việc sử dụng amino acid đặc biệt quan trọng trong môi trường nuôi cấy

tế bào và môi trường nuôi cấy tế bào trần Amino acid cung cấp cho tế bào thực vật nguồn amino acid sẵn sàng cho nhu cầu của tế bào và nguồn nitrogen này được tế bào hấp thu nhanh hơn nitrogen vô cơ Các nguồn nitrogen hữu cơ thường sử dụng trong môi trường nuôi cấy tế bào thực vật là nuôi cấy hỗn hợp amino acid như casein hydrolysate, L-glutamine, L- asparagine và adenin Casein hydrolysate nói chung được sử dụng với nồng độ 0,05 – 0,1%

1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo củ và ý nghĩa của việc tạo củ 1.3.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo củ

- Ánh sáng: Chúng ta đều biết rằng, ánh sáng là một trong những yếu tố sinh lý

tác động mạnh đến cây trồng thông qua quang chu kỳ Người ta vận dụng quang chu kỳ để điều khiển sự ra hoa, củ một số cây (Cúc, Hoa Hồng, Thanh Long,…) Với Lily thì ánh sáng có ảnh hưởng tới quá trình hình thành củ trong ống nghiệm Trong điều kiện tối hoàn toàn có tác dụng tốt cho quá trình tạo củ đặc biệt là ảnh hưởng tới thời gian xuất hiện củ (13 – 19 ngày) Trong điều kiện tối,

củ tạo thành to, trắng, khỏe, ít lá Khi tăng thời gian chiếu sáng thì thời gian xuất hiện củ dài hơn và chất lượng củ bị giảm sút Ngoài ra, ánh sáng còn ảnh hưởng tới sự xuất hiện lá Trong điều kiện càng tối thì số lá càng ít Điều này liên quan đến sự ngủ nghỉ của củ và đây là một hiện tượng sinh lý bình thường của các cây một lá mầm nhưng lại ảnh hưởng rất lớn đến quá trình phá ngủ nghỉ của Lily

trong nhân giống in vitro (Nguyễn Thái Hà, 2003)

- Nguồn Carbon: Trong điều kiện thông thường, sản phẩm của quá trình quang

hợp là nguồn chất hữu cơ chính được tích lũy cho sự hình thành củ Nhưng trong

điều kiện in vitro, các tế bào thực vật không có khả năng quang hợp Do đó đòi

hỏi phải cung cấp nguồn carbon để tạo năng lượng cho các quá trình sinh lý, sinh hóa diễn ra bình thường trong tế bào, lượng chất hữu cơ này được lấy chủ yếu từ môi trường nuôi cấy Ở một số mô có thể sử dụng nguồn carbon như: maltose, fructose, galactose, sucrose, glucose,… nhưng đường sucrose vẫn là nguồn carbon tốt nhất thường được sử dụng Theo kết quả: “Nghiên cứu các yếu tố ảnh

hưởng tới sự hình thành củ từ vảy củ hoa Lily (Lilium longiflorum) bằng phương

pháp nuôi cấy mô tế bào” (Nguyễn Thái Hà và cộng sự, 2003) cho thấy sucrose kích thích quá trình tạo củ, tăng kích thước củ Để thu được tỷ lệ phát sinh củ cao nên chọn nồng độ đường ở mức 90g/l

- Nguồn Nitrogen (Nitơ): Đối với thực vật nói chung và cây trồng nói riêng, N

có vai trò sinh lý đặc biệt quan trọng đối với sinh trưởng, phát triển và hình thành năng suất N có mặt trong rất nhiều hợp chất hữu cơ quan trọng có vai trò quyết định trong quá trình trao đổi chất và năng lượng, đến hoạt động sinh lý của cây

Trong môi trường sống của thực vật, N tồn tai ở 2 dạng:

+ Khí N tự do trong khí quyển (N2) chiếm khoảng 79% không khí (theo thể tích) nhưng dạng này cây không sử dụng được

+ Dạng hợp chất nitơ hữu cơ và vô cơ N liên kết chủ yếu ở 3 dạng hợp chất:

 Hợp chất N vô cơ trong các muối ammonium (NH4), muối nitrate (NO3)

 Nitơ hữu cơ của các protein ở dạng xác bã động vật, thực vật chưa phân giải hoàn toàn, ở dưới dạng mùn protein

 Sản phẩm phân giải của protein như các acid amine, các peptid và các amine

N là nguyên tố đặc thù của protein mà protein lại có vai trò cực kỳ quan trọng đối với cây

+ Protein là thành phần chủ yếu tham gia cấu trúc nên hệ thống chất nguyên sinh trong tế bào, cấu tạo nên hệ thống màng sinh học, các bào quan trong tế bào

N có trong thành phần của acid nucleic (ADN và ARN) Ngoài chức năng duy trì và truyền thông tin di truyền, acid nucleic đóng vai trò rất quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp protein, sự phân chia và sự sinh trưởng của tế bào,

N là thành phần quan trọng của chlorophyll, là một trong những yếu tố quyết định hoạt động quang hợp của cây, cung cấp chất hữu cơ cho sự sống của các sinh vật trên trái đất

N là thành phần của một số phytohormone như auxin và cytokinin Đây là những chất quan trọng trong quá trình phân chia và sinh trưởng của tế bào và của cây

N tham gia vào thành phần của ADP, ATP, có vai trò quan trọng trong trao đổi năng lượng của cây

N tham gia vào thành phần của phytochrome có nhiệm vụ điều chỉnh quá trình sinh trưởng, phát triển của cây có liên quan đến ánh sáng như phản ứng quang chu kỳ, sự nảy mầm, tính hướng quang

Vì vậy cây rất nhạy cảm với N N có tác dụng hai mặt đến năng suất cây trồng, nếu cây trồng thừa hay thiếu N đều có hại:

+ Thừa N: khác với các nguyên tố khác, việc thừa N có ảnh hưởng rất nghiêm trọng đến sinh trưởng, phát triển và hình thành năng suất ở cây trồng Cây sinh trưởng quá mạnh, thân lá tăng nhanh mà mô cơ giới kém hình thành nên cây rất yếu, dễ lốp đổ, giảm năng suất nghiêm trọng và có trường hợp không

là cây sinh trưởng phát triển bình thường

- Ngoài những yếu tố trên thì các chất điều hòa sinh trưởng, độ cao của mầm củ,… cũng ảnh hưởng đến tỷ lệ củ Lily

1.3.2 Ý nghĩa của việc tạo củ

- Tạo ra được nguồn cung cấp củ giống dồi dào và chất lượng tốt

- Củ giống tốt thì khả năng cây sinh trưởng và phát triển cao

- Góp phần khai thác tốt nguồn củ giống

- Nâng cao chất lượng củ

- Góp phần vào sản xuất củ giống Lily thương mại

1.4 Giới thiệu về cây Lily

Loài : Lilium Sorbonne

Do việc mua bán Lily trên thế giới phát triển, nên công tác lai tạo giống mới luôn được chú ý và mở rộng, giống mới ngày càng nhiều Để tiện cho việc mua bán, hiệp hội làm vườn Hoàng gia Anh (Royal Horticultural society Lily commitie) năm 1963 đưa ra hệ thống phân loại Lily Hệ thống này chủ yếu căn

cứ vào nguồn gốc bố mẹ con lai, tác giả tạo ra giống và năm tạo giống từ đó người ta chia giống Lily trồng trọt làm 4 nhóm:

- Nhóm 1: Nhóm Lily Phương Đông: gồm các chủng: L.auratum, L.spucicsum, L.faponicum, L.rubellum, chủ yếu là các giống lai có nguồn gốc

Năm 1982, Hiệp hội Lily quốc tế đề ra hệ thống phân loại Lily trên cơ sở

Hệ thống phân loại của Anh năm 1963 Hệ thống này dựa vào nơi nguyên sản của bố mẹ, quan hệ huyết thống, đặc trưng hình thái, màu sắc hoa và quy các giống Lily vào 8 nhóm:

- Nhóm Lily lai Á châu (Asiatic hybrids)

Hình 1.1 Lilium Sorbonne

- Nhóm Lily lai Tinh Diệp (Martagon hybrids)

- Nhóm Lily lai hoa trắng (Condidum hybrids)

- Nhóm lai Lily Châu Mỹ (American hybrids)

- Nhóm lai Lily thơm (Longgiflorum hybrids)

- Nhóm Lily lai loa kèn (Trumpet hybrids)

- Nhóm lai Phương Đông (Oriental hybrids)

- Nhóm Lily nguyên chủng

1.4.2 Nguồn gốc và phân bố của hoa Lily

Lily là tên gọi thông thường của các loài hoa thuộc chi Lilium, họ Liliaceae

bộ phụ của thực vật một lá mầm Đây là một trong những họ lớn nhất của thực vật có hoa , gồm hơn 200 giống và khoảng 3000 loài Cây hoa Lily có nguồn gốc

từ Nhật Bản và các nước ở Châu Âu Hoa Lily được trồng tại Đà Lạt từ năm

1945 với các giống ở Hà Nội Từ 1970, Đà Lạt đã nhập giống Lily từ Hà Lan, Hàn Quốc, Nhật Bản Hiện nay, hoa Lily đang được trồng phổ biến nhiều nơi như Hà Nội, Đà Lạt,

Năm 1997, Hà Lan có 356 ha Lily, đứng thứ 2 trong tổng diện tích hoa cắt trồng bằng củ (sau Tuy líp) Sở dĩ hoa Lily được phát triển mạnh trong những năm gần đây là do người Hà Lan đã tạo ra rất nhiều giống mới có hoa đẹp, chống chịu sâu bệnh tốt, năng suất cao Ngoài ra còn do kỹ thuật điều khiển hoa phát triển nhanh có thể cho hoa quanh năm Một nguyên nhân nữa là do có sự đầu tư

cơ giới hoá trong việc trồng và chăm sóc đã làm giảm giá thành, vì vậy đã làm hiệu quả kinh tế từ việc trồng hoa Lily cao hơn hẳn trước đây

Hiện nay, Hà Lan mỗi năm trồng 18.000ha hoa Lily, trong đó xuất khẩu 70% Nhật Bản là nước có truyền thống dùng hoa cắm và cũng là một trong những nước tiêu thụ và nhập khẩu hoa cắt lớn nhất châu Á (mỗi năm khoảng 500 triệu USD) Nhật cũng là nước sản xuất hoa lớn, diện tích sản xuất hoa năm 1992 của nước này là 4.600 ha với 36.000 hộ, sản lượng đạt 900 tỷ Yên, trong đó hoa cúc chiếm vị trí thứ nhất, tiếp đó đến hoa hồng và hoa cẩm chướng Hoa Lily đứng ở vị trí thứ 4, trong đó có 2 giống Lily là Star-Gager và Casa-Blanca không những được ưa chuộng ở Nhật Bản mà còn nổi tiếng trên thế giới

Những năm gần đây Hàn Quốc là một trong những nước phát triển nghề trồng hoa mạnh, lượng xuất khẩu hoa của Hàn Quốc lớn nhất khu vực Đông Bắc

Á Theo thống kê năm 2002, Hàn Quốc có 15.000 ha trồng hoa với 1,2 vạn người tham gia, giá trị sản lượng đạt 700 triệu USD, gấp 8 lần năm 1989 , trong đó, Lily là loại cây có hiệu quả kinh tế cao nhất trong các loại hoa ở Hàn Quốc Công nghệ sản xuất hoa Lily cắt cành ở Đài Loan rất tiên tiến, trình độ canh tác còn cao hơn Hàn Quốc, chỉ kém Nhật Bản; năm 2001 nước này đã có 490 ha trồng Lily, trong đó xuất khẩu Lily cắt cành đạt 7,4 triệu USD

Hà Lan là nước có công nghệ tạo giống và trồng lây tiên tiến nhất hiện nay Mỗi năm Hà Lan tạo ra từ 15 – 20 giống mới, sản xuất 1.315 triệu củ giống Lily, cung cấp cho 35 nước khác nhau trên toàn thế giới

Ngoài các nước kể trên còn nhiều nước trồng Lily lớn khác như: Italy, Mỹ, Đức, Mexico, Columbia, Israel,

Hình 1.2 Sự đa dạng về hình thái và màu sắc của Lilium sp

- Độ lớn của thân vảy tương quan chặt chẽ với số nụ hoa Ví dụ giống Lily thơm chu vi thân vảy là 12 – 14cm có 2 – 4 nụ, chu vi thân vảy là 14 – 16cm có

trên 4 nụ Các giống lai phương Đông và lai châu Á số nụ cũng tỷ lệ thuận với

chu vi thân vảy, Vảy có hình elip, hình kim xoè ra, có đốt hoặc không có đốt Mầm vảy to ở ngoài, nhỏ ở trong, là nơi dự trữ nước và dinh dưỡng của thân vảy, trong đó nước chiếm 70%, chất bột 23%, một lượng nhỏ protêin, chất khoáng, chất béo Theo Lin Line (1970) số lượng vảy cũng tỷ lệ thuận với số lá và số hoa,

số vảy càng nhiều thì số lá và số hoa càng nhiều Nếu bóc bỏ lớp vảy ngoài thì tốc độ nảy mầm của củ nhanh hơn, nhưng tốc độ hình thành của các cơ quan sinh sản giảm, hoa ra muộn hơn Thân vảy là thể kết hợp của nhiều thế hệ, vì vậy khả năng phát dục của nó chịu ảnh hưởng của nhiều thế hệ của môi trường và các điều kiện chăm sóc khác nhau Độ lớn của thân vảy thường được đo bằng chu vi

và trọng lượng của nó Vảy nhiều và mập thì chất lượng giống tốt Củ giống để trồng hoa thương phẩm nhất thiết phải là thân vảy đã được bồi dục, thường năm đầu chưa ra hoa, sang năm thứ 2 củ có chu vi từ 9 cm trở lên mới ra hoa

b Rễ

- Rễ Lily gồm 2 phần rễ thân và rễ gốc Rễ thân còn gọi là rễ trên, do phần thân mọc dưới đất sinh ra, có nhiệm vụ nâng đỡ thân, hút nước và dinh dưỡng, tuổi thọ của rễ này là một năm Rễ gốc gọi là dễ dưới, sinh ra từ gốc thân vảy, có nhiều nhánh, sinh trưởng khỏe, là cơ quan chủ yếu hút nước và dinh dưỡng của

c Lá

- Lá Lily mọc rải rác thành vòng thưa, hình kim, xòe hoặc hình thuôn, hình giải, đầu lá hơi nhọn, không có cuống hoặc cuống ngắn Lá to hay nhỏ tùy thuộc vào giống, điều kiện trồng trọt và thời gian xử lý Trên lá có từ 1 – 7 gân, gân giữa rõ ràng hơn, lá mềm có màu xanh bóng

d Củ con và mầm hạt

- Đại bộ phận của Lily có nhiều củ con ở gần thân rễ, chu vi mỗi củ từ 0,5 –

3 cm, số lượng củ con tùy thuộc vào giống và điều kiện trồng trọt Một số giống địa phương và các giống lai tạo ở nách lá có mầm hạt hình cầu hoặc hình trứng, khi chín có màu tím, tối, chu vi mầm hạt từ 0,5 – 1,5 cm

3 cánh tạo thành, màu sắc như nhau nhưng đài hoa hẹp hơn, cánh đều có hình dịp, gốc có tuyến mật Rất nhiều giống Lily ở gốc cánh có chấm màu tím, hồng, Nhị đủ 6 cái, giữa có cuống màu xanh nhạt, gắn với nhau hình chữ T Trục hoa nhỏ, dài, đấu trục phình to, có 3 khía, tử phòng ở phía trên Màu sắc hoa lily rất phong phú: trắng, phấn hồng, đỏ, vàng, vàng cam, đỏ tím, tạp sắc,… Màu sắc lốm đốm có đen, đỏ thắm, đỏ tím, đen nâu, Phấn hoa có màu vàng hoặc đỏ cam, đỏ nâu, nâu tím… Các giống hoa Lily Phương đông thường có hương thơm

và đây là đặc điểm nâng cao giá trị của hoa

1.4.4 Đặc điểm sinh trưởng, phát dục

1.4.4.1 Đặc điểm sinh trưởng thân

Sự sinh trưởng phát dục của Lily có thể chia ra các giai đoạn: phát triển trục thân, ra nụ, nở hoa, kết hạt, chết khô Thân vảy vùi trong đất sau khoảng 2 tuần

sẽ nảy mầm Tuy nhiên trong trường hợp xử lý lạnh không đầy đủ hoặc gặp trời lạnh thời gian nảy mầm có thể kéo dài tới 5 tuần Từ khi trồng tới khi ra nụ mất khoảng 6 – 9 tuần (tùy theo giống và điều kiện thời tiết) Từ khi ra nụ đến lúc nở

hoa kéo dài 4 – 7 tuần Các giống khác nhau có mức độ chênh lệch nhau khá lớn

về thời gian, sinh trưởng của cây Nhóm giống châu Á từ khi trồng đến khi ra hoa khoảng 2 tuần nhưng cũng có một số giống như Kinka, Lotus chỉ cần 11 tuần, Adelina, Yellow blage, cần đến 16 – 17 tuần, cá biệt có giống chỉ cần 9 tuần như Dame Blanche, ngược lại giống Cassa Blanca cần đến 20 tuần

Trục thân của Lily là do trục mầm dinh dưỡng co ngắn lại tạo ra Trục thân chia ra trục thân sơ cấp và trục thân thứ cấp Đầu trục sơ cấp chính và mầm dinh dưỡng co ngắn, trục thứ cấp nằm giữa mầm dinh dưỡng co ngắn và vảy, có từ 1 đến 3 các là trung tâm phát dục ra củ con đời sau Có một số mầm lá, là vảy mới, quyết định đến sự hình thành củ con Sau khi phá ngủ trục sơ cấp, ở trên mầm nách trục thân là vùng vươn dài thứ nhất, mầm đỉnh co ngắn, vươn lên mặt đất, lá trên bắt đầu mở ra, khi cây ra nụ thì số lá đã được cố định Chiều cao cây quyết định bởi số lá và chiều dài đốt, số lá chịu ảnh hướng của chiều của chất lượng củ giống, điều kiện và thời gian xử lý lạnh củ giống, thường thứ số mầm lá đã được

cố định trước khi trồng Vì vậy, chiều cao cây vẫn chủ yếu quyết định bởi chiều dài đốt Trong điều kiện ánh sáng yếu, ngày dài, nhiệt độ thấp và xử lý trước khi bảo quản lạnh lâu, đều có tác dụng kéo dài đốt thân Ngược lại ánh sang mạnh, ngày ngắn, nhiệt độ cao lại ức chế đốt kéo dài Ở phạm vi nhiệt độ từ 20 – 30oC nếu cứ tăng thêm 2oC cây có thể thấp đi 2 cm Nắm được đặc tính này người ta

có thể xử lý giờ chiếu sáng trước khi ra nụ khoảng 4 – 5 tuần để điều chỉnh chiều cao của cây rất có hiệu quả

1.4.4.2 Đặc điểm phát dục

a Sự phân hóa hoa

Trong điều kiện tự nhiên ở miền Bắc Việt Nam, Lily thường được trồng vào tháng 9 tháng 10 và bắt đầu phân hóa hoa vào tháng 11, 12 Quá trình phân hoá hoa được hoàn thành trong khoảng 40 – 60 ngày Các giống lai châu Á đa số thuộc loại này Khi bắt đầu nẩy mầm cũng là lúc cây bắt đầu phân hóa mầm hoa Nguyên nhân là do mầm co ngắn trong vảy rất mẫn cảm với nhiệt độ thấp Củ Lily xử lý lạnh 5oC từ 4 – 6 tuần, sau khi trồng 10 – 14 ngày đỉnh sinh trưởng mầm rút ngắn, đã bắt đầu hình thành mầm hoa nguyên thuỷ Mỗi mầm hoa nguyên thủy này lại kèm theo 1 – 2 mầm khác Khi củ đã qua xử lý lạnh thì trước

khi trồng, củ có thể mọc mầm và phân hóa hoa, vì vậy nếu không trồng kịp thời

sẽ bất lợi cho phát dục mầm hoa Do đó trước khi mọc mầm hoa hoặc khi mầm ngắn hơn 1 cm phải trồng ngay Tuy nhiên, một số giống thuộc loại Lily phương Đông và Lily thơm lại thuộc loại sau khi nảy mầm 1 tháng mới bắt đầu phân hóa hoa, đó cũng là nguyên nhân các giống này có thời gian sinh trưởng dài Trong điều kiện tự nhiên ở miền Bắc Việt Nam, có một số ít giống có thời gian phân hóa hoa bắt đầu vào tháng 8 – 9, đến tháng 10 – 11 thì hoàn thành, cũng có giống thời gian phân hóa hoa rất dài, bắt đầu từ tháng 9 –10, đến tháng 1 – 2 năm sau mới xong Hai loại chính ở các dòng lai châu Á có sức hình thành mầm hoa mạnh, vì vậy khả năng phát triển của củ nhỏ hơn các giống khác

Ánh sáng mạnh tạo ra sự bại dục của nụ, đồng thời còn gây ra cháy lá, việc

xử lý che nắng sẽ giảm thui nụ Ngược lại ánh sáng yếu (đặc biệt là mùa Đông) cũng làm thui nụ và ảnh hưởng đến chất lượng hoa Quả chín sau khi hoa nở được khoảng hai tháng Khi quả có màu vàng, sẽ nứt ra, hạt có cánh vì vậy ở điều kiện tự nhiên có thể truyền đi theo gió Sau khi thu hoạch quả, thân lá khô héo, lúc này ta có thể thu hoạch củ để làm giống

c Sự ngủ nghỉ của củ và biện pháp phá ngủ

Kỹ thuật quan trọng trong việc trồng lấy là phải phá ngủ củ Nếu trồng củ chưa qua phá ngủ sẽ dẫn đến tỷ lệ nảy mầm thấp và thường xuất hiện hiện tượng hoa mù Các giống thuộc dòng lai châu Á có thời gian ngủ nghỉ kéo dài từ 3 – 6 tháng Dùng nhiệt độ thấp đế phá ngủ là biện pháp hữu hiệu nhất hiện nay Nhìn chung các giống bảo quản lạnh 5oC sau 4 – 6 tuần là phá được ngủ nghỉ Nhưng cũng có một số giống như Connecticut cần 6 đến 8 tuần; giống Yellow Blage cần đến 8 tuần Một số giống thuộc dòng lai phương Đông cần xử lý lâu hơn như StarGager, Casa-Blanca (ít nhất phải trên 10 tuần) Cùng một giống, việc xử lý lạnh càng lâu thì thời gian từ trồng đến ra hoa càng ngắn Ví dụ: giống Prominence xử lý 3 tuần thời gian cần cho ra hoa là 104 ngày, xử lý 5 tuần thời gian cần cho ra hoa là 92 ngày, xử lý 6 tuần thời gian cần cho ra hoa là 88 ngày

Từ đặc điểm này ta có thể xác định được thời gian ra hoa, đồng thời là xác định được thời gian trồng thích hợp

1.5 Tình hình sản xuất hoa Lily trên thế giới và Việt Nam

1.5.1 Tình hình sản xuất hoa Lily trên thế giới

Hoa Lily là một trong những loại hoa được ưa chuộng nhất trên thế giới

và là một trong 6 loại hoa cắt phổ biến và có giá trị kinh tế nhất là hoa Hồng, Cúc, Lay ơn, Đồng tiền và Lily

Theo Đặng Văn Đông và Đình Thế Hoa (2003), Hà Lan là nước xuất khẩu hoa lớn nhất thế giới, chiếm 64,8% thị trường, trong các loài hoa nổi tiếng được xuất khẩu từ Hà Lan có hoa Lily Năm 1997, Hà Lan có 365 ha hoa Lily, đứng thứ hai sau hoa Tuylip về tổng diện tích hoa cắt cành trồng bằng củ Hiện nay mỗi năm trồng 18.000 ha hoa Lily trong đó xuất khẩu 70%

Những năm gần đây Hàn Quốc là một trong những nước phát triển nghề trồng hoa mạnh, lượng xuất khẩu lớn nhất khu vực Đông Bắc Á Theo thống kê năm 2002 Hàn Quốc có 15.000 ha trồng hoa giá tri sản lượng đật 700 triệu USD, gấp 8 lần năm 1989 Trong đó Lily là loại cây có hiệu quả kinh tế cao nhất trong các loại hoa ở Hàn Quốc

Công nghệ sản xuất hoa Lily cắt cành ở Đài Loan rất tiên tiến, năm 2001 nước này có 490 ha trồng hoa Lily, trong đó xuất khẩu đạt 7,4 triệu USD Ở

Châu Phi, Kenia là nước xuất khẩu hoa lớn nhất thế giới, hiện nay nước này có 3 vạn nông trường với 2 triệu người trồng hoa chủ yếu là hoa Lily

Ngoài các nước kể trên còn có nhiều nước trồng hoa Lily lớn như Italy,

Mỹ, Đức, Mexico,…

1.5.2 Tình hình sản xuất hoa Lily ở Việt nam

Lily là một trong các loại hoa cắt cành có giá trị kinh tế cao Tuy nhiên hiện nay ta vẫn chưa chủ động sản xuất được củ giống, hầu hết các gống Lily trồng ở Việt Nam chủ yếu được nhập từ Hà Lan, Đài Loan hoặc Trung Quốc

Theo Đặng Văn Đông và Đình Thế Lộc (2003), Đà Lạt là nơi hiện đang

có dện tích trồng Lily nhiều so với các địa phương khác trong cả nước chiếm khoảng 8% trong tổng diện tích trồng hoa, còn ở Hà Nội, Hải Phòng chỉ mới trồng mang tính chất thử nghiệm T́nh h́nh phát triển của hoa Lily ở Đà Lạt khá thuận lợi, một phần do thiên nhiên ưu đãi cho sự phát triển của giống hoa nói chung và cho hoa Lily nói riêng, một phần do kỹ thuật trồng hoa ở Đà Lạt tương đối cao nên sinh trưởng phát triển tốt Hiện nay Lily đem lại hiệu quả kinh tế cao nhất cho một số công ty hoa ở Đà Lạt

Theo Cục Trồng trọt, Bộ NN&PTNT, nhu cầu thị trường hoa, cây cảnh của Việt Nam trong giai đoạn 2000 – 2012 trung bình tăng 15%/năm Riêng năm

2012, thu nhập bình quân trồng hoa, cây cảnh trên cả nước là 220 triệu đồng/ha/năm với các vùng trồng hoa, cây cảnh chủ yếu là: Hà Nội, Hải Phòng, Sapa (Lào Cai), Mộc Châu (Sơn La), Đà Lạt (Lâm Đồng), TP Hồ Chí Minh,… Trong những năm tới, cả nước sẽ giữ ổn định diện tích 15 ngàn ha trồng hoa, với các vùng sản xuất chính: đồng bằng sông Hồng, đồng bằng sông Cửu Long, Đà Lạt (Lâm Đồng) và các vùng tiểu khí hậu phù hợp, vùng ven đô thị,

 Các giống hoa Lily trồng phổ biến ở Việt Nam

- Giống TIBER: Hoa màu nâu hồng, lá to đầu tròn, số hoa trên cành 3 – 5 hoa, hoa to, cây cao vừa phải (80 – 90 cm)

- Giống SIBERIA: Hoa màu trắng, lá to nhọn, số hoa trên cành 4 – 5 hoa, hoa to, cây thấp (60 – 70cm)

- Giống ACAPULCO: Hoa hồng sẫm, lá to nhọn, số hoa trên cành 3 – 5 hoa, hoa vừa, cây cao (90 – 120 cm)

- Giống SORBONNE: Hoa màu hồng nhạt, lá nhỏ, số hoa trên cành 6 – 7 hoa, hoa nhỏ, cây cao (90 – 120 cm)

- Giống STARGAZER: Cây cao trung bình 100cm, viền cánh hoa màu

trắng, các phần khác đỏ, có đốm tím nâu, ra hoa vừa, hoa rất đẹp, là giống được trồng phổ biến ở Trung Quốc

 Hiệu quả của trồng hoa Lily Sorbonne đối với sản xuất hiện nay:

- Hiệu quả kinh tế trực tiếp:

Theo kết quả của Viện Nghiên Cứu Rau Quả, hiệu quả kinh tế trực tiếp đem lại cho các hộ nông dân, doang nghiệp từ trồng Lily rất cao Thu nhập trung bình từ hoa Lily đạt khoảng 250 triệu/1.000m2/năm

- Hiệu quả gián tiếp:

+ Từ chỗ ở miền Băc Việt Nam trở về trước chưa trồng hoa Lily, phải nhập hoàn toàn từ Trung Quốc hoặc từ Đà Lạt, đến nay đã tự sản xuất và cung cấp được số lớn hoa Lily cho nhu cầu thị trường, bên cạnh đó còn xuất khẩu qua Trung Quốc

+ Góp phần nâng cao nhận thức về sản xuất nông nghiệp theo phương thức công nghiệp, giúp người dân thay đổi dần phương thức canh tác lạc hậu, nhanh chóng tiếp thu những tiến bộ khoa học kỹ thuật tiên tiến để sản xuất các chủng loại hoa có giá trị cao

+ Thông qua mô hình sản xuất hoa Lily, đã tạo công ăn việc làm, tăng thu nhập cho người lao động, doang nghiệp, góp phần thực hiện có kết quả chủ trương chuyển đổi cơ cấu cây trồng của Đảng và Nhà nước

1.6 Tình hình nghiên cứu hoa Lily trên Thế Giới và Việt Nam

1.6.1 Tình hình nghiên cứu hoa Lily trên Thế Giới

Năm 1960 Suker đã nghiên cứu ảnh hưởng của ánh sáng lam,đỏ, hồng ngoại đến sự hình thành củ con của giống Lily CasaBalanca, kết quả cho thấy tia hồng ngoại làm tăng số lượng củ con, tia đỏ và tia tử ngoại có thể dẫn đến sự ngủ nghỉ của một số giống thuộc nhóm Châu Á

Beatic (1993), đã nghiên cứu bảo quản lạnh cuả hoa Lily trước khi trồng ở nhà lưới Kết quả đối với các giống Asiatic hybrids cần bảo quản ở nhiệt độ 2 –

5oC trong 6 – 19 tuần

Joong Suklee, Young A Kim và Huyn Jin Wang (1996), đã tiến hành xử lý lạnh củ Lily trong thời gian 2; 4; 6; 10 tuần ở nhiệt độ 5oC đem trồng trong chậu

và duy trì nhiệt độ ban đêm là 15oC Kết quả cho thấy củ giống sử lý trên 4 tuần làm củ nảy mầm nhanh hơn và cho ra hoa sớm hơn, 100% ra hoa

Hiện nay trên thế giới, Hà Lan là nước có công nghê tạo giống và trồng Lily tiên tiến nhất, mỗi năm tạo ra 15 – 20 giống mới và sản xuất 1,315 triệu triệu

củ Lily cung cấp cho 35 nước khác nhau trên thế giới Ở Châu Á, công nghệ sản xuất hoa Lily cắt cành ở Đài Loan cũng rất tiên tiến, trình độ canh tác còn cao hơn Hàn Quốc, chỉ kém Nhật Bản

1.6.2 Tình hình nghiên cứu hoa Lily ở Việt nam

Ở Việt nam, hoa Lily được xếp vào hoa cao cấp, nhu cầu tiêu dùng loại hoa này ngày càng cao trong những năm gần đây Hầu hết các giống hoa Lily trồng ở Việt nam chủ yeeys được nhập từ Hà Lan, Đài Loan và Trung Quốc Từ năm 2002 đến 2005, một số giống Lily nhâp nội từ Hà Lan đã được Viện Nghiên Cứu Rau Quả và Viện Di truyền Nông Nghiệp trồng khảo nghiệm Kết quả đã

tuyển chọn ðýợc giống hoa Lilium Sorbonne phù hợp với điều kiện vụ Đông

miền Bắc Việt Nam

Song song với việc khảo nghiệm sản xuất các giống hoa Lily, Viện rau quả đã nghiên cứu ảnh hưởng của một số biện pháp kỹ thuật thâm canh sản xuất hoa thương phẩm và cho kết quả:

- Mật độ thích hợp trồng Lily là 25 củ/m2

- Trong điều kiện miền Bắc Việt nam nên áp dụng phương pháp xử lý mát

củ giống trước khi trồng, trong đó thời gian xử lý mát trong kho lạnh ở nhiệt độ

12oC – 13oC trong 15 ngày giúp cây sinh trưởng, phát triển tốt, giảm hiện tượng

nụ hoa bị biến dạng

Năm 2005, Nguyễn Thị Lý Anh đã nghiên cứu thành công “ Sự tạo củ

Lily in vitro và sự sinh trưởng cây Lily trồng từ củ in vitro” (tạp chí khoa học kỹ

thuật nông nghiệp số 5, 2005 )

Năm 2006, Cao Thị Huyền Trang, Dương Minh Nga nghiên cứu tạo củ

trực tiếp từ lát cắt vảy củ Lily in vitro

Năm 2006, Dương Tấn Nhựt và cộng sự đã nghiên cứu thành công “Ảnh hưởng kiểu gen hoa Lily lên khả năng tái sinh từ nuôi cấy lớp mỏng tế bào cắt ngang thân non và vảy củ” (tạp chí công nghệ sinh học 4: 227-232, 2006)

Năm 2012, Nguyễn Văn Tỉnh đã nghiên cứu “Sản xuất thử nghiệm hai giống hoa Lily Manissa và Belladonna” (báo cáo Viện Nghiên Cứu Rau quả Việt Nam)

Năm 2012, Nguyễn Xuân Kết đã nghiên cứu “Các biện pháp kỹ thuật nhân nhanh giống hoa Lily bằng phương pháp tách vảy củ” (báo cáo Viện Nghiên Cứu Rau quả Việt Nam)

Qua đây, ta có thể thấy ở nước ta việc nghiên cứu nhân giống in vitro cây hoa Lily chủ yếu tập trung vào việc tạo củ in vitro từ vảy củ, còn phương pháp tạo cây con in vitro từ vảy củ ít được đề cập đến

CHƯƠNG 2:

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP