Khảo sát tỉ lệ phân bố và tình trạng đề kháng kháng sinh của vi khuẩn staphylococcus ở một số tỉnh thuộc khu vực phía nam

30 3.3 Tỉ lệ đề kháng kháng sinh của S.aureus từ các loại mẫu thực phẩm, môi trường và mẫu bệnh phẩm ở 5 tỉnh An Giang, Sóc Trăng, Bến Tre, Bình Phước, TP.Hồ Chí Minh.. Vì thế việc xác đ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT TỈ LỆ PHÂN BỐ VÀ TÌNH TRẠNG ĐỀ

KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN

STAPHYLOCOCCUS Ở MỘT SỐ TỈNH THUỘC KHU

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT TỈ LỆ PHÂN BỐ VÀ TÌNH TRẠNG ĐỀ

KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN

STAPHYLOCOCCUS Ở MỘT SỐ TỈNH THUỘC KHU

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi và được sự hướng dẫn khoa học của Ths Diệp Thế Tài Các nội dung nghiên cứu, kết quả trong đề tài này là trung thực và chưa công bố dưới bất kỳ hình thức nào trước đây Những số liệu trong các bảng biểu phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh giá được chính tác giả thu thập từ các nguồn khác nhau có ghi rõ trong phần tài liệu tham khảo

TP Hồ Chí Minh, ngày 09 tháng 08 năm 2017

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, cho phép tôi được gửi lời cảm ơn chân thành tới ThS Diệp Thế Tài

người đã nhiệt tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

của mình Tôi cũng gửi lời cảm ơn tới tất cả nhân viên thuộc phòng Vi khuẩn 1 – Vi

khuẩn Đường ruột, Khoa Vi sinh Miễn dịch, Viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh

đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi thực hiện tốt công việc của mình trong suốt thời

gian qua

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới Ban Giám hiệu Trường Đại học Công

Nghệ TP.HCM cùng toàn thể Thầy, Cô khoa Công Nghệ Sinh Học đã truyền dạy

kiến thức chuyên ngành để tôi có đủ khả năng hoàn thành đề tài

Đặc biệt, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình tôi vì đã luôn luôn là hậu

phương vững chắc giúp đỡ và động viên tôi không từ bỏ việc học của mình

Xin cảm ơn tới tất cả các bạn học lớp 13DSH01, những người đã cùng tôi

vượt qua thời gian học tập và sinh sống tại thành phố Hồ Chí Minh

Xin chân thành cảm ơn!

Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 09 tháng 08 năm 2017 Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Ngọc Hương

MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN I LỜI CẢM ƠN II MỤC LỤC III DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT VI DANH MỤC CÁC BẢNG VII DANH MỤC BIỂU ĐỒ VIII DANH MỤC HÌNH ẢNH IX

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Tình hình nghiên cứu 2

3 Câu hỏi nghiên cứu 3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 Tụ cầu khuẩn Staphylococcus aureus 5

1.1.1 Tình hình phân bố của Staphylococcus aureus 5

1.1.1.1 Trên thế giới 5

1.1.1.2 Tại Việt Nam 6

1.2 Đặc điểm và phân loại tụ cầu khuẩn (Staphylococcus aureus) 6

1.2.1 Giới thiệu 6

1.2.2 Phân loại tụ cầu vàng 7

1.2.3 Đặc điểm sinh học 7

1.2.3.1 Hình thể và tính chất bắt màu của Stphylococcus aureus 7

1.2.3.2 Nuôi cấy 9

1.2.4 Điều kiện tăng trưởng và sự phân bố 10

1.2.5 Đặc điểm sinh hóa 11

1.2.6 Khả năng đề kháng 11

1.2.7 Tình hình đề kháng kháng sinh của vi khuẩn Staphylococcus trên thế giới và tại Việt Nam 12

1.2.7.1 Tình hình đề kháng kháng sinh của S.aureus trên thế giới 12

1.2.7.2 Tình hình đề kháng kháng sinh của S.aureus tại Việt Nam 13

1.2.8 Khả năng gây bệnh của S.aureus 15

1.2.9 Các yếu tố độc lực của Staphylococcus aureus 16

1.2.10 Phòng và điều trị bệnh 17

1.2.10.1 Phòng bệnh 17

1.2.10.2 Điều trị 17

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 18

2.2 Vật liệu thí nghiệm 18

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu 18

2.2.2 Dụng cụ và thiết bị 18

2.2.2.1 Dụng cụ 18

2.2.2.2 Thiết bị 18

2.2.3 Hóa chất và môi trường 19

2.3 Phương pháp tiến hành 19

2.3.1 Kỹ thuật nuôi cấy và phân lập 19

2.3.1.1 Mẫu nước 19

2.3.1.2 Mẫu thực phẩm 19

2.3.1.3 Mẫu phân 20

2.3.2 Quan sát hình thái 20

2.3.3 Kỹ thuật multiplex PCR 20

2.3.4 Kỹ thuật kháng sinh đồ theo phương pháp Kirby-Bauer 23

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27

3.1 Kết quả nuôi cấy và phân lập vi khuẩn S.aureus từ các loại mẫu thực phẩm, mẫu nước và mẫu bệnh phẩm 27

3.1.1 Quan sát đặc điểm khuẩn lạc S.aureus 27

3.1.2 Kết quả nuôi cấy và phân lập vi khuẩn S.aureus từ các loại mẫu thực phẩm, môi trường và mẫu bệnh phẩm ở 5 tỉnh An Giang, Sóc Trăng, Bến Tre, Bình Phước, TP.Hồ Chí Minh 28

3.1.3 So sánh kết quả nuôi cấy, phân lập và định danh S.aureus tại 5 tỉnh thành theo

từng loại mẫu 30

3.2 Kết quả định danh vi khuẩn S.aureus 30

3.3 Tỉ lệ đề kháng kháng sinh của S.aureus từ các loại mẫu thực phẩm, môi trường và mẫu bệnh phẩm ở 5 tỉnh An Giang, Sóc Trăng, Bến Tre, Bình Phước, TP.Hồ Chí Minh 31

3.4 Tỉ lệ S.aureus kháng Methicilline (MRSA) 35

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 36

4.1 Kết luận 36

4.2 Kiến nghị 37

TÀI LIỆU THAM KHẢO 38

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

VRSA Vancomycin-resistant Staphylococcus aureus

MRSA Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

S.aureus Staphylococcus Aureus

PCR Polymerase Chain Reaction

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Trình tự các cặp mồi được sử dụng cho phản ứng PCR 21Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR đa mồi cơ sở phát hiện vi khuẩn S.aureus 22Bảng 2.3 Chu trình nhiệt cơ sở của các mồi 22Bảng 2.4 Bảng tiêu chuẩn đánh giá kết quả đường kính vô khuẩn đối với

Staphylococcus aureus theo CLSI năm 2017 26Bảng 3.1 Kết quả nuôi cấy, phân lập và định danh S.aureus ở Thành phố Hồ Chí Minh 28Bảng 3.2 Kết quả nuôi cấy, phân lập và định danh S.aureus ở tỉnh An Giang 28Bảng 3.3 Kết quả nuôi cấy, phân lập và định danh S.aureus ở tỉnh Bến Tre 29Bảng 3.4 Kết quả nuôi cấy, phân lập và định danh S.aureus ở tỉnh Bình Phước 29Bảng 3.5 Kết quả nuôi cấy, phân lập và định danh S.aureus ở tỉnh Sóc Trăng 29Bảng 3.6 Kết quả nuôi cấy và phân lập vi khuẩn S.aureus tại khu vực phía Nam theo từng loại mẫu 30Bảng 3.7 Kết quả kháng sinh đồ của S.aureus (n = 17) 32

DANH MỤC SƠ ĐỒ BIỂU ĐỒ

Sơ đồ 1.1 quy trình PCR 21

Sơ đồ 2.2 Quy trình thực hiện kháng sinh đồ S.aureus 24 Biểu đồ 3.1 Tỉ lệ đề kháng đa kháng sinh của S.aureus (n= 15) 32 Biểu đồ 3.2 Tỉ lệ đề kháng kháng sinh của S.aureus trong mẫu bệnh phẩm (n= 6) 33 Biểu đồ 3.3 Tỉ lệ đề kháng kháng sinh của S.aureus trong mẫu nước 34 Biểu đồ 3.4 Tỉ lệ đề kháng kháng sinh của S.aureus trong mẫu thực phẩm 34

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Hình thái Staphylococcus aureus 8

Hình 1.2 Tụ cầu Staphylococcus aureus gram dương dưới kính hiển vi 8

Hình 1.3 Hình thái khuẩn lạc S.aureus trên hai môi trường nuôi cấy 10

Hình 2.1 Cách đọc kết quả kháng sinh đồ 25

Hình 3.1 Khuẩn lạc vi khuẩn S.aureus trên môi trường BP 27

Hình 3.2 Đặc điểm hình thái vi khuẩn S.aureus 27

Hình 3.3 Kết quả điện di phát hiện 31

Hình 3.4 Kết quả kháng sinh đồ từ mẫu thực phẩm (005EQA.82BR) và mẫu bệnh phẩm (GS17.018P.AG) 31

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Vi khuẩn gây bệnh là một trong những nguyên nhân hàng đầu lấy đi sinh mạng của rất nhiều người trên thế giới Nhưng ngày nay, việc con người sản xuất thành công thuốc kháng sinh được xem là bước tiến vĩ đại của ngành y học Các bệnh nhiễm khuẩn trên người hiện nay đều có thể điều trị bằng kháng sinh Ban đầu, dưới tác dụng của một liệu trình kháng sinh, đa số vi khuẩn bị giết chết nhưng sẽ có một số ít tồn tại và phát triển theo nguyên lý chọn lọc tự nhiên của Darwin Vi khuẩn sẽ kháng thuốc bằng cách sản sinh ra enzyme mới phù hợp để phân huỷ kháng thể Nếu chúng ta lạm dụng kháng sinh dùng với mục đích dự phòng hoặc dùng không đủ liều lượng, số ngày qui định sẽ dẫn đến vi khuẩn không bị tiêu diệt ngày càng nhiều và trở nên kháng thuốc rất nguy hiểm

Tình hình đề kháng kháng sinh của S.aureus đã trở thành một vấn đề thời sự của y

tế thế giới Tại Việt Nam: vấn đề này cũng không ngoại lệ, các bệnh nhiễm khuẩn vẫn luôn được đặt vào mối quan tâm hàng đầu của ngành y tế và hiện nay đã có nhiều nghiên cứu khoa học cảnh báo về tình trạng này

Sở dĩ S.aureus được quan tâm nhiều như vậy bởi vì vi khuẩn này là tác nhân gây

bệnh nguy hiểm đứng đầu danh sách các tác nhân thường gặp nhất trong các bệnh

viện Chúng gây ra nhiều ca nhiễm trùng trầm trọng cho người như: viêm da mãn

tính, viêm xương khớp, áp-xe ở các vị trí sâu, nhiễm trùng vết thương, viêm phổi,

viêm màng tim, viêm cơ tim, viêm màng não…S.aureus có khả năng kháng kháng

sinh rất nhanh, kéo dài thời gian nằm viện, tăng chi phí và làm tăng tỉ lệ tử vong Với tình hình kháng kháng sinh ngày càng gia tăng nhanh thì trong tương lai gần có thể dẫn đến tình trạng không còn đủ kháng sinh cho việc điều trị các bệnh nhiễm khuẩn và loài người sẽ trở lại thời kỳ không có kháng sinh

Các nghiên cứu tại Viện Pasteur Nha Trang và Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí

Minh (TP.HCM) từ năm 2006 đến năm 2011 cũng cho thấy S.aureus ngày càng đề

kháng với nhiều loại kháng sinh và tỉ lệ MRSA cũng ngày càng gia tăng

Vì thế việc xác định kháng sinh đặc hiệu cho từng loại vi khuẩn là điều cần thiết

để hỗ trợ cho bác sĩ trong việc điều trị các bệnh nhiễm khuẩn và việc sử dụng đúng kháng sinh trong điều trị sẽ rút ngắn được thời gian điều trị, làm giảm thiểu đáng kể

về chi phí, vật chất và tinh thần của người bệnh, đồng thời cũng hạn chế tỉ lệ

S.aureus kháng kháng sinh trong cộng đồng Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu

tỉ lệ phân bố của vi khuẩn Staphylococcus và tình trạng đề kháng kháng sinh của chúng ở một số tỉnh thuộc khu vực phía nam

Kết quả nghiên cứu nhằm góp phần cung cấp cho các bác sĩ lâm sàng mức độ đề kháng kháng sinh của vi khuẩn Từ đó, đề ra hướng chuẩn đoán và điều trị thích hợp, rút ngắn thời gian điều trị và sử dụng kháng sinh đạt hiệu quả nhất

methicillin để được gọi tên MRSA (Methicillin-resistant Staphylococcus

càng gia tăng, đến năm 1993 có 51 ca tử vong liên quan đến MRSA, năm 2005 có 1.629 ca tử vong, năm 2006 có 1.652 ca tử vong, tỷ lệ tử vong liên quan đến MRSA chiếm đến 50%

Khi đó, muốn chống lại MRSA phải dùng vancomycin là kháng sinh quý hiếm,

dự trữ sau cùng Đến năm 1997, tai họa lại đến là vì MRSA đề kháng được cả vancomycin VRSA(Vancomycin-resistant Staphylococcus aureus) Hiện nay, tên MRSA, VRSA được xem là nỗi kinh hoàng của giới chức y tế Chỉ riêng MRSA

hằng năm gây chết khoảng 20.000 người ở Mỹ, vượt xa HIV/AIDS

Từ tháng 8/2012- tháng 8/2013, một nghiên cứu tại phòng Vi sinh bệnh phẩm, khoa LAM Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh với 143 chủng S.aureus về tỉ lệ đề kháng kháng sinh của S.aureus trong 4.299 bệnh phẩm, cho thấy: S.aureus chiếm 23,6% (n=143), đa số được phân lập từ bệnh phẩm mủ (36,3%), dịch âm đạo (18,9%), nước tiểu (11,9%) và phân (10,5%) (n=143) Qua kết quả từ kháng sinh đồ,

tỉ lệ đề của S.aureus với các KS là 93,7% với Penicilline G, 65,0% với Erythromycine, 60,8% với Kanamycine, 58% với Clindamycine Tỉ lệ MRSA là 39,2% và MSSA là 60,8%

Với sự phát triển mạnh mẽ của khoa học con người đã tao ra nhiều loại kháng sinh mới để điều trị các chủng vi khuẩn khác cùng với chủng vi khuẩn kháng thuốc Nhưng thời gian dùng diễn ra không dài lại xuất hiện những vi khuẩn kháng lại những kháng sinh mới sử dụng, con người đã trở nên thất thế trong việc chạy đua với sự biến đổi của vi khuẩn Kháng kháng sinh đã thực sự trở thành mối đe dọa với con người và nó xảy ra như một hiện tượng tất yếu của quy luật tương sinh tương khắc trong tự nhiên

Thực tế ngày càng nhiều các nhiễm khuẩn bệnh viện gây ra do Tụ cầu, các nhiễm

khuẩn này xảy ra ở mọi lứa tuổi, nhiều khoa phòng và đơn vị điều trị

3 Câu hỏi nghiên cứu

Tỉ lệ phân bố của S.aureus ở một số tỉnh thuộc khu vực phía nam là bao nhiêu?

Tỉ lệ đề kháng kháng sinh của S.aureus phân lập được ở khu vực phía nam là bao

nhiêu ?

4 Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu tổng quát: Xác định tỉ lệ phân bố và tỉ lệ đề kháng kháng sinh của

S.aureus trong các mẫu nước, thực phẩm, bệnh phẩm ở khu vực phía nam từ tháng

 Xác định tỉ lệ đề kháng 7 loại kháng sinh của S.aureus trong các loại mẫu

môi trường, thực phẩm, bệnh phẩm ở 5 tỉnh thành Bến Tre, Bình Phước, Sóc Trăng, An Giang, TP.HCM

 Xác định tỉ lệ S.aureus kháng Methicillin (MRSA) trong các loại mẫu

môi trường, thực phẩm, bệnh phẩm ở 5 tỉnh thành Bến Tre, Bình Phước, Sóc Trăng, An Giang, TP.HCM

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tụ cầu khuẩn Staphylococcus aureus

1.1.1 Tình hình phân bố của Staphylococcus aureus

niệm tụ cầu khuẩn (staphylococcus) và trình bày tương đối đầy đủ vai trò của vi

khuẩn này trong các bệnh lý sinh mủ lâm sàng

Đến năm 1881 Ogston đã thành công trong việc gây bệnh thực nghiệm, đây là tiền đề cho những nghiên cứu về S.aureus sau này

Đến năm 1884 Rosenbach đã thực hiện một loạt các nghiên cứu tỉ mỉ hơn về vi

khuẩn này Và ông đã đặt tên cho vi khuẩn này là Staphylococcus aureus

Năm 1926 Julius von Daranyi là người đầu tiên phát hiện mối tương quan giữa

sự hiện diện hoạt động men coagulase huyết tương của vi khuẩn với khả năng gây bệnh của nó Tuy nhiên mãi đến năm 1948 phát hiện này mới được chấp nhận rộng rãi

Từ năm 1988 đến 1992, S aureus gây ra 5,1% trong số các vụ ngộ độc ở Châu Âu

(G.Normanno và ctv, 2005)

Từ năm 1988 đén 1996, ở Đức xảy ra nhiều vụ ngộ độc thực phẩm do tụ cầu gây ra

và vào năm 2000 lại xảy ra một vụ dịch làm 297 người bị ngộ độc cũng do tác nhân là tụ cầu (Viktoria Atanassovavà ctv, 2001)

Từ năm 1986 đến năm1995, ở Đài Loan vi khuẩn S aureus chiếm 30% trong số

các vụ dịch Vào tháng 6 năm 2000, vụ ngộ độc thực phẩm do tụ cầu tại một trường trung học

ở Taichung County làm 10 trong số 356 học sinh có biểu hiện ngộ độc 2-3 giờ sau khiăn sáng (H.-L Wei và C.-S Chiou, 2002)

Tại Brazil, vào tháng 2 và tháng 5 năm 1999 đã xảy ra hai vụ dịch làm 378 người bị ngộ độc

do dùng phomai và sữa tươi có nhiễm tụcầu (L Simeaxo do Carmo và ctv, 2002)

Tại Pháp, năm 1997 người ta tìm thấy S Aureus là tác nhân gây ra 569 trong tổng

1.1.1.2 Tại Việt Nam

Theo đánh giá của tổ chức ý tế thế giới, hàng năm Việt Nam có khoảng trên 3 triệu ca ngộ độc thực phẩm, gây tổn hại trên 200 triệu USD Trong những năm gần đây số vụ ngộ độc thực phẩm ở nước ta ngày càng gia tăng

Năm 2000 có 213vụ ngộ độc thực phẩm với 4233 người mắc 59 người tử vong (Bùi Thế Hiền, Tô ThịThu và cộng sự, 2003)

Theo số liệu từ cục Quản lý chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm, trong những

vụ dịch được tổng kết từ năm 1997 đến 2002 thì ngộ độc thực phẩm do tác nhân vi sinh vật chiếm

tỷ lệ cao từ 40-45% trong các loại gây ngộ độc, trong số đó có nhiều vụ được xác định tác nhân là

Staphylococcus aureus

Từ năm 2002 đến 2004 theo số liệu của trung tâm y tế dự phòng đã có 77 vụ ngộ độc thực phẩm mà phần lớn nguyên nhân là do thức ăn bị nhiễm khuẩn, chiếm 66%(Nguyễn Lý Hương và ctv, 2005)

Từ dữ liệu của Cục vệ sinh an toàn thực phẩm thì năm 2005 số vụ ngộ độc thực phẩm ở nước ta là 141 vụ, làm 4291 người bị ngộ độc, trong đó có 73 vụ (51,8%) là do vi sinh vật gây ra Từ tháng 1/2006 đến tháng 3/2006, có 18

vụ ngộ độc thực phẩm,trong đó vi sinh vật gây ra 5 vụ (27,8%)

1.2 Đặc điểm và phân loại tụ cầu khuẩn (Staphylococcus aureus)

1.2.1 Giới thiệu

S.aureus (hay còn gọi là Tụ cầu vàng) có dạng hình cầu, đường kính 0,5 –

1,5µm, không di động, không sinh nha bào Trên phiến phết nhuộm Gram: vi khuẩn

có thể đứng riêng lẻ, từng đôi, bốn con hoặc xếp thành hình chùm nho, bắt màu

Gram dương, nhưng đôi khi chúng bắt màu Gram âm trong những lứa cấy già

S.aureus thuộc nhóm tụ cầu có men coagulase nên trên môi trường thạch máu

gây tiêu huyết, trên môi trường đặc mọc khuẩn lạc màu trắng sứ hoặc trắng ngà hoặc màu vàng

S.aureus phân bố khắp nơi trong tự nhiên như đất, nước, không khí Quần thể tụ

cầu khuẩn phổ biến có thể sống trên cơ thể của người Rất nhiều người khỏe mạnh

có mang S.aureus nhưng không bị nhiễm bệnh, chúng được gọi là “tạo khóm” Khi những vi khuẩn này gây bệnh thì người bị bệnh được gọi là “nhiễm” S.aureus Trong đa số trường hợp, S.aureus không gây ra vấn đề gì hoặc chỉ gây nhiễm khuẩn nhẹ như nổi mụn mủ hoặc bóng nước Nhưng trong một số trường hợp, S.aureus có

thể gây nhiễm khuẩn trầm trọng hơn

Tỷ lệ người mang vi khuẩn tụ cầu vàng trên da hoặc niêm mạc vào khoảng từ

10 đến 90% Các khu vực cư trú thường gặp của tụ cầu vàng là tiền đình mũi, tóc, nách và nếp hậu môn Đây là nguồn lây chéo trong các đơn vị hồi sức, đặc biệt là ở các bệnh nhân suy giảm miễn dịch như đái tháo đường, bệnh nhân AIDS hoặc xơ gan Chủng vi khuẩn nguy hiểm trong các khu vực này là tụ cầu vàng đề kháng với methicillin

1.2.2 Phân loại tụ cầu vàng

Phân loại của vi khuẩn Staphylococcus Aureus như sau:

1.2.3.1 Hình thể và tính chất bắt màu của Stphylococcus aureus

Staphylococcus aureus thuộc giống Staphylococcus, do đó mang những tính

chất chung của Staphylococcus.Tụ cầu vàng là những vi khuẩn hình cầu có đường

kính 0,8 - 1μm đứng tụ lại với nhau thành từng đám như chùm nho; đôi khi có thể đứng riêng rẽ hoặc thành từng đôi hay từng chuỗi ngắn Tụ cầu thường không có vỏ, không có lông, không di động, không sinh nha bào, bắt màu Gram dương

Hình 1.1 Hình thái Staphylococcus aureus

(Nguồn: www.impe-qn.org.vn)

Hình 1.2 Tụ cầu Staphylococcus aureus gram dương dưới kính hiển vi

1.2.3.2 Nuôi cấy

Tụ cầu vàng thuộc loại vi khuẩn hô hấp hiếu khí kỵ khí tuỳ nghi, phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường Tụ cầu vàng có khả năng phát triển được ở khoảng nhiệt độ dao động từ 10 - 45o C và môi trường có nồng độ muối cao tới 10%

Trong môi trường canh thang sau 5 - 6 giờ vi khuẩn đã phát triển mạnh và làm đục đều môi trường, để lâu đáy có lắng cặn

Hầu hết các dòng S aureus đều tạo sắc tố vàng, nhưng các sắc tố này ít thấy

khi quá trình nuôi cấy còn non mà thường thấy rõ sau 1-2 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ phòng Sắc tố được tạo ra nhiều hơn trong môi trường có hiện diện lactose hay các nguồn hidrocacbon khác mà vi sinh vật này có thể bẻ gãy và sử dụng (Collin C.H và

cs, 1995)

Trên môi trường BP (Baird Parker), khuẩn lạc đặc trưng của S aureus có màu

đen nhánh, bóng, lồi, đường kính 1-1,5 mm, quanh khuẩn lạc có vòng sáng rộng 2-5

mm (do khả năng khử potassium tellurite và khả năng thủy phân lòng đỏ trứng của lethinase) (Rosamund M B và cs, 1995; Mary K S và cs, 2002)

Trên môi trường MSA (Manitol salt agar) hay còn gọi là môi trường Chapman, khuẩn lạc tròn, bờ đều và lồi, màu vàng nhạt đến vàng đậm và làm vàng môi trường xung quanh khuẩn lạc (do lên men đường manitol) (Mary K S và cs, 2002)

Một số dòng S aureus có khả năng gây tan máu trên môi trường thạch máu,

vòng tan máu phụ thuộc vào từng chủng nhưng chúng đều có vòng tan máu hẹp hơn

Môi trường Bair- Paker Môi trường Chapman

Hình 1.3 Hình thái khuẩn lạc S.aureus trên hai môi trường nuôi cấy

1.2.4 Điều kiện tăng trưởng và sự phân bố

Nhu cầu dinh dưỡng cho sự phát triển của Staphylococcus aureus thay đổi tùy thuộc vào từng dòng S aureus có khả năng phát triển trong khoảng nhiệt độ rất

rộng, từ 7-48o

C, với nhiệt độ cực thuận là 30-45o

C; khoảng pH 4,2-9,3, với độ pH cực thuận là 7-7,5; và trong môi trường chứa trên 10% NaCl Tụ cầu bền vững khi

có nồng độ đường cao, nhưng bị ức chế bởi nồng độ 60%; nồng độ từ 33 - 55%, tụ cầu vẫn phát triển

Ngoài ra, chúng còn có khả năng bám dính tốt trên nhiều loại tế bào và máy móc thiết bị giúp gia tăng tính kháng của tụ cầu với sự sấy khô và lọc thấm Chính

nhờ những đặc điểm trên giúp S aureus có sự phân bố rộng, chủ yếu được phân lập

từ da, màng nhày, tóc và mũi của người và động vật máu nóng S aureus được cho

là vi khuẩn khá mạnh có thể sống tốt bên ngoài kí chủ Vi khuẩn này còn có mặt trong không khí, bụi và trong nước dù chúng thiếu tính di động và rất nhạy với

thuốc kháng sinh và chất diệt khuẩn Tuy nhiên, S aureus cũng khá nhạy với nhiệt

rất lớn do chúng phân bố ở khắp nơi và có khả năng sinh độc tố Tụ cầu nhiễm thực phẩm vào chủ yếu qua con đường chế biến có các công đoạn tiếp xúc trực tiếp với

người Sự hiện diện với mật độ cao của S aureus trong thực phẩm cho thấy điều 12

kiện vệ sinh của quá trình chế biến kém, kiểm soát nhiệt độ trong các công đoạn chế biến không tốt Tuy nhiên, điều đó không đủ bằng chứng để cho rằng thực phẩm đó

sẽ gây độc, điều đó chỉ xảy ra khi S aureus được phân lập tạo độc tố Ngược lại, chỉ

với một lượng nhỏ S aureus tạo độc tố cũng có thể gây ngộ độc (Reginald W B và

cs, 2001)

1.2.5 Đặc điểm sinh hóa

Phát triễn tốt ở môi trường tổng hợp, đặc biệt ở môi trường thạch máu hoặc huyết thanh Sinh beta hemolysis trong môi trường thạch máu

Phản ứng indol, NH3, thủy phân gelatin, đông tụ huyết tương

Trên môi trường thạch khuẩn lạc có hình tròn, trơn bóng, đục mờ

Trên môi trường lỏng tế bào ở dạng cặn, vòng nhãn mờ trong ống nghiệm ở trên

bề mặt môi trường

1.2.6 Khả năng đề kháng

Hầu hết các dòng S aureus kháng với nhiều loại kháng sinh khác nhau Một vài

dòng kháng với tất cả các loại kháng sinh ngoại trừ vancomycin, và những dòng này ngày càng tăng Những dòng MRSA (Methicilin resistant Staphylococcus aureus) rất phổ biến và hầu hết các dòng này cũng kháng với nhiều kháng sinh khác Trong phòng thí nghiệm, người ta đã tìm thấy plasmid kháng vancomycin ở Enterococcus

faecalis có thể chuyển sang S aureus , và người ta nghĩ rằng việc chuyển này có thể xảy ra ngoài tự nhiên, trong đường tiêu hóa chẳng hạn Ngoài ra, S aureus còn

kháng với chất khử trùng và chất tẩy uế (Kenneth Todar , 2005) Từ khi sử dụng penicillin vào những năm 1940, tính kháng thuốc đã hình thành ở tụ cầu trong thời gian rất ngắn

Nhiều dòng hiện nay đã kháng với hầu hết kháng sinh thông thường, và sắp tới

sẽ kháng cả những kháng sinh mới Thật sự là trong hai năm gần đây, việc thay thế kháng sinh cũ bằng vancomycin đã dẫn đến sự gia tăng các dòng kháng vancomycin

VRSA(Vancomycin Resistant Staphylococcus aureus) (Kenneth Todar , 2005) Khảo sát tính chất chống đối kháng sinh tại Thành phố Hồ Chí Minh năm 2005 cho

thấy các chủng S.aureus phân lập từ bệnh phẩm cho thấy có đến 94,1% chủng

kháng Penicillin, 52,9% kháng Ciprofloxacin, 52% kháng Amoxillin và 12,5% kháng Getamicin (Nguyễn Thị Kê và cs, 2006)

1.2.7 Tình hình đề kháng kháng sinh của vi khuẩn Staphylococcus trên thế giới

và tại Việt Nam

1.2.7.1 Tình hình đề kháng kháng sinh của S.aureus trên thế giới

Năm 1941, Penicilline bắt đầu được đưa vào điều trị các bệnh nhiễm khuẩn do

Staphylococci thì đến năm 1943 đã xuất hiện chủng S.aureus kháng Penicilline [26]

Năm 1946 ở London, M.Barber và L.P.Garrod phân lập được 14% S.aureus đề

kháng Penicilline do tiết ra penicillinase Tỉ lệ này tăng lên nhanh chóng: năm 1947

Năm 1959 Methicillin được đưa vào sử dụng, ngay sau đó xuất hiện chủng

S.aureus kháng Methicillin (MRSA) Chủng S.aureus giảm nhạy cảm với

Vancomycine cũng đã được tìm thấy ở Nhật lần đầu tiên vào năm 1997 và một số nước khác

Năm 1961 tại Anh, MRSA được phát hiện Các trường hợp đầu tiên được báo cáo của MRSA đã xuất hiện vào giữa những năm 1990 ở Úc, Hoa Kỳ, Anh, Pháp… Tại Anh, đến năm 1993 có 51 ca tử vong liên quan đến MRSA, năm 2005 có 1.629

ca tử vong, năm 2006 có 1.652 ca tử vong liên quan đến MRSA chiếm 50%

Từ đầu những năm 1980, Vancomycine đã được đưa vào điều trị các nhiễm khuẩn do MRSA, đặc biệt là đối với những ca nhiễm khuẩn bệnh viện Tuy nhiên,

chủng S.aureus giảm nhạy cảm với Vancomycine (VISA) đã được tìm thấy ở Nhật

lần đầu tiên vào năm 1997, sau đó ở một số nước khác như Úc, Đức,…Gần đây hai

chủng S.aureus đề kháng hoàn toàn với Vancomycin đã được tìm thấy tại Mỹ năm

2002

Một nghiên cứu mới nhất vào năm 2013 trong một bệnh viện ở Cannada, cho thấy MRSA cũng hiện diện trên bề mặt các dụng cụ y tế, trong phòng bệnh nhân và môi trường chung của bệnh viện

1.2.7.2 Tình hình đề kháng kháng sinh của S.aureus tại Việt Nam

Báo cáo “Hội nghị tổng kết công tác hội đồng thuốc và điều trị, hoạt động theo dõi sự kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh thường gặp năm 2005”, nghiên cứu trên

5 bệnh viện cho kết quả: S.aureus (10,7%), Acinetobacter spp (10,3%), E.coli (16,7%)…

Báo cáo “Khảo sát tình hình kháng kháng sinh của vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện tại bệnh viện Thống Nhất từ 15/10/2004 đến 30/6/2005” của Vũ Thị Kim

Cương năm 2007 cho thấy: S.aureus (13,3%), Klebsiella (18,2%), P.aeruginosa (29,5%), E.coli (13,3%)

Báo cáo “Tình hình kháng kháng sinh của vi khuẩn S.aureus-kết quả nghiên

cứu trên 235 chủng vi khuẩn” của Phạm Hùng Vân năm 2005, các chủng vi khuẩn

S.aureus từ 7 bệnh viện ở Đà Nẵng, Cần Thơ và TP Hồ Chí Minh Kết quả cho

thấy S.aureus tỉ lệ kháng Methicilline 47%, Gentamicine 42%, Erythromycine 63%,

Azithromycine 68%, Ciprofloxacine 39%, Cefuroxime 38%, Amoxicillin-clavulanic acid 30%, Cefepime 34%, Ticarcilline clavulanic acid 28%, Chloramphenicol 38%, Cotrimoxazol 25%, Levofloxacine 17% và chỉ 8% đối với Rifampicine Nghiên cứu

cho thấy vi khẩn S.aureus kháng Methicilline (MRSA) có tỉ lệ đề kháng các kháng

sinh cao hơn rất rõ rệt so với vi khuẩn nhạy cảm Methicilline (MSSA)

Báo cáo “Sự kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh thường gặp tại bệnh viện Thống Nhất trong năm 2006” của Cao Minh Nga đã phân lập được 1.884 chủng vi

khuẩn từ các bệnh phẩm Trong đó, S.aureus kháng kháng sinh chiếm 7,27% Xuất hiện chủng S.aureus kháng ở mức trung gian với Vancomycine chiếm 0,76%

Báo cáo “Hoạt động theo dõi sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh thường gặp ở Việt Nam 6 tháng đầu năm 2006” tại 10 bệnh viện cho kết quả:

S.aureus tỉ lệ đề kháng Oxacilline là 41.7%, tỉ lệ đề kháng Bactrim là 27.2%, tỉ lệ đề

kháng Vancomycine là 1.8%

Báo cáo “Sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh thường gặp tại bệnh viện Nhi Đồng tháng 2 năm 2007” của Trần Thị Ngọc Anh năm 2008 đã phân lập được

2.738 chủng vi khuẩn từ các mẫu bệnh phẩm Trong đó có 311 chủng S.aureus kháng

Methicillin (MRSA) chiếm 33,5%

Báo cáo “Chọn lựa kháng sinh ban đầu trong điều trị nhiễm khuẩn bệnh viện tại một số bệnh viện ở Thành phố Hồ Chí Minh từ tháng 8/2009 đến tháng 8/2010” của Nguyễn Thanh Bảo và Cao Minh Nga năm 2011, cho thấy có 6 loại vi khuẩn thường

gặp nhất trong các loại nhiễm khuẩn bệnh viện Trong đó S.aureus chiếm 7,66%

Báo cáo “Tình hình kháng kháng sinh trên những chủng vi khuẩn thường gặp phân lập trên bệnh nhân nhiễm trùng tiểu tại Viện Pasteur TP.HCM năm 2010” của Nguyễn Thị Ngọc Lan và cộng sự năm 2011 Trong đó tỉ lệ kháng kháng sinh của

S.aureus với Penicilline 92,9%, Erythromycine 75%, Kanamycine 75%,

Gentamycine 48%, Ofloxacine 46,4%, Fusidic acid 42,9%, Oxacilline 39,3% Tỉ lệ

MRSA của Staphylococcus là 39,3%

Báo cáo “Kháng thuốc và gen mã hóa độc tố ruột của S.aureus phân lập từ năm

2006-2010 tại TP.HCM, Việt Nam” của Diệp Thế Tài, Vũ Lê Ngọc Lan và cộng sự

năm 2011, trong 126 chủng S.aureus có 57 chủng MRSA chiếm 45,24%

Báo cáo “Tìm hiểu tính kháng kháng sinh của Staphylococcus aureus phân lập

trên bệnh nhân tại Viện Pasteur Nha Trang năm 2011” của Nguyễn Văn Vinh đã

phân lập được 243 chủng vi khuẩn từ các mẫu bệnh phẩm, trong đó S.aureus chiếm 35,6% (86 chủng) Kết quả S.aureus kháng nhiều loại kháng sinh với tỉ lệ kháng

Penicilline 91,9%, Erythromycine 79,0%, Kanamycine 68,6%, Gentamycine 48,8%, Oxacilline 39,5%, Ofloxacine 38,4%, Amoxicillin-clavulanic acid 32,6%, Fosfomycine 26,7%, Fusidic acid 23,3%, Pristinamycine 9,3%, Rifampicine 9,3%

và Vancomycine 1,1% Tỉ lệ MRSA chiếm 39,5%

Báo cáo “Khảo sát sự kháng kháng sinh của Staphylococcus aureus và các chủng Staphylococcus spp tại bệnh viện Nhân dân Gia Định từ tháng 1-6/2011” của Trần Thị Quyên năm 2012 Kết quả S.aureus kháng với Erythromycine 60,3%,

Ofloxaxine 55,8%, Penicilline 52,0%, Oxacilline 40,5%, Clindamycine 39,3%, Gentamycine 38,7%, Fusidic acid 11,1%, Rifampicine 3,7% và Vancomycine 0,0%

Tỉ lệ MRSA đa kháng trên 50% và kháng kháng sinh nhiều hơn MSSA

1.2.8 Khả năng gây bệnh của S.aureus

S.aureus gây bệnh là do khả năng nhân lên rồi lan tràn vào mô, đồng thời tiết

ra enzyme (catalase, coagulase, staphylokinase, proteinase, lipase, β-lactamase) và độc tố (enterotoxin A, B, C, D, E, F, Toxic shock syndrome toxin, Exfoliative toxin, α-toxin, β-toxin) [3]

 Cơ chế gây bệnh

Cơ chế gây bệnh của S.aureus là khả năng kết hợp các chất ngoại bào và tính

xâm lấn của vi khuẩn Trong trường hợp ngộ độc thức ăn, yếu tố duy nhất là độc tố

có sẵn trong thức ăn

Bệnh lý

Dạng nhiễm trùng ban đầu là nhọt hay những áp xe khu trú Sự xâm nhập của

S.aureus vào nang lông làm da bị hoại tử Coagulase được tiết ra làm đông huyết

tương tại sang thương, tạo một vách bao quanh và giới hạn quá trình tiến triển của sang thương Vách được củng cố bởi tế bào viêm và cuối cùng là mô sợi Sau đó phân hoá lỏng do hoại tử Nếu phá vỡ vách khi sang thương chưa hoá mủ sẽ tạo điều kiện cho vi khuẩn lan đi nhanh chóng, bệnh tiến triển nặng, đặc biệt là mụn nhọt ở mặt

Từ ổ nhiễm, S.aureus có thể xâm nhập vào các nơi khác qua đường bạch

huyết, máu và có thể gây viêm phổi, viêm màng não, viêm cơ tim, viêm thận, nhiễm

khuẩn máu, viêm tuỷ xương [3]

 Biểu hiện lâm sàng

Tụ cầu có men coagulase gây nên rất nhiều bệnh lý khác nhau dựa vào khả năng xâm nhập hay sinh độc tố của tụ cầu

Các bệnh nhiễm trùng khu trú tại da và niêm mạc: chủ yếu ở các chân lông và

tuyến mồ hôi tạo thành áp xe Tổn thương tại chỗ có thể nhẹ nhưng nó cũng là nguy

cơ phát tán vi khuẩn đến những cơ quan xa hơn Mủ của các ổ áp xe do tụ cầu vàng

thường có màu vàng, đặc và không hôi

Nhiễm trùng các cơ quan sâu: nhiễm trùng các cơ quan bên trong cơ thể do

vi khuẩn theo đường máu và bạch huyết đến các cơ quan khác hoặc vi khuẩn đi từ môi trường vào cơ thể thông qua vết rách da sau chấn thương hoặc trong quá trình phẫu thuật Các bệnh lý điển hình trong nhóm này: viêm tủy xương, nhiễm trùng

huyết, viêm màng tim, viêm màng não mủ…

Viêm da bọng nước (bong da sơ sinh, hội chứng bong da do tụ cầu) thường

gặp ở trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ Tác nhân gây bệnh là các chủng tụ cầu sản xuất độc tố Exofoliatine Ngay sau triệu chứng sốt và đỏ da, bệnh có biểu hiện đặc trưng là việc bong lớp biểu bì đồng thời hình thành bọng nước trên diện rộng Bệnh thường diễn tiến lành tính

Hội chứng sốc nhiễm độc: thường gặp ở phụ nữ trẻ trong kỳ kinh

nguyệt dùng băng thấm hút mạnh Khoảng 20% phụ nữ có mang tụ cầu ở đường âm đạo Triệu chứng lâm sàng của hội chứng sốc nhiễm độc gồm đột ngột sốt cao, cảm giác mệt mỏi, tiêu chảy toàn nước, nhức đầu, đau cơ, nổi ban ngoài da và một hoặc

nhiều dấu hiệu của sốc Hội chứng này có tỉ lệ tử vong khá cao

Ngộ độc thực phẩm là bệnh điển hình nhất do độc tố ruột bền với nhiệt của tụ

cầu Sau khi ăn các thức ăn nguội hoặc kể cả các thức ăn nhiễm tụ cầu đã được nấu

chín

1.2.9 Các yếu tố độc lực của Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus gây ra nhiều bệnh nhiễm trùng, tạo mủ và gây độc ở

người Thường xảy ra ở những chỗ xây xước trên bề mặt da như nhọt, gây ra nhiều bệnh nhiễm nghiêm trọng như viêm phổi, viêm vú, viêm tĩnh mạch, viêm màng não, nhiễm trùng tiểu và những bệnh nguy hiểm khác như viêm xương tủy, viêm màng

trong tim S aureus cũng là nguyên nhân chủ yếu của việc nhiễm trùng vết mổ và những vụ nhiễm trùng do dụng cụ y khoa S aureus còn gây ngộ độc thực phẩm do

13 tạo độc tố ruột enterotoxin trong thực phẩm, và gây hội chứng shock độc tố do chúng tạo ra siêu kháng nguyên trong máu (Kenneth Todar, 2005)

Protein bề mặt: thúc đẩy việc bám dính vào tế bào chủ Ngoài ra, hầu hết các

dòng đều tạo protein gắn kết fibronogen và fibronetin làm kích thích sự kết dính các khối máu và mô bị chấn thương Các protein gắn kết chất tạo keo cũng thường gặp

ở những dòng gây bệnh viêm xương tủy và viêm khớp

Yếu tố xâm lấn (hemolysins, leukocidin, kinase, hyaluronidase): giúp vi khuẩn

lan ra trên mô, phân hủy màng tế bào eukaryote

1.2.10 Phòng và điều trị bệnh

1.2.10.1 Phòng bệnh

Vaccin phòng bệnh tụ cầu ít có kết quả Phương pháp phòng bệnh chủ yếu là vệ sinh môi trường, vệ sinh cá nhân và quần áo, vệ sinh ăn uống, đặc biệt là vệ sinh bệnh viện để tránh nhiễm khuẩn bệnh viện Đối với các dụng cụ tiêm truyền, các dụng cụ dùng trong sản khoa, ngoại khoa phải đảm bảo vô khuẩn khi dùng cho bệnh nhân

1.2.10.2 Điều trị

Tụ cầu bị tiêu diệt bởi nhiều kháng sinh như: tetracylin, oxacillin, kanamycin, gentamycin, vancomycin… Tuy nhiên, do việc dùng kháng sinh rộng rãi và tuỳ tiện nên tụ cầu đã kháng lại nhiều loại kháng sinh Việc điều trị cần thiết phải dựa vào kháng sinh đồ để chọn thuốc thích hợp

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện tại phòng Vi khuẩn 1 (Vi khuẩn đường ruột) – khoa

Vi sinh miễn dịch – Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh

Thời gian nghiên cứu: 12/2016 đến 06/2017

2.2 Vật liệu thí nghiệm

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Các mẫu môi trường (nước đá, nước sông, nước sinh hoạt), các mẫu thực phẩm (thịt, cá, rau,…) và các mẫu phân từ các tỉnh An Giang, Tây Ninh, Bến Tre, Bình Phước và Thành phố Hồ Chí Minh gửi về phòng Vi khuẩn 1

2.2.2.2 Thiết bị

Tủ an toàn sinh học cấp 2 Máy ủ nhiệt

Máy vortex Máy điện di

2.2.3 Hóa chất và môi trường

- Môi trường tăng sinh vi khuẩn: BHI Broth

- Hóa chất tách chiết DNA: dung dịch TE (10 mM Tris HCl + 1 mM EDTA), nước cất

- Hóa chất sử dụng cho quá trình điện di: Agarose (Bio – RAD), Ethidium Bromide, dung dịch chạy điện di TBE 0,5X (Invitrogene), nước cất

- Hóa chất sử dụng cho PCR: Master Mix 2X, Primer, nước cất khử ion

- Môi trường phân lập S.aureus: Baird parker agar (BP)

- Môi trường giữ chủng: LB broth +20% Glycerol

- Môi trường Mueller Hinton (MH)

- Nước muối vô trùng (0,85% NaCl)

2.3 Phương pháp tiến hành

2.3.1 Kỹ thuật nuôi cấy và phân lập

2.3.1.1 Mẫu nước

- Tăng sinh: Lấy 100 μl mỗi mẫu nước tăng sinh trong 3ml môi trường BHI broth,

ủ qua đêm ở 37oC Quan sát mẫu, ghi nhận kết quả

- Cấy trực tiếp: Lấy 10 μl mỗi mẫu nước lên các môi trường BP ủ qua đêm ở 37oC Quan sát khuẩn lạc mọc trên các môi trường, ghi nhận kết quả Nếu mẫu nào không mọc hoặc mọc khuẩn lạc không đặc trưng thì ta tiến hành cấy 10μl mẫu nước đã tăng sinh lên môi trường BP, ủ qua đêm ở 37oC Quan sát khuẩn lạc, ghi nhận kết quả Tiến hành giữ nhuộm gram các khuẩn lạc nghi ngờ

2.3.1.2 Mẫu thực phẩm

- Lấy 25 g mỗi mẫu thực phẩm tăng sinh trong 225 ml môi trường BHI, ủ qua đêm ở 37oC

- Sau đó cấy 10 μl mỗi mẫu đã tăng sinh lên các môi trường BP, ủ qua đêm ở

37oC Quan sát khuẩn lạc mọc trên các môi trường, ghi nhận kết quả Tiến hành

giữ nhuộm gram các khuẩn lạc nghi ngờ

2.3.1.3 Mẫu phân

Mẫu phân được thu nhận trong ống falcon môi trường Cary-Blair

- Tăng sinh: Tăng sinh trong môi trường BHI broth hoặc LB broth bằng cách bỏ que gòn trong ống mẫu vào ống nghiệm môi trường Ủ qua đêm ở 37oC Quan

sát mẫu, ghi nhận kết quả

- Cấy trực tiếp: Lấy que gòn mỗi mẫu phân phết lên các môi trường BP ủ qua đêm

ở 37oC Quan sát khuẩn lạc mọc trên các môi trường, ghi nhận kết quả Nếu mẫu nào không mọc hoặc mọc khuẩn lạc không đặc trưng thì ta tiến hành cấy 10μl mẫu phân đã tăng sinh lên môi trường BP, ủ qua đêm ở 37oC Quan sát khuẩn

lạc, ghi nhận kết quả Tiến hành giữ nhuộm gram các khuẩn lạc nghi ngờ

- Nhuộm với crytal violet trong 1 phút

- Nhuộm với dung dịch Lugol (1% iot, 2% KI) trong 30 giây

- Rửa với ethanol 95% khoảng 30 giây

- Rửa bằng nước

- Nhuộm tiếp với dung dịch fuchsin trong 30 giây

- Rửa qua nước Để khô

- Quan sát dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 1000 lần

2.3.3 Kỹ thuật multiplex PCR

Sau khi đã phân lập được S.aureus trên các mẫu môi trường (mẫu H2O),thực

phẩm Tiến hành định danh S.aureus bằng kỹ thuật multiplex PCR

Quy trình kỹ thuật chạy multiplex PCR:

Sơ đồ 1.1 quy trình PCR Bảng 2.1 Trình tự các cặp mồi đƣợc sử dụng cho phản ứng PCR

Cặp mồi Trình tự

5’ → 3’

Gen mục tiêu

Vị trí khuếch đại (bp) Nuc F

Mẫu đã phân lập

Tách chiết DNA

Chạy PCR

Điện di