Khảo sát tần số gene IGFBP2 (insulin – like growth factor binding protein 2) trên đàn gà tàu vàng tại một trung tâm giống vật nuôi

Tôi xin cam đoan tất cả các số liệu trích dẫn trong đồ án này là trung thực được lấy từ quá trình nghiên cứu thực tế tại Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học Kỹ thuật Nông

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

TÀU VÀNG NUÔI TẠI MỘT TRUNG TÂM

GIỐNG VẬT NUÔI

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : Th.S LÊ THỊ THU HÀ Sinh viên thực hiện : NGUYỄN THỊ THÙY TIÊN MSSV: 0851110247 Lớp: 08DSH2

TP Hồ Chí Minh, 8/2012

i

Khoa: Môi trường & CNSH

PHIẾU GIAO ĐỀ TÀI ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

(Phiếu này được dán ở trang đầu tiên của quyển báo cáo ĐATN)

1 Họ và tên sinh viên/ nhóm sinh viên được giao đề tài (sĩ số trong nhóm: 01):

Họ và tên sinh viên: NGUYỄN THỊ THÙY TIÊN

MSSV: 0851110247 Lớp: 08DSH2

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

2 Tên đề tài: Khảo sát tần số gen PIT-1 (Pituitary specific transcription factor 1) trên đàn gà Tàu vàng nuôi tại một Trung Tâm Giống Vật Nuôi

3 Các dữ liệu ban đầu:

 Tài liệu tổng quan

 Các bài báo khoa học trong và ngoài nước

4 Các yêu cầu chủ yếu:

 Lấy mẫu máu gà Tàu vàng tại Trung Tâm Giống Vật Nuôi

 Tách chiết DNA các mẫu máu

 Xác định tần số gene PIT-1 bằng kỹ thuật PCR – RFLP

5 Kết quả tối thiểu phải có:

 Tách chiết được DNA trong mẫu máu

ii

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc Lập – Tự Do – Hạnh Phúc

LỜI CAM ĐOAN

Tôi tên là Nguyễn Thị Thùy Tiên, sinh viên trường Đại học Kỹ thuật Công

nghệ Tp.Hồ Chí Minh, Khoa Môi trường và Công nghệ Sinh học, lớp 08DSH2

Tôi xin cam đoan tất cả các số liệu trích dẫn trong đồ án này là trung thực

được lấy từ quá trình nghiên cứu thực tế tại Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học,

Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam Tự tôi đã thực hiện tất cả các nội

dung trong đồ án của mình mà không có sự sao chép đồ án nào khác dưới mọi hình

thức

Tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm trước hội đồng Khoa Môi trường và Công

nghệ Sinh học, trước ban giám hiệu trường Đại học Kỹ thuật Công nghệ Tp.Hồ Chí

Minh về lời cam đoan của mình

Tp.Hồ Chí Minh, ngày 16 tháng 07 năm 2012

Người viết

Nguyễn Thị Thùy Tiên

iii

LỜI CÁM ƠN

Để hoàn thành quá trình học đại học và được làm đồ án tốt nghiệp này, em xin gửi lời cám ơn chân thành đến quý thầy cô trường Đại học Kỹ thuật Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh, đặc biệt là các thầy cô Khoa Môi trường và Công nghệ Sinh học đã nhiệt tình giảng dạy, truyền đạt những kiến thức quý báu về chuyên ngành cũng như về cuộc sống trong suốt thời gian em học tập tại trường

Em cũng gửi lời biết ơn sâu sắc đến Thạc sĩ Lê Thị Thu Hà và Thạc sĩ Phạm Minh Nhựt đã tạo điều kiện thuận lợi cho em được làm đồ án ở Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam và tận tình hướng dẫn nghiên cứu, giúp đỡ, động viên

em trong suốt thời gian làm đồ án tại đây

Ngoài ra, em cũng gửi lời cám ơn đến trại gà giống nơi em xuống lấy mẫu, cùng các cô chú trên Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam và các anh chị ở Phòng thí nghiệm (anh Nam, chị Hiền…) đã hướng dẫn, chỉ bảo và tạo điều kiện tốt nhất cho em hoàn thành tốt đồ án này

Không kém phần quan trọng, em xin gửi lời biết ơn đến gia đình những người

đã luôn chăm sóc động viên và là chỗ dựa vững chắc về tinh thần giúp em vượt qua khó khăn Và lời cám ơn đến tất cả những người bạn – tập thể lớp 08DSH2 đã giúp

đỡ tôi trong suốt 4 năm học tập tại trường

Cuối cùng, em xin cám ơn thầy cô Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp đã dành thời gian đọc và phản biện đề tài

Xin chân thành cám ơn!

Tp.Hồ Chí Minh, tháng 07 năm 2012

iv

MỤC LỤC

PHIẾU GIAO ĐỀ TÀI ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP i

LỜI CAM ĐOAN ii

LỜI CÁM ƠN iii

MỤC LỤC iv

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vii

DANH MỤC CÁC BẢNG viii

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH ix

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tìm hiểu chung về gà 5

1.1.1 Sơ lược về nguồn gốc của gà 5

1.1.2 Tình hình chăn nuôi gà tại Việt Nam 6

1.1.3 Một số giống gà địa phương 7

1.1.3.1 Gà Ri 7

1.1.3.2 Gà Đông Tảo 7

1.1.3.3 Gà Hồ 8

1.1.3.4 Gà Mía 8

1.1.3.5 Gà Ác 8

1.1.3.6 Gà Tre 8

1.1.3.7 Gà Nòi 9

1.1.3.8 Gà Tàu vàng 9

1.2 Gà Tàu vàng và các nghiên cứu trên gà Tàu vàng tại Việt Nam 11

1.2.1 Tìm hiểu chung về gà Tàu vàng 11

1.2.2 Các nghiên cứu trên gà Tàu vàng tại Việt Nam 12

1.3 Các nghiên cứu gene PIT-1 trên gà 13

1.4 Giới thiệu về DNA 15

1.4.1 Cấu trúc DNA 15

1.4.2 Phương pháp tách chiết DNA 16

v

1.4.3 Định tính DNA bằng phương pháp điện di 17

1.5 Phương pháp PCR 17

1.5.1 Nguyên tắc 17

1.5.2 Phản ứng PCR 18

1.5.3 Các yếu tố tham gia ảnh hưởng đến phản ứng PCR 20

1.5.3.1 Taq polymerase 20

1.5.3.2 Mồi 20

1.5.3.3 Các nucleotide 21

1.5.3.4 Dung dịch đệm 21

1.5.3.5 DNA mẫu 22

1.5.3.6 Số lượng chu kỳ của phản ứng PCR 22

1.5.3.7 Nhiệt độ và pH 23

1.5.3.8 Ứng dụng của kỹ thuật PCR 23

1.6 Giới thiệu về kỹ thuật RFLP và kỹ thuật PCR-RFLP 24

1.6.1 Kỹ thuật RFLP 24

1.6.2 Kỹ thuật PCR – RFLP 26

1.7 Enzyme cắt giới hạn 26

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thời gian và địa điểm 30

2.2 Nội dung nghiên cứu 30

2.3 Vật liệu, hóa chất và dụng cụ 30

2.3.1 Vật liệu 30

2.3.2 Hóa chất 30

2.3.2.1 Hóa chất dùng trong ly trích DNA 30

2.3.2.2 Hóa chất dùng trong phản ứng khuếch đại DNA 31

2.3.2.3 Hóa chất dùng trong phương pháp điện di 31

2.3.3 Dụng cụ 31

2.4 Phương pháp nghiên cứu 32

2.4.1 Thu thập mẫu 32

vi

2.4.2 Tách chiết DNA 33

2.4.3 Định tính DNA bằng phương pháp điện di 35

2.4.4 Ứng dụng phương pháp PCR – RFLP khảo sát đa hình gene PIT-1 37

2.3.4.1 Tiến hành phản ứng PCR 37

2.4.4.2 Kiểm tra sản phẩm PCR 39

2.4.4.3 Tiến hành cắt sản phẩm PCR bằng enzyme cắt giới hạn 40

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Thu thập và bảo quản mẫu 42

3.2 Hiệu quả tách chiết DNA 42

3.3 Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR 43

3.3.1 Kiểm tra sản phẩm PCR với mồi PIT-1.2 43

3.3.2 Kiểm tra sản phẩm PCR với mồi PIT-1.4 45

3.4 Cắt sản phẩm PCR bằng RE 46

3.4.1 Sản phẩm PCR gene PIT-1.2 được cắt bằng enzyme TaqI 46

3.4.2 Sản phẩm PCR gene PIT-1.4 được cắt bằng enzyme EcoRI 48

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận 53

4.2 Kiến nghị 53

TÀI LIỆU THAM KHẢO 54

­ GHF-1: Growth Hormone Facetor -1

­ MAS: Marker Assisted Selection

­ MR: Maker

­ mRNA: messenger Riconucleic Acid

­ PCR: Polymerase Chain Reaction

­ PIT-1: Pituitary specific transcription factor 1

­ PTN: Phòng Thí Nghiệm

­ PRL: Prolactin

­ QTL: Quantative Trait Locus

­ RAPD: Random Amplified Polymorphic Desoxyribose Nucleic Acid

­ RE: restriction enzyme

­ RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism

­ SDS: Sodium Sodecyl Sulphate

­ SNP: Single nucleotide polymorphism

­ SSR: Single Sequence Repeat

­ TBE: Tris-Boric acid-EDTA

­ Tm: melting temperature

­ TSH- β: Thyroid Stimulating Hormone - β

­ UV: Ultraviolet

viii

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Thành phần bộ Kit EZ-10 Spin Column Genomic DNA Minipreps 30

Bảng 2.2: Trình tự đoạn mồi PIT-1.2 và PIT-1.4 37

Bảng 2.3: Thành phần hóa chất sử dụng cho phản ứng PCR 38

Bảng 2.4: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 38

Bảng 2.5: Thành phần hóa chất trong phản ứng cắt bằng RE 40

Bảng 3.1: Tỷ lệ tách chiết DNA tổng số 43

Bảng 3.2: Tỷ lệ kiểu gene và tần số gene PIT-1.2 47

Bảng 3.3: Tỷ lệ kiểu gene và tần số gene PIT-1.4 50

Bảng 3.4: Tổng hợp kiểu gene và tần số gene PIT-1 51

ix

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

Hình 1.1: Một số giống gà địa phương được nuôi ở Việt Nam 10

Hình 1.2: Gà Tàu vàng 11

Hình 1.3: Quy trình khuếch đại DNA 19

Hình 1.4: Nguyên tắc của kỹ thuật RFLP 25

Hình 2.1: Mẫu máu gà Tàu vàng sau khi lấy về PTN 33

Hình 2.2: Bộ kit EZ-10 Spin Column Genomic DNA Minipreps 34

Hình 2.3: Bộ điện di 36

Hình 2.4: Máy chạy PCR 39

Hình 3.1: Kết quả điện di kiểm tra DNA tổng số 42

Hình 3.2: Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR với mồi PIT-1.2 44

Hình 3.3: Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR với mồi PIT-1.4 45

Hình 3.4: Kết quả kiểm tra sản phẩm cắt bằng enzyme TaqI 46

Hình 3.5: Biểu đồ thể hiện tỷ lệ kiểu gene của gene PIT-1.2 47

Hình 3.6: Kết quả kiểm tra sản phẩm cắt bằng enzyme EcoRI 49

Hình 3.7: Biểu đồ thể hiện tỷ lệ kiểu gene của gene PIT-1.4 50

 1 

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Trong vài chục năm trở lại đây, ngành chăn nuôi gia cầm trên thế giới đã đạt được nhiều thành tựu to lớn Sản phẩm trứng và thịt gia cầm không ngừng tăng lên

Có được thành tựu đó là do việc ứng dụng các tiến bộ kỹ thuật về di truyền giống, dinh dưỡng, công nghệ sinh học, các thành tựu về cơ giới hóa, điện khí hóa trong chăn nuôi gia cầm nhất là chăn nuôi gia cầm công nghiệp Mặt khác, xuất phát từ việc hiểu biết sâu sắc và khai thác triệt để các đặc điểm sinh học vốn có của gia cầm

đã đưa lại hiệu quả cao trong chăn nuôi

Trong ngành nông nghiệp nước ta, chăn nuôi gà chiếm 72 – 73 % tổng đàn gia cầm hàng năm Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đã xây dựng chiến lược phát triển chăn nuôi gia cầm Việt Nam giai đoạn 2006 – 2015 Theo đó, ngành chăn nuôi phải phấn đấu đến năm 2015 tăng tỷ trọng thịt gia cầm lên 32 % tổng sản lượng thịt các loại, trong đó sản lượng thịt gà phải đạt 88 % tổng đàn gia cầm – đạt

350 triệu con, khối lượng thịt 1.992.000 tấn, sản lượng trứng 9.236 tỷ quả (Trích

dẫn: Tình hình chăn nuôi gà giai đoạn 2001 – 2005 và phương hướng phát triển

giai đoạn 2006 – 2015 Cục chăn nuôi)

Hiện nay chăn nuôi gà Tàu vàng để lấy thịt và trứng là một nghề rất phổ biến

và được phân bố nhiều ở các tỉnh thành trong cả nước Do chất lượng thịt thơm ngon, gà có sức sống tốt, khả năng thích nghi cao, chống chịu bệnh tốt Công tác giống đóng vai trò quan trọng trong việc nâng cao hiệu quả của ngành chăn nuôi, chính vì vậy chọn lọc và lai tạo các giống vật nuôi luôn được các nhà khoa học quan tâm Ngày nay với sự phát triển của các kỹ thuật hiện đại trong sinh học, đã hình thành xu hướng nghiên cứu chọn lọc giống vật nuôi dựa vào các chỉ thị DNA Chọn lọc giống vật nuôi dựa vào các chỉ thị DNA, sẽ rút ngắn thời gian, tăng khả năng chính xác và hiệu quả hơn đối với các tính trạng kinh tế ở vật nuôi Việc kiểm soát di truyền của tính trạng sẽ giúp cải thiện năng suất và sinh lý ở gà (Li và ctv, 1990)

 2 

Gene PIT-1 (Pituitary specific transcription factor 1) – yếu tố phiên mã đặc hiệu ở tuyến yên là một gene trong họ gene mã hoá cho các protein đóng vai trò quan trọng trong quá trình phát triển của cơ thể PIT-1 đóng vai trò như một gene điều hòa các hormone sinh trưởng như GH, prolactin và gene hormone tuyến giáp TSH-β Do vậy, PIT-1 đã được khuyến cáo như 1 gene ứng viên cho tính trạng sản xuất (Bodner và ctv, 1988; Li và ctv, 1990; Cohen và ctv, 1996; Miyai và ctv, 2005) Đa hình gene PIT -1 có liên quan đáng kể đến khả năng tăng trưởng cơ thể

và những đặc điểm thành phần thân thịt ở gà

Hiện nay, với nhu cầu thực tế ngày càng cao về các sản phẩm thịt gà sạch thì việc làm sao để chọn lọc tạo giống gà Tàu vàng có năng suất cao, cải thiện khả năng tăng trọng mà vẫn giữ được đặc điểm quý của gà Tàu vàng là vấn đề thực sự đáng quan tâm của các nhà khoa học Một trong số giải pháp đó là việc khai thác các gene quy định năng suất tăng trọng và đưa ra hướng chọn lọc tạo giống gà thương phẩm có năng suất tốt là hết sức cấp bách hiện nay Xuất phát từ thực tế trên, được

sự cho phép của Khoa Môi trường và Công nghệ Sinh học, trường Đại học Khoa học Kỹ thuật Công nghệ Tp.Hồ Chí Minh với sự hướng dẫn trực tiếp của Th.S Lê

Thị Thu Hà chúng tôi đã thực hiện đề tài: “Khảo sát tần số gene PIT-1 (Pituitary specific transcription factor 1) trên đàn gà Tàu vàng nuôi tại một Trung Tâm Giống Vật Nuôi”

2 Tình hình nghiên cứu

 Các nghiên cứu về gà Tàu vàng: Nguyễn Văn Bắc và ctv (2005) đã nghiên

cứu về khả năng sinh trưởng và sinh sản của gà Tàu vàng Việt Nam; Trần Văn Tịnh

và ctv (2011) đã nghiên cứu chọn lọc và nhân thuần nâng cao năng suất gà Tàu vàng; nhóm tác giả Trần Xuân Hoàn và Phạm Doãn Lân (2000) đã nghiên cứu phân tích gene hormone sinh trưởng ở gà Ri bằng kỹ thuật PCR – RFLP Trên đà gà Tàu vàng cho đến nay chưa thấy kết quả nghiên cứu nào dựa vào chỉ thị gene được công

bố

 Các nghiên cứu về gene PIT-1 trên gà: kết quả của Nie và ctv (2008) cho

rằng đa hình gene PIT-1 (MR1 – MR5) trong quần thể gà có tác động đến tính trạng

 3 

tăng trưởng, thành phần thân thịt và không có tác động đến đặc điểm béo ở gà Theo Rodbari và ctv (2011) cho thấy đa hình gene PIT-1 nhờ vào gene đánh dấu có ý nghĩa đáng kể với sự tăng trưởng cơ thể và thành phần thân thịt ở gà thương phẩm tại Iran Jiang và ctv (2004) báo cáo rằng các đột biến A980T của cDNA gen PIT-1

ở gà tương quan đáng kể với khối lượng cơ thể ở 8 tuần Nie và ctv (2005) đã phát hiện 23 SNP trong gen Pit-1 ở gà bằng kỹ thuật HPLC, có 3 trong khu vực 3' UTR

có 16 ở trong vùng intron, và có 57 bp indel (đoạn khuyết/điểm gắn) trong intron 2

57 bp indel trong intron 2 bị ảnh hưởng đáng kể bởi trọng lượng cơ thể, trọng lượng cơ ngực và trọng lượng cơ bắp chân ở gà 1 – 8 tuần tuổi (Qiu và ctv, 2006)

Chưa có nghiên cứu chính thức nào về ảnh hưởng của gene PIT-1 trên gà Tàu vàng tại Việt Nam

3 Mục đích nghiên cứu

Xác định tần số gene PIT-1 trên đàn gà Tàu vàng nuôi tại một Trung Tâm Giống Vật Nuôi

4 Nhiệm vụ nghiên cứu

 Lấy mẫu máu gà Tàu vàng tại Trung Tâm Giống Vật Nuôi

 Tách chiết DNA từ mẫu máu

 Xác định tần số gene PIT-1 bằng kỹ thuật PCR – RFLP

5 Phương pháp nghiên cứu

 Sử dụng bộ Kit EZ-10 Spin Column Genomic DNA Minipreps để tách chiết DNA

 Xác định gene PIT-1 bằng phản ứng PCR với bộ Kit Green Master Mix, 2X

 Xác định tần số gene bằng kỹ thuật PCR – RFLP (sử dụng RE)

6 Các kết quả đạt được của đề tài

 Tách chiết DNA khi sử dụng bộ Kit EZ-10 Spin Column cho kết quả thành công cao đạt 95,12 %

 4 

 Phản ứng PCR khi sử dụng bộ Kit Green Master Mix, 2X với mồi PIT-1.2 (599 bp) và mồi PIT-1.4 (442 bp) cho kết quả thành công 100 %

 Phản ứng cắt của gene PIT-1.2 với enzyme TaqI cho 3 kiểu gene: AA chiếm

12,5 %, kiểu gene BB chiếm 12,5 %, kiểu gene AB chiếm tỷ lệ cao nhất 75 % Tần

số gene A (0,5), tần số gene B (0,5)

 Phản ứng cắt của gene PIT-1.4 với enzyme EcoRI cho 3 kiểu gene: AA

chiếm 30,77 %, kiểu gene BB chiếm 12,82 %, kiểu gene AB chiếm tỷ lệ cao nhất 56,41 % Tần số gene A (0,6), tần số gene B (0,4)

7 Kết cấu của đồ án tốt nghiệp

Chương I Tổng quan tài liệu

Chương II Nội dung và phương pháp nghiên cứu

Chương III Kết quả và thảo luận

Chương IV Kết luận và kiến nghị

 5 

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tìm hiểu chung về gà

1.1.1 Sơ lược về nguồn gốc của gà

Để có bằng chứng chính xác về tổ tiên sống hoang dã của gia cầm, các nhà khoa học đã nghiên cứu những dạng động vật hoang hiện nay còn đang sống có quan hệ họ hàng với chúng Hầu hết các nhà nghiên cứu về gia cầm của thế giới đều

cho rằng gà hoang miền Bắc Ấn Độ hay gà Banquiva (Gallus gallus murghi) một

trong bốn loại hình của gà rừng là được thuần hóa đầu tiên

Nguồn gốc của gà rừng Bắc Ấn Độ phân bố từ thượng nguồn sông Ấn tới miền Nam Gođovani, từ Đông đến Đông Nam dãy núi Hymalaya Gà Banquiva thường đẻ 10 – 12 trứng trong tổ bằng cỏ khô và lá cây Sau 20 – 21 ngày ấp thì trứng nở Lúc trưởng thành khối lượng cơ thể gà mái đạt 0,7 kg, gà trống đạt 1 – 1,1

kg Gà trống có bộ lông sặc sỡ nhiều màu: lông cổ có màu vàng da cam đến vàng, lông thân màu đỏ nâu và lông cánh ánh đen, lông bụng pha lẫn màu đen Gà mái có

bộ lông từ vàng nhạt, vàng trắng đến hoa mơ Màu sắc mỏ, chân cũng không đồng nhất: vàng đậm, vàng nhạt và đen Sự thuần hóa đầu tiên của gà nhà vào thời kỳ đồ đồng Vị trí của gà nhà trong hệ thống động vật được sắp xếp theo sự phát sinh và nguồn gốc của chúng (Lê Hồng Mận – Nguyễn Thanh Sơn, 2001)

Gà nhà (Gallus gallus domesticus) là loài vật nuôi có từ hàng ngàn năm

trước với bằng chứng khảo cổ học cho thấy gà đã tồn tại ở Trung Quốc cách đây 8.000 năm (FAO, 2004) Gà nuôi được thuần hóa từ gà rừng nhiệt đới thuộc Châu

Á, trải qua quá trình thuần hóa, chọn lọc (tự nhiên và nhân tạo) đã hình thành nên các dòng, giống khác nhau theo hướng thịt, trứng và kiêm dụng Trong hệ thống phân loại sinh giới, gà nhà có vị trí phân loại như sau:

 Giới: Ðộng vật (Animalia)

 Ngành: Ðộng vật có xương sống (Chordata)

 Lớp: Chim (Aves)

 6 

 Bộ: Gà (Galiformes)

 Họ: Trĩ (Phasianidae)

 Giống: Gallus

 Loài: Gallus gallus

 Phân loài: Gallus gallus domesticus

1.1.2 Tình hình chăn nuôi gà tại Việt Nam

Theo số liệu thống kê, năm 2010 số lượng gia cầm đạt hơn 300 triệu con, sản lượng thịt đạt 615 nghìn tấn Tổng sản phẩm chăn nuôi trong nước đạt 4.006 nghìn tấn thịt, 306 nghìn tấn sữa tươi và 5,87 tỷ quả trứng (Báo cáo Hội nghị phát triển Chăn Nuôi – Thú Y, 2011) Theo chủ trương của Nhà nước về phát triển chăn nuôi, trong đó chăn nuôi gia cầm nói chung phấn đấu tăng tỷ trọng thịt gia cầm lên 32 % trong năm 2015 so với tổng sản lượng thịt các loại (năm 2003 là 16 – 17 %), tăng sản lượng thịt gà nói riêng lên 88 % năm 2015 (năm 2010 là 82 %) Dự kiến giai đoạn 2011 – 2015, tốc độ tăng đàn là 8,5 % trên 1 năm, sản lượng thịt tăng 10,9 % Đến năm 2015 số lượng gà dự kiến đạt 350 triệu con; sản lượng thịt đạt 1.992 nghìn tấn; sản lượng trứng 9.236 triệu quả Để đạt được mục tiêu đó cần phải có những giải pháp thực hiện, một trong số các giải pháp là nhập nội các giống gà ngoại cùng với việc phát triển, bảo tồn các giống gà địa phương

Vật nuôi bản địa nói chung và gia cầm nói riêng ngày càng được quan tâm bởi khả năng thích nghi, chịu đựng được với khí hậu khắc nghiệt và chất lượng thịt thơm ngon Ngoài ra, gà địa phương còn là nguồn nguyên liệu cho bảo tồn, đa dạng nguồn gene và là giống nền để lai tạo với gà cao sản cải thiện năng suất gà địa phương Mặt khác, chất lượng thịt gà địa phương được nhiều người tiêu dùng ưa thích hơn thịt gà công nghiệp, đặc biệt là người Châu Á bởi thịt hơi dai, có mùi vị thơm ngon Ngoài ra, hàm lượng chất béo thấp, protein cao, hàm lượng collagen tổng số của cơ đùi và cơ ngực cao (Wattanachant và ctv, 2004; Promwatee và Duangjinda, 2010) Nhược điểm của giống gà bản địa là khả năng sinh sản thấp, sinh trưởng chậm và chi phí thức ăn rất cao đã làm giảm hiệu quả kinh tế và từ đó

 7 

cản trở đến việc phát triển chăn nuôi các giống gà bản địa ở quy mô trang trại Điều này đồng nghĩa với việc thoái hóa và biến mất của nhiều nguồn gene gà bản địa quý hiếm đã được cảnh báo từ rất lâu

Cùng với sự tiến bộ của sinh học phân tử, phương pháp chọn lọc dựa trên chỉ thị phân tử hay chọn lọc giống dựa vào dấu chuẩn (MAS) hiện nay rất dễ dàng, kinh

tế hơn và hiệu quả hơn cho các tính trạng tăng năng suất, tính trạng tăng chất lượng… của vật nuôi nói chung và của gà nói riêng Vì di truyền số lượng không thể phân tích được các kiểu gene đơn lẻ Hay nói cách khác, gen đánh dấu liên kết với QTL (Quantative Trait Locus) – điều khiển nhiều đặc điểm kinh tế quan trọng như tăng trưởng, sản xuất trứng… cho phép chọn lọc trực tiếp trên các kiểu gene (Lamont và ctv, 1996) Sử dụng kỹ thuật gene đánh dấu giúp cải thiện các đặc điểm sản xuất, chất lượng Do đó việc kiểm soát di truyền các tính trạng quan trọng sẽ giúp cải thiện năng suất và sinh lý ở gà (Li và ctv, 1990)

1.1.3 Một số giống gà địa phương

1.1.3.1 Gà Ri

Phân bố rộng trên toàn miền đất nước nhưng đã bị pha tạp nhiều Gà mái lông có màu vàng, nâu, nâu nhạt, đen hoặc lốm đốm hoa mơ Gà trống lông có màu tía hoặc vàng, có nơi pha lông đen như ở vùng Sơn Tây, Ninh Bình Gà Ri đa số có mào đơn, da chân vàng, thịt vàng Khối lượng 1 năm tuổi của con trống đạt 1,8 – 2,5 kg; con mái đạt 1,3 – 1,8 kg Sản lượng trứng 90 – 110 quả/năm, khối lượng trứng trung bình 42 – 43 gam Thịt và trứng của gà Ri thơm ngon, tỷ lệ lòng đỏ cao (33,8 %), gà có đặc tính nuôi con khéo nhưng tầm vóc nhỏ, trứng bé, sản lượng trứng thấp

1.1.3.2 Gà Đông Tảo

Gà này có xuất xứ từ thôn Đông Tảo, Khoái Châu, Hưng Yên Gà mái lông

có màu nâu bạc Gà trống lông có màu tía Đặc điểm: đầu to, mào nụ, mắt sâu, chân

to xù xì có nhiều hàng vảy, xương to, nhiều thịt nhưng thịt không mịn, da đỏ, tiếng gáy đục và ngắn Gà trống trưởng thành nặng 3,5 – 4 kg, gà mái trưởng thành nặng

 8 

2,5 – 3 kg Sản lượng trứng đạt 55 – 60 quả/năm, khối lượng trứng trung bình 55 –

57 gam Gà Đông Tảo có ưu điểm: tầm vóc lớn, khối lượng trứng to; nhược điểm: xương to, đẻ ít, mọc lông muộn

1.1.3.3 Gà Hồ

Gà có xuất xứ từ làng Hồ, Bắc Ninh Gà mái lông có màu trắng sữa, màu vỏ nhãn hay màu đất thô Gà trống lông có màu tía, đầu cổ to, da đỏ Đặc điểm: chân hai hàng vảy, mào đơn Gà trống trưởng thành nặng 3,5 – 4 kg, gà mái trưởng thành nặng 2,5 – 3 kg Sản lượng trứng đạt 50 – 55 quả/năm, khối lượng trứng trung bình

55 – 58 gam

1.1.3.4 Gà Mía

Gà này có xuất xứ ở huyện Tùng Thiện, xã Phùng Hưng, Hà Tây Gà mái lông có màu nâu xám hoặc vàng Gà trống lông có màu tía Đặc điểm: đầu to, mắt sâu, mào đơn, chân thô có 3 hàng vảy, da ở bụng có màu đỏ Khối lượng gà trống trưởng thành đạt 3,5 – 4 kg, gà mái trưởng thành đạt 2,5 – 3 kg Sản lượng trứng 50 – 55 quả/năm, khối lượng trứng trung bình 50 – 55 gam

1.1.3.5 Gà Ác

Gà Ác được nuôi nhiều ở các tỉnh miền Tây Nam Bộ như: Trà Vinh, Long

An, Tiền Giang… Đặc điểm: gà có lông màu trắng xù như bông, tầm vóc nhỏ bé,

da, thịt, xương, mỏ, chân đều màu đen, mào có màu đỏ bầm, chân có hoặc không có lông và có 5 ngón nên còn được gọi là “ngũ trảo” Sản lượng trứng đạt 70 – 80 quả/năm, khối lượng trứng trung bình 30 – 32 gam Đây là loại gà thuốc, bổ dưỡng sức khỏe cho tất cả mọi người Tỷ lệ sắt (Fe) trong thịt gà Ác cao hơn gà bình thường 45 %, tỷ lệ acid amin cao hơn 25 %

1.1.3.6 Gà Tre

Gà mái lông có màu xám xen lẫn màu trắng Gà trống lông có màu vàng ở cổ

và đuôi, phần còn lại màu đen, lông dài Đặc điểm: tầm vóc nhỏ, thịt thơm ngon, đầu nhỏ, mào hạt đậu Giai đoạn 6 tháng tuổi: gà trống nặng 0,8 – 0,85 kg; gà mái

 9 

nặng 0,6 – 0,62 kg Sản lượng trứng đạt 50 – 60 quả/năm, khối lượng trứng trung bình 21 – 22 gam Ngoài công dụng cung cấp thịt và trứng thì gà Tre còn có thể làm cảnh và thi chọi

1.1.3.7 Gà Nòi

Gà Nói còn được gọi là gà Chọi Số lượng gà này không nhiều, rải rác ở nhiều nơi, thường nuôi để thi chọi gà Đặc điểm: gà có màu lông đen xám, pha lẫn màu vàng tươi, lông đuôi đen, đầu to, mỏ màu đen, mào hạt đậu, mắt đen có vòng

đỏ, cổ dài và to, thân dài rộng, lưng ngang phẳng, chân cao có vảy đen xám, cựa sắc

và dài Giai đoạn 1 năm tuổi con trống nặng 2,5 – 3 kg, con mái nặng 1,8 – 1,9 kg Sản lượng trứng đạt 50 – 60 quả/năm, khối lượng trứng trung bình 45 – 50 gam

1.1.3.8 Gà Tàu vàng

Phổ biến chủ yếu ở miền Nam, bị pha tạp nhiều Đặc điểm: mào đơn hoặc hạt đậu, lông vàng, chân có lông ở bàn chân, có khi ở cả ngón chân Gà trống trưởng thành nặng 3 kg, gà mái trưởng thành nặng 2 kg Sản lượng trứng 70 – 90 quả/năm, khối lượng trứng trung bình 45 – 50 gam

(Trích dẫn: Hội chăn nuôi Việt Nam, 2002 Chăn nuôi gà thả vườn và gà Tây Nhà

xuất bản Nông Nghiệp)

 10 

Hình 1.1: Một số giống gà địa phương được nuôi ở Việt Nam A: Gà Ri; B: Gà

Đông Tảo; C: Gà Hồ; D: Gà Mía; E: Gà Ác; F: Gà Tre; G: Gà Nòi; H: Gà Tàu vàng (Nguồn: http://agriviet.com/home/threads/40829-cac-giong-ga-tren-the- gioi#axzz21t2NH4Lj)

 11 

1.2 Gà Tàu vàng và các nghiên cứu trên gà Tàu vàng tại Việt Nam

1.2.1 Tìm hiểu chung về gà Tàu vàng

Gà Tàu vàng có ngoại hình khá đẹp, lông màu vàng đến vàng rơm, vàng sẫm,

cổ có cườm đen từ ít đến nhiều, có đốm đen ở cánh và đuôi Chân màu vàng, da màu vàng và thịt màu trắng Mào gà Tàu vàng phần lớn là mào đơn và một số ít con

có mào nụ Ngoài ra, một số con còn xuất hiện lông ở chân và ngón chân Gà rất nhanh nhẹn và ưa thích tìm kiếm mồi trong vườn Gà Tàu vàng có trọng lượng vừa phải thường vào giai đoạn 6 tuần tuổi gà trống có khối lượng 2 kg, gà mái có khối lượng 1,4 kg Gà Tàu vàng có khả năng sinh sản kém, nếu nuôi tập trung và áp dụng

kỹ thuật cai ấp thì tỷ lệ đẻ bình quân toàn đàn đạt 25 – 30 % Nếu không áp dụng kỹ thuật cai ấp thì tỷ lệ đẻ bình quân toàn đàn nhiều khi đạt dưới 20 % Đặc thù của giống gà Tàu vàng là đẻ sớm (khoảng 20 tuần tuổi), ham ấp và khéo nuôi con Gà mái bắt đầu đẻ lúc 17 – 20 tuần tuổi, năng suất trứng đạt từ 90 – 120 quả Trọng lượng trứng bình quân chỉ đạt 42 – 45 gam Trong môi trường chăn thả và ấp tự nhiên thì tỷ lệ nở thành công đạt từ 90 – 95 % Còn khi nuôi nhốt và ấp máy theo lối công nghiệp thì tỷ lệ nở thành công chỉ đạt 73 – 77 % (Át lát vật nuôi, 2004)

Hình 1.2: Gà Tàu vàng (Nguồn: http://iasvn.org/chuyen-muc-in-bai-viet/605.html)

Gà Tàu vàng được nuôi nhiều ở các tỉnh miền Đông và Tây Nam Bộ như Bà Rịa Vũng Tàu, Đồng Nai, Bình Dương, Tây Ninh, Long An, Tiền Giang… số lượng

gà được nuôi nhiều nhất phải kể đến Long An, Tiền Giang, còn tại Tp.Hồ Chí Minh

 12 

gà được nuôi rải rác ở các huyện ngoại thành như Củ Chi, Hóc Môn Gà Tàu vàng

là một trong số những giống gia cầm được ưa chuộng nhất trong chăn nuôi hộ gia đình hay công nghiệp do chất lượng thịt thơm ngon, có sức sống tốt, khả năng thích nghi cao, chống chịu bệnh tật tốt hơn gà công nghiệp Tuy nhiên năng suất của giống gà này tương đối thấp, khả năng tăng trưởng chậm Trong những năm gần đây, nhiều giống gà mới (Tam Hoàng, Lương Phượng, Sasso…) đã được du nhập rất nhanh vào chăn nuôi gà thả vườn ở Nam Bộ Tuy vậy giống gà Tàu vàng vẫn được nuôi giữ trong nhiều hộ dân, một phần là do đặc tính sinh học quý báu của giống gà này, một phần là do thị hiếu của người tiêu dùng ngày càng cao – người tiêu dùng rất ưa chuộng và chấp nhận mua giá cao hơn các loại gà địa phương khác

Gà Tàu vàng mái dầu thường có giá cao gấp hai lần gà Lương Phượng Tập quán nuôi và bán gà mái dầu, gà trống thiến vẫn còn tồn tại ở các tỉnh Nam bộ Có thể nói đây là đặc sản của vùng đất Nam bộ còn giữ được trong quá trình công nghiệp hoá hiện nay, những món ăn đặc sản không thể thiếu khi bảo tồn văn hoá của mỗi vùng đất (Đinh Công Tiến và Nguyễn Quốc Đạt, 2005)

1.2.2 Các nghiên cứu trên gà Tàu vàng tại Việt Nam

Kết quả nghiên cứu của Lâm Minh Thuận và ctv (2003) cho thấy tỷ lệ đẻ từ

25 tuần tuổi đến 52 tuần tuổi là khá cao đạt 41 – 62 %; về khả năng sinh trưởng thì khối lượng con trống đạt từ 1,47 – 1,58 kg và con mái từ 1,17 – 1,33 kg lúc 12 tuần tuổi Khảo sát khả năng sản xuất thịt gà tại Bà Rịa Vũng Tàu khối lượng con trống

và con mái 12 tuần tuổi tương ứng là 1,95 – 2,04 kg và 1,49 – 1,6 kg, kết quả này khá cách biệt với chính kết quả của tác giả nêu trên Theo tác giả thì sự khác biệt này là do quy mô nghiên cứu trên gà Tàu vàng nhỏ, kinh phí thấp chưa đáp ứng tốt cho chương trình giống

Trong nghiên cứu về gà Tàu vàng Nam Bộ của Nguyễn Văn Bắc và ctv (2005) cho thấy khả năng sinh sản của gà khi nuôi nhốt thì năng suất trứng ở 40 tuần tuổi đạt 73,25 trứng/mái, nuôi gà chăn thả trong hộ dân thì năng suất trứng năm đầu đạt 125 trứng/mái/năm, năm thứ 2 là 95 trứng/mái/năm Gà Tàu vàng nuôi

 13 

lấy thịt theo phương thức nuôi nhốt ở giai đoạn 16 tuần tuổi khối lượng con trống đạt 2 kg và khối lượng con mái đạt 1,4 kg, tỷ lệ sống sót của gà đạt 92,5 % và tiêu tốn 3,79 kg thức ăn/mái Nếu nuôi theo quy trình giống thì ở giai đoạn 19 tuần tuổi khối lượng con trống đạt 1,94 kg, khối lượng con mái đạt 1,47 kg; tỷ lệ sống sót của

gà đạt 91 % và tiêu tốn 10,07 kg thức ăn/mái

Kết quả nghiên cứu của Trần Văn Tịnh và ctv (2011), bước đầu đã chọn lọc

và lai tạo ra được quần thể gà Tàu vàng khá đồng nhất (trên 80 % quần thể lúc 1 ngày tuổi có màu lông vàng) Kết quả vào 14 tuần tuổi con trống có khối lượng 2,1

kg, con mái có khối lượng 1,4 kg; tỷ lệ sống sót của gà đạt 95,56 % và tiêu tốn 3,66 – 3,95 kg thức ăn/mái Năng suất trứng thế hệ xuất phát (gà giống) là 94 trứng/mái/năm, các thế hệ tiếp theo đạt 100 – 110 trứng/mái/năm tăng 6 – 17 % Khối lượng trứng trung bình là 46 gam vào giai đoạn 40 tuần tuổi Tuy nhiên, quần thể chọn lọc còn nhỏ, vẫn còn phân ly, chưa tạo được dòng trống, dòng mái riêng

để khai thác tối đa tiềm năng giống (sinh trưởng, sinh sản)

1.3 Các nghiên cứu gene PIT-1 trên gà

POU (Pit-Oct-UNC) là một loại yếu tố phiên mã vùng có chứa hai vùng được bảo tồn: một vùng đặc hiệu-POU và một vùng cân bằng-POU, yếu tố phiên

mã đặc hiệu ở tuyến yên (PIT-1, hoặc GHF-1, hoặc POU1F1) đã được chứng minh

để liên kết và mã hóa gene khởi động cho hormone tăng trưởng (GH), prolactin (PRL) và hormone kích thích tuyến giáp-β (TSH-β) (Bodner và ctv, 1988; Cohen và ctv, 1996; Miyai và ctv, 2005) Hoạt động sinh học khác của gene PIT-1 cũng đã được báo cáo, như điều hòa sự phát triển của thùy trước tuyến yên và tăng sinh tế bào tuyến yên, làm bất hoạt hoặc trì hoãn adrenarche (tuyến thượng thận) ở người, liên quan đến kiểu hình lùn ở chuột , cũng như gây ra sự khác biệt giữa các tế bào tiền thân gan và các tế bào sản xuất PRL (Li và ctv, 1990; Taha và ctv, 2005; Lee

và ctv, 2005) Gene PIT-1 ban đầu kích hoạt dưới sự kiểm soát của Phophet 1), gene PIT-1 tự động quy định trong mRNA của nó và hiện diện trong bất kỳ loại

(PROP-tế bào nào của tuyến yên, trong khi protein PIT-1 chủ yếu hiện diện trong

tự bởi Tanaka và ctv (1999) và ba đồng dạng là PIT-1, PIT-1β và PIT-1ω được gây

ra bởi thay thế ghép nối cũng đã được phân lập và được tìm thấy bao gồm 335, 363,

và 327 acid amin tương ứng (Van và ctv, 2000) Thay thế ghép nối gene PIT-1 đã được báo cáo ở các loài khác.Theo trình tự hệ gene gà phát hành tháng 5 năm 2006 (http:/ /mgc.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway), gene PIT-1 gà nằm ở nhiễm sắc thể số 1 (GGA1) và kéo dài hơn 14 kb (Nie và ctv, 2008)

 Một vài nghiên cứu gene PIT-1 trên gà:

 Kết quả nghiên cứu của Zahra Rodbari và ctv (2011) cho biết: các kiểu

gene và tần số gene ở locus gene PIT-1 cắt bằng enzyme TaqI cho kết quả kiểu gene

AA (0,61); kiểu gene AB (0,32); kiểu gene BB (0,07) Tần số gene A (0,77), tần số gene B (0,23) Alen A xuất hiện thường xuyên hơn so với alen B và kiểu gene AA cũng xuất hiện nhiều hơn các kiểu gene khác trong quần thể Kiểm tra Chi-square (P < 0,05) và được tính dựa theo định luật cân bằng Hardy-Weinberg Kiểu gene ở

locus gene PIT-1 cắt bằng enzyme TaqI có mối liên quan đáng kể với trọng lượng

cơ thể, trọng lượng cơ ức, trọng lượng cánh (P  0,1) Không kiểu gene nào trong

đa hình gene PIT-1 có liên quan đáng kể đến đặc điểm béo ở gà

 Kết quả nghiên cứu của Nie và ctv (2008) cho biết: 5 đa hình của gene PIT-1 trong quần thể gà có liên quan đến tốc độ tăng trưởng của gà Cụ thể MR1 (nằm ở vùng intron 2 – kích thước 387 hoặc 330 bp) có liên quan đáng kể đến đường kính chân, trọng lượng trứng mới nở, chiều dài chân gà ở 84 ngày tuổi (P < 0,01); MR2 (nằm ở vùng intron 5 – kích thước 599 bp – được cắt bằng enzyme cắt

TaqI) có liên quan đáng kể với trọng lượng cơ thể ở 42 ngày tuổi và tăng khối

lượng trung bình hàng ngày ở giai đoạn 0 – 4 tuần tuổi (P < 0,05); MR3 (nằm ở

 15 

vùng intron 5 – kích thước 599 bp – được cắt bằng enzyme cắt MspI) có liên quan

đáng kể đến tăng khả năng tăng khối lượng trung bình hàng ngày ở giai đoạn 4 – 8 tuần tuổi (P < 0,05); MR4 (nằm ở vùng intron 5 – kích thước 442 bp – được cắt bởi

enzyme EcoRI) có liên quan đến chiều dài chân, đường kính chân ở 77 ngày tuổi,

trọng lượng cơ thể ở 84 ngày tuổi (P < 0,01); MR 5 (nằm ở vùng exon 6 – kích

thước 483 bp – được cắt bằng enzyme cắt TasI) có liên quan đáng kể với trọng

lượng cơ thể ở 35 ngày tuổi, đường kính chân ở 77 ngày tuổi và tăng khối lượng trung bình hàng ngày ở giai đoạn 0 – 4 tuần tuổi Không có sự liên quan đáng kể của các SNP và kiểu gene với các tính trạng béo ở gà

1.4 Giới thiệu về DNA (Desoxyribose Nucleic Acid)

1.4.1 Cấu trúc DNA

DNA là polymer của những nucleotide và là vật chất mang thông tin di truyền của các hệ thống sống Những nucleotide được nối với nhau bằng liên kết phosphate 5’ – 3’ Cầu nối phosphate này là cầu nối ester đồng hóa trị, còn gọi là cầu nối phosphodiester Do những cầu nối phosphodiester, đại phân tử polynucleotide có cấu trúc phân cực tại vị trí 3’ – hydroxyl (3’ – OH) và 5’ – phosphate (5’ – P) ở đầu và cuối của bất cứ acid nucleic nào

Mỗi nucleotide gồm nhóm phosphate, đường desoxyribose và một trong bốn base (adenine, thymine, guanine và cytosine) Các base hữu cơ thuộc hai nhóm: các purine gồm adenine và guanine; các pyrimidine gồm thymine, cytosine và uracil

Phân tử DNA là một chuỗi xoắn kép gồm hai mạch đơn, mỗi mạch đơn là một chuỗi nucleotide Hai mạch đơn liên kết với nhau nhờ các liên kết hydro hình thành giữa các base bổ sung nằm trên hai mạch (A liên kết với T bằng hai liên kết hydro và G liên kết với C bằng ba liên kết hydro) Mỗi mạch đơn là một trình tự có định hướng với một đầu là đầu 5’ – phosphate tự do, đầu kia là đầu 3’ – hydroxyl tự

do (hướng quy ước là 5’ – 3’) Hướng của hai mạch đơn trong chuỗi xoắn kép là ngược nhau, người ta gọi chúng là hai mạch đối song song

 16 

Cầu nối hydro dễ bị phá vỡ làm hai dây đơn của phân tử DNA tách rời nhau, tiến trình này gọi là sự biến tính (denaturation) và tiến trình ngược lại gọi là sự hồi tính (renaturation) Phương pháp thường được sử dụng để tách hai dây đơn của phân tử DNA là nhiệt độ hay các tác nhân hóa học (dung dịch kiềm, urê) Sau đó, nếu điều chỉnh nhiệt độ (hạ dần nhiệt độ) và nồng độ muối thích hợp, các sợi đơn có thể bắt cặp trở lại phân tử DNA ban đầu Dây đơn DNA sẽ không hoàn nguyên một cách hoàn toàn nếu nhiệt độ giảm quá nhanh như trong trường hợp đặt mẫu DNA vào nước đá (trích dẫn Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999)

Tiến trình tách đôi phân tử DNA có thể được ghi nhận bằng nhiều phương pháp Phương pháp đơn giản và hiệu quả nhất là xem xét sự thay đổi của mật độ quang (optical density) Những nucleotide hấp thụ tia cực tím với độ dài sóng tối đa

260 nm Trong quá trình tách đôi dây, giá trị ở bước sóng 260 nm sẽ tăng nhiều trên dây đơn so với dây đôi Người ta sẽ có đồ thị giữa nhiệt độ và sự hấp thụ quang phổ Trong đó điểm giữa khoảng nhiệt độ trong quá trình tách đôi dây DNA được gọi là nhiệt độ nóng chảy (Tm: melting temperature) Hình dạng của đường biểu diễn giống nhau nhưng Tm thay đổi tùy theo thành phần base của DNA và một vài yếu tố khác nhau (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999)

1.4.2 Phương pháp tách chiết DNA

DNA được tách chiết từ mô và các cơ quan của động thực vật Ở động vật DNA được tách từ da, cơ vân, mô mỡ và từ máu Quy trình cơ bản này gồm 3 bước:

 Bước 1: Phá vỡ màng tế bào và màng nhân Tiến hành nghiền mô, tế bào trong dung dịch SDS (sodium dodecyl sulphate) và proteinase (proteinase K) Hỗn hợp này sẽ phá hủy màng tế bào và màng nhân, giải phóng DNA ra môi trường, đồng thời phân hủy các protein liên kết DNA

 Bước 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong dung dịch chứa DNA bằng hỗn hợp dung dịch phenol và chloroform kết hợp với phương pháp ly tâm

 17 

 Bước 3: Tủa dung dịch acid nucleic, thu nhận acid nucleic dạng cô đặc trong ethanol hoặc isopropanol

1.4.3 Định tính DNA bằng phương pháp điện di

Phương pháp điện di là phương pháp cho phép xác định kích thước của các đoạn DNA dựa vào đặc tính cấu trúc của các DNA Đó là các đại phân tử tích điện

âm đồng đều trên khắp bề mặt nên khi chịu tác dụng của một điện trường, chúng sẽ

di chuyển về cực dương của điện trường Tính di động của phân tử phụ thuộc vào khối lượng phân tử (số lượng nucleotide hay cặp nucleotide) và nồng độ chất cấu thành bản thạch (gel) Hai loại gel được sử dụng trong nghiên cứu DNA là polyacrylamide và agarose

Gel agarose là loại gel thông dụng nhất, do thao tác đơn giản Agarose là một trong các dạng của polysaccharide Agarose sẽ tạo thành hạt agarose sau khi tan ở nhiệt độ cao hoặc đun sôi vài phút Khi nguội lại những hạt agarose sẽ kết tụ lại với nhau, giữa những hạt như vậy có những lỗ rất nhỏ Tùy theo nồng độ của gel mà kích thước của các lỗ nhỏ này khác nhau Khi thay đổi nồng độ agarose, kích thước

lỗ giữa các hạt agarose cũng thay đổi Nồng độ gel càng cao thì kích thước các lỗ càng nhỏ và ngược lại Trong điện trường, DNA di chuyển từ cực âm sang cực dương vì DNA mang điện âm (do tính chất của gốc phosphate) Khi DNA di chuyển qua các lỗ của agarose, sự cọ xát giữa các hạt agarose và phân tử DNA tạo

ra lực kháng làm ngăn cản sự chuyển dịch này của DNA DNA có kích thước càng lớn thì lực trở kháng càng mạnh do đó sự di chuyển càng chậm và ngược lại Các DNA cùng kích thước sẽ di chuyển về cùng vị trí và tạo thành các băng, các băng này có thể được quan sát sau khi nhuộm chúng trong ethidium bromide và đặt dưới tia tử ngoại (UV) (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999)

1.5 Phương pháp PCR (Polymerase chain reaction)

1.5.1 Nguyên tắc

PCR là phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ polymerase do Kary Mullis và ctv phát minh năm 1985 Đây là một kỹ thuật phân tử tạo dòng DNA rất đơn giản

 18 

và hiệu quả Thông qua PCR hàng triệu DNA đồng nhất được thu thập một cách dễ dàng từ một hỗn hợp các phân tử bao gồm RNA, protein, polysaccharide, DNA không có chức năng di truyền và DNA có chức năng di truyền

Tất cả các DNA polymerase khi tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới Phương pháp PCR đã được hình thành dựa vào đặc tính đó của các DNA polymerase Thật vậy, nếu cung cấp hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA, sẽ chỉ tổng hợp đoạn DNA nằm giữa hai mồi Điều đó có nghĩa là để khuếch đại một trình tự DNA xác định, ta phải có đủ thông tin tối thiểu về trình tự đó đủ để tạo các mồi bổ sung chuyên biệt; các mồi này gồm một mồi xuôi (forward primer) và một mồi ngược (reverse primer)

Sử dụng sai nhiệt độ trong giai đoạn này dẫn đến việc đoạn mồi không gắn hoàn toàn vào DNA mẫu, hay gắn 1 cách tùy tiện

 Giai đoạn kéo dài (Extension): tổng hợp chuỗi DNA mới giống chuỗi DNA gốc Nhiệt độ được tăng lên khoảng 72 0C giúp cho DNA polymerase tác dụng, vốn polymerase chịu nhiệt hoạt động tổng hợp tốt nhất Thời gian tùy thuộc

Hình 1.3: Quy trình khuếch đại DNA

(Nguồn: http://serc.carleton.edu/microbelife/research_methods/genomics/pcr.html)

 20 

1.5.3 Các yếu tố tham gia ảnh hưởng đến phản ứng PCR

1.5.3.1 Taq polymerase

Taq polymerase là các DNA polymerase xúc tác sự tổng hợp DNA theo

chiều 5’ – 3’ Phần lớn các DNA polymerase dùng một bản mẫu là DNA để làm khuôn cho sự tổng hợp Các DNA polymerase để hoạt động cần một cặp mồi

(primer) DNA polymerase được phân lập từ vi khuẩn suối nước nóng Thermus

aquaticus, nó không bị phá hủy ở nhiệt độ biến tính Taq polymerase cho phép

chúng ta có thể tổng hợp dây DNA mới có tính chất lặp đi lặp lại nhiều lần

Taq polymerase có một mức tối hảo về nhiệt độ trong sinh tổng hợp DNA

(70 – 72 0C) Ở khoảng nhiệt độ này, hoạt động đặc biệt của Taq polymerase có thể

cao như 150 nucleotide/giây/enzyme Do đó người ta phải cố gắng phát triển ở khoảng nhiệt độ 70 – 72 0C trong vòng một phút (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999)

Taq polymerase nhạy cảm với ion Mg++ Nồng độ tối hảo của Mg++ là 1,5 – 2,5 mM Vì deoxyribonucleotide triphosphate (dNTP) có thể gắn với Mg++, cho nên nồng độ chính xác của Mg++ tùy thuộc vào nồng độ của dNTP Các thành phần khác

ít mẫn cảm với Taq polymerase là KCl và Tris Nồng độ Taq polymerase cao sẽ hình thành nhiều sản phẩm giả Nếu nồng độ Taq polymerase quá thấp dẫn đến

không đủ số lượng enzyme xúc tác để tạo ra sản phẩm PCR (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999)

1.5.3.2 Mồi (Primer)

Chiều dài tối thiểu của mồi cho hầu hết các ứng dụng PCR là 18 nucleotide Đối với việc khuếch đại các chuỗi có mức độ dị hợp cao thường sử dụng mồi có 28 – 35 nucleotide Mồi khởi đầu cho quá trình tổng hợp mạch mới Khi mồi bắt cặp

vào mạch khuôn thì Taq polymerase bắt đầu kéo dài chuỗi DNA

Khái niệm quan trọng nhất của PCR là tối hảo giữa mồi và khuôn DNA Nếu nồng độ mồi cao quá hiện tượng primer – dimer (vật giả primer) sẽ xuất hiện giống

 21 

như trường hợp mẫu DNA loãng Nếu tỉ lệ này quá nhỏ, kết quả sản phẩm PCR sẽ không nhiều, nồng độ primer có thể biến động khoảng 0,1 – 1 mM (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999) Thông thường nồng độ mồi xuôi và mồi ngược phải bằng nhau

Mồi là chỉ tiêu quan trọng nhất để đạt được một sự khuếch đại đặc trưng và

có hiệu quả cao Việc chọn mồi là giai đoạn quan trọng quyết định của phương pháp PCR và phải tuân thủ một số nguyên tắc:

 Trình tự của mồi được chọn sao cho không thể có sự bắt cặp bổ sung giữa mồi “xuôi”, mồi “ngược” và cũng không có những cấu trúc “kẹp tóc” do sự bắt cặp

bổ sung giữa các thành phần khác nhau của mồi

 “Nhiệt độ nóng chảy” Tm của mồi xuôi và mồi ngược không cách biệt quá xa Thành phần nucleotide của các mồi cân bằng tránh các cặp GC lặp đi lặp lại nhiều lần

 Các mồi chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, không trùng với các trình tự lặp lại trên gene

 Trình tự nằm giữa hai mồi mồi xuôi và mồi ngược không quá lớn, phản ứng PCR sẽ tối ưu trên những trình tự nhỏ hơn 1 kb

1.5.3.3 Các nucleotide

dNTP – deoxyribonucleotide triphosphate Đây là hỗn hợp 4 loại nucleotide: dATP, dTTP, dCTP, dGTP làm nguyên liệu cho phản ứng tổng hợp mạch mới Nồng độ dNTP biến thiên khoảng 50 – 400 M Thường người ta khuyến cáo mỗi loại được sử dụng là 200 M Nồng độ nucleotide trong phản ứng PCR mất cân

bằng sẽ làm cho phát sinh các lỗi sao chép của Taq polymerase (Bùi Chí Bửu và

Nguyễn Thị Lang, 1999)

1.5.3.4 Dung dịch đệm

Thành phần quan trong nhất trong dung dịch đệm là Mg++ Nó rất cần thiết

cho quá trình liên kết các dNTP, xúc tác cho enzyme Taq polymerase, làm tăng

vài ion Mg++ sẽ được kẹp giữ bởi dNTP trong phản ứng Do đó, người ta cần phải xác định nồng độ tối ưu của Mg++ nhằm đảm bảo kết quả số lượng sản phẩm và sự chuyên tính của sản phẩm PCR

1.5.3.5 DNA mẫu

Phản ứng PCR tối ưu xảy ra trên DNA thật tinh sạch Tuy nhiên có nhiều nghiên cứu cho thấy chẩn đoán bằng PCR vẫn đạt kết quả tốt trên DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào, các vết máu, mẫu khảo cổ Lượng DNA mẫu sử dụng cũng có khuynh hướng giảm từ 1 g xuống khoảng 20 ng nhằm giảm khuếch đại

“ký sinh” tạo các sản phẩm phụ không mong muốn (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998)

Tỷ lệ mồi/DNA template (DNA xét nghiệm) ảnh hưởng rất lớn đến phản ứng PCR, nếu tỷ lệ này quá cao sẽ dẫn đến hiện tượng primer – dimer, còn nếu quá thấp

sẽ có ít sản phẩm PCR (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999) Vì vậy cần xác định hàm lượng DNA để việc bổ sung mồi cho phù hợp

1.5.3.6 Số lượng chu kỳ của phản ứng PCR

Số lượng chu kỳ phản ứng PCR trong thực tế không vượt quá 40 chu kỳ Sở

dĩ như vậy là vì phản ứng PCR diễn tiến qua hai giai đoạn, trong giai đoạn đầu số lượng bản sao tăng theo cấp số nhân tỉ lệ với lượng mẫu ban đầu, sau đó hiệu quả khuếch đại giảm hẳn vì những nguyên nhân sau:

 Sự phân hủy và cạn kiệt các thành phần của phản ứng

 Sự xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng

94 – 95 0C là khoảng nhiệt độ thường sử dụng vì nếu lớn hơn 95 0C thì Taq

polymerase nhanh chóng mất hoạt lực Để kéo dài chuỗi, thường dùng 72 0C vì

nhiệt độ này gần với nhiệt độ tối hảo cho Taq polymerase hoạt động

Theo Bùi Chí Bửu, phức tạp nhất là nhiệt độ trong giai đoạn ủ bắt cặp, nhiệt

độ này là yếu tố quyết định của phản ứng, khoảng nhiệt độ này được xác định tùy từng loại primer Primer có trình tự càng nhiều G, C thì nhiệt độ bắt cặp càng cao Tác giả cho rằng, nhiệt độ này khoảng 56 0C sẽ cung cấp những cơ hội tốt nhất để duy trì mức độ chuyên tính và hiệu quả cao Nhiệt độ ủ có thể thay đổi lớn Nếu nhiệt độ ủ quá thấp sự bắt cặp các primer không chuyên biệt có thể xảy ra và làm cho sản phẩm nhân lên quá mức Nếu nhiệt độ ủ quá cao năng suất của sản phẩm mong muốn giảm nhiều

Hầu hết các enzyme, DNA mẫu được đệm trong môi trường tối ưu có pH =

8 Ở pH này DNA rất ổn định Trong môi trường acid các bazơ purin rất dễ bị tách khỏi sợi DNA, cầu nối phosphodiester bị phá vỡ Tuy nhiên theo chu kỳ nhiệt độ của phản ứng PCR thì pH có thể thay đổi từ 6,8 – 7,8 (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998)

1.5.3.8 Ứng dụng của kỹ thuật PCR

Kỹ thuật PCR được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau, từ nghiên cứu khoa học đến sản xuất và đời sống xã hội Những ứng dụng chính của

kỹ thuật PCR là: